C.P. Ing. Agroindustrial. UNAMBA.
PRACTICA Nº 5 FROTIS BACTERIANO: COLORACIÓN SIMPLE, COLORACION DIFERENCIAL
(COLORACION GRAM) Y COLORACION DE ESPORAS.
I.- Introducción:
La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: Observando
microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando células muertas teñidas
con colorantes. El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas
de sus características (morfología, tamaño, movimiento, etc.). Sin embargo, las
microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fácilmente al
microscopio óptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ahí que se
utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta
forma hacerlos visibles. Los colorantes son compuestos aromáticos solubles en agua
(generalmente en forma de sales), que contienen un ión orgánico coloreado y otro ión
inorgánico. Pueden dividirse en dos grupos: Ácidos y básicos.
El colorante es ácido si la porción coloreada tiene carga negativa, es decir, si tiene un
anión coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras de la célula que presenten
la misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se denomina
básico si la porción coloreada es el catión, cargado positivamente y con afinidad por
estructuras de la célula con carga negativa, como es la superficie celular. Las bacterias
toman mejor los colorantes básicos, como son el cristal violeta, el azul de metileno y la
safranina. La eosina es un colorante de tipo ácido, así como la nigrosina.
II.- Objetivo:
- Observar microorganismos en el microscopio.
- Observar su morfología y agrupación,
- Apreciar las diferencias de tamaño entre Organismos procarióticos y
eucarióticos.
- Aprender a diferenciar el movimiento browniano de la movilidad de los
microorganismos.
III.- Revisión bibliográfica:
Preparación de un frotis:
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va
a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que
el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser
empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para
transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del
portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina
previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeñas
que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera
estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del
desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede
visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o
bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta
que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.
TINCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
Existen distintos tipos de tinción:
1.-Tinción simple: Aquella en la que sólo se utiliza un colorante, que generalmente
tiñe a los microorganismos. Este tipo de tinción se denomina directa.
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Si el colorante proporciona una coloración al fondo, sin alterar el aspecto de las células,
que permanecen sin teñir, la tinción se denomina negativa.
La tinción simple permite observar morfología celular, tamaño y agrupación de los
microorganismos.
2.-Tinción diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que
permiten distinguir tipos de microorganismos en función de diferencias en su
estructura y composición química.
La tinción de Gram y la ácido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la
pared celular bacteriana, son las más utilizadas.
3.-Tinción estructural: Se utiliza para identificar y estudiar determinadas
estructuras que pueden estar presentes en los microorganismos. En las tinciones
estructurales se colorea únicamente una parte de la célula.
Se utilizan este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cápsulas,
endosporas, flagelos o inclusiones (almidón, polifosfato, etc.).
Morfología ultramicroscópica de las bacterias: estructuras internas:
Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas
mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato
contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rígida
que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en
condiciones especiales. Constituyentes importantes de la pared celular son los
aminoácidos, amino azúcares, azúcares y grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos
de carbono, grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared
celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las
bacterias gram-positivas contienen menos aminoácidos que la gram-negativa; el
contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas que en las gram-
positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al
gram (ver las dos imágenes juntas).
Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa
IV.- Materiales y Métodos.
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Mechero Bunsen.
Portaobjetos.
Tubos con cultivos con cepas bacterianas.
Cubetas para realizar la tinción.
Fósforo.
Asa de siembra.
Agua destilada.
Aceite de inmersión.
Lápiz marcador de cera.
Microscopio.
Reactivos y colorantes
Cristal violeta.
Lugól.
Alcohol acetona.
Safranina.
Azul de lactofenol.
Verde de malaquita.
Agua destilada.
Portaobjetos.
Asas de kolle.
Métodos:
Muestra de carne.
Muestra de queso.
Muestra de células eucariota (levaduras).
- Se selecciona las colonias con que se va a trabajar, en la palca petri.
- Marcar las laminas (1, 2,3 colonias).
Primeramente se realizó con el procedimiento del frotis, el cual consiste en la
extracción de una colonia de microorganismos ya cultivados y seleccionados, con una
aguja de kolle frotar suavemente en un porta objetos limpio, y previamente se haya
añadido en el centro del porta objeto una gota o menos de agua para colocar la pequeña
parte de la colonia seccionada y haciendo unos movimientos circulares con la aguja de
kolle, haciendo que se expanda y su secado.
Pasos para la coloración:
Una vez seca de cada muestra extraída de las colonias con la que se va a trabajar,
procedemos una a una a colorear.
- Primeramente se utiliza el cristal violeta colocándole sobre el frotis que se realizó, de
cada muestra, después de unos minutos enjuagar con agua destilada o agua a chorro.
- Luego se le a cubre de igual forma que la anterior con Lugól, también se espera unos
minutos y se procede a el enjuague con agua a chorro.
- Se coloca el siguiente reactivo, que es el alcohol acetona, de igual forma se enjuaga
con agua a chorro.
- Y por ultimo se le coloca safranina, esto para las bacterias gram negativa, en caso de
que retengan este colorante y si no es así no serán gram negativas, y se enjuaga
también con agua a chorro.
- Dejar secar al medio ambiente los porta objetos que hemos coloreado.
- Preparar los microscopios para poder observar nuestras muestras.
- Ya teniendo seco las laminas porta objetos se cubren con las laminas cubreobjetos y se
llevan al microscopio, para su respectiva observación esto a 40x.
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- También se trajo otras láminas ya anteriormente coloreadas que a simple vista eran
de color azul, pero que también se llevó al microscopio, pero para esto se utilizó aceite
de inmersión y a 100x.
- Hubo también otra muestra en donde solo se utilizó como reactivo el azul de lactofeno
(este reactivo es usado para las células eucariotas en este caso levaduras).
V.- Resultados:
Se pudo observar en el microscopio que la coloración que realizamos estuvo bien hecha
ya que fue posible una clara observación de los microorganismos que en su mayoría
eran gram negativos ( las que coloreamos) y las otras muestra que se trajeron y que
fueron coloreadas anteriormente eran gram positivas, lo interesante fue cuando se
trajeron otras laminas porta objetos que a las cuales se les añadió azul de lactofenol, y
se observo la diferencia de tamaños que hay entre una procariota y una eucariota.
VI.- Discusiones:
En el trabajo realizado, en esta practica de laboratorio los resultados que se obtuvieron
fueron favorables por en la mayoría de trabajos que consisten en esta practica hay
buenos resultados, quizás nos hubiera gustado probar con otros tipos de colonias pero
el tiempo nos fue un tanto corto, pero las bases ya están puestas para en cualquier otro
momento realizarlo y obteniendo también buenos resultados.
VII.- Conclusiones:
Esta presente practica fue de suma importancia para cada uno de nosotros, ya que es
uno de los primeros pasos para el estudio de microorganismos, que nos mostrará la
forma el tamaño y en algunos casos su motilidad, con la practica realizada no creó que
haya sido suficiente a pesar que se obtuvieron buenos resultados, por tanto concluyo
que deberíamos darnos un tiempo para realizar mas pruebas de este tipo.
VIII.- Bibliografías:
- Biblioteca encarta 2007.
- PECAZR, Michael y E. Chan. Elementos de Microbiología. México McGraw Hill. 1988.
Anexos.
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