FLUORESCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA:

HISTORIA DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA:
Aunque el fenmeno de la QL se conoce desde 300 aos a.C., el desarrollo de
aplicaciones analticas es relativamente reciente. Debido a su alta sensibilidad y
selectividad, los mtodos basados en detecciones QL suponen una herramienta
analtica de gran utilidad. La primera aplicacin de la QL como tcnica analtica la
llev a cabo Erdey en 1957, que estudi el uso de varias sustancias, como
luminol, lofina y lucigenina, como indicadores volumtricos. Las investigaciones
sobre el potencial analtico de la QL para anlisis de rutina datan de los aos 70,
en el caso de reacciones en fase gaseosa, y de la d- cada de los 80 para
reacciones en fase lquida.
Desde entonces, los mtodos quimioluminiscentes han sido ms ampliamente
utilizados, fundamentalmente en anlisis bioqumico y ambiental, y el nmero de
publicaciones y comunicaciones sobre el tema ha ido incrementando de forma
exponencial desde la celebracin del primer Simposium Internacional sobre
Bioluminiscencia y Quimioluminiscencia, celebrado en Bruselas en 1978. De
hecho, en el desarrollo de mtodos QL pueden diferenciarse dos periodos: una
primera etapa (1928-1940) caracterizada por la bsqueda de nuevos compuestos
o sistemas quimioluminiscentes, por medio de modificaciones qumicas de
estructuras bien conocidas, y, desde la 2 Guerra Mundial hasta el presente, un
avance en la instrumentacin, junto con el desarrollo de conceptos tericos de los,
a veces, complejos principios de la QL.

HISTORIA DE LA FLUORESCENCIA:
Una temprana observacin de la fluorescencia fue descrita en 1560 por
Bernardino de Sahagn y en 1565 por Nicols Monardes en la infusin conocida
como lignum nephriticum (del latn, "madera renal"). Fue derivado de la madera de
dos especies de rboles, Pterocarpus indicus yEysenhardtia polystachya
El compuesto qumico responsable de esta fluorescencia es la matlalina, que es el
producto de oxidacin de uno de los flavonoides que se encuentran en esa
madera. En 1819, Edward D. Clarke y en 1822 Ren Just Hay vid
Brewster describi el fenmeno en la clorofila8 y en 1845 sir John Herschel hizo lo
mismo con laquinina.9
En un artculo de 1852 sobre la "refrangibilidad " (cambio de longitud de onda) de
la luz, George Gabriel Stokes describi la facultad del fluorspar y del cristal de
uranio para cambiar la luz invisible ms all del extremo violeta del espectro visible
en luz azul. Llam a este fenmeno fluorescencia (fluorescence): Casi me inclino
a acuar una palabra, y llamo la apariencia fluorescencia, de fluor-spar [es decir, la
fluorita], como el trmino anlogo opalescencia se deriva del nombre de un
mineral. El nombre fue derivado del mineral fluorita (difluoruro de calcio), que en

algunas muestras tiene rastros de europio bivalente, que sirve como activador
fluorescente emitiendo luz azul. En un experimento clave utiliz un prisma para
islar la radiacin ultravioleta de la luz solar y observ la luz azul emitida por una
solucin de etanol de quinina expuesto por ella.

QU ES LA QUIMIOLUMINISCENCIA?
Quimioluminiscencia (CLIA por su nombre en ingls: ChemiLuminescent
Immuno Assay) es el fenmeno por el que, en ciertas reacciones qumicas, la
energa liberada no slo es emitida en forma de calor o de energa qumica, sino
tambin en forma de luz.
La quimioluminiscencia es un fenmeno que se produce cuando, en una reaccin
qumica, los electrones saltan de las capas ms altas de los tomos a las ms
bajas.
Se entiende adems, que la quimioluminiscencia es la propiedad que tienen
algunas sustancias qumicas para emitir luz. Estas sustancias son, por ejemplo,
las que se emplean para los nmeros de los relojes que brillan en la oscuridad, o
las que de forma natural tienen algunos animales, como las lucirnagas.
Adems tienen su aplicacin en la medicina, en esta rea por lo general se
emplean para detectar la existencia de sustancias qumicas en las biopsias de
tejidos.
La quimioluminiscencia, como se puede ver, es algo propio de los laboratorios.
No hay ninguna prueba que se aplique a los enfermos que se base en
la quimioluminiscencia.
En el laboratorio clnico los sistemas que llevan a cabo esta reaccin fueron
especialmente diseados para realizar inmuno ensayos con tecnologa
automatizada de vanguardia como lo es la quimioluminiscencia, mtodo de lectura
con mayor sensibilidad que ELISA, basndose en el principio de emisin de
energa luminosa a travs de una reaccin qumica (Enzima Sustrato).
La QL se define como la emisin de radiacin electromagntica (normalmente en
la regin del visible o del infrarrojo cercano) producida por una reaccin qumica.
Cuando esta emisin proviene de organismos vivos o sistemas derivados de ellos,
se denomina bioluminiscencia. Ambos fenmenos son procesos luminiscentes que
se han identificado tradicionalmente mediante un prefijo que identifica la fuente de
energa responsable del inicio de la emisin de radiacin electromagntica.

Actualmente, los procesos de luminiscencia se han incluido en la lista de

fenmenos luminiscentes.

QU ES LA FLUORESCENCIA?
La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las
sustancias que son capaces de absorber energa en forma de radiaciones
electromagnticas y luego emitir parte de esa energa en forma de radiacin
electromagntica de longitud de onda diferente.
La energa total emitida en forma de luz es siempre menor a la energa total
absorbida y la diferencia entre ambas es disipada en forma de calor. En la mayora
de los casos la longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor
energa- que la absorbida, sin embargo, si la radiacin de excitacin es intensa, es
posible para un electrn absorber dos fotones; en esta absorcin bifotnica, la
longitud de onda emitida es ms corta que la absorbida, sin embargo en ambos
casos la energa total emitida es menor que la energa total absorbida.
En general las sustancias fluorescentes absorben energa en forma de radiacin
electromagntica de onda corta (p ej radiacin gamma, rayos x, UV, luz azul, etc),
y luego la emiten nuevamente a una longitud de onda ms larga, por ejemplo
dentro del espectro visible; los ejemplos ms notables de fluorescencia ocurren
cuando la luz absorbida se encuentra dentro del rango ultravioleta del espectro
-invisible al ojo humano- y la luz emitida se encuentra en la regin visible.
El mecanismo de fluorescencia tpico implica tres pasos secuenciales, llamados
respectivamente absorcin (1), disipacin no radiativa (2) y emisin (3).
El mecanismo de fluorescencia tambin se encuentra muy relacionado con el
proceso de quimioluminiscencia.

PARTES DEL EQUIPO DE QUIMIOLUMINISCENCIA:

La instrumentacin para medidas de QL vara desde sistemas muy simples hasta
instrumentacin ms compleja, pudindose usar un fluormetro simplemente con la
fuente de excitacin apagada.

PARTES DEL EQUIPO DE FLUORESCENCIA:

Un monocromador selecciona una longitud de onda de excitacin, y la
fluorescencia se examina con un segundo monocromador el cual se coloca de
manera que forme un ngulo de 90 con la luz incidente. Manteniendo fija la
y
haciendo un barrido de la radiacin emitida, se obtiene un espectro de emisin. Si
la
se mantiene constante y se hace variar la
, se obtiene el espectro de
excitacin.
Fuentes: En la mayora de las aplicaciones se necesita una fuente ms intensa
que las lmparas de volframio o de deuterio utilizadas para la medida de
absorcin. Esto se debe, como qued demostrado anteriormente a que la
magnitud de la seal de salida, y por tanto la sensibilidad, es directamente
proporcional a la potencia de la fuente P0. Normalmente se utiliza una lmpara de
arco de xenn o de mercurio.
Filtros y monocromadores: En los fluormetros se utilizan tanto los filtros de
interferencia como los de absorcin, mientras que los espectrofluormetros estn
equipados con monocromadores de red.
Detectores: La seal de fluorescencia tpica es de baja intensidad, por tanto, se
necesitan factores de amplificacin altos para estas medidas. Los tubos
fotomultiplicadores son los ms utilizados como detectores en instrumentos de
fluorescencia sensibles.
Cubetas: Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilndricas como
rectangulares fabricadas con vidrio o ms normalmente con slice.

VENTAJAS
Y
APLICACIONES
QUIMIOLUMINISCENCIA:

DE

LA

Hoy en da, el inters analtico de la QL est aumentando considerablemente

debido a las ventajas ya comentadas, como bajos lmites de deteccin, rangos
dinmicos amplios, alta sensibilidad y la gran versatilidad de los mtodos QL.
Recientemente, las investigaciones se estn centrando especialmente en el
desarrollo de productos quimioluminiscentes para aplicaciones de diagnstico
clnico; as, la QL es hoy en da un posible sustituto del marcado isotpico,
remplazando as el uso de radioistopos. La QL se aplica tambin en el control de
calidad de productos crnicos y residuos, existiendo igualmente aplicaciones en la
medida del ozono ambiental. Considerablemente ventajosa resulta la sensibilidad
que ofrecen las reacciones basadas en QL en diversos mbitos del anlisis
aplicado, por ejemplo en la determinacin de compuestos prohibidos en diversas
matrices.
Siguiendo la tendencia general en qumica analtica, la mejora en los mtodos de
deteccin est dirigida actualmente a la miniaturizacin y, por lo tanto, a reducir el
gasto de disolventes orgnicos en mtodos de separacin, empleando ms
sistemas acuosos y volmenes de muestra menores con concentraciones
inferiores. Como las tcnicas quimioluminiscentes pueden proporcionar mejoras
en estas situaciones, la instrumentacin para medidas quimioluminiscentes y el
desarrollo de acoplamientos con interfaces selectivas fsicas o qumicas que
permitan medidas selectivas estn tambin dirigidos a conseguir este fin, de modo
que puedan eliminarse las desventajas de las tcnicas basadas en medidas
directas de QL (como falta de selectividad o dependencia de factores fsicoqumicos).
Debido a que la QL puede resolver las limitaciones en la deteccin en estos casos,
resulta previsible el desarrollo de este acoplamiento en la prxima dcada. Como
ejemplo, puede mencionarse un sistema descrito recientemente, basado en
deteccin quimioluminiscente de enzimas y que emplea la tcnica denominada
micro ensayo a travs de electroforesis (EMMA, electrophoretically mediated
microassay), que permite la deteccin de enzimas a niveles de zepto moles, tanto
en capilares abiertos como en canales realizados en microchips, detectndose la
oxidasa y catalasa a niveles de 9000 molculas y empleando una instrumentacin
relativamente econmica.
Como la intensidad de emisin es funcin de la concentracin de las especies
qumicas implicadas en la reaccin QL, las medidas de la intensidad de emisin
pueden emplearse con fines analticos. Una ventaja de las tcnicas QL es que
permiten emplear una instrumentacin bsica bastante sencilla, ya que el sistema

ptico no requiere fuente externa de excitacin. La QL se describe a menudo

como una tcnica de campo oscuro: la ausencia de niveles altos de luz de fondo,
que s ocurren en espectrofotometra y fluorimetra, reduce el ruido y permite
mejorar los lmites de deteccin. La instrumentacin para medidas de QL vara
desde sistemas muy simples hasta instrumentacin ms compleja, pudindose
usar un fluormetro simplemente con la fuente de excitacin apagada. No obstante
deben considerarse algunas limitaciones en el anlisis por QL, como la
dependencia de la emisin quimioluminiscente de varios factores ambientales que
deben ser controlados, la falta de selectividad, ya que un reactivo
quimioluminiscente no se limita a un nico analito, y finalmente, como ocurre en
otros sistemas de deteccin en flujo, la emisin quimioluminiscente no es
constante sino que vara con el tiempo (el flash de luz est compuesto de una
seal que se produce tras la mezcla de los reactivos, alcanza un mximo y
despus cae hasta la lnea de base), y este perfil de emisin frente al tiempo
puede variar ampliamente en diferentes sistemas quimioluminiscentes, por lo que
hay que extremar el cuidado para detectar la seal en sistemas en flujo, midiendo
en periodos de tiempo bien definidos.

VENTAJAS Y APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA:

En general, los mtodos de fluorescencia son de uno a tres rdenes de magnitud
ms sensibles que los mtodos basados en la absorcin porque la sensibilidad de
los primeros se puede reforzar, sea aumentando la energa del haz de excitacin o
por amplificacin de la seal del detector. Es de destacar que ninguna de estas
opciones mejora la sensibilidad de los mtodos basados en los procesos de
absorcin porque el parmetro en la ley de Beer basado en la concentracin es el
logaritmo de una proporcin
Existen muchos compuestos naturales y sintticos que exhiben fluorescencia, y
tienen un sinnmero de aplicaciones prcticas, desde la simple decoracin
fluorescente hasta aplicaciones en qumica analtica tales como FPIA. En la
naturaleza hay mltiples ejemplos de organismos que utilizan la fluorescencia y en
especial la quimioluminiscencia para atraer alimento o pareja, o bien para espantar
a los depredadores.

Iluminacin: El comn tubo fluorescente depende de la fluorescencia.

Dentro del tubo de vidrio hay un vaco parcial y una pequea cantidad
de mercurio. Una descarga elctrica en el tubo causa que los tomos de
mercurio emitan luz. La luz emitida se encuentra en el
rango ultravioleta (UV), y es por lo tanto invisible para nuestros ojos; pero el
tubo se encuentra revestido con una capa de un material fluorescente
llamado fsforo, el cual absorbe la luz ultravioleta y la reemite en el

espectro visible. La iluminacin fluorescente es energticamente mucho

ms eficiente que la tecnologa incandescente, pero el espectro producido
puede hacer que ciertos colores no parezcan naturales, esto es as porque
el espectro de emisin no es continuo, sino que se encuentra formado por
un limitado nmero de longitudes de onda (lneas de emisin).

Qumica analtica:
La fluorescencia puede ser detectada con
un monocromador para encontrar emisiones tpicas de compuestos
presentes en una cromatografa lquida de alta eficacia. Adems, permite
visualizar las manchas producidas por una TLC si los compuestos o los
reactivos de reveladores son fluorescentes. La fluorescencia es ms
efectiva cuando hay una gran proporcin de tomos en los niveles bajos de
energa en una distribucin de Boltzmann. Existe entonces una mayor
probabilidad que los tomos con energa baja sean excitados y liberen a su
vez fotones, permitiendo as un anlisis ms eficiente. Las huellas
dactilares pueden visualizarse con compuestos fluorescentes como
la ninhidrina.

Bioqumica y medicina: Las biomolculas pueden marcarse con un grupo

qumico fluorescente (fluorocromo) mediante una reaccin qumica simple,
lo cual permite una deteccin sensible y cuantitativa de la molcula.

Gemologa, mineraloga, geologa y ciencias forenses: Las gemas, los

minerales, las fibras y muchos otros materiales que pueden ser
encontrados en medicina forense, pueden tener una fluorescencia distintiva
o pueden fluorecer diferente bajo luz ultravioleta de onda corta, de onda
larga, o rayos X: Muchos tipos de calcita y mbar presentarn fluorescencia
bajo luz ultravioleta de onda corta. Los rubes, las esmeraldas y el diamante
Hope exhiben fluorescencia roja bajo luz UV de onda corta; los diamantes
tambin emiten luz bajo rayos X. El petrleo emite fluorescencia en un
rango de colores, desde el marrn mate para aceites pesados y alquitrn
hasta el amarillento y blanco azulado para los aceites muy livianos y
condensados. Este fenmeno es usado en perforaciones hechas para la
exploracin de petrleo permitiendo identificar pequeas cantidades de
crudo en las perforaciones y en los poros de las muestras.

Lquidos orgnicos: Los lquidos orgnicos, como las mezclas

de antraceno en benceno o tolueno, emiten fluorescencia bajo la accin de
radiacin UV o rayos gamma. Los tiempos de decaimiento de esta
fluorescencia se encuentran en el orden de los nanosegundos ya que la
duracin de la luz depende del tiempo de vida de los estados excitados del
material fluorescente, en este caso antraceno.

BIBLIOGRAFIAS
Quimioluminiscencia:
http://www.cclabgroup.com/quimioluminiscencia-clia/
http://farmacia.ugr.es/ars/pdf/217.pdf

Fluorescencia:
https://es.wikipedia.org/wiki/Fluorescencia#Aplicaciones
http://www.ugr.es/~decacien/Planes/Quimica/Plan%201997/temarios/671111darchivos/fundamentos/SEMINARIO%203.PDF