ZLN005 通过 PGC-1α/ERRα 轴缓解 PBDE-47 诱导的线粒体翻译障碍

线粒体作为细胞的 “能量工厂”，其功能稳态对神经元的存活与功能维持至关重要，因为神经元属于高耗能细胞，对线粒体功能异常极为敏感。近年来，越来越多的研究证实线粒体功能障碍是 PBDEs 神经毒性的核心病理机制之一，前期研究已发现 PBDE-47 可诱导细胞线粒体 cristae 结构紊乱、动态平衡失调，并激活线粒体依赖性凋亡通路。线粒体生物发生与氧化磷酸化过程的调控依赖于核基因与线粒体基因的协同作用，其中过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅激活因子 1α（PGC-1α）与雌激素相关受体 α（ERRα）构成的信号轴发挥关键作用：PGC-1α 可通过激活核呼吸因子 1（NRF1）调控线粒体转录因子 A（TFAM）的表达，进而影响线粒体 DNA（mtDNA）编码基因的转录；ERRα 作为 PGC-1α 的关键互作伙伴，二者协同调控线粒体功能相关基因的表达。

此外，必需减数分裂核分裂 1（RMND1）作为 PGC-1α 与 ERRα 的共同靶基因，已被证实参与线粒体翻译过程的调控，而线粒体翻译是 mtDNA 编码基因转录生成的 mRNA 转化为蛋白质的关键步骤，其过程涉及起始、延伸、终止及线粒体核糖体循环四个阶段，每个阶段均需特定的核编码线粒体翻译因子参与。目前，关于 PBDE-47 是否通过干扰 PGC-1α/ERRα 轴调控的线粒体翻译过程诱发神经毒性，尚未有明确研究报道。​

2-（4 - 叔丁基苯基）苯并咪唑（ZLN005）作为一种小分子 PGC-1α 激活剂，具有独特的化学结构与生物学特性：其结构与噻苯咪唑类似，同属于苯并咪唑类化合物，且前期研究证实 ZLN005 经灌胃给药后其代谢产物可在 SD 大鼠脑组织中检出，提示其具备中枢神经系统靶向性。

已有研究表明 ZLN005 可通过激活 PGC-1α 改善胰岛素敏感性、缓解脑缺血诱导的神经元损伤，本团队前期研究也发现 ZLN005 可通过上调 PGC-1α 表达激活线粒体生物发生，从而减轻 PBDE-47 对 PC12 细胞的毒性作用。基于此，本研究通过建立 SD 大鼠体内模型与 PC12 细胞体外模型，系统探究 PBDE-47 对线粒体翻译的影响及其在神经毒性中的作用，并阐明 ZLN005 是否通过激活 PGC-1α/ERRα 轴调控线粒体翻译，进而缓解 PBDE-47 诱导的神经毒性。​

本研究采用 SPF 级 SD 大鼠与大鼠嗜铬细胞瘤 PC12 细胞作为研究对象，大鼠饲养于 SPF 级动物房，温度控制在 22±2℃，湿度 50±5%，光照周期为 12h 光 / 12h 暗，自由摄食标准颗粒饲料与饮水。每只孕鼠单独饲养，于出生后第 3 天（PND 3）每笼分配 8 只幼鼠（4 雄 4 雌），PND 21 后根据性别与处理条件分笼饲养至 PND 60。​

PBDE-47 暴露实验分为两部分：

研究 1 采用哺乳期暴露模型，于 PND 10 至 PND 16 期间对幼鼠进行 PBDE-47 灌胃处理。PBDE-47 粉末经室温超声 20min 溶解于玉米油中，将幼鼠随机分为对照组（玉米油灌胃）、0.1mg/kg/day PBDE-47 组、1.0mg/kg/day PBDE-47 组与 10mg/kg/day PBDE-47 组，给药体积为 5μL/g/day，每日 13:00-14:00 灌胃。该剂量选择基于前期研究：PND 10 单次灌胃 1、5、10mg/kg PBDE-47 可导致 2 月龄大鼠认知障碍，且参考 PBDE-47 神经毒性的无观察到有害作用水平（0.7mg/kg）与最低观察到有害作用水平（10.5mg/kg）。

研究 2 采用 ZLN005 干预模型，所用 ZLN005 购自 AbMole Bioscience（M2335），经二甲基亚砜（DMSO）溶解后用无菌生理盐水稀释。前期研究显示 2.5mg/kg ZLN005 静脉注射可缓解 SD 大鼠脑缺血损伤，考虑到腹腔注射生物利用度约为静脉注射的 80%，故选择 3.0mg/kg 作为腹腔注射剂量，于 PND 10、13、16 每日 14:00 给药。将雌性幼鼠分为 4 组（每组 10 只）：对照组（PND 10-16 玉米油灌胃 + PND 10、13、16 DMSO + 生理盐水腹腔注射）、PBDE-47 组（PND 10-16 10mg/kg/day PBDE-47 灌胃 + 同期 DMSO + 生理盐水腹腔注射）、ZLN005 组（PND 10-16 玉米油灌胃 + 同期 3.0mg/kg ZLN005 腹腔注射）、PBDE-47+ZLN005 组（PND 10-16 10mg/kg/day PBDE-47 灌胃 + 同期 3.0mg/kg ZLN005 腹腔注射）。行为学测试结束后 1 天内处死大鼠，分离海马组织并置于 - 80℃保存。​

PC12 细胞培养于含 10% 胎牛血清（FBS）与 1% 青霉素 - 链霉素的 RPMI 1640 培养基中，置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养。PBDE-47 粉末用 DMSO 溶解后，以培养基稀释至终浓度 1.0、10、20μmol/L，对融合度达 70%-80% 的 PC12 细胞处理 24h，对照组加入等体积 DMSO。ZLN005 处理浓度参考前期研究确定为 0.5μmol/L，于 PBDE-47 处理前加入细胞培养基。腺病毒转染实验中，空载体（Ad-Vector）与过表达 Rmnd1 的重组腺病毒（Ad-Rmnd1）以感染复数（MOI）200 在无血清培养基中转染 PC12 细胞，4h 后更换为含血清培养基，继续培养 20h 后进行 20μmol/L PBDE-47 处理 24h。siRNA 转染实验中，PGC-1α siRNA、RMND1 siRNA 及阴性对照（NC）siRNA ，最佳 PGC-1α siRNA 序列为 5′-GCACGCAGUCCUAUUCAUUTT-3′（反义链 5′-AAUGAAUAGGACUGCGUGCTT-3′），RMND1 siRNA 序列为 5′-GCACGCAGUCCUAUUCAUUTT-3′（反义链 5′-AAUGAAUAGGACUGCGUGCTT-3′），NC siRNA 序列为 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′（反义链 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）。按照转染试剂说明书，将 siRNA 转染至 PC12 细胞，48h 后进行后续处理。​

行为学测试包括 Morris 水迷宫（MWM）与旷场试验（OFT）。MWM 测试参照前期方法，分为定位航行试验（PNT）与空间探索试验（SPT）：PNT 持续 4 天，每日将大鼠从不同象限面向池壁放入水中，记录 60s 内找到平台的潜伏期、游泳距离与游泳速度；SPT 于 PNT 结束后次日移除平台，记录 60s 内大鼠在目标象限的停留时间、游泳距离及穿越原平台位置的次数，所有数据由视频跟踪系统自动记录。OFT 用于评估大鼠活动能力与焦虑水平，测试装置为 72×72×36cm 黑色箱体，内部分为 4×4 均匀网格（16 个方格），中心 4 个方格为中央区，边缘 12 个方格为周边区。在昏暗环境下，将大鼠置于箱体中心，观察 5min，记录总活动时间、总活动距离、中央区停留时间与中央区活动距离，每只大鼠测试结束后用 10% 乙醇擦拭箱体以去除气味干扰。​

Western blot 检测中，采用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂）提取细胞或海马组织总蛋白，通过 BCA 试剂盒定量蛋白浓度。取 30μg 变性蛋白进行 10% SDS-PAGE 电泳，湿转至 PVDF 膜，5% 脱脂牛奶室温封闭 3h 后，加入一抗 4℃孵育 12h。室温孵育二抗 1.5h 后，ECL 化学发光液显影，GeneGnome 系统采集信号，Image J 软件定量分析蛋白相对表达水平。​

ATP 含量测定中，采用线粒体提取试剂盒分离大鼠海马组织与 PC12 细胞的完整线粒体，BCA 法定量线粒体蛋白浓度，参照前期方法测定 ATP 水平，结果以 nmol/mg 蛋白表示。​

透射电镜（TEM）分析中，海马组织经 2.5% 戊二醛与 4% 多聚甲醛混合液 4℃固定过夜，1.0% 四氧化锇后固定，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，制备 70nm 超薄切片，柠檬酸铅与 4% 醋酸铀染色，在透射电镜（10000× 放大倍数）下观察线粒体超微结构，每样本随机选取 10 个视野（100μm²），统计线粒体数量。​

免疫组化（IHC）检测中，大鼠脑组织石蜡包埋后制备 5μm 切片，脱蜡至水，3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶活性，抗原修复后，加入 PGC-1α 一抗（1:50）4℃孵育过夜，二抗室温孵育 1h，DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片。光学显微镜采集图像，Image-Pro Plus 7.0 软件分析海马 CA1 区 PGC-1α 阳性染色平均光密度，每样本选取 5 张冠状切片进行分析。​

流式细胞术检测线粒体膜电位（MMP）中，PC12 细胞经处理后，加入 JC-1 染色液 37℃孵育 20min，PBS 洗涤 2 次，采用 Attune NxT 流式细胞仪检测 490/525nm（绿色荧光）与 590/620nm（红色荧光）处荧光强度，以红色荧光 / 绿色荧光比值表示 MMP 水平。​

细胞活力检测采用 CCK8 试剂盒（AbMole），PC12 细胞以 5×10³ 个 / 孔接种于 96 孔板，经处理后，加入含 1/3 体积 CCK8 溶液的培养基，37℃孵育 30min，酶标仪（Tecan，瑞士）测定 450nm 处吸光度（OD）值，细胞活力（%）=（处理组 OD 值 - 空白组 OD 值）/（对照组 OD 值 - 空白组 OD 值）×100%。​

统计分析采用 SPSS 20.0 软件，数据以均值 ± 标准差（SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用 Fisher 最小显著差异（LSD）法，两组间比较采用独立样本 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。​

哺乳期 PBDE-47 暴露对 SD 大鼠神经行为与海马 PGC-1α/ERRα 轴的影响结果显示，旷场试验中，PBDE-47 处理组大鼠活动轨迹较对照组明显紊乱，10mg/kg/day 组总活动距离与总活动时间显著降低，中央区停留时间与中央区活动距离占比显著减少（P<0.05），提示 PBDE-47 暴露可导致大鼠焦虑样行为增加（图 1B、C）。Western blot 与 RT-qPCR 结果显示，随着 PBDE-47 暴露剂量升高，大鼠海马组织中 PGC-1α 与 ERRα 的蛋白及 mRNA 表达水平呈剂量依赖性降低，10mg/kg/day 组降低最为显著（P<0.05）（图 1D、E）。免疫组化结果进一步证实，10mg/kg/day PBDE-47 组海马 CA1 区 PGC-1α 阳性神经元数量减少，平均光密度显著低于对照组（P<0.05）（图 1F），而海马 CA1 区神经元功能与自发运动活性密切相关，上述结果提示哺乳期 PBDE-47 暴露可能通过抑制 PGC-1α/ERRα 轴诱发大鼠神经行为异常。​

为探究 PBDE-47 对线粒体翻译与功能的影响，检测大鼠海马组织线粒体 ATP 含量、相对 mtDNA 含量及线粒体翻译相关分子表达。结果显示，10mg/kg/day PBDE-47 组线粒体 ATP 含量较对照组显著降低（P<0.05），相对 mtDNA 含量（ND1/GAPDH 比值）也显著下降（P<0.05）（图 2A、B），表明 PBDE-47 暴露可抑制线粒体功能并减少 mtDNA 拷贝数。

同时，10mg/kg/day PBDE-47 组 RMND1 的蛋白及 mRNA 表达水平显著低于对照组（P<0.05）（图 2C、D），而 RMND1 作为 PGC-1α/ERRα 轴的靶基因，其表达降低提示该信号轴功能受抑可能影响线粒体翻译调控。进一步检测线粒体翻译各阶段关键因子发现，PBDE-47 暴露可剂量依赖性降低 TUFM（延伸阶段）、mtRF1L（终止阶段）、mtIF3（起始阶段）及 mtRRF1（核糖体循环阶段）的蛋白与 mRNA 表达，10mg/kg/day 组上述因子表达均显著低于对照组（P<0.05）（图 2E、F）。mtDNA 编码的呼吸链亚基（ND5、Cytb、CO2、ATP6）作为线粒体翻译的终产物，其蛋白表达水平在 10mg/kg/day PBDE-47 组也显著降低（P<0.05）（图 2G），提示 PBDE-47 通过抑制线粒体翻译过程，减少呼吸链亚基合成，进而导致线粒体功能障碍。​

ZLN005 对 PBDE-47 暴露大鼠神经行为与 PGC-1α/ERRα 轴的改善作用研究显示，Morris 水迷宫定位航行试验中，PBDE-47 组大鼠第 4 天逃避潜伏期显著长于对照组，游泳距离显著增加（P<0.05）；而 PBDE-47+ZLN005 组逃避潜伏期与游泳距离较 PBDE-47 组显著缩短（P<0.05），与对照组无显著差异（图 3B、C）。空间探索试验中，PBDE-47 组大鼠在目标象限停留时间占比与平台穿越次数显著低于对照组（P<0.05），PBDE-47+ZLN005 组上述指标较 PBDE-47 组显著升高（P<0.05），且接近对照组水平（图 3D、E），表明 ZLN005 可改善 PBDE-47 诱导的大鼠空间学习记忆障碍。

旷场试验结果显示，PBDE-47 组总活动距离、总活动时间及中央区停留时间占比显著低于对照组（P<0.05），PBDE-47+ZLN005 组上述指标较 PBDE-47 组显著恢复（P<0.05）（图 4A、B），提示 ZLN005 可缓解 PBDE-47 诱导的焦虑样行为。Western blot 与 RT-qPCR 结果显示，PBDE-47 组海马 PGC-1α 与 ERRα 的蛋白及 mRNA 表达显著低于对照组（P<0.05），而 PBDE-47+ZLN005 组上述分子表达较 PBDE-47 组显著升高（P<0.05）（图 4C、D）；免疫组化结果也证实，PBDE-47+ZLN005 组海马 CA1 区 PGC-1α 阳性染色平均光密度较 PBDE-47 组显著增加（P<0.05）（图 4E）。

透射电镜观察发现，PBDE-47 组大鼠海马神经元线粒体出现肿胀、嵴断裂甚至消失等结构异常，而 PBDE-47+ZLN005 组线粒体结构基本恢复正常， cristae 排列整齐（图 4F），表明 ZLN005 可通过激活 PGC-1α/ERRα 轴，改善 PBDE-47 诱导的线粒体结构损伤与神经行为异常。​

ZLN005 对 PBDE-47 诱导的大鼠海马线粒体功能和翻译障碍的逆转作用研究表明，PBDE-47 组线粒体 ATP 含量与相对 mtDNA 含量显著低于对照组（P<0.05），PBDE-47+ZLN005 组上述指标较 PBDE-47 组显著升高（P<0.05），且与对照组无显著差异（图 5A、B），提示 ZLN005 可恢复 PBDE-47 诱导的线粒体能量代谢障碍与 mtDNA 拷贝数减少。

同时，PBDE-47+ZLN005 组 RMND1 的蛋白及 mRNA 表达水平较 PBDE-47 组显著升高（P<0.05）（图 5C、D），TUFM、mtRF1L、mtIF3、mtRRF1 等线粒体翻译因子的蛋白与 mRNA 表达也显著高于 PBDE-47 组（P<0.05）（图 5E、F）。此外，PBDE-47+ZLN005 组 mtDNA 编码亚基 ND5、Cytb、CO2、ATP6 的蛋白表达水平较 PBDE-47 组显著恢复（P<0.05）（图 5G），表明 ZLN005 可通过激活 PGC-1α/ERRα 轴，上调 RMND1 与线粒体翻译因子表达，促进线粒体翻译过程，进而恢复线粒体呼吸链功能。​

PC12 细胞体外实验结果显示，PBDE-47 处理可剂量依赖性降低 ERRα 与 RMND1 的蛋白及 mRNA 表达，20μmol/L 组降低最为显著（P<0.05）（图 6A、B）；同时，20μmol/L PBDE-47 组 TUFM、mtRF1L、mtIF3、mtRRF1 的蛋白及 mRNA 表达水平也显著低于对照组（P<0.05）（图 6C、D），与体内实验结果一致，证实 PBDE-47 可抑制神经细胞线粒体翻译过程。而加入 0.5μmol/L ZLN005 处理后，PBDE-47+ZLN005 组 ERRα 与 RMND1 的蛋白及 mRNA 表达较 PBDE-47 组显著升高（P<0.05）（图 6E、F），线粒体翻译因子的表达也显著恢复（P<0.05）（图 6G、H）。

流式细胞术结果显示，PBDE-47 组 MMP（JC-1 红 / 绿荧光比值）显著低于对照组（P<0.05），PBDE-47+ZLN005 组 MMP 较 PBDE-47 组显著升高（P<0.05）（图 6I）；CCK8 检测显示，PBDE-47 组细胞活力显著降低（P<0.05），PBDE-47+ZLN005 组细胞活力较 PBDE-47 组显著恢复（P<0.05）（图 6J），提示 ZLN005 可在体外缓解 PBDE-47 诱导的神经细胞线粒体功能障碍与细胞损伤。​

为明确 PGC-1α 在 ZLN005 神经保护作用中的关键地位，采用 siRNA 敲低 PC12 细胞中 PGC-1α 表达。结果显示，PGC-1α siRNA 可显著降低 ZLN005 诱导的 PGC-1α、ERRα 及 RMND1 蛋白与 mRNA 表达升高（P<0.05）（图 7A、B），同时抑制 ZLN005 对 TUFM、mtRF1L、mtIF3、mtRRF1 表达的恢复作用（P<0.05）（图 7C、D）。此外，PGC-1α 敲低后，ZLN005 对 PBDE-47 诱导的 mtDNA 编码亚基（Cytb、ATP6）表达降低、MMP 下降及细胞活力抑制的缓解作用均被显著削弱（P<0.05）（图 7E、F、G），表明 PGC-1α 是 ZLN005 激活 PGC-1α/ERRα 轴、调控线粒体翻译的核心分子。​

进一步探究 RMND1 在线粒体翻译中的作用发现，RMND1 siRNA 可显著降低 ZLN005 诱导的 RMND1 蛋白与 mRNA 表达升高（P<0.05），但对 PGC-1α 与 ERRα 的表达无显著影响（P>0.05）（图 8A、B），提示 RMND1 是 PGC-1α/ERRα 轴的下游靶分子。RMND1 敲低后，ZLN005 对 TUFM、mtRF1L、mtIF3、mtRRF1 表达的恢复作用被显著抑制（P<0.05）（图 8C、D），mtDNA 编码亚基（Cytb、ATP6）的蛋白表达、线粒体 ATP 含量及细胞活力也显著低于 NC siRNA 转染的 PBDE-47+ZLN005 组（P<0.05）（图 8E、F、G）。而 Ad-Rmnd1 转染可显著升高 PBDE-47 处理的 PC12 细胞中 RMND1 表达（P<0.05），并上调线粒体翻译因子与 mtDNA 编码亚基的表达，恢复线粒体 ATP 含量与细胞活力（P<0.05），进一步证实 RMND1 是 PBDE-47 抑制线粒体翻译及 ZLN005 发挥保护作用的关键效应分子。​

综上，本研究通过体内外实验证实，哺乳期 PBDE-47 暴露可通过抑制 PGC-1α/ERRα 轴，下调 RMND1 与线粒体翻译因子表达，干扰线粒体翻译过程，减少 mtDNA 编码呼吸链亚基合成，进而导致线粒体功能障碍与神经行为异常；而 AbMole 品牌的 ZLN005 可通过激活 PGC-1α/ERRα 轴，恢复 RMND1 与线粒体翻译因子表达，促进线粒体翻译，改善线粒体结构与功能，从而缓解 PBDE-47 诱导的神经毒性。该研究不仅揭示了线粒体翻译障碍在 PBDE-47 神经毒性中的关键作用，也为针对 PGC-1α/ERRα 轴开发缓解环境污染物神经毒性的干预策略提供了实验依据。