See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/279892924

Validation of analytical methods - Strategies & importance

Article  in  International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences · July 2010

CITATIONS READS
70 4,645

4 authors:

Ravichandran Veerasamy Shalini Sivadasan

Asian Institute of Medicine, Science and Technology KMCH College of Pharmacy
152 PUBLICATIONS   2,824 CITATIONS    41 PUBLICATIONS   603 CITATIONS   

SEE PROFILE SEE PROFILE

Sundram Karupiah Harish Rajak

Asian Institute of Medicine, Science and Technology Guru Ghasidas University
25 PUBLICATIONS   894 CITATIONS    112 PUBLICATIONS   1,481 CITATIONS   

SEE PROFILE SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Exploring quantitative structure activity relationship of some anti-HIV agents (AIMST University Research Grant, 2013, Principal investigator, Completed) (RM. 10,000) View
project

method development and validation View project

All content following this page was uploaded by Sundram Karupiah on 31 March 2019.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences
ISSN- 0975-1491 Vol 2, Suppl 3, 2010
 
Review Article 
VALIDATION OF ANALYTICAL METHODS – STRATEGIES & IMPORTANCE 
 
RAVICHANDRAN V, 1 SHALINI S,1 SUNDRAM K. M.1 AND  HARISH RAJAK2 
1Faculty of Pharmacy, AIMST University, Semeling – 08100, Kedah, Malaysia. 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Guru Ghasidas 
University, Bilaspur­495009, India. Email: Phravi75@rediffmail.com 
Received: Received: 15 April 2010, Revised and Accepted: 03 May 2010 
ABSTRACT 
Validation  is  an  act  of  proving  that  any  procedure,  process,  equipment,  material,  activity  or  system  performs  as  expected  under  given  set  of 
conditions and also give the required accuracy, precision, sensitivity, ruggedness, etc. When extended to an analytical procedure, depending upon 
the application, it means that a method works reproducibly, when carried out by same or different persons, in same or different laboratories, using 
different  reagents,  different  equipments,  etc.  In  this  review  article  we  discussed  about  the  strategy  and  importance  of  validation  of  analytical 
methods.  
Keywords: Validation; Analysis; Accuracy; Precision 
 
INTRODUCTION  ‘Conference  Report  of  the  Washington  conference  on  analytical 
methods  validation:  bioavailability,  bioequivalence  and 
Analytical chemistry, which is both theoretical and practical science,  pharmacokinetic  studies  held  in  1990  (sponsored  by  the  American 
is practical in a large number of laboratories in many diverse ways.  Association of Pharmaceutical Scientists, the AOAC and the US FDA, 
The  analytical  procedure  refers  to  the  way  of  performing  the  among others).3 The report gives guiding principles for validation of 
analysis.  Analytical  method  validation  is  required  for  herbal  studies in both human and animal subjects that may be referred  to 
procedure,  new  process  and  reaction,  new  molecules,  active  in  developing  future  formal  guidelines.  Hokanson  applied  the  life 
ingredients,  residues,  impurity  profiling  and  component  of  interest  cycle  approach,  developed  for  computerized  systems,  to  the 
in  different  matrices.  An  analytical  methodology  consists  of  the  validation and revalidation of methods.4,5  
techniques,  method,  procedure  and  protocol.  This  methodology 
includes  the  required  data  for  a  given  analytical  problem,  required  Green gave a practical guide for analytical method validation with a 
sensitivity,  required  accuracy,  required  range  of  analysis  and  description of a set of minimum requirements for a method. 6 Renger 
required precision to the analyst. It is required for assuring  quality,  and  his  colleagues  described  the  validation  of  a  specific  analytical 
achieving  acceptance  of  products  by  the  international  agencies,  procedure  for  the  analysis  of  theophylline  in  a  tablet  using  high 
mandatory requirement purposes for accreditation as per ISO 17025  performance  thin  layer  chromatography  (HPTLC). 7  The  validation 
guidelines,  mandatory  requirement  for  registration  of  any  procedure  in  that  article  is  based  on  requirements  for  European 
pharmaceutical product or pesticide formulation. The main objective  Union  multistate  registration.  Wegscheider  has  published 
is  to  demonstrate  that  the  procedure  is  suitable  for  its  intended  procedures for  method validation  with  special focus  on  calibration, 
purpose.   recovery  experiments,  method  comparison  and  investigation  of 
ruggedness.8  
The  word  validation  was  not  mentioned  in  the  current  Good 
Manufacturing  Practices  (cGMP’s)  of  1971,  and  precision  and  The  Association  of  Official  Analytical  Chemists  (AOAC)   has 
accuracy were stated as laboratory controls. The need for validation  developed a Peer‐Verified Methods validation program with detailed 
was implied only in the cGMP guideline of March 1979. It was done  guidelines  on  what  parameters  should  be  validated. 9  This  article 
in  two  sections:  (1)  Section  211.165,  where  the  word  ‘validation’  gives a review and a strategy for the validation of analytical methods 
was used and (2) section 211.194, in which the proof of suitability,  for  both  in‐house  developed  as  well  as  standard  methods  and  a 
accuracy  and  reliability  was  made  compulsory  for  regulatory  recommendation  on  the  documentation  that  should  be  produced 
submissions.   during and at the end of method validation. 
The World Health Organization (WHO) published a guideline under  Types of analytical procedures to be validated 
the title, ‘Validation of analytical procedures used in the examination 
of  pharmaceutical  materials’.  It  appeared  in  the  32nd  report  of  the  Discussion  of  the  validation  of  analytical  procedures  is  directed  to 
WHO  expert  committee  on  ‘specifications  for  pharmaceutical  the four most common types of analytical procedures: 
preparations’ which was published in 1992.  
1. Identification tests 
The  International  Conference  on  Harmonization  (ICH),  which  has 
2. Quantitative tests for impurities content 
been  on  the  forefront  of  developing  the  harmonized  tripartite 
guidelines  for  adoption  in  the  US,  Japan  and  EC,  has  issued  two  3. Limit tests for the control of impurities 
guidelines  under  the  titles‐‘Text  on  validation  of  Analytical 
procedures  (Q2A)  and  validation  of  Analytical  procedure  4. Quantitative  tests  of  the  active  moiety  in  samples  of  drug 
Methodology (Q2B)’.   substance  or  drug  product  or  other  selected  component(s)  in 
the drug product 
Among  the  pharmacopoeias,  USP  XXII  1225  (1995)  has  a  section 
which  describes requirements  of  validation of compendia methods.  Identification tests are intended to ensure the identity of an  analyte 
The  British  Pharmacopoeia  includes  the  definition  of  method  in a sample. This is normally achieved by comparison of a property 
validation in latest editions, but the term is completely missing from  of  the  sample  (e.g.,  spectrum,  chromatographic  behavior,  chemical 
the Indian Pharmacopoeia (1996).   reactivity, etc) to that of a reference standard. Testing for impurities 
can be either a quantitative test or a limit test for the impurity in a 
The  United  States  Environmental  Protection  Agency  (US  EPA)  sample.  Either  test  is  intended  to  accurately  reflect  the  purity 
prepared  a  guidance  for  methods  development  and  validation  for  characteristics of the sample. Different validation characteristics are 
the  Resource  Conservation  and  Recovery  Act  (RCRA). 1  The  required  for  a  quantitative  test  than  for  a  limit  test.  Assay 
pharmaceutical  industry  uses  methodology  published  in  the  procedures  are  intended  to  measure  the  analyte  present  in  a  given 
literature.2 The most comprehensive document was published as the  sample. In the perspective of this document, the assay represents a 
  Ravichandran et al. 
Int J Pharmacy and Pharm Sci, Vol 2, Issue 3, 18­22 

quantitative  measurement  of  the  major  component(s)  in  the  drug  Instruments  performance  should  be  verified  using  generic 
substance.  For  the  drug  product,  similar  validation  characteristics  standards,  before  an  instrument  is  used  to  validate  a  method. 11,12 
also  apply  when  assaying  for  the  active  or  other  selected  These  studies  should  include  the  approximate  precision,  working 
component(s). The same validation characteristics may also apply to  range and detection limits. If the preliminary validation data appear 
assays associated with other analytical procedures.  to be inappropriate, either the method itself or the equipment or the 
analysis  technique  or  the  acceptance  limits  should  be  changed.  In 
The various validation parameters are:   this way method development and validation is an iterative process. 
¾ Accuracy  For  example,  in  liquid  chromatography  selectivity  is  achieved 
through  selection  of  mobile  phase  composition.  For  quantitative 
¾ Precision (repeatability and reproducibility)   measurements  the  resolution  factor  between  two  peaks  should  be 
2.5  or  higher.  If  this  value  is  not  achieved,  the  mobile  phase 
¾ Linearity and range  
composition  needs  further  optimization.  There  are  no  official 
¾ Limit of detection (LOD)/ limit of quantitation (LOQ)   guidelines  on  the  sequence  of  validation  experiments  and  the 
optimal sequence can depend on the method itself.  
¾ Selectivity/ specificity  
Validation of standard methods 
¾ Robustness/ ruggedness  
A  laboratory  applying  a  specific  method  should  ensure  that  they 
¾ Stability and system suitability studies  have documentary evidence that the method has been appropriately 
Advantages of analytical method validation  validated.  “The  responsibility  is  with  the  user  to  ensure  that  the 
validation  documented  in  the  method  is  sufficiently  complete  to 
The  biggest  advantage  of  analytical  method  validation  is  that  it  meet  his  or  her  needs”.13  When  standard  methods  are  used,  their 
builds a degree of confidence, not only for the developer but also to  scope  should  be  in  line  with  the  scope  of  the  laboratories,  method 
the  user.  Although  the  validation  exercise  may  appear  costly  and  requirements  and  the  suitability  of  the  entire  analytical  system  in 
time  consuming,  it  results  inexpensive,  eliminates  frustrating  the  specific  laboratory‘s  environment  should  be  verified  for  the 
repetitions and leads to better time management in the end.   method.  The  laboratory  should  demonstrate  the  validity  of  the 
method  in  the  laboratories  environment.  Full  validation  of  a 
Minor  changes  in  the  conditions  such  as  reagent  supplier  or  grade, 
standard  method  is  recommended  where  no  information  on  type 
analytical  setup  are  unavoidable  due  to  obvious  reasons  but  the 
and  results  of  validation  can  be  found  in  the  standard  method 
method validation absorbs the shock of such conditions and pays for 
documentation.  
more than invested on the process.  
Revalidation 
Strategy for validation of methods 
A revalidation is  necessary  whenever  a method  is  changed  and the 
The  validity  of  a  specific  method  should  be  demonstrated  in 
new  parameter  is  outside  the  operating  range.  Operating  ranges 
laboratory experiments using samples or standards that are similar 
should be clearly defined for each method based on experience with 
to  the  unknown  samples  analyzed  in  the  routine.  The  preparation 
similar  methods,  or  they  should  be  investigated  during  method 
and  execution  should  follow  a  validation  protocol,  preferably 
developments.  These  ranges  should  be  verified  during  method 
written  in  a  step  by  step  instruction  format.  Possible  steps  for  a 
validation  in  robustness  studies  and  should  be  part  of  the  method 
complete method validation are listed below.  
characteristics. Availability of such operating ranges makes it easier 
Steps in method validation  to decide when a method should be revalidated.  If, for example, the 
operating range of the column temperature has been specified to be 
1. Develop  a  validation  protocol  or  operating  procedure  for  the       between  35  and  40°C,  if,  for  whatever  reason,  the  new  operating 
validation   parameter has been selected as 42°C, and then the method should be 
2. Define the application, purpose and scope of the method   revalidated.  Revalidation  is  also  required  if  the  sample  matrix 
3. Define the performance parameters and acceptance criteria   changes and if the instrument type changes.  
4. Define validation experiments  
5. Verify relevant performance characteristics of equipment   Key parameters of the analytical method validation 
6. Qualify materials, e.g. standards and reagents  
7. Perform pre‐validation experiments   It  is  important  for  one  to  understand  the  parameters  or 
8. Adjust  method  parameters  or/and  acceptance  criteria  if  characteristics  involved  in  the  validation  process.  The  various 
necessary   performance  parameters,  which  are  addressed  in  a  validation 
9. Perform full internal (and external) validation experiments   exercise, are grouped as follows.  
10. Develop  SOPs  (standard  operating  procedures)  for  executing  Accuracy 
the method in the routine  
11. Define criteria for revalidation   The  accuracy  of  an  analytical  method  may  be  defined  as  the 
12. Define  type  and  frequency  of  system  suitability  tests  and/or  closeness  of  the  test  results  obtained  by  the  method  to  the  true 
analytical quality control (AQC) checks for the routine   value.  It  is  the  measure  of  the  exactness  of  the  analytical  method 
13. Document  validation  experiments  and  results  in  the  developed. The accuracy of an analytical method may be determined 
validation.      by any of the following ways:  
First  the  scope  of  the  method  and  its  validation  criteria  should  be  • Analysing a sample of known concentration and comparing the 
defined.  These  include:  compounds,  matrices,  type  of  information,  measured  value  to  the  ‘true’  value.  However,  a  well 
qualitative  or  quantitative,  detection  and  quantitation  limits,  linear  characterized sample (e.g., reference standard) must be used.  
range, precision and accuracy, type of equipment and location.  The 
scope of the method should include the different types of equipment  • Spiked  –  placebo  (product  matrix)  recovery  method.  In  this 
and  the  locations  where  the  method  will  be  run.  The  method’s  method, a known amount of pure active constituent is added to 
performance characteristics should be based on the intended use of  formulation  blank  [sample  that  contains  all  other  ingredients 
the method. For example, if the method will be used for qualitative  except the active(s)], the resulting mixture is assayed, and the 
trace  level  analysis,  there  is  no  need  to  test  and  validate  the  results obtained are compared with the expected result.  
method’s  linearity  over  the  full  dynamic  range  of  the  equipment. 
• Standard addition method. In this method, a sample is assayed, 
Initial  parameters  should  be  chosen  according  to  the  analyst’s  best 
a  known  amount  of  pure  active  constituent  is  added,  and  the 
judgment.  Finally,  parameters  should  be  agreed  between  the  lab 
sample is again assayed. The difference between the results of 
generating the data and the client using the data.10  
the two assays is compared with the expected answer.  

19 
  Ravichandran et al. 
Int J Pharmacy and Pharm Sci, Vol 2, Issue 3, 18­22 

In both methods  (spiked –  placebo recovery  and standard  addition  Range 

method),  recovery  is  defined  as  the  ratio  of  the  observed  result  to 
the expected result expressed as a percentage.   The range of an analytical method is the interval between the upper 
and  lower  levels  of  the  analyte  (including  these  levels)  that  have 
The  accuracy  of  a  method  may  vary  across  the  range  of  possible  been  demonstrated  to  be  determined  with  precision,  accuracy  and 
assay values and  therefore must be determined at  several  different  linearity using the method as written.  
fortification  levels.  The  accuracy  should  cover  at  least  3 
concentrations (80, 100 and 120%) in the expected range.   The following minimum specified ranges should be considered.  

Accuracy  may  also  be  determined  by  comparing  test  results  with  • For  the  assay  of  an  active  substance  or  a  finished  product: 
those  obtained  using  another  validated  test  method.  Dosage  form  normally from 80 to 120 percent of the test concentration;  
assays  commonly  provide  accuracy  within  3‐5%  of  the  true  value.  • For  content  uniformity,  covering  a  minimum  of  70  to  130 
The  ICH  documents  recommend  that  accuracy  should  be  assessed  percent  of  the  test  concentration,  unless  a  wider,  more 
using  a  minimum  of  nine  determinations  over  a  minimum  of  three  appropriate range, based on the nature of the dosage form (e.g., 
concentration  levels,  covering  the  specified  range  (i.e.  three  metered dose inhalers), is justified;  
concentrations  and  three  replicated  determination  for  each 
concentration).14   • For  dissolution testing:  ± 20 percent  over  the specified  range; 
e.g., if the specifications for a controlled released product cover 
Precision   a  region  from  20%,  after  1  h,  up  to  90%,  after  24  h,  the 
The  precision  of  an  analytical  method  is  the  degree  of  agreement  validated range would be 0‐110% of the label claim.  
among individual test results when the method is applied repeatedly 
• For the determination of an impurity: from the reporting level 
to  multiple  samplings  of  homogenous  samples.  This  is  usually 
of  an  impurity  to  120%  of  the  specification;  for  impurities 
expressed  as  the  standard  deviation  or  the  relative  standard 
known  to  be  unusually  potent  or  to  produce  toxic  or 
deviation  (coefficient  of  variation).  Precision  is  a  measure  of  the 
unexpected pharmacological effects, the detection/quantitation 
degree  of  reproducibility  or  of  the  repeatability  of  the  analytical 
limit  should  be  commensurate  with  the  level  at  which  the 
method under normal operating circumstances.  
impurities must be controlled.  
Repeatability involves analysis of replicates by the analyst using the 
• If assay and purity are performed together as one test and only 
same  equipment  and  method  and  conducting  the  precision  study 
a 100% standard is used, linearity should cover the range from 
over  short  period  of  time  while  reproducibility  involves  precision 
the reporting level of the impurities to 120 percent of the assay 
study  at  different  occasions,  different  laboratories  and  different 
specification.  
batch of reagent, different analysts and different equipments.  
Limit of detection and limit of quantitation  
Determination of repeatability 
Limit of detection 
It is normally expected that at least six replicates be carried out and 
a  table  showing  each  individual  result  provided  from  which  the  The  limit  of  detection  (LOD)  of  an  analytical  procedure  is  the  lowest 
mean,  standard  deviation  and  co‐efficient  of  variation  should  be  amount  of  an  analyte  in  a  sample  that  can  be  detected,  but  not 
calculated  for  set  of  n  value.  The  RSD  values  are  important  for  necessarily  quantitated.  It  is  a  limit  that  specifies  whether  or  not  an 
showing degree of variation expected when the analytical procedure  analyte  is  above  or  below  certain  value.  The  LOD  of  detection  of 
is repeated several time in a standard situation. (RSD below 1% for  instrumental  procedures  is  carried  out  by  determining  the  signal‐to‐
built drugs, RSD below 2% for assays in finished product). The  ICH  noise  ratio  by  comparing  test  results  from  the  samples  with  known 
documents recommend that repeatability should be assessed using a  concentration of analyte with those of blank samples and establishing 
minimum  of  nine  determinations  covering  the  specified  range  for  the  minimum  level  at  which  the  analyte  can  be  reliably  detected.  A 
the procedure (i.e. three concentrations and three replicates of each  signal‐to‐noise ratio of 2:1 or 3:1 is generally accepted. The  signal‐to‐
concentration or using a minimum of six determinations at 100% of  noise ratio is determined by dividing the base peak by the standard 
the test concentration).   deviation of all data points below a set threshold. Limit of detection 
is  calculated  by  taking  the  concentration  of  the  peak  of  interest 
Determination of reproducibility 
divided  by  three  times  the  signal‐to‐noise  ratio.  For  spectroscopic 
 Reproducibility  means  the  precision  of  the  procedure  when  it  is  techniques  or  other  methods  that  rely  upon  a  calibration  curve  for 
carried  out  under  different  conditions‐usually  in  different  quantitative  measurements,  the  IUPAC  approach  employs  the 
laboratories‐on  separate,  putatively  identical  samples  taken  from  standard deviation of the intercept (Sa) which may be related to LOD 
the  same  homogenous  batch  of  material.  Comparisons  of  results  and  the  slope  of  the  calibration  curve,  b,  by  LOD  =  3  S a  /  b.  The 
obtained by different analysts, by the use of different equipments, or  method  used  to  determine  LOD  should  be  documented  and 
by  carrying  out  the  analysis  at  different  times  can  also  provide  supported,  and  an  appropriate  number  of  samples  should  be 
valuable information.15,16   analysed at the time to validate the level.  

Linearity   Limit of quantitation 

The linearity of an analytical method is its ability to elicit test results  Limit of quantitation (LOQ) is a parameter of quantitative assays for 
that are directly (or by a well defined mathematical transformation)  low  levels  of  compounds  in  sample  matrices  such  as  impurities  in 
proportional to the analyte concentration in samples within a given  bulk  drugs  and  degradation  products  in  finished  pharmaceuticals. 
range. Linearity usually expres  sed  in  terms  of  the  variance  around  The limit of quantitation is the lowest concentration of analyte in a 
the  slope  of  regression  line  calculated  according  to  an  established  sample  that  can  be  determined  with  acceptable  accuracy  and 
mathematical relationship from test results obtained by the analysis  precision  under  the  stated  operational  conditions  of  the  method. 
of samples with varying concentrations of analyte. The linear range  Like LOD, LOQ is expressed as concentration, with the precision and 
of detectability that obeys Beer’s law is dependent on the compound  accuracy of the measurement also reported. Sometimes a signal‐to‐
analyzed and the detector used. The working sample concentration  noise ratio of 10 to 1 is used to determine LOQ.  
and  samples  tested  for  accuracy  should  be  in  the  linear  range.  The 
It is measured by analyzing samples containing known quantities of 
claim  that  the  method  is  linear  is  to  be  justified  with  additional 
the  analyte  and  determining  the  lowest  level  at  which  acceptable 
mention of zero intercept by processing data by linear least square 
degrees  of  accuracy  and  precision  are  attainable.  Where,  the  final 
regression.  Data  is  processed  by  linear  least  square  regression 
assessment  is  based  on  an  instrumental  reading,  the  magnitude  of 
declaring the regression co‐efficient and b of the linear equation 
background  response  by  analyzing  a  number  of  blank  samples  and 
y = ax + b together with the correlation coefficient of determination 
calculating  the  standard  deviation  of  this  response.  The  standard 
r. For the method to be linear the r value should be close to ±1.  
deviation multiplied by a factor (usually 10) provides an estimate of 

20 
  Ravichandran et al. 
Int J Pharmacy and Pharm Sci, Vol 2, Issue 3, 18­22 

the  limit  of  quantitation.  In  many  cases,  the  limit  of  quantitation  is  environmental  conditions  that  may  differ  but  are  still  within  the 
approximately twice the limit of detection.   specified  parameters  of  the  assay.  The  testing  of  ruggedness  is 
normally suggested when the method is to be used in more than one 
Selectivity and specificity  laboratory.  Ruggedness  is  normally  expressed  as  the  lack  of  the 
Selectivity of a method refers to the extent to which it can determine  influence  on  the  test  results  of  operational  and  environmental 
particular  analyte(s)  in  a  complex  mixture  without  interference  variables of the analytical method.  
from  other  components  in  the  mixture.  The  terms  selectivity  and  For  the  determination  of  ruggedness,  the  degree  of  reproducibility 
specificity  have  often  been  used  interchangeably.  The  term  specific  of  test  result  is  determined  as  function  of  the  assay  variable.  This 
generally  refers  to  a  method  that  produces  a  response  for  a  single  reproducibility may be compared to the precision of the assay under 
analyte  only,  while  the  term  selective  refers  to  a  method  that  normal  condition  to  obtain  a  measure  of  the  ruggedness  of  the 
provides  responses  for  a  number  of  chemical  entities  that  may  or  analytical method.14  
may  not  be  distinguished  from  each  other.  If  the  response  is 
distinguished  from  all  other  responses,  the  method  is  said  to  be  Table 1: Characteristic that should be considered for different 
selective.  Since  very  few  analytical  methods  respond  to  only  one  types of analytical procedure 
analyte,  the  use  of  the  term  selectivity  is  more  appropriate  than 
specificity.  The  International  Union  of  Pure  and  Applied  Chemistry  Class B 
(IUPAC) have expressed the view that “Specificity is the ultimate of  Parameters  Class A  Quantitative  Limit  Class C  Class D 
Selectivity’.  The  IUPAC  discourages  use  of  the  term  specificity  and 
instead encourages the use of the term selectivity.   tests  tests 

The  selectivity  of  the  analytical  method  must  be  demonstrated  by  Accuracy  ‐  Yes  ‐  Yes  Yes 
providing data to show the absence of interference peaks with regard  Precision Yes Yes ‐  Yes Yes
to  degradation  products,  synthetic  impurities  and  the  matrix 
(excipients present in the formulated product at their expected levels).   Robustness Yes Yes Yes  Yes Yes
The  selectivity  of  chromatographic  methods  may  be  assessed  by  Linearity Yes Yes ‐  Yes Yes
examination  of  peak  homogeneity  or  peak  purity  test  (e.g.,  diode 
array,  mass  spectrometry)  to  show  that  the  analyte  Range  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐ 
chromatographic  peak  is  not  attributable  to  more  than  one  Selectivity  Yes  Yes  Yes  Yes  Yes 
component.10,17‐19  
Limit of  ‐  Yes  Yes  ‐  ‐ 
It is not always possible to demonstrate that an analytical procedure  Detection 
is specific for a particular analyte (complete discrimination). In this 
case,  a  combination  of  two  or  more  analytical  procedures  is  Limit of  ‐ Yes ‐  ‐ ‐
recommended to achieve the necessary level of discrimination.   Quantitation
Identification: To ensure the identity of an analyte.  Analytical methods may be broadly classified as Per USP as follows:  
Purity Tests: To ensure that all the analytical procedures performed  Category I: Analytical methods for quantitation of major components 
allow  an  accurate  statement  of  the  content  of  impurities  of  an 
of  bulk  drug  substances  or  active  ingredients  including 
analyte,  i.e.  related  substances  test,  heavy  metals,  residual  solvents 
preservatives in finished pharmaceutical products.  
content, etc. 
Category  II:  Analytical  methods  for  determination  of  impurities  in 
Assay (content or potency): To provide an exact result which allows 
an accurate statement on the content or potency of the analyte  in a  bulk  drugs  or  for  determination  of  degradation  compounds  in 
sample.  finished pharmaceutical products.  

Robustness and ruggedness  Category  III:  Analytical  methods  for  determination  of  performance 

characteristics (e.g. dissolution, drug release).  
Robustness 
Category IV: Identification tests.  
 The robustness of an analytical method is a measure of its capacity 
to  remain  unaffected  by  small  but  deliberate  variation  in  method  Stability and system suitability tests 
parameters  and  provides  an  indication  of  its  reliability  during 
Stability  of  the  sample,  standard  and  reagents  is  required  for  a 
normal  usage.  The  robustness  of  a  method  is  evaluated  by  varying 
reasonable  time  to  generate  reproducible  and  reliable  results.  For 
method  parameters  such  as  percent  organic  solvent,  pH,  ionic 
example,  24  h  stability  is  desired  for  solutions  and  reagents  that 
strength,  temperature  and  determine  the  effect  (if  any)  on  the 
need to be prepared for each analysis.  
results  of  the  method.  The  evaluation  of  robustness  should  be 
considered during the development phase and depends on the type  System suitability test provide the added assurance that on a specific 
of procedure under study.   occasion the  method is giving, accurate and precise results.  System 
If  measurements  are  susceptible  to  variations  in  analytical  suitability test are run every time a method is used either before or 
conditions, the analytical conditions should be suitably controlled or  during  analysis.  The  results  of  each  system  suitability  test  are 
a precautionary statement should be included in the procedure. One  compared  with  defined  acceptance  criteria  and  if  they  pass,  the 
consequence of the evaluation of robustness should be that a series  method  is  deemed  satisfactory  on  that  occasion.  The  nature  of  the 
of system suitability parameters (e.g., resolution test) is established  test  and  the  acceptance  criteria  will  be  based  upon  data  generated 
to ensure that the validity of the analytical procedure is maintained  during  method  development  optimization  and  validation 
whenever used.   experiments.  

Examples  of  typical  variations  are  stability  of  analytical  solutions  Documentation  of  system  suitability  can  be  accomplished  by  using 
and extraction time   software  specifically  designed  for  the  task  to  provide  a  review  of 
method  development  and  to  summarize  the  data  regarding 
Ruggedness  reproducibility.18 
The  ruggedness  of  an  analytical  method  is  the  degree  of  Validation characteristics and requirements  
reproducibility  of  test  results  obtained  by  the  analysis  of  the  same 
samples under a variety of normal test  conditions such as different  There  are  various  analytical  methods  used  for  the  examination  of 
laboratories,  different  analysts,  using  operational  and  pharmaceutical materials. Not all the characteristics referred  above 

21 
  Ravichandran et al. 
Int J Pharmacy and Pharm Sci, Vol 2, Issue 3, 18­22 

will  need  to  be  considered  in  all  cases.  Analytical  methods  may  be  Class C: Methods used to determine quantitatively the concentration 
broadly classified as Per WHO as follows:   of  a  bulk  drug  substance  or  of  a  major  ingredient  in  a  finished 
dosage form.  
Class  A:  Tests  designed  to  establish  identity,  whether  of  bulk  drug 
substances or of a particular ingredient in a finished dosage form.   Class D: Methods used to assess the characteristic of finished dosage 
forms, such as dissolution profiles and content uniformity.  
Class B: Methods designed to detect and quantitative impurities in a 
bulk drug substance or finished dosage form.  
 
Table 2: Characteristics required for assay validation as per USP 

Analytical performance  Assay  Assay category II  Assay category III  Assay category IV 

characteristics  category I 
Quantitative tests  Limit tests 
Accuracy  Yes  Yes * *  
Precision  Yes  Yes Yes  
Specificity  Yes  Yes  Yes  *  Yes 
Limit of Detection      Yes  *   
Limit of Quantitation    Yes    *   
Linearity  Yes  Yes    *   
Range  Yes  Yes * *  

Where, * indicates that may be required depending on the nature of the specific test. 
 
CONCLUSION  8. Wegscheider,  Validation  of  analytical  methods,  In  Guenzler  H, 
editor.  Accreditation  and  quality  assurance  in  analytical 
Validation  is  a  constant,  evolving  process  that  starts  before  an  chemistry. Berlin: Springer Verlag; 1996.  
instrument  is  placed  on‐line  and  continues  long  after  method  9. AOAC Peer Verified methods Program, Manual on policies and 
development and transfer. In this review article we discussed about  procedures, Arlington, VA; 1993.  
the importance and types of validation of analytical methods. From  10. Vessman  J.  Selectivity  or  specificity?  Validation  of  analytical 
the  above  discussed  matter  we  concluded  that  the  validation  of  methods  from  the  perspective  of  an  analytical  chemist  in  the 
developed  analytical  methods  is  critical  elements  in  the  pharmaceutical  industry.  J  Pharm  Biomed  Analy.  1996;  14: 
development  of  pharmaceuticals.  Success  in  these  areas  can  be  867‐69.  
attributed to several important factors, which in turn will contribute  11. Huber L. Validation of computerized analytical systems, Part 3: 
to regulatory compliance.   Installation  and  operational  qualification.  LC‐GC  Magazine. 
REFERENCES  1996; 14: 806‐12.  
12. Huber  L.  Validation  of  Computerized  Analytical  Systems, 
1. US  EPA,  Guidance  for  methods  development  and  methods  Interpharm, Buffalo Grove, IL; 1995.  
validation  for  the  Resource  Conservation  and  Recovery  Act  13. EURACHEM  Guidance  Document  No.  1/WELAC  Guidance 
(RCRA) Program, Washington; 1995.  Document No. WGD 2: Accreditation for chemical laboratories: 
2. Szepesi  MG,  Mihalyfi  K.  Selection  of  HPLC  methods  in  Guidance  on  the  interpretation  of  the  EN  45000  series  of 
pharmaceutical  analysis  ‐III  method  validation.  J  Chromatogr  standards and ISO/IEC Guide 25, 1993.    
1989; 464: 265‐78.   14. General  Chapter,  Validation  of  compendial  methods,  United 
3. Shah P, Midha KK, Dighe S, McGilveray IJ, Skelly JP, Yacobi A, et  States  Pharmacopeia,  26th    Revision,  National  Formulary,  21st 
al.  Analytical  methods  validation:  Bioavailability,  Edition,  Rockville,  MD,  The  United  States  Pharmacopeial 
bioequivalence and pharmacokinetic studies. Eur J Drug Metab  Convention, Inc, 2440; 2003.  
Pharmacok. 1991; 16: 249‐55.   15. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical 
4. Hokanson  GC.  A  life  cycle  approach  to  the  validation  of  Requirements  for  the  Registration  of  Pharmaceuticals  for 
analytical  methods  during  pharmaceutical  product  Human  Use,  Validation  of  analytical  procedures,  ICH‐Q2A, 
development, part I: The initial validation process. Pharm Tech.  Geneva; 1995.  
1994; 118‐30.   16. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical 
5. Hokanson GC. Hokanson, A life cycle approach to the validation  Requirements  for  the  Registration  of  Pharmaceuticals  for 
of  analytical  methods  during  pharmaceutical  product  Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, 
development,  part  II:  Changes  and  the  need  for  additional  ICH‐Q2B, Geneva; 1996.  
validation. Pharm Tech. 1994; 92‐100.   17. US  FDA  Technical  Review  Guide:  Validation  of 
6. Green  JM.  A  practical  guide  to  analytical  method  validation.  Chromatographic  Methods,  Center  for  Drug  Evaluation  and 
Anal Chem News  Features. 1996; 305‐9.   Research (CDER), Rockville, MD; 1993.  
7. Renger  B,  Jehle  H,  Fischer  M,  Funk  W.  Validation  of  analytical  18. US FDA, General principles of validation, Rockville, MD, Center 
procedures  in  pharmaceutical  analytical  chemistry:  HPTLC  for Drug Evaluation and Research (CDER); 1987.  
assay  of  theophylline  in  an  effervescent  tablet.  J  Planar  19. US FDA, Guidelines for submitting samples and analytical data 
Chrom.1995; 8: 269‐78.   for  method  validation,  Rockville,  MD,  Center  for  Drugs  and 
Biologics Department of Health and Human Services;  1987.  
 

22 

View publication stats