Coverage Uniformity OverOnTarget Rate for Efficient Targeted NGS

下一代测序（NGS）已成为研究和临床环境中检测变异的技术首选。尽管测序成本正在稳步下降，但大规模的全基因组测序仍然过于昂贵，因此研究常常集中在使用靶向测序技术针对特定基因和基因位点进行研究。靶向测序依赖于对感兴趣的基因组区域进行富集后再进行测序。例如，在外显子测序中，设计了生物素化的合成DNA探针以杂交到外显子区域。在与基因组DNA样本杂交后，探针被纯化以产生富含外显子区域的样本。尽管靶向富集可以降低成本并使实验更可行和集中，但它也引入了偏差，这些偏差降低了测序工作的效率。虽然由于靶向NGS的随机性，一些效率低下是不可避免的，但其中许多效率低下是由于靶向富集探针板的设计和生产固有的（Warret al. 2015）。一些探针交叉杂交到非目标区域，导致“离靶”（非特异性）捕获。探针板还可能存在捕获效率不平衡（缺乏均匀性），导致某些目标区域过度富集而其他区域富集不足。为了确保高置信度的数据，研究人员必须增加测序量以提高覆盖度较低的区域的覆盖度。然而，这种策略导致了其他本已充足覆盖的区域的过度测序，从而导致更高的测序成本和效率降低。这种“浪费的测序”程度反映在均匀度和靶向率这两个描述靶向测序整体效率的指标上。在本文中，我们将使用商业外显子试剂盒典型的靶向率和均匀度范围来数学建模两个指标对整体效率的相对影响。我们证明，尽管大多数商业探针板只引用了靶向率，但均匀度对于靶向测序的整体效率至关重要。 靶向测序的均匀度是指在目标区域中测序读取的分布均匀性。如果一个区域中的读取深度非常低，那么这个区域可能没有得到充分的覆盖，从而导致变异检测的不准确。均匀度低可能是因为设计和生产探针板时的偏差，如一些探针的交叉杂交或某些特定区域的过度捕获。这需要研究人员增加测序的总体量以确保覆盖率低的区域有足够多的读取次数，以便准确检测变异。然而，这也会导致原本读取深度已足够高的区域被重复测序，从而增加了测序成本并降低了整体实验的效率。 靶向率则是另一个重要指标，它指的是测序读取中落在目标区域的比例。在高靶向率的情况下，大部分读取都能准确地富集到感兴趣的区域，减少测序读取在外显子区域外的浪费，从而提高了测序的整体效率。然而，即使有高靶向率，如果均匀度不佳，我们仍然会面对许多区域覆盖不足而其他区域过度覆盖的问题，这需要额外的测序来弥补覆盖率较低的区域，从而导致了不必要的额外成本和效率低下。 商业外显子试剂盒通常会宣传其产品具有高靶向率，但往往忽视了均匀度的重要性。一个高靶向率的试剂盒如果均匀度不佳，那么在实际应用中可能不如靶向率稍低但均匀度较好的试剂盒有效。这是因为后者能够提供更一致的数据，减少了对额外测序的需求，从而提高了实验的总体效率。 通过数学建模，研究人员可以评估不同靶向率和均匀度的组合如何影响靶向测序的整体效率。优化这些参数可以帮助研究人员在保证数据质量的同时，最大化测序的经济性和效率。因此，在选择靶向测序试剂盒时，需要综合考虑靶向率和均匀度两个指标，而非单独依赖于某一个参数。这样，研究人员才能在有限的资源下，进行更为高效和准确的变异检测研究。