PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.0 5.1.11.

Activité bactéricide, fongicide ou levuricide des antiseptiques

Méthodes C et D. Si la nature du produit à examiner entraîne Les informations requises sont à rechercher auprès des
une interférence ne pouvant être éliminée par les moyens fabricants, et les firmes sont invitées à fournir toutes les
classiques (par exemple dilution ou centrifugation), il est données de validation dont elles disposent concernant
possible d’établir la courbe d’étalonnage avec le même type l’applicabilité de la méthode de substitution aux substances ou
de substance ou produit rendu exempt d’endotoxines par un produits considérés. Ces données comprennent notamment la
traitement approprié ou par dilution. L’essai des endotoxines description détaillée du mode de préparation des échantillons
bactériennes est alors réalisé par rapport à cette courbe et de toute procédure nécessaire pour éliminer les facteurs
d’étalonnage. d’interférence.
L’ultrafiltration sur membrane filtrante asymétrique en Comme indiqué dans le chapitre général 2.6.30. Essai
triacétate de cellulose s’est avérée appropriée dans la plupart d’activation des monocytes, l’essai d’activation des monocytes
des cas. Elle nécessite une validation convenable des filtres, car est en premier lieu destiné à remplacer l’essai des pyrogènes
la présence de dérivés de la cellulose (β-D-glucanes) peut dans sur le lapin. Des lignes directrices sont données dans le
certaines circonstances conduire à l’obtention de résultats chapitre général 2.6.30. Essai d’activation des monocytes sur le
faussement positifs. choix de la méthode (A, B ou C) à utiliser et sur les modalités
Une autre option possible pour éliminer les facteurs de validation de l’essai d’activation des monocytes.
d’interférence consiste à procéder en 2 étapes : 1) les 12-2. REMPLACEMENT PAR UNE MÉTHODE
endotoxines contenues dans l’échantillon produisant une ALTERNATIVE NON DÉCRITE DANS LA PH. EUR.
interférence sont fixées sur une phase solide ; 2) après Le recours à des réactifs de substitution tels que le facteur C
élimination de la substance responsable de l’interférence recombinant pour remplacer le lysat d’amoebocytes permet
(par exemple par lavage), la détection des endotoxines peut d’éviter l’utilisation de réactifs extraits d’animaux vivants.
se poursuivre normalement dans les conditions d’essai Le remplacement d’un essai des pyrogènes sur lapin ou
appropriées. d’un essai des endotoxines bactériennes prescrit dans une
10. RÔLE DES TÉMOINS monographie par un essai utilisant le réactif facteur C
recombinant ou un autre réactif à la place du lysat
Le rôle du témoin composé d’eau EEB et de la préparation de d’amoebocytes est à considérer comme un cas de recours
référence d’endotoxine à concentration double de la sensibilité à une méthode alternative pouvant se substituer à un
déclarée du lysat, est de permettre de vérifier l’activité du lysat essai de pharmacopée sous les conditions décrites dans les
au moment et dans les conditions de l’essai (méthodes A et B). Prescriptions générales.
Le rôle du témoin négatif est de permettre de vérifier l’absence
d’endotoxines à concentration détectable dans l’eau EEB.
Le témoin positif qui contient le produit à examiner à la 07/2017:50111
concentration utilisée dans l’essai sert à démontrer l’absence
de facteurs d’inhibition au moment et dans les conditions de
l’essai.
11. LECTURE ET INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS 5.1.11. DÉTERMINATION DE
Il peut arriver que de très faibles quantités d’endotoxines
bactériennes, présentes dans l’eau EEB ou dans tout autre
L’ACTIVITÉ BACTÉRICIDE,
réactif ou matériel auquel le lysat est exposé au cours de FONGICIDE OU LEVURICIDE
l’essai, ne soient pas détectées si elles sont inférieures à la DES MÉDICAMENTS À VISÉE
limite de sensibilité du lysat. Elles peuvent cependant s’ajouter
aux endotoxines présentes dans la solution de la substance ANTISEPTIQUE
ou du produit à examiner de sorte que la quantité totale
Ce chapitre général décrit un essai pouvant être utilisé pour la
d’endotoxines présentes devient juste supérieure à la limite de
détermination de l’activité antimicrobienne des médicaments à
sensibilité et que l’essai donne un résultat positif.
visée antiseptique miscibles à l’eau et destinés à être administrés
Il est possible de réduire ce risque en contrôlant l’eau EEB
par contact direct avec la peau ou les muqueuses. L’étendue
et les autres réactifs et matériels utilisés avec le lysat le plus
de l’essai est fonction de l’activité antimicrobienne déclarée du
sensible dont on dispose, ou tout au moins avec un lysat plus
produit.
sensible que celui utilisé pour l’essai du produit. Même ainsi,
L’essai permet de déterminer si un produit présente une
toutefois, le risque d’obtenir un résultat « faussement positif »
activité bactéricide, fongicide ou levuricide et s’il satisfait à une
n’est pas totalement éliminé. spécification correspondante préétablie.
12. REMPLACEMENT DE MÉTHODES PRESCRITES DANS L’essai ne peut ni remplacer ni confirmer l’évaluation de
LES MONOGRAPHIES l’efficacité clinique du produit.
12-1. REMPLACEMENT PAR UNE AUTRE MÉTHODE 1. PRINCIPE
DÉCRITE DANS LA PH. EUR. L’activité antimicrobienne est déterminée par mise en contact
Comme indiqué dans les Prescriptions générales, les méthodes du produit antiseptique à examiner avec des suspensions de
d’essai figurant dans les monographies et les chapitres microorganismes de référence (bactéries, germes fongiques ou
généraux ont été validées selon la pratique scientifique d’usage levures, séparément), pendant un temps défini égal à 5 min
et les recommandations usuelles sur la validation analytique. pour l’activité bactéricide et 15 min pour l’activité fongicide
Les méthodes décrites dans les chapitres généraux 2.6.14. Essai ou levuricide, en maintenant le mélange à 33 ± 1 °C. Des
des endotoxines bactériennes et 2.6.30. Essai d’activation des temps de contact additionnels peuvent être testés selon l’usage
monocytes ne nécessitent donc pas une revalidation portant déclaré du médicament à visée antiseptique. A la fin du temps
sur la méthode en soi, mais sont à valider au regard de leur de contact, un échantillon du mélange est prélevé et son
utilisation pour une substance ou un produit spécifique, dans activité antimicrobienne est immédiatement stoppée par une
un environnement analytique spécifique. méthode validée. 2 méthodes sont disponibles à cet effet :
La méthode d’essai et les matériels et réactifs utilisés doivent dilution-neutralisation ou filtration sur membrane.
être validés comme décrit pour l’essai concerné. La procédure fait l’objet d’une validation visant à vérifier
Il convient de vérifier l’absence de facteurs d’interférence sa capacité à mettre en évidence la réduction requise du
(et, si nécessaire, le procédé d’élimination employé) sur des nombre de microorganismes viables, au moyen de contrôles
échantillons provenant d’au moins 3 lots de fabrication. appropriés.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 695
5.1.11. Activité bactéricide, fongicide ou levuricide des antiseptiques PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.0

2. MICROORGANISMES DE RÉFÉRENCE ET Souches pour la détermination de l’activité bactéricide

CONDITIONS DE CULTURE
Staphylococcus aureus par exemple ATCC 6538,
Préparez des suspensions standardisées stables des souches de NCIMB 9518, CIP 4.83,
NBRC 13276
référence comme indiqué dans la section 2-1. Les cultures
sont effectuées selon un système de lot de semence tel que les Candida albicans par exemple ATCC 10231,
microorganismes viables utilisés pour l’inoculation n’aient pas NCPF 3179, CIP 48.72, NBRC 1594
subi plus de 5 passages à partir du lot de semence primaire
d’origine. Cultivez séparément chacune des souches de Aspergillus brasiliensis par exemple ATCC 16404,
référence comme indiqué dans le tableau 5.1.11.-1. IMI 149007, CIP 1431.83,
NBRC 9455

Les solutions et milieux recommandés sont décrits dans le Conditions de culture

chapitre général 2.6.13. De l’eau purifiée est utilisée. Tous les
réactifs sont stériles préalablement à leur emploi. Milieu Sabouraud dextrosé-gélosé nombre d’UFC dans la suspension
ou milieu liquide Sabouraud d’essai :
dextrosé 1-5 × 107 UFC/mL
La détermination de l’activité bactéricide, fongicide ou
- pour la préparation des
levuricide est effectuée avec les souches prescrites dans le suspensions d’essai de C. albicans :
tableau 5.1.11.-1. En plus de ces microorganismes, il peut 20-25 °C, 2-3 jours
être nécessaire d’utiliser d’autres souches bactériennes ou - pour la préparation de la
fongiques représentatives de l’indication du médicament à suspension d’essai de spores
visée antiseptique considéré. d’A. brasiliensis : 20-25 °C, au
moins 5 jours (jusqu’à sporulation
satisfaisante)
L’essai est effectué séparément pour chaque souche. Les - pour l’essai du produit
dénombrements sont effectués en double et la moyenne et la validation de l’essai :
arithmétique des résultats est calculée et exprimée en UFC/mL. 20-25 °C, ≤ 5 jours pour C. albicans
et A. brasiliensis

Tableau 5.1.11.-1. – Microorganismes de référence et conditions 2-1. PRÉPARATION DE LA SUSPENSION D’ESSAI

de culture
Pour récolter les microorganismes, utilisez un volume suffisant
d’une solution contenant 9 g/L de chlorure de sodium R (pour
Souches pour la détermination de l’activité bactéricide les bactéries et pour C. albicans) ou 9 g/L de chlorure de
sodium R et 0,5 g/L de polysorbate 80 R (pour A. brasiliensis)
Staphylococcus aureus par exemple ATCC 6538,
NCIMB 9518, CIP 4.83, de façon à obtenir une suspension d’essai contenant le nombre
NBRC 13276 d’UFC indiqué dans le tableau 5.1.11.-1. Utilisez la suspension
dans les 2 h ou dans les 24 h si elle est conservée à 2-8 °C.
Enterococcus hirae par exemple ATCC 10541,
NCIMB 8192, CIP 58.55, DSM 3320 2-2. PRÉPARATION DE LA SOLUTION DU PRODUIT
ANTISEPTIQUE À EXAMINER
Escherichia coli par exemple NCIMB 10083, La concentration de la solution du produit antiseptique à
CIP 54.117, NCTC 10538,
DSM 11250 examiner doit, si possible, être égale à 1,25 fois la concentration
de la solution soumise à l’essai, car elle est diluée à 80 pour
Pseudomonas aeruginosa par exemple ATCC 15442, cent dans le cadre des essais et de la validation de la méthode.
NCIMB 8626, CIP 103467,
NBRC 13275 2-3. AGENTS NEUTRALISANTS
Des agents neutralisants sont utilisés pour neutraliser l’activité
Conditions de culture antimicrobienne du produit antiseptique. Le tableau 2.6.12.-2.
du chapitre général 2.6.12. Contrôle microbiologique des
Milieu gélosé aux peptones de nombre d’UFC dans la suspension
caséine et de soja ou milieu liquide d’essai :
produits non stériles : essais de dénombrement microbien
aux peptones de caséine et de soja 1-5 × 108 UFC/mL
donne une liste des agents neutralisants usuels. Le temps de
– pour la préparation des souches neutralisation n’est pas inférieur à 10 s ni supérieur à 60 s.
de référence : 30-35 °C, 18-24 h, au
moins 2 repiquages
– pour l’essai du produit
et la validation de l’essai : 3. MODE OPÉRATOIRE
30-35 °C, ≤ 3 jours

Souche pour la détermination de l’activité levuricide

Avant de procéder à l’essai, équilibrez la température de tous
les réactifs à 33 ± 1 °C.
Candida albicans par exemple ATCC 10231, 3-1. MÉTHODE DE DILUTION-NEUTRALISATION
NCPF 3179, CIP 48.72, NBRC 1594
Transférez 1,0 mL d’une solution d’albumine bovine R à
Conditions de culture 3 g/L dans un tube. Ajoutez 1,0 mL de la suspension d’essai.
Placez le tube à 33 ± 1 °C pendant 2 min, puis ajoutez
Milieu Sabouraud dextrosé-gélosé nombre d’UFC dans la suspension 8,0 mL de la solution du produit antiseptique à examiner et
ou milieu liquide Sabouraud d’essai : maintenez à 33 ± 1 °C pendant le temps de contact choisi.
dextrosé 1-5 × 107 UFC/mL Prélevez un échantillon de 1,0 mL du mélange et transférez-le
– pour la préparation des souches
de référence : 20-25 °C, 2-3 jours, dans un tube contenant 1,0 mL d’eau R et 8,0 mL d’agent
au moins 2 repiquages neutralisant. Maintenez le tube à 33 ± 1 °C pendant le temps
– pour l’essai du produit de neutralisation approprié, puis prélevez en double 1,0 mL du
et la validation de l’essai : mélange neutralisé et inoculez sur plaque par ensemencement
20-25 °C, ≤ 5 jours en profondeur ou par étalement en surface. Incubez dans les
conditions spécifiées dans le tableau 5.1.11.-1, puis procédez
Souches pour la détermination de l’activité fongicide
au dénombrement.

696 Voir la section d’information sur les monographies générales (pages de garde)
PHARMACOPÉE EUROPÉENNE 10.0 5.1.11. Activité bactéricide, fongicide ou levuricide des antiseptiques

3-1-1. Conformité de l’essai/contrôles de rétention des microorganismes ne soit pas affectée par
Pour chaque méthode, préparez une suspension de validation les constituants de l’échantillon à examiner. Une membrane
contenant 100-1000 UFC du microorganisme de référence filtrante unique est utilisée pour chacun des microorganismes
par millilitre. cités. Prélevez 0,1 mL de solution à examiner, préparez une
3-1-1-1. Contrôle des conditions expérimentales dilution appropriée et filtrez immédiatement la totalité du
volume, puis rincez la membrane filtrante avec un volume
Transférez 1,0 mL d’une solution d’albumine bovine R à 3 g/L approprié de diluant. Effectuez l’essai en double. Incubez
dans un tube. Ajoutez 1,0 mL de la suspension de validation. dans les conditions spécifiées dans le tableau 5.1.11.-1, puis
Placez le tube à 33 ± 1 °C pendant 2 min, puis ajoutez 8,0 mL procédez au dénombrement.
d’eau R et maintenez à 33 ± 1 °C pendant le temps de contact
choisi. Prélevez en double 1,0 mL du mélange et inoculez sur 3-2-1. Vérification des conditions expérimentales choisies
plaque par ensemencement en profondeur ou par étalement en et de la méthode de filtration sur membrane
surface. Incubez dans les conditions spécifiées dans le tableau 3-2-1-1. Contrôle des conditions expérimentales
5.1.11.-1, puis procédez au dénombrement. Le nombre d’UFC
obtenu après l’incubation n’est pas inférieur à 0,5 × (nombre Procédez comme décrit dans la section 3-1-1-1 mais, à la
d’UFC dans la suspension de validation)/10. fin du temps de contact, prélevez un échantillon en double
3-1-1-2. Contrôle de l’agent neutralisant et transférez dans des appareils de filtration sur membrane
séparés. Filtrez immédiatement et transférez chacune des
Transférez 1,0 mL d’une solution d’albumine bovine R à 3 g/L
membranes filtrantes sur une plaque séparée. Incubez dans
dans un tube. Ajoutez 1,0 mL de la suspension de validation et
les conditions indiquées dans le tableau 5.1.11.-1, puis
8,0 mL de l’agent neutralisant utilisé pour l’essai, et maintenez
procédez au dénombrement. Le nombre d’UFC obtenu après
à 33 ± 1 °C pendant le temps de neutralisation approprié.
l’incubation n’est pas inférieur à 0,5 × (nombre d’UFC dans la
Prélevez en double 1,0 mL du mélange et inoculez sur
suspension de validation)/10.
plaque par ensemencement en profondeur ou par étalement
en surface. Incubez dans les conditions spécifiées dans 3-2-1-2. Contrôle de la procédure de filtration sur membrane
le tableau 5.1.11.-1, puis procédez au dénombrement. Le
nombre d’UFC obtenu après l’incubation n’est pas inférieur à Procédez comme décrit dans la section 3-1-1-3 mais, à la
0,5 × (nombre d’UFC dans la suspension de validation)/10. fin du temps de contact, prélevez un échantillon en double
et transférez dans des appareils de filtration sur membrane
3-1-1-3. Contrôle de la procédure de dilution-neutralisation séparés. Filtrez en rinçant comme décrit dans la section 3-2,
Transférez 1,0 mL d’une solution d’albumine bovine R à 3 g/L puis couvrez les membranes avec le liquide de rinçage et
dans un tube. Ajoutez 1,0 mL d’une solution de chlorure ajoutez un échantillon de la suspension de validation. Filtrez à
de sodium R à 9 g/L et 8,0 mL de la solution du produit nouveau et transférez chacune des membranes filtrantes sur
antiseptique à examiner. Maintenez à 33 ± 1 °C pendant le une plaque séparée. Incubez dans les conditions indiquées
temps de contact choisi. Prélevez un échantillon de 1,0 mL dans le tableau 5.1.11.-1, puis procédez au dénombrement. Le
du mélange et transférez-le dans un tube contenant 8,0 mL nombre d’UFC obtenu après l’incubation n’est pas inférieur à
d’agent neutralisant. Maintenez à 33 ± 1 °C pendant le temps 0,5 × (nombre d’UFC dans la suspension de validation)/10.
de neutralisation approprié. Ajoutez 1,0 mL de la suspension
de validation et mélangez. Après 30 min, prélevez en double
1,0 mL du mélange et inoculez sur plaque par ensemencement 4. CRITÈRES D’ACCEPTATION
en profondeur ou étalement en surface. Incubez dans les Sauf exception justifiée et autorisée, la préparation possède :
conditions spécifiées dans le tableau 5.1.11.-1, puis procédez au
dénombrement. Le nombre d’UFC obtenu après l’incubation – une activité bactéricide si elle entraîne une réduction
n’est pas inférieur à 0,5 × (nombre d’UFC dans la suspension d’au moins 5 log10 du nombre des UFC contenues dans la
de validation)/10. suspension,
3-2. FILTRATION SUR MEMBRANE – une activité fongicide si elle entraîne une réduction d’au
Opérez comme décrit dans la section 3-1, en procédant moins 4 log10 du nombre des UFC contenues dans la
immédiatement à la filtration au lieu de la neutralisation. suspension,
Utilisez des membranes filtrantes de porosité nominale – une activité levuricide si elle entraîne une réduction d’au
inférieure ou égale à 0,45 μm. Le matériau constituant les moins 4 log10 du nombre des UFC contenues dans la
membranes filtrantes est choisi de telle sorte que l’efficacité suspension.

Les Prescriptions Générales (1) s’appliquent à toutes les monographies et autres textes 697