一文解析PL-MS实验关键细节，让数据更可靠！

在蛋白质组学研究中，蛋白质间的动态互作关系一直是科学家面临的重大挑战。传统的蛋白互作研究方法（如Co-IP、Pull-down）往往需要在试管中重现蛋白互作情况，不仅容易丢失弱或瞬时的相互作用，还可能错过空间信息。邻近标记技术（Proximity Labeling，PL）通过在活细胞微环境中放置“化学定位信标”，能在原位、实时地为目标蛋白周围的分子打上可捕获的化学标签。当PL与高灵敏度质谱（Mass Spectrometry，MS）联用时，标记信息被精确读取，绘制出高分辨率的蛋白互作图谱。PL-MS成为探索细胞内动态分子网络的强大工具，尤其在解析复杂信号通路和疾病机制方面展现出独特优势。

技术流程（以TuboID为例）

01 实验准备阶段

1、融合表达载体构建：将目标蛋白（POI）与标记酶TuboID融合表达，可选择N端和C端融合，并加入标签蛋白（如GFP、YFP、HA或His等），以便后续进行蛋白表达鉴定。

Tips：标签蛋白通常选择小分子量标签如FLAG或者HA等，避免影响诱饵蛋白空间结构。

2、细胞系准备：根据研究目标选择合适的哺乳动物细胞系。例如模式细胞HEK-293T、Hela等具有高转染效率的细胞系适合进行蛋白表达预实验验证。

3、实验分组设计：

阴性对照组：空载 / 空载-TuboID / 空载-POI

实验组1：空载-POI-TuboID

实验组2：空载-TuboID-POI

02 预实验阶段

1、细胞培养：严格遵循不同细胞类型培养条件，培养细胞至适宜的汇合度（70 ％ - 80 ％），确保细胞状态良好。

2、细胞转染：使用适合的转染方式将融合表达质粒转染至细胞，并继续培养24- 48 h。

脂质体瞬时转染：阳离子脂质体Lipofectamine 2000/3000包裹DNA进入细胞，操作简单、高效，适用于多数贴壁细胞，无病毒污染风险；但对某些细胞系转染效率较低。

电穿孔：通过短暂电击打孔细胞膜，使DNA或RNA进入胞内，可用于难转染细胞（如悬浮细胞、免疫细胞），转染效率高；但对细胞损伤较大，操作较复杂。

慢病毒包装与侵染：利用慢病毒系统将目标基因整合入细胞基因组，实现稳定表达，感染效率高，可用于多数细胞类型（贴壁/悬浮）实现稳定表达；但制备周期较长。

3、WB：收集细胞裂解液，使用识别融合蛋白亲和标签的抗体进行WB实验，检测融合蛋白（POI-TuboID/TuboID-POI）融合蛋白的表达情况，选择表达效率更高的表达质粒进行后续实验。

03 细胞转染

按预实验摸索确定的蛋白表达质粒和细胞培养最适条件进行细胞培养、铺板（6孔板）与细胞转染实验。

04 生物素孵育

1、生物素储备液制备：使用DMSO或无菌水溶解生物素，制备100 mM储备液。使用前需用0.22 µm滤膜过滤除菌，可提前分装至-20℃储存。

2、生物素添加：将生物素储备液加入细胞完全培养基中至最终浓度50 - 100 μM，在37 °C、5% CO₂的常规培养条件下孵育10-30 min。

Tips：生物素标记对细胞毒性较低，但高浓度和长时间的孵育也可能导致标记的非特异性，因此可在预实验中优化确认最适的生物素浓度及孵育时间。

3、终止标记：孵育完成后用预冷的PBS迅速洗细胞3 - 5次，去除残余生物素。

05 细胞裂解

1、收集细胞：对于贴壁细胞，用细胞刮刀刮下细胞或用胰蛋白酶消化后转移至离心管中，离心收集细胞沉淀；悬浮细胞则直接低速离心收集。

2、裂解细胞：根据实验要求选择合适的裂解液。

温和裂解（RIPA）：通用裂解，兼顾保留蛋白复合物和溶解效率；

强裂解（SDS）：强烈裂解，彻底释放蛋白，适用于高背景样本。

根据细胞量加入合适的裂解液，确保裂解充分。充分吹打混匀，必要时可旋涡震荡或轻微超声（冰上超声，2秒 × 5次）。冰上孵育10-30min，期间轻轻振荡混匀。

3、离心去除杂质：4 °C，12,000 - 15,000 g离心10-15 min，去除细胞碎片和未裂解的细胞核，小心收集上清裂解产物。

4、蛋白定量（可选）：使用BCA或Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，便于标准化下游步骤（如加磁珠量、上样量等）。

Tips：所有的裂解液必须现用现加蛋白酶抑制剂、1 mM PMSF和1 mM DTT。细胞裂解所有步骤必须冰上操作，防止蛋白降解。

06 生物素化蛋白纯化

1、磁珠预处理：根据蛋白量吸取适量的磁珠放入1.5 mL管中，置于磁力架上弃上清；加入1mL无SDS裂解缓冲液洗涤3次。

Tips：生物素与链霉亲和素（Streptavidin）的结合具有高特异性和强亲和力，因此常使用链霉亲和素偶联的琼脂糖珠（Agarose Resin）或磁珠（Magnetic Beads）。

2、结合生物素化蛋白：将预处理的磁珠加入细胞裂解液中，4 °C旋转孵育2-3 h或过夜。

Tips：总蛋白浓度控制在0.5-2 mg/mL；过夜孵育结合更完全。

3、洗涤磁珠：洗涤的目的是去除非特异性的结合蛋白，是降低背景的关键步骤。

低盐缓冲液洗涤（×2）：裂解缓冲液RIPA（不含SDS），去除未结合的小分子和弱结合蛋白；

高盐缓冲液洗涤（×1）：500 mM NaCl + 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) + 0.1 % NP-40，去除非特异性静电结合的蛋白；

高去污剂洗涤（×1）：含较高浓度非离子去污剂（如1 % Triton X-100或NP-40）或不同类型去污剂的缓冲液，去除疏水性非特异结合蛋白；

尿毒洗涤（×1）：含1-2 M尿素的缓冲液（通常在Tris-HCl, pH 8.0中），去除疏水和弱相互作用蛋白。

PBS洗涤（×1）：去除盐和去污剂残留，保护下游分析。轻柔颠倒混匀或4 °C旋转孵育2-5 min，避免剧烈吹打破坏磁珠–蛋白复合物。

07 实验准备阶段

1、煮脱：取总蛋白液，加入1 × SDS Sample Buffer，99 ℃金属浴5 min，记为Input组；取结合有生物素标记蛋白的磁珠，加入1 × SDS Sample Buffer 99 ℃金属浴5 min，磁吸后取上清，记为IP组，-80 ℃保存备用。

2、洗脱后蛋白可用于Western Blot验证特定候选蛋白或进行蛋白质组学分析（LC-MS/MS）。

图1 PL实验技术流程图

注意事项

1、实验设计与克隆构建：选择合适的邻近标记酶（TuboID、APEX2等），测试N-端和C-端融合蛋白表达情况。

2、对照组实验设置：

① 空载：排除系统性背景干扰，例如磁珠与内源蛋白的非特异性结合（技术噪音）。

② 空载-TuboID：排除游离的TuboID自身的背景标记（定位背景）。

③ 空载-POI：排除POI表达本身的背景信号（生物学背景）。

3、生物素孵育：TuboID标记时间通常为10 - 30 min，能够快速标记，若信号弱可相应延长孵育时间，但可能导致背景信号增加，需要摸索最适的标记时长。

4、细胞处理与裂解：选择合适的细胞转染方式处理细胞后，需确保融合蛋白稳定表达（通常为转染后24 - 48 h）后再加生物素。根据目标蛋白的亚细胞定位和预期互作稳定性选择合适的裂解液，确保最佳的裂解效果。裂解和后续操作需要在4 ℃或冰上操作以防止蛋白裂解。

5、Streptavidin磁珠洗涤：SDS、尿素、去污剂浓度过高会破坏弱相互作用或抑制下游操作，按需要平衡去背景与保留弱互作。

常见问题分析

问题1：融合蛋白不表达或表达量低。

原因：克隆载体构建不当，标签干扰，转染效率低等会直接影响融合蛋白表达水平；融合蛋白如果发生错误折叠等也会导致其被蛋白酶体或溶酶体降解。

解决方案：

① 优化载体设计，使用强启动子（如CMV），并采用高转染效率方法（如电转）；

② 调整标签位置，WB验证比较N-端和C-端融合蛋白的表达情况，在TuboID和POI之间添加柔性连接肽linker，减少空间位阻对蛋白折叠、功能或结合能力的影响。

问题2：添加生物素或表达标记酶后细胞死亡、形态改变或生长受抑制。

原因：标记酶过表达，如TuboID过度消耗ATP；底物毒性，如H2O2浓度过高导致氧化应激，生物素浓度过高，标记时间过长；融合蛋白的错误定位干扰正常细胞功能。

解决方案：

① 使用诱导型启动子（如Tet-On/Off系统），精细调控POI-TuboID表达水平；

② 适当降低生物素浓度或缩短孵育时间，可通过预实验确定最适浓度和时间；

③ 选择APEX2等过氧化物酶作为邻近标记酶时，因其发挥作用的底物为H2O2，具有细胞毒性，必须严格把控H2O2浓度和反映时间，并迅速淬灭；

④ IF检测蛋白表达定位是否在预期亚细胞区域。

问题3：目标蛋白未富集或富集信号弱。

原因：该现象可能是由于蛋白表达不足，标记底物生物素浓度不够或孵育时间太短，裂解及富集步骤丢失部分蛋白导致。

解决方案：

① 确认融合蛋白顺利表达；

② 优化生物素浓度及标记时间，检查生物素储备是否新鲜、避光保存并分装；

③ 适当增强细胞裂解强度，避免因裂解不充分导致目标蛋白提取不足，影响后续富集效率。

④ 增加起始细胞量或磁珠量。

问题4：背景生物素化水平太高。

原因：细胞内本身存在少量天然生物化蛋白（如乙酰辅酶A羧化酶ACC1和ACC2、丙酮酸羧化酶等）；培养基、血清及细胞中含有游离的生物素，TuboID具有很强的生物素化活性，在没有外源生物素添加的情况下，也可能利用细胞内源生物素进行标记，增加了基础生物素化水平。

解决方案：

① 严格设置对照实验：no-Biotin对照实验设计，数据分析时排除背景信号的干扰；

② 生物素缺陷型培养基预处理：在添加外源生物素标记之前，将细胞在无生物素或低生物素含量的培养基中预培养（24 - 48 h），耗尽细胞内游离生物素，增强外源生物素标记特异性，降低背景信号；

③ 严格控制生物素标记时间：TuboID能够快速标记邻近蛋白，因此需确定最适标记时间，在有效标记前提下使用最短的标记时间减少背景积累；

④ 优化洗涤条件：增加强洗脱条件，有效去除与链霉亲和素弱结合的内源性生物素化蛋白或其他非特异性结合蛋白，注意平衡保留弱互作。

问题5：候选蛋白太多、难以筛选真实互作。

关键：质谱原始数据的处理、肽段和蛋白质的鉴定、以及后续定量和统计分析对于筛选高置信度的互作蛋白至关重要。

解决方案：

① 使用多种对照做差异分析，例如TurboID-only、beads-only、no-Biotin；

② 使用数据库（如UniProt、NCBI等）搜索质谱数据，识别肽段，并将其与蛋白质序列匹配进行肽段鉴定和定量。（常用分析软件Mascot、MaxQuant、Proteome Discoverer等）；

③ 选用针对PL数据设计的统计分析工具或流程，例如SAINT、CRAPome等进行背景扣除和显著性分析，评估可信度；

④ 功能富集与相互作用网络分析，例如使用GO或KEGG等数据库对筛选出的蛋白进行功能注释，或使用TRING，Cytoscape等工具构建蛋白质互作网络筛选关键蛋白。

小结

邻近标记（PL）技术以其高灵敏度和空间特异性，为解析蛋白质互作网络和亚细胞蛋白质组提供了强有力的工具。从实验设计到质谱数据分析，每一步的优化都直接关系到结果的可信度与生物学意义。实验过程中可能面临标记效率低、背景噪音高、细胞毒性等问题，需从表达系统、底物浓度、洗涤条件等多方面进行针对性优化。此外，确保操作标准化和数据分析严谨性，是提升结果可靠性的关键。

参考文献

[1] Cho KF, Branon TC, Udeshi ND, Myers SA, Carr SA, Ting AY. Proximity labeling in mammalian cells with TurboID and split-TurboID. Nat Protoc. 2020;15(12):3971-3999.

[2] May DG, Scott KL, Campos AR, Roux KJ. Comparative Application of BioID and TurboID for Protein-Proximity Biotinylation. Cells. 2020;9(5):1070. Published 2020 Apr 25.