如何用CHAMOT Matrix Gel /基质胶培养小鼠小肠类器官?

A.b. 关键材料与试剂

B.a. 从小鼠新鲜小肠获取肠道隐窝

1. 冰上解冻1管 Matrix Gel。
2. 将24孔组织培养板置于37℃培养箱预热至少30分钟。
3. 依据IACUC规范处死小鼠，截取约20 cm小肠。
4. 将小肠置于含5 mL预冷（2-8℃）DPBS的10 cm培养皿中。
5. 吸取1 mL预冷（2-8℃）DPBS，将枪头从小肠一端伸入肠腔，冲洗肠腔。
6. 用手术剪纵向剪开小肠，用1 mL预冷（2-8℃）DPBS轻柔冲洗内肠壁3次。
7. 将小肠转移至含15 mL预冷（2-8℃）DPBS的10cm洁净培养皿中，用镊子夹持肠段充分漂洗。
8. 将肠段剪成2 mm片段，收集至含15 mL预冷（2-8℃）DPBS的50 mL离心管中。
9. 用预冷（2-8℃）DPBS预湿后的10 mL移液管上下吹打洗涤肠片段。静置离心管30秒，待小肠片段沉降后吸出上清弃置。重新加入15 mL预冷（2-8℃）DPBS。重复15-20次至上清澄清。
10. 去除上清，重悬肠片段于25 mL室温（15-25℃）温和细胞解离试剂中，室温（15-25℃）摇床孵育15分钟（20 rpm）。
11. 弃上清，重悬于10 mL预冷（2-8℃）DPBS（含0.1% BSA）中，上下吹打三次。
12. 让大部分肠片段沉降至底部。移除上清液，将剩余悬液通过70 µm滤网过滤至50 mL离心管中。标记滤液为“组分 1”并置于冰上。
13. 重复步骤11-12三次，得到组分 2至组分 4。
14. 将各组分在290 × g下离心5分钟，温度保持在2-8℃。小心弃去上清。
15. 将每个组分分别重悬于10 mL预冷（2-8℃）的DPBS + 0.1% BSA中。
16. 将每个悬液转移至标记有对应组分编号的新鲜15 mL离心管中。
17. 将各组分在200 × g下离心3分钟，温度保持在2-8℃。小心弃去上清。
18. 将每个隐窝组分分别重悬于10 mL预冷（2-8℃）的DMEM/F-12（含15 mM HEPES）中。
19. 从每个组分悬液中各取1 mL加入6孔板的单个孔中，使用倒置显微镜评估悬液质量。选择富含肠道隐窝的悬液。

注：适合培养的隐窝大小不一，通常类似于单层上皮细胞的小折叠片段。组分3和4通常富含理想的隐窝。

1. 对于选定的组分，使用倒置显微镜计数10 μL等分样品中的隐窝数量，并计算每毫升悬液中的隐窝数量。
2. 从选定的组分中，将含有约2000个隐窝的悬液分装至15 mL离心管中。

后续步骤请参考C部分进行肠道类器官培养。

B.b.复苏小鼠肠道类器官

1. 冰上解冻1管Matrix Gel。
2. 将24孔组织培养板在37℃培养箱中预热30分钟。
3. 将含有类器官的冷冻管置于37℃水浴中解冻。通常需要不到3分钟。待冷冻培养基完全液化且类器官可见后立即进行后续步骤。
4. 将冷冻管中的内容物转移至15 mL离心管中，并加入9 mL DMEM/F-12（含15 mM HEPES + 1% BSA）。使用移液管轻柔吹打5次以重悬类器官。
5. 使用倒置显微镜计数类器官数量，计算每毫升悬液中的类器官数量，并将含有约2000个类器官的悬液分装至另一个15 mL离心管中。

后续步骤请参考C部分进行肠道类器官培养。

C. 小鼠小肠类器官培养

1. 将来自B.a.或B.b.步骤的类器官等分样品在200 × g下离心5分钟，温度保持在2-8℃。弃置上清。
2. 向类器官沉淀中加入90 µL室温的完全类器官生长培养基（小鼠）。
3. 加入210 µL Matrix Gel，轻柔吹打10次以重悬沉淀。避免引入气泡。
4. 将悬液小心加入预热的24孔板的5个孔中，每孔50 µL。将移液枪头保持在孔板底部上方，并缓慢释放。样品应在每孔中央形成穹顶结构。避免引入气泡。
5. 将孔板转移至37℃培养箱中孵育10-15分钟，直至Matrix Gel固化。转移过程中请勿扰动穹顶结构。
6. 沿孔壁缓慢加入750 µL室温（15-25℃）的完整类器官生长培养基（小鼠）。请勿直接将培养基滴加在凝胶穹顶上。
7. 向未使用的孔中加入无菌DPBS。
8. 盖上孔板盖，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。
9. 每3天更换一次培养基，使用750 µL新鲜的完整类器官生长培养基（小鼠），室温（15-25℃）操作。使用Nikon C2共聚焦显微镜观察类器官的发育情况（图1）。小鼠肠道类器官应每7-9天传代一次，平均传代比例为1:5。

注1：新鲜分离的小肠隐窝通常在培养2-4天后开始出芽。

注2：对于从冷冻管复苏的类器官，建议在用于下游实验前传代2次以获得最佳结果。类器官生长初期较慢，1-2天内形成球状体，5-7天后开始出芽。5-7天后类器官即可传代。经过1-2次传代后，类器官的典型生长特征应恢复正常。

D. 小鼠小肠类器官传代

1. 冰上解冻1管Matrix Gel。
2. 将类器官生长完全培养基（小鼠）预热至室温（15-25℃）。将含15 mM HEPES的DMEM/F-12保持在冰上。
3. 将24孔组织培养板在37℃培养箱中预热至少30分钟。
4. 轻柔移除每孔中的培养基。请勿扰动Matrix Gel的穹顶结构。
5. 每孔中加入1 mL 温和细胞解离试剂，覆盖暴露的穹顶结构。室温（15-25℃）孵育1分钟。
6. 使用预湿的1000 µL移液枪头，将孔内溶液上下吹打约20次以破坏穹顶结构并打散类器官。
7. 将悬液转移至15 mL离心管中。用额外的1 mL 温和细胞解离试剂冲洗孔内，并加入同一离心管中。
8. 对每个需要传代的孔重复步骤6-7。
9. 将含有类器官的15 mL离心管置于室温（15-25℃）摇床上，以20 rpm的速度孵育10分钟。
10. 在290 × g下离心5分钟，温度保持在2-8℃。轻轻倾倒并弃去上清液。
11. 使用预湿的移液管将沉淀重悬于10 mL预冷（2-8℃）的DMEM/F-12中。
12. 在200 × g下离心5分钟，温度保持在2-8℃。弃去上清液。

后续培养步骤请参考C部分。

E.a. 全标本免疫荧光染色

1. 移除培养基，并用DPBS洗涤含有小鼠肠道类器官的Matrix Gel三次。
2. 将类器官在4%多聚甲醛（PFA）中室温固定1小时。
3. 用DPBS洗涤类器官两次，每次至少15分钟。
4. 通过梯度甲醇在室温下透化3D细胞模型。依次用以下溶液洗涤类器官：DPBS洗涤两次；50%甲醇（溶于DPBS）洗涤一次；80%甲醇（溶于去离子水）洗涤一次；最后100%无水甲醇洗涤一次。
5. 依次用以下溶液洗涤类器官：20% DMSO/甲醇洗涤一次；80%甲醇（溶于去离子水）洗涤一次；50%甲醇（溶于DPBS）洗涤一次；100% DPBS洗涤一次；最后用含0.2% Triton X-100的DPBS洗涤一次。
6. 在37℃下用1% BSA（溶于0.1% DPBS-Tween）孵育1.5小时，以阻断非特异性蛋白相互作用。
7. 与一抗（E-cadherin，Abcam）在4℃下孵育过夜。
8. 与二抗（phalloidin，Thermo Fisher Scientific；DAPI，Thermo Fisher Scientific）在避光条件下孵育3小时。
9. 用DPBS洗涤样品三次，并进行共聚焦成像（Leica TCS SP8）。

E.b. 免疫细胞化学（ICC）染色

1. 移除培养基，并用DPBS洗涤含有小鼠肠道类器官的Matrix Gel三次。
2. 将类器官在4%多聚甲醛（溶于DPBS）中室温固定1小时。
3. 用DPBS洗涤孔板三次。
4. 向孔中加入含1%牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich）的DPBS，并通过上下吹打破坏Matrix Gel的结构。将类器官及其碎片转移至1.5 mL离心管中。
5. 让类器官静置几分钟，或离心5-10秒以加速沉淀。弃去上清液，避免扰动类器官。
6. 加入30%蔗糖溶液，将类器官样品脱水过夜。
7. 将脱水后的类器官包埋于OCT化合物（Tissue-Tek）中，置于-80℃保存。
8. 对类器官样品进行8 µm的冷冻切片。
9. 用含0.1% Triton X-100的4%山羊血清（Thermo Fisher Scientific）对样品进行封闭和透化处理。
10. 将样品与下列6种一抗孵育过夜：Vimentin Cytoskeleton，Abcam；Lysozyme，Abcam；Chromogranin-A，Abcam；Mucin2，Abcam；Villin，Santa Cruz Biotechnology。
11. 与相应的二抗在避光条件下孵育3小时。
12. 用DPBS洗涤样品三次，并进行共聚焦成像（Leica TCS SP8）。

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