手把手教你如何获得光学成像系统的PSF（点扩散函数）——从beads成像到处理图像的经验分享

首先声明：仅发表个人理解，因为我的课题研究经历更多都是自己搜罗的资源，课题组其他人都没有做这个方向的，所以如果有不对的地方，欢迎评论区讨论。

1、样品的购买和制备

我们会使用beads，俗称荧光小球，它是一个点光源，具有一定的直径，一般是0.1um，0.2um，0.5um，1um等几个直径挡位，在不同的系统下，它能成像到的点扩散函数不一样，这是反应系统质量和参数的一个标准样本。

第一步是购买beads，一般会购买ThermoFisher的荧光小球，链接如下：

荧光微球，适用于多种生物学应用领域 | Thermo Fisher Scientific - CN

可以根据你所需要使用的系统选定波段和直径，对于一般商业的光学系统来说都是0.2um就够用的，也可以根据你研究领域的相关文献留意下使用的直径和波段；标注的505/515指的是激发波段/发射波段，也就是根据你系统的波长来选定。

第二步是制备beads，国外有一个视频讲解如何制备：

Measuring a Point Spread Function

也有b站搬运的：【搬运+自制字幕】如何测量显微镜点分布函数_哔哩哔哩_bilibili

制备beads需要注意以下几点：

①视频中稀释的倍数不一定是用于你的样本，因此稀释beads时可以设置几个梯度，比如1000倍、10000倍、100000倍，根据实际成像结果选择最终的梯度；

②视频中使用的酒精烘干和旋转的那个我都没有用，但是效果一样

③视频中采用了盖玻片，其实不采用也是一样的效果

2、成像

实际成像让我踩过的坑可太多了，大部分都是技术性错误，建议先用商业系统进行成像，看看beads的密度和亮度是否正常，尽管处理图像的时候只需要选用一个beads，但我总会采用画面上有遍布但不重叠的稀释梯度，它们像星星一样微弱地存在着。

如果beads正常，但你仍然看不到图像，别怀疑，就是你系统哪里搭错了或者成像步骤错了。

3、结果处理

成像后你会得到一个Z stack，那么如何获得系统的psf呢？

你可以使用比较快捷的插件直接处理图像获得psf，也可以自己写代码处理，这里我提供插件处理的方法：

MetroloJ [ImageJ Documentation Wiki]

下载插件后，将安装包放入imageJ的plugins文件中，重启imageJ，你会在plugin框中看到MetroloJ插件的。如果没有看到，那么再下载链接中的补充安装包。

然后使用ImageJ打开想要处理的文件

然后使用roi画出带有单个beads的区域

 然后image-->crop裁剪圈出来的区域

再点击plugin->metroloj->generate psf report，再填写完基本的波长信息后，就可以获得一份系统psf的文件，注意有可能会需要填写pixel的实际长度信息。

这样就可以获得实际系统的PSF，包括分辨率和焦深。

如果你对处理结果要求高的话，可以自己写代码（因为我代码挺懒的就不放出来了），或者直接画一条线处理，分辨率可以直接画条线，然后analysis->plot profile，matlab拟合高斯函数获得半高全宽，而焦深可以直接image->stack->plot z profile，同样matlab拟合数据，然后根据要求自己绘图。

更新：有朋友说下载插件的网站进不去，这里我分享一下插件，并且说一下安装步骤。

(3条消息) 第一篇文章中提及到的插件-Java文档类资源-CSDN文库

首先下载的是一个压缩文件，解压缩后会看到两个jar文件:

 然后打开你imageJ的插件的路径，如下图：

 我是之前把软件装在E盘的，大家自己找到软件包安装的位置，打开plugins的文件，能看到很多插件。说明：Fiji其实就是ImageJ，区别是Fiji自动包含了各种有用的插件，而ImageJ1需要手动安装插件。

然后把我分享的插件复制到这个文件里面

 再重启ImageJ就可以使用插件啦！