Universidad Nacional de Cuyo – Facultad de Ciencias Aplicadas a la Industria
BIOQUIMICA DE LOS ALIMENTOS
TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO Nº3: CINÉTICA ENZIMÁTICA
Introducción
Una enzima es un catalizador biológico que lleva a cabo reacciones bioquímicas a muy
altas velocidades y con un elevado grado de especificidad.
Las enzimas hacen posible la vida, sin ellas sería imposible que se lleve a cabo el
metabolismo celular. Todos los seres vivos sintetizan enzimas: el hombre, animales,
vegetales, hongos, levaduras, bacterias.
La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por
los cuales transcurren.
La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:
por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo
por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo
En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del
sustrato (S) y de la enzima (E) en la cinética de la enzima -amilasa en su acción sobre
los enlaces -1-4 del almidón. Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón en
la unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reacción de color que produce el
mismo, así como sus productos de hidrólisis con el Iodo en disolución de Ioduro de
potasio (Reactivo de Lugol).
Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe
tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos
productos de hidrólisis) con el reactivo de Lugol:
AMILOSA – AMILOPECTINA + Lugol = Color azul
AMILODEXTRINAS + Lugol = Color azul violeta ó rojizo
MALTOSA ó GLUCOSA + Lugol = No dan coloración
Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la
cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: [S], [E], pH y T,
fundamentalmente.
Fundamento (Manning y Campbell, 1961)
En presencia de amilasa, el almidón es hidrolizado a dextrinas intermedias y maltosa. Se
incuba la amilasa (ó muestra con amilasa) con una solución de almidón soluble (500 g/ml
en buffer pH 7 fosfato 100 mM con NaCl 15 mM) a temperatura controlada por 7,5
minutos y posteriormente se hace reaccionar la mezcla con lugol (2 g/L I2 y 20 g/L KI en
HCl 20 mM), lo que producirá color azul si hay almidón sin hidrolizar. El descenso en el
color, provee una medida de la actividad amilasa.
Para ensayo cuantitativo la reacción se lee espectrofotométricamente a 640 nm.
Se define a la unidad enzimática (UE) como la cantidad de enzima necesaria para
hidrolizar 10 g de almidón en 7,5 min bajo las condiciones del ensayo.
A) Estudio de la influencia de la concentración de la enzima
1. Añade a cada tubo de ensayo 0,2 ml de solución de almidón, [S] = 500 g/ml.
2. Añade a cada tubo primero el agua y luego la disolución de enzima (0,005 g/ml) a
cada tubo en la cantidad correspondiente (tabla), pues de lo contrario la reacción
comenzará a verificarse y no tendrás en cuenta el tiempo transcurrido.
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Inmediatamente después de adicionar la solución de la enzima en cada tubo, lleva a
incubación a 37°C y mide exactamente 7,5’.
3. Agrega 0,2 ml de lugol y 1,55 ml agua destilada.
4. Lee la absorbancia de cada muestra a 640 nm.
5. Completa la tabla y realiza el gráfico [E] vs. V.
6. Conclusiones
Diferencia
Tubo S (ml) H2O E (ml) [E] (g/ml) Absorb. V (g/min.ml)
de absorb.
1 0,2 0,05 0 0
2 0,2 0,04 0,01 0,001
3 0,2 0,03 0,02 0,002
4 0,2 0,02 0,03 0,003
5 0,2 0,01 0,04 0,004
6 0,2 0 0,05 0,005
B) Estudio de la influencia de la concentración del sustrato
1. Añade a cada tubo de ensayo la cantidad de agua destilada y de solución de almidón
indicada en la tabla.
2. Añade la disolución de enzima (0,005 g/ml). Inmediatamente después de adicionar la
solución de la enzima en cada tubo, lleva a incubación a 37°C y mide exactamente
7,5’.
3. Agrega 0,2 ml de lugol y 1,55 ml agua destilada.
4. Lee la absorbancia de cada muestra a 640 nm.
5. Completa la tabla, realiza el gráfico [S] vs. V, y calcula Vmáx y Km.
6. Realiza el gráfico 1/[S] vs. 1/V, calcula Vmáx y Km; compara los resultados con el punto
anterior (B-5).
7. Conclusiones
S H2O [S] E Diferencia V 1/[S] 1/V
Tubo Absorb.
(ml) (ml) (g/ml) (ml) de absorb. (g/min.ml) (ml/g) (min.ml/g)
1 0 0,2 0 0,05
2 0,05 0,15 125 0,05
3 0,1 0,1 250 0,05
4 0,15 0,05 375 0,05
5 0,2 0 500 0,05
