单细胞测序流程分析

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已于 2022-08-25 17:45:17 修改

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文章标签： python 开发语言

于 2022-08-25 17:30:08 首次发布

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一.读入10x数据并创建seurat对象

#pbmc为外周血单个核细胞
library(Seurat)
pbmc.data <- Read10X(data.dir="E:/GSE152982_RAW/hg19")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts=pbmc.data,project = "pbmc5k",min.cells = 3,min.features =200)

创建Seurat对象，counts为读取的源文件，project为Seurat对象想保存的文件名

min.features为筛细胞，一个细胞中测出的最少的基因数量

min.cells为筛选基因，该feature至少在n个细胞内被覆盖

这个原始数据来自CellRanger的处理，Cellranger返回一个UMI的count矩阵。矩阵里的列是细胞，行是基因。接下来我们用count矩阵创建Seurat对象。这个对象就好比一个容器，里面装着单细胞数据集，比如count矩阵，PCA，聚类结果等等。举个栗子：count matrix 储存在pbmc[["RNA"]]@counts里。

二.质控

library(magrittr)
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
#%>%为管道函数，就是把左件的值发送给右件的表达式（暂存在内存当中，没有保存为对象在硬盘中）
pbmc@meta.data %>% head()

^MT- 表示线粒体，进行质量控制，看一下线粒体里面的数据有多少。太多了说明就是有污染
创建一列名为percent.mt的新数据，添加到pbmc中，使用PercentageFeatureSet函数（此函数可以计算每个细胞中每一细胞器的QC指标）计算线粒体基因占比。

PercentageFeatureSet 函数是根据counts总数相除算的打分：该基因集的counts总和/所有基因的counts总和。
#%>%为管道函数，就是把左件的值发送给右件的表达式（暂存在内存当中，没有保存为对象在硬盘中）

画小提琴图加散点图去除极值点

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 4000 & percent.mt < 25)

三.标准化

#通常情况下采用全局缩放的归一化方法"LogNormalize"，
 pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
#“SCTransform” 方法是一种三合一的方法，可以将质控，归一化和去识别高变基因合为一体
 pbmc <- SCTransform(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt", verbose = FALSE)

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