蛋白间相互作用是细胞各种基本功能的主要完成者，参与几乎所有的重要生命活动。因此，蛋白-蛋白相互作用研究以及解析相互作用的关系网络图，具有十分重要的意义。为了研究蛋白质间的相互作用，科学家们开发了多种实验技术，其中包括免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、GST pull-down、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）以及蛋白邻近连接技术（Proximity ligation assay，PLA）。本文将对这四种技术进行详细比较，帮助大家了解它们的优缺点及适用场景，选择合适的方法用于您的研究之中。
01 免疫共沉淀（Co-IP）
Co-IP是基于抗体-抗原特异性结合的特性来研究蛋白质相互作用的经典方法。利用特异性抗体精准捕获细胞裂解液中的目标蛋白，与目标蛋白直接或间接结合的互作蛋白则会被一同“吸”下来，最终通过洗涤、洗脱和分析等步骤，确定目标蛋白和其互作蛋白的身份和相互作用模式。
技术流程：
1、载体构建及转染（涉及互作位点或缺乏内源抗体时）；
2、提取细胞或组织的总蛋白质；
3、使用特异性抗体对目标蛋白质进行免疫沉淀；
4、免疫沉淀的复合物洗涤，洗脱；
5、通过Western blotting验证或质谱筛选分析与诱饵蛋白结合的目的蛋白。
技术优势:
1、在非变性条件下进行，保留蛋白质天然构象，反映生理条件下互作复合物；
2、操作简单，成本较低、适用范围广；
3、下游可结合多种方法研究相互作用。
技术局限：
1、无法检测弱/瞬时表达相互作用，无法区分直接/间接互作；
2、高度依赖抗体质量，抗体质量决定实验成败；
3、背景噪音较高，灵敏度低，有假阳性干扰；
4、仅提供静态互作情况，无法实时监测互作动态 。
应用案例：
2024年9月复旦大学临床医学院葛均波课题组在《Theranostics》期刊发表题为“Knocking out USP7 attenuates cardiac fibrosis and endothelial-to-mesenchymal transition by destabilizing SMAD3 in mice with heart failure with preserved ejection fraction”的研究论文。该团队利用Co-IP实验证明，USP7直接与SMAD3结合。这种结合引导SMAD3去除K63位点泛素链实现去其泛素化来维持SMAD3的稳定性，并防止SMAD3被蛋白酶体降解，来促进内皮间充质转化和心脏纤维化。
文献来源（Yuan et al., 2024）
02 GST pull-down
GST pull-down是一种通过亲和标签纯化进行体外检测蛋白质直接相互作用的实验工具。其基本原理是将已知蛋白（探针蛋白）与GST（谷胱甘肽-S-转移酶）融合表达形成GST融合蛋白，融合蛋白通过GST将已知蛋白固定在谷胱甘肽包被的琼脂糖珠上，充当一种“诱饵蛋白”。当含有与诱饵蛋白有相互作用的猎物蛋白（目的蛋白）的溶液过柱时，猎物蛋白会被捕获并与诱饵蛋白结合形成复合物，将复合物洗脱后，利用western-blot检测特定蛋白是否与诱饵蛋白结合；或通过质谱鉴定筛选出与诱饵蛋白可能互作的蛋白信息。
技术流程：
1、诱饵融合表达载体构建；
2、将GST标记的融合蛋白通过大肠杆菌表达系统进行表达纯化；
3、将GST-融合蛋白与含有目标蛋白质的细胞裂解液共孵育；
4、通过谷胱甘肽-Sepharose珠子捕获GST-融合蛋白及其结合的目标蛋白质；
5、分离和洗脱后，通过Western blotting或质谱分析检测目标蛋白质。
技术优势：
1、可以验证蛋白质-蛋白质之间的直接相互作用；
2、无需抗体，降低假阳性风险；
3、可结合质谱筛选未知互作蛋白。
技术局限：
1、实验在体外进行，不能完全反映细胞内蛋白的真实互作状态；
2、需要构建构建融合蛋白，标签可能影响蛋白的表达和结构；
3、需要进行蛋白纯化，受纯化质量影响大；
4、仅提供静态互作，无法实时监测互作动态 。
应用案例：
2023年11月常熟理工学院食品学院张杰课题组在《Molecular Cancer》期刊发表题为“ELF5 drives angiogenesis suppression though stabilizing WDTC1 in renal cell carcinoma”的研究论文。该研究发现，ELF5在肾细胞癌（RCC）中处于低水平表达，由于DNA高甲基化导致的ELF5下调通过RCC中的USP3/WDTC1轴抑制RCC的发展。该团队先利用Co-IP证明WDTC1和USP3存在生理条件下的相互作用，接着在利用GST pull-down证明这两个蛋白为直接互作。
文献来源（Li et al., 2023）
03 荧光共振能量转移（FRET）
荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET），是采用物理方法去检测分子间相互作用。FRET检测的原理是将两种荧光蛋白分别与两种目的蛋白融合表达，形成荧光供体蛋白与荧光受体蛋白，当两个融合蛋白之间的距离在1-10 nm的范围内，则供体发出的荧光可被受体吸收，并激发受体发出荧光，此时通过测量供体荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，供体所发出的荧光被受体接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。
技术流程：
1、细胞培养：根据实验培养特定的细胞用于后续的转染；
2、细胞转染：将要检测的X和Y蛋白分别偶联上CFP和YFP构建CFP-X和Y-YFP融合表达质粒载体，并将两个质粒共转染到培养的细胞中；
3、FRET图像采集：首先，确定FRET配对的激发波长，蓝光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号，最大供体信号和最小受体信号用于收集双表达细胞的FRET信号。其次，调整激光变化，以获取最大CFP信号和最小YFP信号的激发光波长，随后，采集供体和受体图像，并收集FRET信号。每个细胞FRET检测重复3次，确保结果的准确性。每种转染至少完成6个细胞的FRET检测，保障分析数据充分性；
4、FRET数据处理：去除FRET信号中供体的直接激发（DSBT）和受体的直接激发（ASBT）的光谱串色信号；对受体通路的FRET信号进行供体和受体光谱灵敏度、自发荧光和光学噪声的矫正；利用矫正系数对双标记细胞进行像素匹配矫正，以确保数据的准确性。通过以上步骤，获得更加精确和可靠的FRET数据来分析XY蛋白在细胞内的互作情况。
技术优势：
1、活细胞内实时监测：在活细胞内实时检测，从而观察生物分子在生理条件下动态变化和相互作用；
2、单分子灵敏度和高空间分辨率：FRET可以检测到纳米级别（1-10 nm）的距离变化，实现对单细胞水平的研究；
3、可以进行多色标记：在单细胞中同时引入多对荧光探针，同时监测多个生物事件，比如研究信号通路中多个蛋白的协同作用情况；
4、可与多种技术和手段联用：例如显微镜、色谱技术、电泳以及流式细胞技术等，提供多样化的研究手段。
技术局限：
1、应用局限且有距离限制：待检测的蛋白偶联的荧光基团可能会影响其正常功能。FRET信号强度受距离限制，只有供体和受体之间的距离在1-10 nm范围内才能检测到有效的能量转移；
2、对实验条件敏感：FRET信号可能受到多种因素的影响，如供体和受体的浓度、pH值、温度和离子强度等；
3、荧光背景干扰，存在假阳性：供受体的光谱重叠不好或复杂的生物样本中有其他背景荧光，都可能导致荧光干扰，影响实验结果的可靠性；
4、供体和受体的选择有限：合适的荧光分子数量有限，且每种分子有其特定的光谱特性和生物相容性。
应用案例：
2024年10月Oksana Berezovska团队发表在《Acta Neuropathologica Communication》期刊发表题为“PS1/gamma-secretase acts as rogue chaperone of glutamate transporter EAAT2/GLT-1 in Alzheimer’s disease”的研究论文。该研究发现，在阿尔茨海默病（特别是与早发性AD相关的PSEN1突变存在时），原本主要负责切割淀粉样前体蛋白(APP)产生Aβ的γ-分泌酶复合物的催化亚基--早老素1(PS1)，会以一种异常的方式与主要的谷氨酸转运体EAAT2/GLT-1相互作用。这种相互作用干扰了GLT-1的正常折叠、成熟和转运到细胞膜的过程，导致其功能受损（谷氨酸摄取减少），从而加剧了AD中的兴奋性毒性。这篇文章的FLIM-FRET实验有力地证实了PS1（尤其是AD相关的突变型PS1）能够与谷氨酸转运体GLT-1在细胞内发生直接的、增强的物理相互作用，这种相互作用损害GLT-1功能并最终导致AD兴奋性毒性。
文献来源（Perrin et al., 2024）
04 邻近连接技术（PLA）
邻近连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）是一种超灵敏的原位蛋白互作/蛋白修饰检测技术，通过DNA连接扩增将分子邻近性（<40 nm）转化为可视化信号。该技术使用特异性的抗体来识别并结合目标蛋白，再通过带有寡聚脱氧核苷酸（单链DNA）的PLA探针识别一抗并与之结合；当两个目标蛋白靠近时，两个目标蛋白的PLA探针的DNA就会配对互补，然后在连接酶的作用下，PLA探针上的DNA片段被连接在一起，会形成环状结构，通过滚环扩增（RCA）产生可检测的荧光信号。
技术流程：
1、准备样本：准备细胞或组织片子；
2、封闭样本：根据样本特性选择合适的封闭液进行封闭；
3、孵育一抗：加入两种一抗（不同种属来源）分别与结合目标分子；
4、PLA探针孵育：加入PLUS和MINUS两种PLA探针；
5、连接反应：加入连接缓冲液进行连接反应；
6、扩增及成像：加入扩增缓冲液并使用荧光显微镜观察两个目的蛋白的互作情况。
技术优势：
1、高灵敏度：即使细胞中的靶蛋白的表达量很低，PLA仍然能精准捕获互作事件；
2、高特异性：需要双抗体识别和双DNA探针同时结合靶标（<40 nm）才能触发信号，有效规避抗体非特异性吸附导致的假阳性，尤其适合复杂样本（如肿瘤微环境分析）；
3、原位检测：直接在细胞/组织原位捕获互作事件，保留亚细胞定位信息（如膜受体簇集、核内修饰位点），分辨率达40 nm；
4、适用于多种样本类型：适用于多种样本，如FFPE组织、穿刺活检等微量样本，可兼容IF/FISH等其他标记技术，为精准医疗提供分子病理新工具。
技术局限：
1、只能静态检测：由于需要固定样本并进行透化处理，只能捕捉某个时间的互作情况，无法实时追踪动态过程，对于研究瞬时信号有限制；
2、高度依赖抗体：低质量抗体会引发假阳性（交叉反应导致非特异结合）或假阴性（表位遮蔽阻碍有效识别），尤其当检测磷酸化等翻译后修饰时，抗体的质量尤为重要；
3、互作类型无法区分：该技术仅能证明两个蛋白在纳米尺度邻近（＜40 nm），但不能确定这种邻近源于直接结合还是通过支架蛋白介导的间接互作；
4、信号统计具有主观性：荧光点聚集或者组织自发荧光会干扰信号统计，对厚组织样本（＞10 μm），滚环扩增（RCA）效率从表层到深层逐级衰减，导致定量结果不准确。
应用案例：
2023年11月Jaerak Chang团队在《Autophagy》期刊发表题为“TRIM22 facilitates autophagosome-lysosome fusion by mediating the association of GABARAPs and PLEKHM1”的研究论文。该研究发现，E3泛素连接酶TRIM22在自噬体-溶酶体融合过程中扮演了关键的组织者角色。该研究利用PLA证实了TRIM22通过其SPRY结构域同时结合自噬体相关蛋白GABARAP/GABARAPL1 (ATG8家族成员) 和溶酶体相关支架蛋白PLEKHM1。TRIM22的这种结合作用有效地将GABARAPs和PLEKHM1“拉”到一起，促进它们之间的直接相互作用，从而形成功能性的复合物，最终促进自噬体与溶酶体的高效融合。
文献来源（eo et al., 2024）
四大技术对比
好了，说了这么多，你一定想知道那个技术才是需要的，小编总结如下:
想知道“生理条件下是否互作？” →选 Co-IP
想知道“是否直接互作？” → 选 GST Pull-down
想知道“活细胞里怎么互作以及动态结合情况？” → 选 FRET
想知道“组织中在哪互作？”“低表达蛋白能否检测互作？”→选 PLA
参考文献
[1] Yuan S, Wang Z, Yao S, et al. Knocking out USP7 attenuates cardiac fibrosis and endothelial-to-mesenchymal transition by destabilizing SMAD3 in mice with heart failure with preserved ejection fraction [J]. Theranostics. 2024;14(15):5793-5808.
[2] Li T, Xu L, Wei Z, et al. ELF5 drives angiogenesis suppression though stabilizing WDTC1 in renal cell carcinoma [J]. Mol Cancer. 2023;22(1):184.
[3] Perrin F, Anderson LC, Mitchell SPC, et al. PS1/gamma-secretase acts as rogue chaperone of glutamate transporter EAAT2/GLT-1 in Alzheimer's disease [J]. Acta Neuropathol Commun. 2024;12(1):166.
[4] eo H, Park H, Lee MS, et al. TRIM22 facilitates autophagosome-lysosome fusion by mediating the association of GABARAPs and PLEKHM1 [J]. Autophagy. 2024;20(5):1098-1113.
扫一扫
1631
被折叠的 条评论
为什么被折叠?
到【灌水乐园】发言
