基因工程是一种通过人为方法对生物遗传物质进行改造的技术。在基因工程的基本操作程序中，通常包含四个主要步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
目的基因的获取可以通过从基因文库中直接获取基因组DNA或使用反转录酶从mRNA合成cDNA。基因文库分为基因组文库和部分基因文库，前者包含了生物体全部基因组的DNA片段，后者则只包含了转录产生的mRNA对应的cDNA片段。
PCR技术是利用特定的引物和酶来扩增特定的DNA序列，其过程包括高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段，通过重复循环实现目的基因的指数级扩增。PCR技术需要已知目的基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、引物、TaqDNA聚合酶以及适宜的温度和PH值。通过这种方法可以快速获得大量的目的基因片段。
基因表达载体是基因工程中的关键因素，它通常包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。构建基因表达载体时，需要将目的基因插入到合适的位置，并确保启动子和终止子正确地调控基因的表达。构建过程中，两个DNA片段连接形成的产物可以有多种，具体取决于连接点和片段的排列组合。
将目的基因导入受体细胞有多种方法，包括农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法和转化微生物细胞的方法。农杆菌转化法适用于植物细胞，通过让农杆菌感染植物细胞导入目的基因；基因枪法则通过高速微粒将目的基因导入植物细胞；花粉管通道法利用植物的自然授粉过程将基因送入；显微注射法则通过显微镜将目的基因直接注入动物的受精卵；而转化微生物细胞则通常通过Ca2+处理使细胞处于感受态，然后与表达载体混合，使感受态细胞吸收DNA分子。
目的基因的检测与鉴定可以在分子水平和个体水平上进行。分子水平的检测包括DNA分子杂交技术来检测目的基因是否被插入、是否转录出mRNA以及是否翻译成蛋白质。个体水平的鉴定则是观察基因工程生物的表型变化。通过这些技术可以确保目的基因在受体细胞中正确表达。
在基因工程中，基因表达载体的构建不仅需要目的基因，还需要启动子和终止子以控制基因的表达，以及标记基因以方便基因工程细胞的筛选。因此，基因工程表达载体并非仅仅含有目的基因就能完成任务。
思考题的答案反映了对基因工程操作程序的深入理解。例如，关于基因工程的叙述正确的是，限制酶在构建重组质粒时也在细胞外发挥作用；不是所有质粒都可以作为基因工程的运载体；蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索。在特定基因工程的叙述中，目的基因是通过反转录获得，而启动子对于目的基因在受体细胞中的表达是不可或缺的。对于PCR过程的描述，变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，但解旋酶并不参与PCR过程；复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成；延伸过程中需要DNA聚合酶、四种核苷酸但不是核糖核苷酸，而是脱氧核苷酸；PCR过程所用酶的最适温度确实比细胞内DNA复制所用酶的最适温度要高。此外，通过人工合成方法获得目的基因的途径之一是以目的基因转录的RNA为模板，逆转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA。基因工程常用的受体细胞包括细菌、真菌，若将真核基因在原核细胞中表达，则对该目的基因的基本要求包括去除内含子、调整密码子使用频率以及添加原核生物的启动子等。假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有两种DNA分子，它们分别是：一个是目的基因片段插入到质粒中的重组DNA分子，另一个是质粒自身环化形成的非重组DNA分子。
