听说你想研究巨噬细胞极化？

巨噬细胞是机体内非常重要的一类免疫细胞，也一直是科研工作者们的研究热点，尤其是巨噬细胞的极化。在不同的刺激下，巨噬细胞可以通过极化呈现出不同表型，进而发挥不同的功能。由于巨噬细胞的这种多样性和可塑性，使其在发挥免疫功能和抗原提呈时极易受到外部因素的诱发产生极化，而巨噬细胞极化的失调将会导致许多疾病的发生。

一、巨噬细胞简介

巨噬细胞（Macrophage）由ELie Metchnikoff首次提出，是人体固有免疫系统中重要的组成部分，具有强大的识别、吞噬、清除细菌及外来异物、处理并提呈抗原、介导特异性免疫应答、清除衰老细胞、修复损伤及维持自身代谢稳定的功能。巨噬细胞广泛分布于全身组织，具有组织特异性，主要来源于卵黄囊、胎肝和骨髓前体细胞等。巨噬细胞作为一群具有异质性的免疫细胞，具有高度可塑性，不同的诱导信号可激活巨噬细胞改变其自身的形态和生理特征。

二、巨噬细胞的极化及类型

01 巨噬细胞的极化

当机体内环境稳态遭到破坏时，巨噬细胞通过吞噬、释放炎症因子等作用清除外源微生物，以恢复机体动态平衡，这个过程称为活化。伴随着活化，在细胞因子的作用下，巨噬细胞改变其表型，以增强应对微环境变化的能力，这个过程即为巨噬细胞的极化。巨噬细胞极化就是指成熟巨噬细胞在特殊微环境刺激下，产生不同功能表型的过程。巨噬细胞的极化对防御病原体、调节炎症、修复组织和维持体内平衡的稳定有着十分重要的作用。

根据表型和功能，巨噬细胞的极化可分为经典活化的M1型巨噬细胞和替代激活的M2型巨噬细胞，M2型巨噬细胞又进一步划分为M2a、M2b、M2c和M2d亚群。另外，还有其他类型的巨噬细胞，如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、CD169+巨噬细胞和TCR+巨噬细胞。但值得注意的是，巨噬细胞极化是一个动态过程，M1和M2两种表型并没有绝对意义上的对立区分，两者不但并非相互排斥，而且经常共存，在特定条件下M1，M2之间还可以相互转化，这种转化使巨噬细胞在微环境变化时仍能维持组织稳态与机体平衡。

图1 不同环境因素对巨噬细胞分化方向的影响（Gao et al., 2022）。

02 M1型巨噬细胞

通过Th1细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和细菌脂多糖（LPS）以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）可诱导产生经典活化的M1型巨噬细胞，并释放促炎因子，如白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素23（IL-23）、白细胞介素1β（IL-1β）、TNF-α和其他炎症应答分子（如活性氧ROS、一氧化氮NO）。M1型巨噬细胞在炎症早期承担着促炎作用，具有强大的抗感染、抗肿瘤、清除凋亡细胞及坏死组织的能力，可通过抗原提呈介导Th1型免疫反应杀伤病原，保护机体。

03 M2型巨噬细胞

通过Th2细胞因子如白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素13（IL-13）、白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）等可诱导产生替代激活的M2型巨噬细胞，并释放抑炎因子（IL-1、IL-10和TGF-β等）。M2型巨噬细胞可介导抑炎反应和Th2型免疫应答，起着抑制炎症反应及组织修复的作用。但实际上不同刺激诱导的M2表型也具有不同的作用，如分别受到IL-4/IL-13、免疫复合物和脂多糖/IL-1受体、IL-10及Toll样受体的刺激M2a、M2b、M2c和M2d细胞。其中，M2a巨噬细胞，又称伤口愈合巨噬细胞，可增加内吞活性，发挥免疫调节作用并促进Th2型细胞反应；M2b巨噬细胞，又称调节性巨噬细胞，具有强大的抗炎和免疫抑制作用；M2c巨噬细胞，又称灭活巨噬细胞，与免疫反应抑制和组织重塑相关；M2d巨噬细胞，有时也称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM），参与血管生成和肿瘤进展。

图2 M1和M2巨噬细胞在形态、表面标志物、分泌细胞因子及生物学功能等方面的差异（YongLi et al., 2019）。

三、巨噬细胞极化的诱导及鉴定

目前巨噬细胞已成为申请国自然的研究热点之一，有关巨噬细胞极化研究的高分文章也不断涌现。在实际的科研工作中，常涉及到各种来源的巨噬细胞的极化，在此，小医为大家总结了比较常用的体外巨噬细胞极化诱导及鉴定的protocol以供大家参考。

01 人THP-1细胞向M1、M2极化的诱导

（1）使用生长旺盛的THP-1悬浮细胞进行铺板，添加PMA（终浓度100 ng/mL）诱导其向成熟巨噬细胞分化，培养48h后细胞完全贴壁，从悬浮状态变为贴壁细胞；

（2）M1型极化诱导：添加LPS（终浓度100 ng/mL）刺激24h诱导其向M1极化；

（3）M2型极化诱导：添加IL-4（终浓度20 ng/mL）+ IL-13（终浓度20 ng/mL）刺激24h诱导其向M2极化；

（4）可采用qPCR、Western Blot、ELISA和流式检测等方法检测极化后的M1和M2型巨噬细胞标志物，可参考表1。

02 人外周血巨噬细胞向M1、M2极化的诱导

（1）使用人淋巴细胞分离液和CD14单核细胞磁珠分选试剂盒从外周血中分离PBMCs及单核细胞；

（2）调整单核细胞密度（1~2×106/mL），添加M-CSF（终浓度25 ng/mL）诱导其向成熟巨噬细胞分化；

（3）M1型极化诱导：添加LPS（终浓度50 ng/mL）+ IFN-γ（终浓度20 ng/mL）刺激24h诱导其向M1极化；

（4）M2型极化诱导：添加IL-4（终浓度20 ng/mL）+ IL-10（终浓度20 ng/mL）刺激24h诱导其向M2极化；

（5）可采用qPCR、Western Blot、ELISA和流式检测等方法检测极化后的M1和M2型巨噬细胞标志物，可参考表1。

03 小鼠RAW264.7细胞向M1、M2极化的诱导

与人THP-1细胞和人外周血巨噬细胞相比，RAW264.7的极化相对更简单，可直接添加刺激物向M1和M2型极化诱导。

（1）M1型极化诱导：添加LPS（终浓度100 ng/mL）刺激24h或者48h诱导其向M1型极化；

（2）M2型极化诱导：添加IL-4或IL-10（终浓度20 ng/mL）刺激24h或者48h诱导其向M2型极化；

（3）可采用qPCR、Western Blot、ELISA和流式检测等方法检测极化后的M1和M2型巨噬细胞标志物，可参考表1。

表1 M1和M2型巨噬细胞表型

参考文献

Gao J, Liang Y, Wang L. Shaping PoLarization Of Tumor-Associated Macrophages In Cancer Immunotherapy[J]. Front ImmunoL. 2022 Jun 30;13:888713.

YongLi Y, Xiang-Hong X, Liping J. Macrophage PoLarization in PhysioLogicaL and PathoLogicaL Pregnancy[J]. Frontiers in immunoLogy, 2019,10.

Wang L X, Zhang S X, Wu H J, et al. M2b macrophage polarization and its roles in diseases[J]. Journal of leukocyte biology,106(2), 345–358.