ceRNA机制研究常见套路

竞争性内源RNA（ceRNA）机制（Competitive endogenous RNA mechanism），与常说的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）或mRNA等的概念不同，其不是某种特定类型的RNA，而是一种调控机制（图1）。百度百科中解释ceRNA机制揭示了一种RNA间相互作用的新机制，已知microRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNA可以通过竞争性地结合microRNA来调节基因表达。ceRNA可以通过应答元件（microRNA response elements，MREs）与microRNA结合从而使microRNA失效，这揭示了一条RNA-microRNA调节通路的存在，具有重大生物意义。虽然该机制已经12岁了，但对于它的解释是不是读起来还是有种每个字拆开都认识，拼起来读又拗口又难以理解的感觉？别急，小医刚开始了解ceRNA机制的时候也是一脸懵的状态，但经过多篇文献的阅读，小医终于搞明白该机制的作用，并且发现研究ceRNA机制可谓是套路满满，并且依然是科学研究领域的热门呢！下面就和小医一起来学习一下吧。

图1 ceRNA概述（Wang et al., 2022）。

一、ceRNA机制的发现

哈佛大学医学院癌症遗传学家Pier Paolo Pandolfi教授于2011年在Cell上发表的A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language?一文中首次提出了ceRNA机制假说（图2），但彼时教授并没有对其进行实验验证。该假说一经提出，就受到了多方关注，该文章也立即登上了Cell杂志最受关注的文章。

图2 颠覆microRNA-mRNA相互作用的传统逻辑（Salmena et al., 2011）。（A）mRNA和microRNA之间的关系可能是相互的，导致一种mRNA的水平影响另一种mRNA的水平和活性；（B）RNA分子可通过microRNA和MREs相互通信，共享的MREs越多，“沟通”水平越高；（C）RNA分子的3'UTR包含MRE，它可以顺式调节RNA分子本身，但也可能调节microRNA的水平，从而调节其他RNA分子。

同年的下半年，Pier Paolo Pandolfi教授在Cell上连续发表了题为“Coding-Independent Regulation of the Tumor Suppressor PTEN by Competing Endogenous mRNAs”与“In vivo identification of tumor- suppressive PTEN ceRNAs in an oncogenic BRAF-induced mouse model of melanoma”的文章，印证了ceRNA猜想，证实了ceRNA机制的存在，并在肿瘤中进行了验证（图3，图4）。首先，在第一篇文章中，作者在PTEN（一种关键的肿瘤抑制因子，其丰度决定了肿瘤发生的关键结果）背景下测试了ceRNA假设，通过结合计算和实验方法，确定并验证了调节PTEN、拮抗PI3K/AKT信号并具有生长和肿瘤抑制特性的内源性蛋白质编码转录物，提出了预测和验证ceRNA活性和网络的路线图，从而赋予蛋白质编码mRNA反式调节功能，证明了蛋白质编码RNA转录本可通过竞争常见的microRNA进行串扰，而microRNA反应元件是这种相互作用的基础（图3）。

图3 PTEN表达的调节模型，通过ceRNA隔离microRNA的转录后调控代表了PTEN调控的反式调控维度（Tay et al., 2011）。

接着，在第二篇文章中，作者在黑色素瘤小鼠模型中，发现了肿瘤抑制基因PTEN的多个ceRNA，并进一步表征了ZEB2转录本，通过体外表征验证了EMT调节剂ZEB2作为PTEN ceRNA以microRNA依赖、蛋白质编码独立的方式调节PTEN蛋白质水平，同时，人类癌症数据库分析证实了其与PTEN的功能关系，即ceRNA通过miRNA竞争对PTEN的异常调节有助于黑色素瘤的发展（图4）。

图4 诱变筛选鉴定肿瘤抑制性PTEN ceRNA机制概要（Karreth et al., 2011）。

不仅如此，Cell同期杂志上还刊登了罗马第一大学Irene Bozzoni教授的“A Long Noncoding RNA Controls Muscle Differentiation by Functioning as a Competing Endogenous RNA”文章，也证实了ceRNA机制的存在，在肌肉分化中起着重要作用，确定了一种肌肉特异性长链非编码RNA linc-MD1可通过在小鼠和人类成肌细胞中充当ceRNA来调控肌肉分化的时间。具体而言，linc-MD1的下调或过表达分别与肌肉分化程序的延迟或预测相关，linc-MD1“海绵”miR-133和miR-135以调节MAML1和MEF2C的表达，这是激活肌肉特异性基因表达的转录因子（图5）。

图5 连接linc-MD1，miR-135，miR-133和肌肉分化的通路示意图（Cesana et al., 2011）。

二、ceRNA机制的研究进展

研究发现mRNA、假基因、lncRNA、circRNA、miRNA等各种类型的RNA均可通过ceRNA机制来进行相互交流，从而调控各种微生物、病毒及动植物生命进程与疾病进展（图6）。

图6 不同类型的ceRNA和miRNA之间的相互作用（Abdollahzadeh et al., 2019）。

小医在pubmed简单检索ceRNA，2011-至今的结果就有6544条，而近3年来发表的文献高达4500+篇，且该趋势还在逐年上升。之后，小医又以ceRNA为关键词，在国家自然科学基金项目中通过查询发现，截至2022年，医学科学部国自然基金项目资助278个，项目资助金额高达11000多万。

▲ ceRNA机制文献发表情况

▲ ceRNA国自然基金项目资助情况

最后，小医又在pubmed中对ceRNA机制研究方向进行初筛，结果发现，lncRNA与circRNA参与ceRNA机制调控的研究占了ceRNA的大半壁江山，并且该机制曾一度风靡肿瘤研究领域，现如今，该机制已在神经、肌肉、心血管、脂肪、造血、免疫系统等众多人类疾病中得以探索。

▲ ceRNA研究方向统计

三、ceRNA机制的研究套路

在确定想要研究的领域后，可通过以下手段对ceRNA机制进行研究。

1）RNA差异分析，一般采用全转录组测序、基因芯片、临床数据库检索等手段；

2）基因富集与PPI分析，初筛目标基因，判断研究价值（可选）；

3）目标基因筛选，推荐优先确定目标miRNA（ceRNA机制的中心），建议进行细胞功能检测等预实验，确认研究价值；

4）生物信息学网站预测与目标基因互作的靶基因（包括lncRNA、circRNA、mRNA与假基因等）并通过相应实验（如：双荧光素酶实验）对其进行验证，即共表达分析；

5）选择趋势符合的基因（即表达量与miRNA趋势相反）构建ceRNA机制通路。

其实，针对ceRNA机制研究最主要、最核心的步骤就是：寻找差异基因——预测调控关系—共表达分析—建立调控通路。随着ceRNA机制研究的套路化，单纯的ceRNA机制也越来越难发高分文章，但如果大家认为单纯的ceRNA研究已经out了，那就太小看这个机制了，最近小医就发现了几篇以ceRNA机制研究套路为基础的高分文献。

例子一：

2023年3月20日，中国农业科学院动物研究所张丽团队在Cells上发表了题为“The Molecular Mechanism of the TEAD1 Gene and miR-410-5p Affect Embryonic Skeletal Muscle Development: A miRNA-Mediated ceRNA Network Analysis”的研究性文章。在本研究中，团队证明了miR-410-5p与TEAD1基因的调控关系，与绵羊胚胎成肌细胞的增殖有关，为理解胚胎肌肉发育的分子机制提供了参考和分子基础（图7）。详细而言，团队首先采用全转录组分析发现了一个共表达网络，即三个miRNA（miR-493-3p、miR-3959-3p和miR-410-5p）、三个lncRNA（MSTRG.3533、MSTRG.4324和MSTRG.1470）以及三个基因（TEAD1、ZBTB34和POGLUT1），随后通过分子实验与细胞功能验证相关实验对差异表达的miRNA（differentially expressed miRNAs，DE-miRNAs）靶基因进行分析，发现miR-410-5p与TEAD1基因具有显著的靶向调控关系。

图7 通过miRNA介导的ceRNA机制网络分析TEAD1基因与miR-410-5p影响胚胎骨骼肌发育的分子机制（Hu et al., 2023）。

本研究技术路线如图8所示。

图8 研究技术路线

例子二：

2023年3月30日，昆明医科大学第二附属医院舒钧教授在Frontiers in Molecular Neuroscience上发表了题为“Construction of ceRNA and m6A-related lncRNA networks associated with anti-inflammation of AdipoAI”的研究性文章。本研究通过比较不对称和对称椎间盘退变的全转录组测序和生物信息学分析，系统地筛选了成人退行性脊柱侧弯（Adult degenerative scoliosis，ADS）发展中的关键ncRNA，鉴定了多个在ADS发病机制中发挥关键调控作用的ncRNA，包括miRNA-766-3p、miRNA-326、novel_circ_0004327、XLOC_000209、GRK2，这些发现为进一步研究与ADS发展相关的非编码RNA奠定了基础（图9）。

图9 不对称椎间盘退变引起的 ADS 相关的关键通路和分子机制（Shi et al., 2023）。

图10 本研究工作流程示意图（Shi et al., 2023）。

参考文献

Abdollahzadeh R, Daraei A, Mansoori Y, Sepahvand M, Amoli MM, Tavakkoly-Bazzaz J. Competing endogenous RNA (ceRNA) cross talk and language in ceRNA regulatory networks: A new look at hallmarks of breast cancer. J Cell Physiol. 2019;234(7):10080-10100.

Cesana M, Cacchiarelli D, Legnini I, et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA [published correction appears in Cell. Cell. 2011;147(2):358-369.

Hu W, Wang X, Bi Y, Bao J, Shang M, Zhang L. The Molecular Mechanism of the TEAD1 Gene and miR-410-5p Affect Embryonic Skeletal Muscle Development: A miRNA-Mediated ceRNA Network Analysis. Cells. 2023;12(6):943.

Karreth FA, Tay Y, Perna D, et al. In vivo identification of tumor- suppressive PTEN ceRNAs in an oncogenic BRAF-induced mouse model of melanoma [published correction appears in Cell. Cell. 2011;147(2):382-395.

Salmena L, Poliseno L, Tay Y, Kats L, Pandolfi PP. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell. 2011;146(3):353-358.

Shi X, Li P, Wu X, Shu J. Whole-transcriptome sequencing identifies key differentially expressed circRNAs/lncRNAs/miRNAs/mRNAs and linked ceRNA networks in adult degenerative scoliosis. Front Mol Neurosci. 2023;16:1038816.

Tay Y, Kats L, Salmena L, et al. Coding-independent regulation of the tumor suppressor PTEN by competing endogenous mRNAs. Cell. 2011;147(2):344-357.

Wang Y, Mo Y, Peng M, et al. The influence of circular RNAs on autophagy and disease progression. Autophagy. 2022;18(2):240-253.