LABORATORIO

DE BIOQUÍMICA BÁSICA

1000043



DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

FACULTAD DE CIENCIAS

SEDE BOGOTÁ





GUÍAS DE LABORATORIO


I-2022







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 CONTENIDO



PRÁCTICA NOMBRE PÁGINA


1 Materiales y seguridad en el Laboratorio 5


2 Operaciones básicas en el Laboratorio 13


3 pH, Amortiguadores y Presión Osmótica 25


4 Determinación de glucosa en muestras biológicas 39


5 Desnaturalización y cuantificación de proteínas 51


Separación y reconocimiento de los constituyentes
6 63
de la leche


7 Determinación de vitamina C (ácido ascórbico) 75


Estudio de la actividad enzimática de la deshidrogenasa
8 85
succínica


9 Estudio de la actividad enzimática de la catalasa 97


10 Extracción y cuantificación de ADN 107


ANEXO 1 FORMATO FICHAS DE SEGURIDAD 117

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 PRÁCTICA 1

MATERIALES Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO


OBJETIVOS

1. Identificar el material de uso común del laboratorio de Bioquímica y el manejo de
sustancias químicas sólidas y líquidas.
2. Reconocer las normas básicas de seguridad del laboratorio de Bioquímica.

I. MATERIAL DE USO COMÚN EN EL LABORATORIO

Material de vidrio: Se distingue por su buena resistencia química frente al agua,
soluciones salinas, ácidos, bases y disolventes orgánicos. Únicamente es atacado por el
ácido fluorhídrico, bases concentradas como el NaOH y KOH a altas temperaturas y por
el ácido fosfórico concentrado y caliente. El vidrio posee alta transparencia, estabilidad
a la forma incluso a temperaturas elevadas, no es permeable.

Vidrio de soda: Es vidrio ordinario que posee resistencia química aceptable, se utiliza
en productos que usualmente deben resistir ataques químicos por corto tiempo y no
deben soportar grandes cambios de temperatura.

Vidrio de alta resistencia química (DURAN, PYREX): Representa un tipo especial de
borosilicato que posee muy buena resistencia química y térmica. Se utiliza para
construir vasos de precipitados, matraces de fondo redondo y en general material que
se somete a cambios drásticos de temperatura.

Material de plástico: Tiene alta resistencia a la rotura, pero no al calor. Sus
propiedades físicas y químicas varían ampliamente con la composición. Los materiales
más comunes son teflón, polimetilpentano (Nalgene), polipropileno de alta densidad
(Corning), polietileno, poliestireno (Falcon). En general, se construyen instrumentos de
plástico que no requieren ser calentados o cuando el vidrio no es aplicable.

Cuaderno de laboratorio: En las actividades de investigación se requiere llevar un
registro detallado del trabajo realizado. En el laboratorio de bioquímica se debe
disponer de un cuaderno exclusivo para anotar todo lo relacionado con los
experimentos realizados, utilizando esfero no borrable para evitar pérdida de datos.

5
II. MANEJO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS

Sólidos: Siempre revise la etiqueta antes de destapar cualquier reactivo. Los reactivos
sólidos son almacenados en botellas de boca ancha. Gire e incline el frasco de modo que
parte del sólido pase a la tapa plástica y remueva cuidadosamente la tapa con el sólido
dentro de ella. Retire la cantidad necesaria con una espátula. Este procedimiento se
realiza para reactivos de uso común, pero no para aquellos que se emplean en
investigación.

Líquidos: Se almacenan en botellas de boca angosta o en frascos gotero. Para medir la
cantidad de un líquido (puro o solución) se debe sacar una porción en un vaso limpio y
seco, luego se toma la cantidad con una pipeta o el recipiente de medida adecuado.

NUNCA INTRODUZCA PIPETAS O CUALQUIER OTRO INSTRUMENTO DENTRO DE
LA BOTELLA ORIGINAL QUE CONTIENE EL REACTIVO.

III. NORMAS BÁSICAS DE SEGURIDAD

Gafas de seguridad: Los ojos son extremadamente sensibles, muchas sustancias no
son inofensivas y causan comezón o quemaduras leves en la piel y algunas pueden ser
fatales en tiempo muy corto. Se pueden emplear gafas en policarbonato, un material de
alta resistencia química, su diseño permite una visión amplia y son más económicas que
las gafas de seguridad tradicionales. Evite utilizar lentes de contacto en el laboratorio,
pues estos facilitan la acumulación de sustancias tóxicas en los ojos.

Ducha para los ojos: En caso de contacto con cualquier sustancia con los ojos, lave
inmediatamente con abundante agua durante 15 minutos y pida ayuda durante el
lavado. El laboratorio cuenta con una fuente para lavado de ojos la cual se activa
fácilmente por una barra anti-pánico. Identifique y memorice el lugar donde está
ubicada la fuente en el laboratorio.

Blusa de laboratorio: Siempre que realice actividades en el laboratorio debe vestir
una blusa blanca abotonada, de material grueso, que llegue hasta las rodillas. La blusa
ayuda a proteger la piel y su ropa.

Calce zapatos cerrados y recoja el cabello largo al realizar prácticas de laboratorio.

Considere todas las sustancias como peligrosas, nunca pruebe o tome el sabor de
las sustancias químicas.

6
Lave sus manos con frecuencia y utilice guantes para manejo de sustancias
corrosivas o de las sustancias que se absorban con facilidad por la piel.

Es prohibido comer, beber y fumar en el laboratorio.

Los productos químicos volátiles, corrosivos, venenosos e irritantes a la piel o los
ojos, deben ser manejados en la cabina de extracción.

Cuando manipule tubos de ensayo no dirija la boca del tubo hacía usted, tampoco hacía
otras personas (principalmente cuando calienta el contenido del tubo).

Cuando se rompa material de vidrio limpie inmediatamente y pregunte al laboratorista
por los recipientes especiales para disposición de residuos.

Al derramar sustancias químicas debe avisar inmediatamente al Profesor para
aplicar el procedimiento apropiado.

Esté siempre alerta ante la posibilidad de un accidente de sus vecinos. Usted puede ser
una víctima de sus errores.

Mantenga su lugar de trabajo ordenado. Guarde las maletas, chaquetas y demás
elementos que no hagan parte de la práctica en las gavetas para el efecto.

No deseche los productos químicos por las alcantarillas, el laboratorio dispone de
recipientes para su tratamiento:

● Recipientes para disposición de residuos sólidos.
● Recipientes para disposición de residuos líquidos: ácidas, básicas y orgánicas.
● Recipientes para disposición de residuos biológicos.

ATENCIÓN: Observe cuidadosamente las precauciones incluidas en los experimentos.
Estudie el experimento con anterioridad a la práctica. Un estudiante mal preparado es
un peligro para todas las personas en el laboratorio.

BIBLIOGRAFÍA

Trujillo C.A. & Sánchez Rojas J.E. Técnicas y Medidas Básicas en el Laboratorio de
Química. Colección Notas de Clase, Facultad de Ciencias, Departamento de Química,
Universidad Nacional de Colombia. 2007

7
ACTIVIDADES PRE-LABORATORIO

Realizar la lectura de la presente guía y observar y leer la siguiente información:

Material y Equipos de uso frecuente en el laboratorio:
https://youtu.be/w-ri040VvgA
https://youtu.be/8-qllNcLDiM

Manejo de micropipeta automática:
https://youtu.be/3leT7THt3Ac

Seguridad en el laboratorio:
https://youtu.be/FghDomvt6Us
https://www.jove.com/es/v/10379/guidelines-in-case-of-a-laboratory-emergency

Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos
(GHS, por el acrónimo en inglés Global Harmonized System):

http://ghs-sga.com

https://es.wikipedia.org/wiki/Sistema_Globalmente_Armonizado_de_Clasificaci%C3
%B3n_y_Etiquetado_de_Productos_Qu%C3%ADmicos

https://es.wikipedia.org/wiki/Anexo:Frases_H

https://es.wikipedia.org/wiki/Anexo:Frases_P

Símbolos de Riesgo Químico:
https://youtu.be/yufEs67Q4mQ

Identificación de riesgos y peligros por sustancias químicas:
https://youtu.be/PdV3L9O0nPc

Manejo Sustancias Químicas en el Laboratorio:
https://youtu.be/yfGyvriOzV4

8
ACTIVIDADES POST-LABORATORIO

Video 1: Atuendo y equipamiento de protección personal para trabajo en el laboratorio:
https://www.ncbionetwork.org/educational-resources/videos/lab-safety-lesson-1-
proper-dress-and-ppe

Video 2: Equipamiento de seguridad en el laboratorio:
https://www.ncbionetwork.org/educational-resources/videos/lab-safety-lesson-2-
safety-equipment

Video 3: Comportamiento en el laboratorio:
https://www.ncbionetwork.org/educational-resources/videos/lab-safety-lesson-3-
behavior

Video 4: Peligros químicos en el laboratorio:
https://www.ncbionetwork.org/educational-resources/videos/lab-safety-lesson-4-
chemical-hazards

Video 5: Manipulación segura de productos químicos en el laboratorio:
https://www.ncbionetwork.org/educational-resources/videos/lab-safety-lesson-5-
safe-chemical-handling

Video 6: Otros peligros generales en el laboratorio:
https://www.ncbionetwork.org/educational-resources/videos/lab-safety-lesson-6-
other-general-hazards

SIMULADOR VIRTUAL
Enlace para simulador de Seguridad en el Laboratorio:
https://www.ncbionetwork.org/educational-resources/elearning/lab-safety

Objetivo del simulador: Explicar la importancia de cómo vestirse apropiadamente
para trabajo en el laboratorio, uso de protección personal en el laboratorio, de
mantener el laboratorio organizado, conocer e identificar el equipo de seguridad en un
laboratorio y la importancia de seguir las indicaciones y procedimientos.

Resultado: Debe escribir su nombre completo al inicio del simulador. Al finalizar el
mismo, recibirá un certificado con su nombre indicando que completó el simulador.
Este certificado debe ser anexado al informe de laboratorio. Realizar el quiz del
simulador para averiguar su conocimiento después de completar las actividades del
laboratorio.

9
CUESTIONARIO (se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. ¿Qué son las claves internacionales H y P? Explique su funcionamiento y mencione
tres ejemplos para cada caso.

2. ¿Cuáles considera usted que son los riesgos biológicos más frecuentes que se
pueden presentar en un laboratorio de Bioquímica?

3. ¿Dónde se localizan los siguientes elementos del Laboratorio de Bioquímica 330?
Realice un esquema (plano) indicando la ubicación de:

Almacén de reactivos Máquina de hielo
Balanzas Nevera
Botiquín Potenciómetro
Cabinas de extracción Recipientes de desechos
Casilleros Salidas de emergencia
Centrífugas Puesto de trabajo
Extintores
Termostatos
Lava ojos

4. Reconozca los recipientes dispuestos en el laboratorio para colectar los desechos de
las prácticas. Realice una descripción de ellos e indique en cuál recipiente se deben
descartar los siguientes reactivos. Indique la composición de los reactivos marcados
con asterisco (*). Anexar al informe de laboratorio la ficha de seguridad de uno de
los reactivos indicados en la tabla, utilizando la ficha de seguridad indicada en el
ANEXO 1 como referencia.

Acetona o-toluidina
Ácido molíbdico Oxalato de amonio
Ácido nítrico Permanganato de potasio
Azul de metileno Sangre
Cloroformo 3,5-dinitrosalicilato
Cloruro de sodio *Reactivo de Benedict
Hidróxido de amonio *Reactivo de Biuret

5. De acuerdo con los videos acerca de emergencias en el laboratorio, ¿qué se debe
realizar mientras se evacua el laboratorio en caso de explosión o incendio?

10
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
INFORME DE LABORATORIO


PRÁCTICA:
DOCENTES:

ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-
3-

CUESTIONARIO:

11


FICHA SEGURIDAD DEL REACTIVO SELECCIONADO

CERTIFICADO SIMULADOR

BIBLIOGRAFÍA

12
 PRÁCTICA 2

OPERACIONES BÁSICAS DE LABORATORIO

OBJETIVOS

1. Conocer las unidades de medida y la aplicación de cifras significativas.
2. Reconocer los errores de medición en las determinaciones experimentales.
3. Utilizar parámetros estadísticos como promedio aritmético y desviación estándar
en la construcción de una curva de calibración.

I. SISTEMA INTERNACIONAL DE MEDIDAS (SI)

Las unidades fundamentales del SI corresponden a las propiedades longitud (metro,
m), masa (kilogramo, kg), temperatura termodinámica (kelvin, k), cantidad de
sustancia (mol), corriente eléctrica (amperio, A) e intensidad luminosa (candela, cd).
Existen otras unidades derivadas como las de superficie (m2), volumen (m3), densidad
(kg/m3) y velocidad (m/s), entre otras. También muy importantes son las unidades
aceptadas que no pertenecen al SI: minuto (min), tonelada (t), hora (h), grado Celsius
(oC) y litro (L o l). En Colombia, el nombre completo de las unidades del SI se escribe
con letra minúscula, con la única excepción de grados Celsius, salvo en el caso para
comenzar una frase o luego de un punto.

Medida

El proceso de medir consiste en evaluar una característica por comparación con una
magnitud que se toma como unidad. Esta comparación se hace por medio de un
instrumento calibrado a partir del patrón unitario respectivo. El resultado de la medida
es un número aproximado que indica cuántas veces cabe el patrón unitario en lo que se
mide. Por ejemplo, si se toma como unidad el kilogramo y se determina la medida de la
masa en 45,2 kg, significa que ese cuerpo tiene una masa 45,2 veces mayor que el patrón
que sirve como unidad de masa.

Las medidas pueden tener diferentes aproximaciones de acuerdo con la graduación del
instrumento empleado para determinarlas. Así, en una medida de longitud si el
instrumento esta graduado en metros, decímetros o centímetros, la medida de la
longitud tendrá diferentes grados de aproximación.

13
Cifras significativas

Son aquellas sobre las cuales se tiene certeza absoluta a excepción de la última, la cual
presenta incertidumbre. Por ejemplo, si el peso del CO2 es 44,00 (cuatro cifras
significativas), indica que este peso puede estar entre 43,95 y 44,05, pero si el resultado
se expresa como 44,0 (tres cifras significativas), se puede considerar que su valor está
entre 43,5 y 44,5. Si la última cifra es mayor que cinco y se requiere aproximación, se
realiza hacia el dígito mayor (22,37 se aproxima a 22,4), si es menor que cinco se realiza
hacia el menor (22,34 se aproxima a 22,3) y si es igual a cinco se debe buscar el número
par (22,35 ó 22,45 se aproxima a 22,4).

Los ceros que preceden a un número natural en una fracción no son cifras significativas;
por ejemplo 0,0028 tiene dos cifras significativas y es conveniente expresarlo en
notación exponencial como 2,8 x 10-3.

Al establecer el resultado de una operación aritmética entre magnitudes de medidas, se
debe reportar con el número de cifras significativas de la magnitud con el número
menor de ellas. En sumas y restas, esta regla es válida sólo para el número de cifras
significativas después de la coma, es decir se conserva el número de cifras decimales
que del término con menos cifras decimales. Al calcular la densidad a partir de una masa
de 23,0 g y un volumen de 15,87 mL, se debe reportar la densidad con 3 cifras
significativas, aunque el volumen tenga cuatro. La densidad será 1,45 g/ml. Al sumar
las cantidades 2,2538 y 0,4, el resultado 2,6538 debe expresarse como 2,7.

II. CÁLCULO DEL ERROR EN LA MEDICIÓN

Error es la medida de la diferencia entre el valor observado (X1) y el valor verdadero
(X). Esto implica conocer el valor verdadero. Cuando el error es pequeño comparado
con la magnitud de la medida, se dice que la medida es exacta. Cuando diferentes
medidas del mismo parámetro no se desvían en forma apreciable de un valor promedio,
aunque no sea el verdadero, se dice que cada medida es precisa.

Error absoluto: Se representa por la letra griega ∆ (delta mayúscula). Se define como
la diferencia entre el valor experimental X1 y el valor verdadero teórico X de la medida:


∆= [X1 - X]

14
Error relativo: Se representa por la letra griega δ (delta minúscula) y se expresa como
el cociente entre el error absoluto (∆) y el valor verdadero (X):

δ= (∆/X)
Porcentaje de error relativo (% δ) = δ * 100

Como criterio general, en el trabajo de laboratorio con instrumentos de uso común
(probetas, buretas, balanzas, etc.), el error relativo no debe exceder el 5%.

Errores sistemáticos o determinables: Son aquellos que tienen una causa concreta y
valores definidos, los cuales en principio pueden ser calculados y corregidos después
de determinar su magnitud. Son a menudo unidireccionales, dado que afectan todos los
resultados de una serie de mediciones repetidas (medidas más altas o bajas). Este tipo
de errores se clasifican en Personales, Instrumentales y Metodológicos. Por el contrario,
los errores indeterminados o aleatorios son errores que se presentan al azar y no se
pueden clasificar.

Clases de errores sistemáticos o determinables

Errores personales: Son inherentes a la persona que realiza la medición a causa de sus
limitaciones. Por ejemplo, falta de apreciación del cambio de color en una titulación,
fallas de agitación en la titulación, deficiencia en la mezcla de reactivos, estimación de
la posición de una aguja en una lectura, etc.

Errores instrumentales: Provienen de las limitaciones que tienen todos los
instrumentos de medida. Por ejemplo, la utilización de material volumétrico a una
temperatura diferente a la de su calibración, contaminación, errores en la calibración
original, etc. En instrumentos que poseen graduaciones, se considera en general como
máximo error instrumental (error absoluto), la mitad de la división más pequeña en el
aparato.

Por ejemplo, en la probeta graduada en mililitros el error absoluto instrumental es 0,5
mL (1 mL/2). Si la medida obtenida es X1 y la división más pequeña es e, se acostumbra
en algunos casos a expresar la medida como: X1 ± (e/2).

En algunos instrumentos el error está certificado por el fabricante. Tal es el caso de la
pipeta aforada de 10 mL, en la cual se certifica que el máximo error posible es de 0,05
mL a 25ºC. En este caso, el valor de la medida se puede expresar como 10,00 mL con
cuatro cifras significativas.

15
Ejemplo: En los tres termómetros de la Figura 1 se pueden reportar los resultados con
diferentes grados de aproximación:

Figura 1. Medida de temperatura en termómetros con distintas graduaciones.
Termómetro 1: la temperatura presenta una certidumbre entre 21ºC y 22ºC, se puede
reportar con tres cifras significativas y podría ser 21,5ºC.
Termómetro 2: la temperatura presenta una certidumbre que entre 21,50ºC y 21,60ºC,
se puede reportar con cuatro cifras significativas y podría ser 21,57ºC.
Termómetro 3: la temperatura presenta una certidumbre entre 21,57ºC y 21,58ºC, se
puede reportar con cinco cifras significativas y podría ser 21,575ºC.

Es evidente entonces que el termómetro que presenta el máximo error absoluto es el
termómetro 1.

Errores metodológicos: El comportamiento químico o físico no ideal de las soluciones
o reactivos en los que se basa un análisis, pueden generar frecuentemente errores
determinados. Por ejemplo, inestabilidad de las especies químicas, reacciones
incompletas, reacciones secundarias que produzcan interferencias, falta de
especificidad de los reactivos, etc.

III. MÉTODOS ESTADÍSTICOS BÁSICOS

Cuando se realiza una medida varias veces, es conveniente efectuar un tratamiento
estadístico de los datos obtenidos, con el fin de juzgar su confiabilidad y
reproducibilidad. Es así como en estadística se utilizan cálculos relativos a las medidas
de tendencia central o promedios (media, moda, mediana) y a las desviaciones
(varianza, desviación típica o estándar).

Media: Corresponde al promedio aritmético ( ). Se define como el cociente obtenido
entre la suma de los diferentes valores obtenidos dividido por el número de datos (n).
16
Desviación estándar típica (s): Es una medida del grado de dispersión de la serie de
datos con respecto a un valor central; se expresa como:

Porcentaje de desviación (% s):

% s = (s * 100) /


ACTIVIDADES PRE-LABORATORIO

Realizar la lectura de la presente guía y observar los siguientes videos informativos:

Sistema Internacional de medidas:
https://youtu.be/nqxHnu4LJ6k
https://youtu.be/VNiSonmWV8k

Cifras significativas:
https://youtu.be/1LR93mgjjs4

Curvas de calibración:
https://www.youtube.com/watch?v=Guo7ntYAyIY
https://www.youtube.com/watch?v=taOKpMEpJqs

REACTIVOS

● Agua destilada
● Soluciones stock de colorantes naturales 0,2% (V/V)
● Muestra problema: solución de colorante natural de concentración desconocida

PROCEDIMIENTO

En esta práctica los grupos pares trabajarán con pipetas de vidrio, mientras que los
grupos impares utilizarán micropipetas para construir curvas de calibración y
comparar los resultados obtenidos para el color correspondiente. Todos los grupos
deben manejar todos los datos obtenidos para realizar el análisis estadístico
correspondiente.

La absorbancia de las muestras debe analizarse a las siguientes longitudes de onda:

Solución Amarilla: 405 nm / Solución Azul: 630 nm / Solución Roja: 490 nm

17

GRUPOS PARES

1. Tomar 6 tubos de ensayo y rotularlos con los números 1 a 6. En el tubo No. 1
adicionar 2,5 mL de agua destilada, éste será el blanco.
2. En el tubo No. 2 mezclar 4,0 mL de agua destilada y 1 mL de colorante de
concentración conocida. Agitar cuidadosamente hasta homogenizar la solución.
3. Transferir 2,5 mL de solución del tubo 2 al tubo 3 y adicionar a este último 2,5 mL
de agua destilada. Agitar cuidadosamente hasta homogenizar la solución.
4. Proceder de la misma manera para preparar las soluciones 4 y 5, sucesivamente.
5. Registrar en el espectrofotómetro la absorbancia de las muestras a la longitud de
onda correspondiente al color a determinar (ver arriba), incluyendo la muestra
problema. Utilizar agua destilada como blanco.

GRUPOS IMPARES

1. Tomar una caja multipozos e identificar las columnas 1 y 2. En la fila A, a los pozos
1 y 2, adicionar 200 µL de agua destilada. Estos pozos serán el blanco.
2. En la fila B, a los pozos 1 y 2, adicionar 200 µL de solución de colorante. A cada uno
de ellos adicionar 200 µL de agua destilada.
3. Tomar 200 µL de la solución del pozo B1 y colocarla en el pozo de la fila C, columna
1. Transferir del mismo modo 200 µL del pozo B2 al pozo C2. Adicionar a cada uno
de estos pozos 200 µL de agua destilada.
4. Realizar la misma acción anterior hasta llegar a la fila F.
5. En la columna 3, adicionar 200 µL de la muestra problema, a los pozos A3, B3 y C3.
6. Registrar en el lector multiplacas la absorbancia de las muestras a la longitud de
onda correspondiente al color a determinar (ver arriba). Utilizar agua destilada
como blanco (pozos A1 y A2).

CUESTIONARIO

1. ¿Qué son las cifras significativas y cuáles son las reglas básicas para su manejo en
operaciones algebraicas? Mencione algunos ejemplos.

2. De acuerdo con los videos acerca de las curvas de calibración, ¿cuál es su principal
utilidad en el trabajo experimental?

3. Indique los cálculos para determinar la concentración de los 6 patrones del
colorante utilizado.

18
4. Construya una curva de calibración incluyendo el promedio de cada punto y su
desviación estándar típica para el experimento realizado con pipetas de vidrio y
para aquél realizado con micropipetas.

5. Determine la ecuación de la recta y el coeficiente de regresión lineal (R2) para ambas
curvas y explique las diferencias en este último valor.

6. Utilizando la ecuación de la recta, determinar la concentración de la muestra
problema.


BIBLIOGRAFÍA

Trujillo C.A. & Sánchez Rojas J.E. Técnicas y Medidas Básicas en el Laboratorio de
Química. Colección Notas de Clase, Facultad de Ciencias, Departamento de Química,
Universidad Nacional de Colombia. 2007

19


20
PRÁCTICA 2: OPERACIONES BÁSICAS DE LABORATORIO
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Construya una tabla con los datos experimentales obtenidos en la práctica:

21
22
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
INFORME DE LABORATORIO


PRÁCTICA:
DOCENTES:

ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-
3-

CUESTIONARIO

23


BIBLIOGRAFÍA

24
 PRÁCTICA 3

pH, AMORTIGUADORES Y PRESIÓN OSMÓTICA


OBJETIVOS

1. Determinar el pH con papel indicador universal, papel tornasol y potenciómetro.
2. Observar el efecto amortiguador de soluciones buffer al agregarles ácidos o bases.
3. Observar el efecto de la presión osmótica en células sanguíneas.

INTRODUCCIÓN

I. SOLUCIONES ACUOSAS Y pH:

Todas las soluciones acuosas contienen iones de hidrógeno e hidroxilo como resultado
de la auto-ionización del agua:

H2O « H+ + OH-

En una solución neutra, las concentraciones de los dos iones son idénticas. Una solución
ácida es aquella en la que la concentración de iones de hidrógeno excede la de iones
hidroxilo, mientras que una solución básica (o alcalina) es aquella en la cual la
concentración de iones hidroxilo excede a la de iones hidrógeno.

La acidez o la alcalinidad de una solución se expresa frecuentemente como el logaritmo
en base 10 del inverso de la concentración de iones hidrógeno, expresada en moles por
litro (M). A este valor se le denomina pH:

pH = log10 (1/[H+]) = log10 [H+]-1 = -log10 [H+]

Ejemplo: Suponiendo [H+] = 5 x 10-3 M, entonces:

pH = log10 (1/5 x 10-3)
pH = log10 (0.2 x 103)
pH = log10 (2 x 102)
pH = log10 (2) + 2 log10 (10)
pH = 0,3 + 2 = 2,3

25
El producto iónico del agua (Kw) relaciona las concentraciones de los iones generados
por la auto-ionización del agua, del siguiente modo:

Kw = [H+] x [OH-]

A 25ºC, Kw = 1,00 x 10-14, luego aplicando logaritmos decimales negativos a ambos
lados de la ecuación, obtenemos:

-log10 Kw = -log10 ([H+] x [OH-])
-log10 Kw = -log10 [H+] - log10 [OH-]

De manera análoga a como se definió pH, el pOH representa el logaritmo del inverso de
la concentración de iones hidroxilo, pOH = - log10 [OH-], entonces:

14 = pH + pOH

De esta manera, una solución neutra contiene concentraciones iguales de iones
hidrógeno e hidroxilo, es decir pH = pOH = 7. Un exceso de iones hidrógeno causa que
el valor de pH sea menor de 7 y un exceso de iones hidroxilo produce un valor de pH
mayor que 7.

Los procesos metabólicos de los alimentos generan ácido fosfórico, láctico y pirúvico
junto con productos alcalinos como el bicarbonato. Los compuestos ácidos predominan
y el organismo debe eliminar continuamente el exceso de los ácidos producidos dentro
de la célula. Estos productos se transportan a los órganos de excreción a través de
fluidos extracelulares, evitando la alteración de la [H+].

El intervalo de pH de 7,35 a 7,45 de la sangre es una de las características más
estrictamente controladas del ser humano y la forma de lograrlo se basa en el
mecanismo de la regulación del balance ácido/base, lo cual implica el balance de agua
y electrolitos, sustancias amortiguadoras y la acción de los órganos encargados de la
excreción de sustancias (pulmones, riñones, intestino, hígado). Las variaciones del
equilibrio ácido/base son una consecuencia de alteraciones funcionales del organismo
más o menos graves; de ahí la importancia del conocimiento del valor del pH en un
fluido biológico.

26
II. SOLUCIONES AMORTIGUADORAS DE pH (SOLUCIONES BUFFER):

Las soluciones amortiguadoras, también conocidas como soluciones buffer,
reguladoras o tampón, son aquellas que se oponen a los cambios de pH cuando se les
agrega ácido o base. De acuerdo con la teoría de Bronsted-Lowry, una solución
amortiguadora se compone por un ácido débil y su base conjugada. Los ácidos débiles
son aquellos que no se disocian completamente y en solución existen en más del 90%
en forma molecular (no disociada); esta forma constituye la acidez potencial, es decir,
pueden disociarse generando H+.

Por el contrario, las sales alcalinas de estos ácidos son iónicas (si se disocian) y en sus
soluciones existe una alta concentración de la base conjugada del ácido. Por ejemplo, el
acetato de sodio (CH3COONa) en solución se encuentra disociado como CH3COO- y Na+.
La base CH3COO- se puede combinar con H+ generando moléculas de ácido acético
(CH3COOH), evitando la acumulación de H+ en la solución.

En una solución acuosa compuesta por CH3COOH y CH3COONa, el pH se conserva por
las reacciones de los iones H+ y OH- con las especies químicas existentes en la solución,
del siguiente modo:

OH- + CH3COOH CH3COO- + H2O

H+ + CH3COO- CH3COOH

De esta forma, las relaciones iniciales en las concentraciones de CH3COOH y CH3COO-
tienden a restablecerse y el pH de la solución no varía.

La ecuación de Henderson-Hasselbach permite calcular el pH de la solución reguladora:

[Base conjugada]
pH = pKa + log10
[Ácido conjugado]

El intervalo útil para la mayoría de los amortiguadores es de una unidad de pH por
encima o por debajo del valor de pKa. La mayoría de las células pueden funcionar
dentro de límites estrechos de pH y requieren por tanto sistemas amortiguadores que
se opongan a los cambios de pH que de otra forma ocurrirían a causa del metabolismo.
Los tres principales sistemas amortiguadores en la materia viva son las proteínas, el
bicarbonato y el fosfato.

27
III. MEMBRANAS Y PRESIÓN OSMÓTICA:

Las membranas ejercen una función más compleja que ser simples barreras
delimitantes. Son estructuras sumamente activas donde ocurren procesos metabólicos
complejos como transporte de moléculas, transducción de señales, respiración celular
y generación de potenciales eléctricos, entre otros. La estructura de las membranas
biológicas se describe en el modelo del Mosaico Fluido. En este modelo se establece que
los fosfolípidos forman una bicapa en la cual las regiones no polares de cada capa se
encuentran hacia adentro de la misma y las regiones polares de cada capa se encuentran
hacia afuera, en interacción con el medio acuoso. Las proteínas se encuentran
embebidas entre estos fosfolípidos estableciendo interacciones generalmente de tipo
no covalente.

La proporción de cada una de estas macromoléculas dependerá de la función de cada
membrana en particular, la cual a su vez depende de la célula a la cual pertenece. Por
ejemplo, la membrana plasmática de un hepatocito de ratón está constituida
proporcionalmente de 45% de proteínas, 27% de fosfolípidos, 25% de colesterol y 3%
de otras macromoléculas.

Las membranas son impermeables a la mayoría de los solutos polares y permeables a
los solutos no polares. Para el intercambio de la mayoría de los solutos polares existen
mecanismos controlados que pueden implicar inversión de energía. La existencia de
este tipo de membranas permite evidenciar una propiedad coligativa del solvente
universal, el agua, que se conoce como presión osmótica. Las moléculas de agua tienden
a moverse desde una región de alta concentración de agua hacia una de menor
concentración de agua. Cuando dos soluciones acuosas están separadas por una
membrana semipermeable que permite el paso del agua, pero no del soluto, el
movimiento de las moléculas de agua desde la región más concentrada de agua hacia la
de menor concentración genera una presión conocida como presión osmótica.

La presión osmótica puede ser cuantificada como se muestra en la Figura 1. Considérese
un recipiente que contiene agua pura al cual se le introduce un tubo en cuyo extremo
sumergido presenta una membrana semipermeable. Dentro del tubo se encuentra un
soluto disuelto en agua pero que no es permeable a través de la membrana (Fig. 1A).
Como se muestra en la Fig. 1B, el agua del recipiente atravesará la membrana para pasar
al tubo y así disminuir la concentración del soluto en el tubo.

La presión osmótica es medida como la fuerza que debe ser aplicada para que la
solución en el tubo regrese al mismo nivel de aquella que se encuentra en el recipiente

28
y es proporcional a la altura del nivel de líquido contenido en el tubo, llamada “h” en la
Fig. 1B. En la Fig. 1C, esta fuerza es aplicada por un pistón.

Figura 1. Medida de la presión osmótica.

La ósmosis, definida como el movimiento de agua a través de una membrana
semipermeable debido a diferencias en presión osmótica, es un factor importante para
la supervivencia celular. Las membranas citoplasmáticas son más permeables al agua
que a la mayoría de otras moléculas o iones. Esta permeabilidad es debida en parte a la
difusión libre del agua a través de la bicapa de lípidos y a la presencia de canales
proteicos que facilitan su paso.

Aquellas soluciones que poseen la misma osmolaridad, medida usada para expresar la
concentración total (en osmoles/litro) de sustancias en disolución, se conocen como
soluciones isotónicas (Fig. 2A). En estas condiciones, una célula intercambia agua con
el medio que la rodea de manera equilibrada (la cantidad de agua que entra a la célula
es igual a la cantidad de agua que sale de la célula).

En una solución hipertónica (Fig. 2B), es decir, aquella que posee mayor osmolaridad
que la célula, el agua del citoplasma tenderá a salir deformando y encogiendo la célula.

Al contrario, en una solución hipotónica, aquella que posee menor osmolaridad que la
célula, el agua de la solución tiende a entrar abruptamente a la célula hasta causar su
lisis (Fig. 2C).

29

Figura 2. Efecto de diferentes condiciones osmóticas sobre una célula. A. Célula en
solución isotónica: no existe movimiento neto de agua. B. Célula en solución
hipertónica: el agua se mueve hacia afuera de la célula, deshidratándola. C. Célula en
solución hipotónica: el agua entra a la célula, lisándola.

BIBLIOGRAFÍA

• Bohinski R.C. Bioquímica. 5ª edición. Addison-Wesley Iberoamericana. 1991.
• Campell M & Farrel S. Bioquímica. 4ª edición. Thompson. 2004
• Nelson D.L. & Cox M.M. Lehninger. Principles of Biochemistry. 6th edition. W.H.
Freeman & Company. 2014. New York, USA.

REACTIVOS

● Papel tornasol azul y rojo
● Papel indicador
● Potenciómetro
● Muestras de 3 soluciones acuosas (bebidas gaseosas, cerveza, jugo natural, etc.,
preferiblemente no coloreadas). El estudiante debe traer estas muestras.
● Ácido acético 0,1 M
● Acetato de sodio 0,1 M
● Ácido clorhídrico 0,1 M
● Hidróxido de sodio 0,1 M
● NaCl 10% (P/V), pH 7,4
● NaCl 0.9% (P/V), pH 7,4
● Agua destilada
● Muestra de sangre anticoagulada (EDTA, oxalato o heparina) de origen animal. La
trae el Profesor.

30
PROCEDIMIENTO

I. DETERMINACIÓN DEL pH DE SOLUCIONES ACUOSAS:

Determinar el pH de cada una de las 3 soluciones acuosas con el papel indicador
universal, el papel tornasol y con el potenciómetro (pH-metro).

II. ESTUDIO DEL EFECTO AMORTIGUADOR DE LAS SOLUCIONES BUFFER:

1. Preparación del buffer de trabajo para todo el Laboratorio: mezclar 250 mL de
ácido acético 0,1 M con 250 mL de acetato de sodio 0.1 M. Determinar el valor
experimental del pH con el potenciómetro. Nota: esta solución será preparada por
el Profesor.

2. Dilución del buffer: en la probeta dispensar 20 mL del buffer y completar con agua
destilada hasta 50 mL. Determinar el valor experimental del pH con el potenciómetro.

3. Tomar 20 mL del buffer diluido (preparado en el numeral 2) y agregar con la pipeta
graduada 1,0 mL de HCl 0,1 M. Trasvasar la mezcla al vaso de precipitado y determinar
el pH experimental con el potenciómetro.

4. Tomar 20 mL del buffer diluido (preparado en el numeral 2) y agregar con la pipeta
graduada 1,0 mL de NaOH 0,1 M. Trasvasar la mezcla al vaso de precipitado y
determinar el pH experimental con el potenciómetro.

5. Tomar 20 mL de agua destilada en un vaso de precipitado y agregar con la pipeta
graduada 1,0 mL de HCl 0,1 M. Determinar el pH experimental con el potenciómetro.

6. Tomar 20 mL de agua destilada en un vaso de precipitado y agregar con la pipeta
graduada 1,0 mL de NaOH 0,1 M. Determinar el pH experimental con el potenciómetro.

III. ENSAYOS DE PRESIÓN OSMÓTICA:

Colocar 3 tubos de ensayo pequeños en una gradilla y adicionar lo siguiente:

Tubo 1: 3 mL de agua destilada
Tubo 2: 3 mL de NaCl 0.9% (P/V)
Tubo 3: 3 mL de NaCl 10% (P/V)

31
Agregar LENTAMENTE por la pared de cada tubo una gota de sangre anticoagulada.
Dejar reposar los tubos a temperatura ambiente durante 10 min y observar los
resultados desde el inicio del experimento. ATENCIÓN: NO AGITAR LOS TUBOS.

Colocar los tubos dentro de los adaptadores de plástico para centrifuga, equilibrar el
peso del conjunto de tubos con otro grupo de trabajo y centrifugar a 2500 rpm a
temperatura ambiente, durante 5 min. Observar los resultados.

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar el Informe de Laboratorio correspondiente.

CUESTIONARIO (se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. ¿Por qué los eritrocitos son un buen modelo para estudiar el efecto osmótico?

2. ¿Cuál es la concentración salina del suero fisiológico?

3. ¿Qué efecto tendría el suero fisiológico sobre una solución de eritrocitos? Explique.

32
PRÁCTICA 3: pH, BUFFERS Y PRESIÓN OSMÓTICA
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Determinación del pH de soluciones acuosas:

Método de Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

medición de pH _______________ ________________ _______________

Papel Universal

Papel tornasol

Potenciómetro

Efecto amortiguador de las soluciones buffer al agregarles ácidos o bases:

Muestra Tipo de solución pH Muestra Tipo de solución pH

1 Buffer original 4 Buffer + NaOH 0,1M

2 Buffer diluido 5 Agua + HCl 0,1M

3 Buffer + HCl 0,1M 6 Agua + NaOH 0,1M

Ensayos de presión osmótica (describa los resultados obtenidos):

Muestra de sangre en tubo con agua destilada (Tubo 1):
Antes de centrifugar:
Después de centrifugar:
Muestra de sangre en tubo con NaCl 0,9% (P/V) (Tubo 2):
Antes de centrifugar:
Después de centrifugar:
Muestra de sangre en tubo con NaCl 10%(P/V) (Tubo 3):
Antes de centrifugar:
Después de centrifugar:

33


34
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
INFORME DE LABORATORIO


PRÁCTICA:
DOCENTES:

ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-
3-

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:
pH Solución amortiguadora









Ósmosis Presión osmótica










DATOS Y CÁLCULOS: Complete las siguientes tablas:
TABLA 1: Determinación del pH mediante distintos métodos
Papel tornasol Valor de
Soluciones Papel indicador
¿Cómo viró? Potenciómetro referencia
analizadas universal
ROJO AZUL (Reportado)

35
Calcule la [H+] de las soluciones de la TABLA 1:
Solución 1: Solución 2: Solución 3:



TABLA 2: Indique el valor de pH determinado con el potenciómetro para cada solución
Solución pH experimental Solución pH experimental
1-Buffer original 4-Buffer diluido+NaOH
2-Buffer diluido 5-Agua+HCl
3-Buffer diluido+HCl 6-Agua+NaOH

Calcule el factor de dilución de la solución amortiguadora:




Calcule el pH teórico de las seis soluciones de la TABLA 2:
1- 2- 3-







4- 5- 6-








TABLA 3: Indique con dibujos o fotografías, el efecto de la solución (iso, hipo o hipertónica) y la
centrifugación sobre los eritrocitos en el ensayo de presión osmótica
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3
Solución:________________ Solución:________________ Solución:________________
Antes Después Antes Después Antes Después

36
 DISCUSIÓN
Defina la relación existente entre pH y [H+] observada en las soluciones de la TABLA 1.







Explique molecularmente lo que sucede con las soluciones de la TABLA 2 al adicionarle ácidos y bases.







Describa lo que ocurre con los eritrocitos en cada caso del ensayo de presión osmótica.








CONCLUSIONES
1-
2-
3-

CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA

37


38
 PRÁCTICA 4

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS


OBJETIVO

Aplicar un método simple para extraer y determinar la concentración de glucosa en una
muestra biológica mediante un método colorimétrico.

INTRODUCCIÓN

La glucosa es posiblemente el carbohidrato más corriente en la naturaleza. Se
encuentra en todas las frutas dulces, por eso es también conocida como el azúcar de las
frutas. Todos los tejidos del organismo necesitan glucosa como fuente de energía para
sus funciones metabólicas, la cual procede principalmente de los carbohidratos
ingeridos en la alimentación o de la degradación del glicógeno (glucogenólisis). Existen
otras fuentes como los aminoácidos, el ácido láctico y el glicerol, los cuales son
transformados en glucosa por mecanismos gluconeogénicos en el hígado y los riñones.

La determinación de los niveles de glucosa en plasma o suero sanguíneo y en fluidos
corporales (orina, líquido cefalorraquídeo, pleural, etc.) constituye una medición de
primera línea para explorar las alteraciones del metabolismo de carbohidratos. Se han
reportado tres métodos para la determinación de glucosa sanguínea: óxido-reducción,
enzimáticos y de condensación.

El método de óxido-reducción aprovecha las propiedades de la forma enediol de la
glucosa, la cual al ser muy reactiva se oxida fácilmente por acción de iones cúpricos en
medio básico; no obstante, es un método dispendioso y poco específico. Los métodos
enzimáticos (glucosa oxidasa y hexoquinasa) catalizan la oxidación de la d-glucosa por
el oxígeno produciendo ácido glucónico y peróxido de hidrógeno; a pesar de ser una
técnica rápida y confiable, tiene la limitación de su alto costo. En los métodos de
condensación la glucosa puede quelarse a diversos compuestos aromáticos en solución
ácida, generando productos coloreados que pueden medirse colorimétricamente. Entre
estos compuestos aromáticos encontramos los fenoles y algunas aminas como la o-
toluidina.

La reacción de la glucosa con la o-toluidina conduce a la formación de una mezcla en
equilibrio de glicosilamina y la respectiva base de Schiff, la cual exhibe un color verde
que a 630 nm presenta su máximo de absorción (método de Dubowsky). Este método

39
es confiable, sencillo y específico para aldosas, sin embargo, registra interferencias por
la presencia de galactosa, manosa, ácido úrico, bilirrubina, fructosa y salicilatos. La
reacción química es la siguiente:

ESPECTROFOTOMETRÍA

Sistema de análisis basado en las medidas de la intensidad de la luz que pasa a través
de una solución utilizando diferentes longitudes de onda (λ), la cual se define como la
distancia entre dos picos cuando la luz recorre un camino en forma ondulatoria.

Numerosas sustancias químicas absorben luz de la región visible o ultravioleta del
espectro electromagnético. Esta propiedad es aprovechada para determinar la
concentración de dichas sustancias. Para esto, se hace pasar un rayo de luz de longitud
de onda específica, a través de una solución de la sustancia a cuantificar.

La cantidad de luz absorbida por dicha solución depende de tres factores: el tipo de
sustancia, su concentración y la distancia que debe recorrer el haz luminoso dentro de
la solución. En los análisis espectrofotométricos se utilizan como fuente de luz,
lámparas de tungsteno y de deuterio, para la región visible y ultravioleta (UV),
respectivamente. La longitud de onda de máxima absorbancia, la cual depende de la
sustancia a analizar, se selecciona con un monocromador.

La luz de intensidad inicial (Io) se pasa a través de una celda o cuveta que contiene la
solución de interés, la cual absorbe una parte de la luz incidente. La intensidad de la luz
transmitida se denomina I y es menor a Io. La absorbancia (A) de la solución se define
como Log10 Io/I y su relación con el tipo de sustancia, su concentración y la distancia
que debe recorrer el haz de luz, se explican con las siguientes leyes:

Ley de Lambert: relaciona la intensidad de la luz trasmitida y el espesor de la celda o
camino recorrido por la radiación luminosa. La expresión matemática es:

40
 e = Base de logaritmos naturales
I = Io e-K1.L L = Distancia que debe recorrer el haz luminoso dentro de la celda (cm)
K1 = Constante característica de la sustancia coloreada

Ley de Beer: relaciona la intensidad de la luz trasmitida con la concentración de la
sustancia coloreada dentro de la solución. La expresión matemática es:


C = Concentración de la solución coloreada (M)
I = Io e-K2.C
K2 = Constante de la sustancia coloreada


Las dos leyes pueden combinarse en una, conocida como Ley de Lambert-Beer, cuya
expresión matemática es: I = Io e-K.C.L

Despejando y convirtiendo a logaritmo decimal: Log10 Io/I = 0.4343 K.C.L

Como se mencionó anteriormente, Log10 Io/I es igual a la absorbancia (A), mientras que
el valor 0.4343 K corresponde al coeficiente de extinción óptica específico de la
sustancia analizada (ε), cuyas unidades son [M-1 . cm-1]. Reemplazando en la ecuación:


A = ε.C.L LEY DE LAMBERT-BEER

Funcionamiento básico de un espectrofotómetro.

Figura adaptada del Color Atlas of Biochemistry.

41
Por su parte, la transmitancia (T) de la luz no absorbida se define como:

T = I/Io

A menudo, la transmitancia se expresa como porcentaje:

%T = (I/Io) x 100

Despejando y ordenando la ecuación:

Io/I = 100 / %T

Aplicando logaritmo decimal:

Log10 Io/I = log 100 – log %T

Dado que Log10 Io/I = A, entonces la relación matemática entre transmitancia y
absorbancia es:

A = 2 – Log10 %T

Al determinar cuantitativamente una sustancia por colorimetría se debe establecer
primero la longitud de onda a la cual dicha sustancia presenta la máxima absorción, ya
que a esta longitud de onda la reacción es más sensible (Espectro de absorción).

A dicha longitud de onda se construye una curva de calibración graficando los valores
de absorbancia de soluciones de concentración conocida (ordenadas) -VS- el valor de
concentración respectiva (abscisas). En esta curva se interpolan los valores de
absorbancia para determinar las concentraciones de soluciones desconocidas.


BIBLIOGRAFÍA

• Dubowski K.M. An o-toluidine method for body fluid glucose determination.
Clinical Chemistry. 1962, 8 :215-235
• Koolman J, Roehm KH. Color Atlas of Biochemistry. 2nd edition. Georg Thieme
Verlag. 2005. Stuttgart, Germany.

42
REACTIVOS

● Patrón de glucosa (1 mg/mL)
● 0-toluidina 3% (P/V) en ácido acético, recién preparada
● Uva verde. El estudiante debe traer esta muestra.

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de la muestra: retirar la piel y las semillas una uva verde y pesar la
pulpa. Macerar en un mortero, filtrar a través de una gasa, algodón o papel de filtro y
medir el volumen obtenido. Tomar 1 mL del zumo filtrado y diluir con agua destilada
hasta completar un volumen de 50 mL. Esta será la MUESTRA para analizar.

2. Determinación de la concentración de glucosa: rotular 9 tubos de ensayo y
adicionar los reactivos en las cantidades (mL) y en el orden que se indica en la siguiente
tabla, mezclando después de cada adición:

TUBOS
REACTIVOS (mL)
PATRONES MUESTRA
BLANCO
P1 P2 P3 P4 P5 6 7 8
Patrón de glucosa (1 mg/mL) - 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 - - -
Agua destilada 1,0 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0,75 0,5 -
Muestra A - - - - - - 0,25 0,5 1,0
o-toluidina 3% (P/V) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Colocar los tubos en el baño de agua en ebullición por 15 min. Enfriar a temperatura
ambiente por 5 min y medir la absorbancia de cada tubo a 630 nm, ajustando el cero de
absorbancia con el tubo BLANCO.

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar el Informe de Laboratorio correspondiente.

CUESTIONARIO (se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. Algunos atletas consumen dietas con alto contenido de carbohidratos antes de los
eventos deportivos. ¿Bioquímicamente, cuál es el motivo de esta costumbre?

2. ¿Mediante qué ruta bioquímica las plantas sintetizan glucosa y cómo la almacenan?

43


44
PRÁCTICA 4: DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Preparación de la muestra:

Peso de la pulpa de la uva: ____________ Volumen del zumo de la uva: ____________

Determinación de la concentración de glucosa:

Concentración patrón de glucosa: _____mg/mL

Valores de absorbancia de los patrones de glucosa:

TUBO BLANCO 1 2 3 4 5
Absorbancia

630 nm
Concentración patrón

de glucosa (mg/mL)


Valores de absorbancia de las soluciones de muestra biológica:

MUESTRA BIOLÓGICA
TUBO 6 7 8
Absorbancia

630 nm

Otras Observaciones:

45
46
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
FORMATO DE LABORATORIO


PRÁCTICA:
DOCENTES:
ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:
Glucosa Método de Dubowsky










Espectrofotometría (colorimetría) Curva de calibración












DATOS Y CÁLCULOS: Complete las siguientes tablas:
TABLA 1: Datos de la muestra vegetal
Peso de la pulpa Volumen del zumo
de la uva (g) de la uva (mL)

47
 TABLA 2: Valores de absorbancia de los patrones de glucosa y de la muestra vegetal
PATRONES MUESTRA
TUBO BLANCO
1 2 3 4 5 6 7 8
Absorbancia 630

nm corregida

TABLA 3: Concentración (mg/mL) de glucosa en los patrones (indique los cálculos)

Concentración del patrón
Patrón 1: Patrón 2:
original





Patrón 3: Patrón 4: Patrón 5:





Utilizando los datos de las TABLAS 2 y 3, construya la curva de calibración correspondiente (Abs 630
nm VS Concentración de glucosa (mg/mL)), indicando la ecuación de la recta y el coeficiente de
regresión lineal (R2):














Calcule el factor de dilución del zumo de uva preparado:





Calcule el factor de dilución de las muestras 6-8 utilizadas:
Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8

48
Utilizando la ecuación de la recta, la absorbancia corregida de las muestras 6-8, los factores de dilución
calculados y los datos de la TABLA 1, calcule el porcentaje de peso de glucosa en la uva (%P/P):

DISCUSIÓN
Compare el contenido de glucosa de la muestra vegetal con datos reportados y discuta al respecto.

















Describa otras técnicas para determinar la concentración de glucosa en muestras biológicas.

49
 CONCLUSIONES
1-

2-


CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA

50
 PRÁCTICA 5

DESNATURALIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS


OBJETIVO

Identificar algunos factores que desnaturalizan a las proteínas y aplicar el método de
Biuret para determinar la concentración de estas en solución.

INTRODUCCIÓN

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

La desnaturalización de una proteína consiste en la pérdida de su estructura terciaria o
su estado nativo al alterar las fuerzas intermoleculares que la mantienen plegada.
Algunos de los factores que conllevan a la desnaturalización de las proteínas incluyen
la temperatura, el pH y los solventes orgánicos, entre otros.

La temperatura afecta interacciones no covalentes como los puentes de hidrógeno. En
general, la mayoría de las proteínas globulares experimentan desnaturalización cuando
se calientan por encima de 60-70oC. La formación de coágulos insolubles y blancos
cuando se hierve la clara de huevo es un ejemplo común de desnaturalización térmica.
Por su parte, valores extremos de pH afectan la carga neta de la proteína, causando
repulsión electrostática. La desnaturalización térmica y por pH es generalmente un
proceso irreversible.

Los solventes orgánicos (alcohol, acetona), ciertos solutos (urea, clorhidrato de
guanidina) y algunos detergentes, causan desnaturalización reversible, debido a que
alteran fuerzas intermoleculares hidrofóbicas que estabilizan el núcleo de las proteínas
globulares. Cuando el agente químico es removido, la proteína adquiere nuevamente su
estructura terciaria.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Existen diversos métodos de cuantificación de proteínas cuya elección se realiza
teniendo en cuenta criterios como la cantidad y la concentración de proteína, la
especificidad del ensayo y los interferentes, entre otros. Los métodos basados en la
absorción de la luz ultravioleta presentan ventajas como el análisis directo de la
muestra sin agregar reactivos y sin realizar incubaciones previas, siendo la relación

51
entre absorbancia y concentración, lineal. Las proteínas absorben luz ultravioleta a 220
nm (enlace peptídico) y a 280 nm (aminoácidos aromáticos). Sin embargo, en esta
región muchos compuestos pueden absorber, especialmente aquellos que contienen
dobles enlaces o grupos carboxilo.

Por su parte, los métodos colorimétricos se basan en la formación de complejos
coloreados entre los enlaces peptídicos y metales como Cu+2, otras coloraciones se
basan en la interacción de los aminoácidos con colorantes como Azul de Coomasie.
Algunos de los métodos más comunes son: Lowry, Biuret, Bradford y ácido
bicinconínico (BCA). Todos ellos presentan diferencias en sensibilidad y en las
sustancias que pueden interferir con la cuantificación de la muestra problema.

DETERMINACIONES COLORIMÉTRICAS

Cuando un rayo de luz de longitud de onda conocida pasa a través de una solución, parte
de la luz es absorbida y el resto es transmitida. La cantidad de luz absorbida depende
de la distancia que debe recorrer la luz dentro de la solución y de la concentración de
esta. Son dos las leyes que rigen las mediciones colorimétricas de las sustancias: la Ley
de Lambert y la Ley de Beer (Revisar la Práctica 3).

Al cuantificar una sustancia por colorimetría se debe establecer la longitud de onda a la
cual dicha sustancia presenta la máxima absorción, dado que a esta longitud de onda la
reacción es más sensible. A dicha longitud de onda se construye una curva de
calibración graficando los valores de absorbancia de soluciones de concentración
conocida o patrones (ordenadas) VS su concentración respectiva (abscisas):
Absorbancia VS Concentración. En esta curva se interpolan los valores de
absorbancia de las muestras desconocidas para calcular su concentración.

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET

La reacción de Biuret es una medida del número de enlaces peptídicos presentes en una
muestra. Los compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos, entre ellos
péptidos y proteínas, desarrollan un color rosado o lila cuando se tratan con sulfato de
cobre diluido en medio alcalino. El color se debe al complejo de coordinación que se
establece entre el átomo de cobre y cuatro átomos de nitrógeno provenientes de los
enlaces peptídicos. Los espectros de absorción de los complejos de cobre formados por
diferentes proteínas son similares, en consecuencia, es posible utilizar cualquier
proteína como patrón de coloración. Este método presenta buena reproducibilidad,
aunque su sensibilidad es baja, dado que requiere cantidades relativamente grandes de
proteína para desarrollar el color (1-20 mg/mL).

52
BIBLIOGRAFÍA

• Bohinski R.C. Bioquímica. 5ª edición. Addison-Wesley Iberoamericana. 1991.
• Campell M & Farrel S. Bioquímica. 4ª edición. Thompson. 2004
• Stoscheck C.M. Quantification of Protein. In Methods in Enzimology. Edited by
Deutscher M.P. 1990, 50-68
• Nelson D.L. & Cox M.M. Lehninger. Principles of Biochemistry. 6th edition. W.H.
Freeman & Company. 2014. New York, USA.

REACTIVOS

● Acetona
● Ácido Clorhídrico 1N
● Etanol 96%
● Hidróxido de Sodio 1N
● Reactivo de Biuret
● Solución estándar de caseína 5 mg/mL
● Solución de clara de huevo: diluir 15 mL de clara de huevo hasta 360 mL con NaCl
1% (P/V). Marcar como Muestra 1 (M1).

NOTA: Se realiza una única solución de clara de huevo para todos los grupos. Solo se
requiere un huevo, que debe ser traído por un estudiante.

PROCEDIMIENTO

1. Desnaturalización térmica:

Colocar en un tubo de ensayo 4 mL de solución de clara de huevo (M1). Calentar el tubo
al baño maría (37-40°C) por 5 min y observar cambios. Conservar esta muestra para
posterior cuantificación de proteínas. Marcar como Muestra 2 (M2).

Colocar en otro tubo de ensayo de vidrio 4 mL de solución de clara de huevo (M1).
Calentar hasta ebullición en la plancha de calentamiento y observar cambios.
Centrifugar a 4000 rpm por 5 min. Retirar el sobrenadante y almacenarlo en otro tubo
de ensayo para posterior cuantificación de proteínas. Marcar como Muestra 3 (M3).

53
2. Desnaturalización por pH extremos:

Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de solución de clara de huevo (M1). Adicionar con
pipeta Pasteur 0,5 mL de HCl 1N y observar cambios. Colocar al baño maría (37-40°C)
durante 5-10 min y observar cambios nuevamente. Utilizar 3 mL de solución de clara
de huevo (M1) adicionales y repetir el procedimiento, pero adicionando 0,5 mL de
NaOH 1N con una pipeta Pasteur, en lugar de HCl.

3. Desnaturalización por solventes orgánicos:

Colocar en un vaso de precipitado 1 mL de solución de clara de huevo (M1). Adicionar
1 mL de etanol (96%), agitar, dejar en reposo y observar cambios. Repetir el
procedimiento, pero adicionando 1 mL de acetona en lugar de etanol.

4. Cuantificación de proteínas:

a. Curva de calibración:
Rotular 6 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos (volumen total en
cada tubo: 2,5 mL):

PATRONES
REACTIVOS (mL) BLANCO
P1 P2 P3 P4 P5
Patrón de caseína (5 mg/mL) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Agua destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -
Reactivo de Biuret 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Mezclar e incubar 10 min a 37°C. Leer la absorbancia a 540 nm calibrando el
espectrofotómetro con el tubo Blanco. El color del complejo es estable 1 hora.

b. Cuantificación de muestras:
Se determinará la concentración de proteínas utilizando 0,25, 0,5 y 1,0 mL de:

● Muestra 1: Solución de clara de huevo original.
● Muestra 2: Sobrenadante obtenido por desnaturalización térmica a 37°C.
● Muestra 3: Sobrenadante obtenido por desnaturalización térmica a ebullición.

54
Rotular 10 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos (volumen total en
cada tubo es de 2,5 mL):

MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3
REACTIVOS (mL) BLANCO
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Muestra - 0,25 0,5 1,0 0,25 0,5 1,0 0,25 0,5 1,0
Agua destilada 1,0 0,75 0,5 - 0,75 0,5 - 0,75 0,5 -
Reactivo de Biuret 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Mezclar e incubar 10 min a 37°C. Leer la absorbancia a 540 nm calibrando el
espectrofotómetro con el tubo Blanco. El color del complejo es estable 1 hora.

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar el Informe de Laboratorio correspondiente.

CUESTIONARIO (se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. ¿Qué tipo de fuerzas intermoleculares se afectan en cada uno de los procesos de
desnaturalización aplicados en la práctica?

2. ¿Cuáles son las proteínas que están presentes en la clara de huevo?

3. ¿Cuál es el principio de la técnica de Bradford para análisis de proteínas?
Explique.

55
56
PRÁCTICA 5: DESNATURALIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Complete la siguiente tabla con las observaciones realizadas para cada prueba:

Desnaturalización térmica
Muestra calentada a 37ºC Muestra calentada a ebullición




Desnaturalización por pH
Muestra con HCl Muestra con NaOH




Desnaturalización por solventes
Muestra con etanol Muestra con acetona





Complete las siguientes tablas sobre la cuantificación de proteínas:

Volumen de la clara de huevo original Peso de la clara de huevo original


Concentración de la solución patrón de caseína:___________
TUBOS BLANCO P1 P2 P3 P4 P5
Absorbancia 540 nm
Concentración (mg/mL) -

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
TUBOS T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Absorbancia 540 nm

57


58
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
FORMATO DE LABORATORIO


PRÁCTICA:
DOCENTES:
ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:

Proteínas Estructura de proteínas

Desnaturalización Método de Biuret

DATOS Y CÁLCULOS: Complete las siguientes tablas utilizando fotos o dibujos y descripciones:
TABLA 1: Desnaturalización térmica
Muestra incubada a 37ºC por 5 minutos Muestra incubada hasta ebullición

59
 TABLA 2: Desnaturalización por pH extremo
Muestra desnaturalizada con HCl 1N Muestra desnaturalizada con NaOH 1N

TABLA 3: Desnaturalización por solventes orgánicos

Muestra desnaturalizada con etanol 96% Muestra desnaturalizada con acetona

TABLA 4: Valores de absorbancia de los patrones de caseína

PATRONES
TUBO BLANCO P1 P2 P3 P4 P5
Absorbancia 540 nm

TABLA 5: Concentración (mg/mL) de caseína en los patrones (indique los cálculos)

Concentración de la solución
Patrón 1: Patrón 2:
estándar

Patrón 3: Patrón 4: Patrón 5:

TABLA 6: Valores de absorbancia de las muestras proteicas

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
(Inicial) (Incubada a 37ºC) (Incubada a ebullición)
TUBO T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Absorbancia 540 nm

60
Utilice los datos de las TABLAS 4 y 5 para construir una curva de calibración: Abs 540 nm VS Concentración
de proteína (mg/mL). Indique ecuación de la recta y coeficiente de regresión lineal (R2):

Calcule el factor de dilución de las siguientes muestras:

Tubo 1, 4, 7 Tubo 2, 5, 8 Tubo 3, 6, 9

Utilizando la ecuación de la recta, los datos de la TABLA 6 y los factores de dilución anteriormente calculados,
determine la concentración de proteínas en las siguientes muestras:
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
(Inicial) (Incubada a 37ºC) (Incubada a ebullición)

Utilizando la concentración recién calculada para la Muestra 1 (Inicial) y los datos de la siguiente TABLA,
determine el % P/P de proteínas en la clara de huevo original:
Factor de dilución de la Volumen de la clara Peso de la clara original %P/P proteínas de la
clara original original (mL) (g) clara original

DISCUSIÓN
Compare el contenido de proteínas de la clara original con datos reportados y discuta al respecto.

61
Explique en términos bioquímicos lo que ocurre en cada caso de desnaturalización.

Explique los resultados de concentración de proteínas antes y después de la desnaturalización térmica.

CONCLUSIONES
1-

2-

CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA

62
 PRÁCTICA 6

SEPARACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS CONSTITUYENTES DE LA LECHE


OBJETIVO

Separar e identificar las principales proteínas, carbohidratos y minerales que contiene
la leche de vaca y cuantificar la lactoalbúmina y lactoglobulina presente.

INTRODUCCIÓN

LA LECHE
La composición química de la leche la constituye como uno de los alimentos naturales
más completo, presentando deficiencias únicamente de hierro y vitamina D. La leche
entera de vaca en promedio contiene agua (89,5%), proteína (3,4%), grasa (3,1%),
carbohidratos (3,2%) y cenizas (0,7%). Las leches de otras fuentes varían en
composición y aún en una misma especie pueden darse diferencias dependiendo del
estado fisiológico y hormonal, dieta ingerida y período de lactancia. La principal
proteína de la leche es la caseína, una fosfoproteína que constituye el 3% de la misma.
El 0,4% restante de las proteínas de la leche esta representado por las proteínas del
suero: lactoalbúmina, lactoglobulina y lactotransferrina.

SOLUBILIDAD Y PRECIPITACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
Las proteínas son electrolitos multivalentes y se comportan de manera similar a los
iones simples. En este sentido, bajas concentraciones de sal en el solvente estabilizan
los grupos cargados de las proteínas, aumentando su solubilidad (solubilidad por
salado o “Salting in”). El fenómeno contrario (precipitación por salado o “Salting out”)
se observa a altas fuerzas iónicas, como resultado de la competencia entre la proteína
y los iones de la sal por las moléculas de agua de solvatación. El incremento en la
concentración de la sal disminuye la concentración efectiva de moléculas de agua,
favoreciendo interacciones proteína-proteína, conllevando a su precipitación.

La solubilidad de la mayoría de las proteínas, a una fuerza iónica constante, presenta
un mínimo en su punto isoeléctrico, dado que a este valor de pH las repulsiones
electrostáticas entre las moléculas de soluto son mínimas. Los solventes orgánicos
como la acetona, el isopropanol y el cloroformo son buenos precipitantes, debido a que
presentan una baja constante dieléctrica.

63
Según su solubilidad, las proteínas se clasifican en los siguientes grupos:

GRUPO SOLUBLES EN INSOLUBLES EN EJEMPLOS
Agua
Soluciones de sulfato de
Soluciones diluidas de Lactalbúmina
amonio (NH4)2SO4
Albúminas sales como el NaCl Ovoalbúmina
saturadas al 80 % P/V
Soluciones ácidas y Seroalbúmina
Coagulan por calor
básicas diluidas
Soluciones diluidas de Agua y soluciones de Ovoglobulina
sales como el NaCl (NH4)2SO4 saturadas al Seroglobulina
Globulinas
Soluciones ácidas y 50 % P/V Legumina (globulina
básicas diluidas Coagulan por calor de semilla)
Alcohol 60-80% (V/V) Gliadina del trigo
Agua y etanol absoluto
Prolaminas Soluciones ácidas y Hordeína de la avena
No coagulan por calor
básicas diluidas Zeína del maíz
Solventes neutros,
Soluciones ácidas y soluciones salinas y Glutelina del trigo
Glutelinas
básicas diluidas alcohólicas Orizeína del arroz
Coagulan por calor
Agua y soluciones ácidas y Colágeno
básicas diluidas, salinas y Elastina
Escleroproteínas -
alcohólicas, resistentes a Fibroina
las enzimas proteolíticas Queratina

BIBLIOGRAFÍA

• Bohinski R.C. Bioquímica. 5ª edición. Addison-Wesley Iberoamericana. 1991.
• Campell M & Farrel S. Bioquímica. 4ª edición. Thompson. 2004
• Shriner R.L. & Fuson R.C. Identificación sistemática de compuestos orgánicos.
Limusa Noriega editores. 1995.
• Tabla de Composición de Alimentos Colombianos. ICBF. 2015.

REACTIVOS

● Ácido ascórbico (10 mg/10 mL)
● Ácido clorhídrico HCl 10% (V/V)
● Ácido molíbdico 20 mM
● Ácido nítrico
● Leche: 10 mL de leche entera de bolsa que no sea UHT/grupo de trabajo
● Oxalato de amonio 4% (P/V)
● Patrón de caseína o albúmina (5 mg/mL)
● Reactivo de Benedict
● Reactivo de Biuret

64
PROCEDIMIENTO
1. Precipitación isoeléctrica de la caseína:

a. En un vaso de precipitados de 100 mL mezclar 5 mL de leche y 5 mL de agua destilada.
Añadir con gotero HCl 10 % (V/V) cuidadosamente. Agitar constante y suavemente
hasta observar un precipitado floculento de caseína. La leche precipita a un pH
ligeramente más ácido que su punto isoeléctrico (pI = 4,55). Evitar el exceso de ácido.

b. Pesar un tubo Falcon vacío y transferir la mezcla anterior al mismo. Centrifugar 5
min a 4000 rpm, recoger y medir el volumen del sobrenadante (lactoalbúmina,
lactoglobulina). Marcar como Suero. Esta muestra se utilizará en las pruebas de
reconocimiento y en la cuantificación de proteínas.

c. Secar el precipitado remanente (caseína) contenido en el tubo Falcon, colocando el
tubo en la estufa a 75°C por 45 minutos. Enfriar, pesar y calcular el peso seco de caseína.

2. Cuantificación de proteínas por el método de Biuret:

a. Curva de calibración:
Rotular 6 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos (Vol. total: 2,5 mL):

PATRONES
REACTIVOS (mL) BLANCO
P1 P2 P3 P4 P5
Patrón de caseína (5 mg/mL) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Agua destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -
Reactivo de Biuret 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Mezclar e incubar 10 min a 37°C. Leer la absorbancia a 540 nm calibrando el
espectrofotómetro con el tubo Blanco. El color del complejo es estable 1 hora.

b. Cuantificación de muestras:
Rotular 4 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos (Vol. total: 2,5 mL):

REACTIVOS (mL) BLANCO T1 T2 T3
Muestra (Suero) - 0,25 0,5 1,0
Agua destilada 1,0 0,75 0,5 -
Reactivo de Biuret 1,5 1,5 1,5 1,5

Mezclar e incubar 10 min a 37°C. Leer la absorbancia a 540 nm calibrando el
espectrofotómetro con el tubo Blanco. El color del complejo es estable por 1 hora.

65
3. Determinación cualitativa de proteínas (Reacción Xantoproteica):

Muestras para analizar: suero, caseína (precipitado) y patrón de caseína.

Colocar 0,5 mL de las muestras en tubos de ensayo y adicionar CUIDADOSAMENTE 20
gotas de ácido nítrico concentrado. Mezclar e incubar en baño maría durante 5 minutos
y observar las coloraciones generadas. Agregar CUIDADOSAMENTE 20 gotas de
hidróxido de sodio 50% (P/V) y los resultados obtenidos.

Con el precipitado de caseína seca contenido en el tubo Falcon, proceder del mismo
modo, pero tomando una muestra con espátula en un tubo de ensayo.

4. Determinación de lactosa:

Colocar 1 mL de Suero en un tubo de ensayo y adicionar 1 mL del reactivo de Benedict.
Mezclar y calentar en baño maría con agua en ebullición durante 5 min. Observar los
resultados obtenidos.

5. Determinación de algunos minerales:

Determinación de calcio
Colocar 1 mL de Suero en un tubo de ensayo y adicionar 3 gotas de oxalato de amonio
4% (P/V). Observar los resultados obtenidos. Preparar un control de reacción
repitiendo el procedimiento, pero utilizando agua destilada en lugar de Suero.

Determinación de fosfato (reacción de Fiske-Subbarow)
Colocar 0.5 mL de Suero en un tubo de ensayo y adicionar 0,5 mL de ácido molíbdico,
agitar y dejar en reposo por 5 min. Adicionar 0,5 mL de ácido ascórbico, agitar y
observar los resultados obtenidos.

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar el Informe de Laboratorio correspondiente.

CUESTIONARIO (se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. Describa las siguientes reacciones químicas implementadas en esta práctica: Biuret
y determinación de calcio.
2. ¿Cuáles son los constituyentes de la lactosa y cómo puede hidrolizarse?
3. ¿Qué es un azúcar reductor? Mencione 3 ejemplos de reacciones para reconocerlos.

66
PRÁCTICA 6: SEPARACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS CONSTITUYENTES DE LA LECHE
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Complete la siguiente tabla sobre la precipitación isoeléctrica de la caseína:

Peso del tubo Falcon Peso del tubo Falcon + Cálculo del peso de la
Caseína seca caseína seca



Complete las siguientes tablas sobre la cuantificación de proteínas:

Concentración de la solución patrón de caseína: ___________
TUBOS BLANCO P1 P2 P3 P4 P5
Absorbancia 540 nm
Concentración (mg/mL) -

SUERO
TUBOS T1 T2 T3
Absorbancia 540 nm

Complete la siguiente tabla con las observaciones realizadas para cada prueba:

Determinación cualitativa de
proteínas (Reacción
Xantoproteica)

Determinación de Lactosa
(Prueba de Benedict)

Determinación de calcio
(Oxalato de amonio)

Determinación de fosfato
(Prueba de Fiske-Subbarow)

67


68
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
FORMATO DE LABORATORIO

PRÁCTICA:
DOCENTES:
ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-
3-

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:

Precipitación isoeléctrica de proteínas Prueba Xantoproteica

Prueba de Benedict Prueba de Fiske-Subbarow

DATOS: Complete las siguientes tablas utilizando fotos o dibujos y descripciones:

Identificación cualitativa de proteínas (Prueba Xantoproteica)
Suero (lactoalbúmina y lactoglobulina) Caseína seca

69
 Identificación cualitativa de azúcares reductores en el Suero: lactosa (Prueba de Benedict)

Identificación cualitativa de minerales en el Suero

Identificación de calcio Identificación de fosfato

Determinación del % P/V de caseína en la leche

Peso del tubo Cálculo del peso Volumen de la % P/V de la
Peso del tubo
Falcon + Caseína de la caseína seca muestra de leche caseína en la
Falcon (g)
seca (g) (g) analizada (mL) muestra

TABLA 1: Valores de absorbancia de los patrones de caseína

PATRONES
TUBO BLANCO P1 P2 P3 P4 P5

Absorbancia 540 nm

TABLA 2: Valores de absorbancia de las muestras de Suero

TUBO T1 T2 T3

Absorbancia 540 nm

70
 TABLA 3: Concentración (mg/mL) de caseína en los patrones (indique los cálculos)
Concentración de la solución
Patrón 1: Patrón 2:
estándar

Patrón 3: Patrón 4: Patrón 5:

Utilice los datos de las TABLAS 1 y 3 para construir una curva de calibración: Abs 540 nm VS Concentración
de proteína (mg/mL). Indique ecuación de la recta y coeficiente de regresión lineal (R2):

Calcule el factor de dilución de las siguientes muestras de Suero:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3

Utilizando la ecuación de la recta, los datos de la TABLA 2 y los factores de dilución anteriormente calculados,
determine la concentración de proteínas en el Suero de la leche:

DISCUSIÓN
Explique en términos bioquímicos los resultados de la identificación cualitativa de proteínas.

71
Explique en términos bioquímicos los resultados de la identificación de azúcares reductores.

Explique en términos bioquímicos los resultados de la identificación cualitativa de minerales.

Compare el contenido caseína y de proteínas del suero con datos reportados y discuta al respecto.

CONCLUSIONES
1-

2-

3-

72
CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA

73


74
 PRÁCTICA 7

DETERMINACIÓN DE VITAMINA C (ÁCIDO ASCÓRBICO)

OBJETIVO

Determinar el contenido de ácido ascórbico o vitamina C en frutas y/o verduras.

INTRODUCCIÓN

En el siglo XIV, durante extensos viajes en altamar, se registraban numerosas muertes

en las tripulaciones marítimas; la causa, un déficit vitamínico (avitaminosis o
hipovitaminosis) de ácido ascórbico o vitamina C, que conllevaba al desarrollo de una
condición patológica denominada escorbuto.

Esta enfermedad se caracteriza por una degeneración del tejido conectivo, el cual está
constituido principalmente por fibras de colágeno. Debido a que la vitamina C es
requerida para la hidroxilación de residuos de prolina y lisina del colágeno, su déficit
genera fibras inestables cuyos síntomas principales incluyen hemorragias, pérdida de
dientes, cicatrización insuficiente, fatiga e infecciones respiratorias.

En términos químicos, la vitamina C o ácido ascórbico, es una cetolactona de seis
carbonos (C6H8O6) que se oxida con facilidad al ambiente. La mayoría de los animales
sintetizan vitamina C a partir de glucosa en una ruta bioquímica de cuatro reacciones
catalizadas enzimáticamente. Sin embargo, algunos mamíferos como los gorilas, los
murciélagos de la fruta y los humanos, han perdido la última enzima de la ruta de
síntesis de ácido ascórbico, que cataliza la conversión de L-gluconolactona en ácido L-
ascórbico, razón por la cual debe obtenerse de la dieta.

Como su nombre lo indica, el ácido ascórbico, al ser un ácido, libera protones (H+) y trae
como consecuencia la disminución en el pH de la solución. Esta propiedad favorece que
el ácido ascórbico participe en reacciones REDOX como agente reductor (cede
electrones a otras moléculas reduciéndolas a expensas de su oxidación), lo cual es
relevante desde el punto de vista bioquímico. Al reaccionar con especies reactivas de
oxígeno, la vitamina C evita la oxidación de otras moléculas esenciales para la célula
como los fosfolípidos de las membranas biológicas y el ácido ribonucleico (ARN). Por lo
tanto, la vitamina C es un anti-oxidante vital para los seres vivos.

La oxidación del ácido ascórbico genera ácido dehidroascórbico, como se ilustra en la
siguiente figura:
75


El oxígeno, los iones metálicos, el pH, la luz y la temperatura son algunos de los factores
que conducen a la oxidación de la vitamina C. Adicionalmente, diversas enzimas utilizan
dicha vitamina como agente reductor en las reacciones que catalizan.

Las frutas cítricas, guayabas, tomates, fresas, verduras verdes y papas son fuentes ricas
de vitamina C. Los jugos de naranja y limón presentan una concentración de ácido
ascórbico aproximada de 0,5 mg/mL (2,8 mM). En vegetales puede presentarse en
forma libre (ácido ascórbico) o en forma combinada (ascorbígeno). Esta forma no es
detectada por los métodos corrientes de análisis a menos que se hidrolice a ácido
ascórbico, hirviendo el material con solución de ácido oxálico.

BIBLIOGRAFÍA

• Frankenburg FR. Vitamin discoveries and disasters. History, science and
controversies. ABC-CLIO. 2009. Santa Barbara, California, USA. Capítulo 5
• Tsao CS, Packer L, Fuchs J. An overview of ascorbic acid chemistry and
biochemistry. J Fac Pharm. 2009; 38(3): 233–55

REACTIVOS

● Ácido oxálico 0,15% (P/V)
● Agua destilada
● Etanol absoluto
● 1 fruta (Deben traerlas los estudiantes)
● NaOH 20% (P/V)
● 2-nitroanilina 0,16% (P/V) en ácido acético glacial:HCl 10% (V/V) (9:1)
● Nitrito de sodio 0,08 % (P/V), recién preparado
● Patrón de vitamina C 0,2 mg/mL, recién preparado. Nota: evitar la exposición del
patrón de vitamina C a la atmósfera, debido a que es un compuesto fácilmente
oxidable.

76
PROCEDIMIENTO

1. Registrar el peso de las muestras, exprimirlas y medir el volumen total del zumo.

2. Tomar 1 mL de zumo y agregar 4 mL de ácido oxálico 0,15% (P/V), mezclar y filtrar
(usar 2 capas de gasa y un embudo para tal fin). Cuando trabaje con frutas no
exprimibles o verduras, pesar 1 g de estas y macerar con 4 mL de ácido oxálico
0,15% (P/V). Estas preparaciones constituyen las muestras (M).

Nota: cuando las frutas y/o verduras, denominadas Muestras (M), presentan
coloración, se debe preparar un tubo Blanco de muestra con todos los reactivos
(incluyendo la muestra) excepto NaOH. Al realizar los cálculos, el valor de absorbancia
de este Blanco Problema se debe descontar del valor de absorbancia de las muestras.

3. En 10 tubos de ensayo CORRECTAMENTE marcados, agregar los siguientes
reactivos:
BLANCO PATRONES FRUTA
REACTIVO
BLANCO DE
S (mL)
MUESTRA P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2

2-Nitro
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
anilina

Nitrito de
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
sodio

4. Agitar y observar la decoloración. Si no se produce decoloración, agregar 0,1 mL
adicionales de nitrito de sodio y restar del volumen de agua. Luego, adicionar:
BLANCO PATRONES FRUTA
REACTIVOS
BLANCO DE
(mL) P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2
MUESTRA
Etanol
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
absoluto
Patrón vit. C
- - 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - -
0,2 mg/mL
Ácido
oxálico 0,6 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 - 0,3 -
0,15% (P/V)

Muestra - 0,3 - - - - - - 0,3 0,6

77
5. Mezclar y dejar en reposo 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, adicionar:
BLANCO PATRONES FRUTA
REACTIVOS
BLANCO DE
(mL)
MUESTRA P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2
NaOH
0,6 - 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
20% (P/V)
Agua
2,6 2,9 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6
destilada

6. Mezclar bien el contenido de cada tubo y leer en el espectrofotómetro a 540 nm.

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar el Formato de Informe de Laboratorio.

CUESTIONARIO (Se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. ¿Cuál es la función del ácido oxálico en la práctica?

2. ¿Por qué se realiza el análisis en el espectrofotómetro a 540 nm?

3. ¿Qué función realizan los BLANCOS en la práctica?

4. ¿Qué sucedería al cuantificar el ácido ascórbico inmediatamente y 10 horas después
de obtenerlo? ¿Por qué se presenta este fenómeno?

78
PRÁCTICA 7: EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Complete las siguientes tablas:

Muestra utilizada: Peso de la muestra (g): Volumen del zumo (mL):




Absorbancia a 540 nm:


BLANCO PATRONES FRUTA
BLANCO DE
MUESTRA P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2

Otras observaciones:

79
80
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
FORMATO INFORME DE LABORATORIO

PRÁCTICA:
DOCENTES:
ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:

Función de las vitaminas Hidroxilación de prolina en el colágeno

Función antioxidante Factor de dilución

DATOS Y CÁLCULOS: Complete las siguientes tablas:

TABLA 1: Datos de la fruta analizada
Muestra Peso (g) Volumen del zumo (mL)

TABLA 2: Datos registrados a partir de análisis espectrofotométricos

BLANCO PATRONES FRUTA
BLANCO DE
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2
MUESTRA
Abs. corregida

540 nm

81

TABLA 3: Concentración (mg/mL) de Vit C en los patrones (indique los cálculos)
Patrón 1: Patrón 2: Patrón 3:

Patrón 4: Patrón 5: Patrón 6:

Utilice los datos de las TABLAS 2 y 3 para construir una curva de calibración: Abs 540 nm VS Concentración
de Vit C (mg/mL). Indique ecuación de la recta y coeficiente de regresión lineal (R2):

Calcule el factor de dilución del zumo preparado en el numeral 2 del procedimiento de la guía:

Calcule el factor de dilución de las muestras M1 y M2 cuando se mezclaron con los demás reactivos:
M1 M2

Utilizando la ecuación de la recta, la absorbancia corregida de las muestras M1 y M2, los factores de dilución
calculados y los datos de la TABLA 1, calcule el %P/P de Vit C en la muestra analizada:

82
DISCUSIÓN
Compare el contenido de Vit C de la muestra vegetal con datos reportados y discuta al respecto.

Describa otras técnicas para determinar la concentración de Vit C en muestras biológicas.

83
CONCLUSIONES
1-

2-

CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA

84
 PRÁCTICA 8

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA


OBJETIVO

Preparar un extracto enzimático crudo desde una fuente biológica para detectar la
actividad enzimática de la deshidrogenasa succínica, evaluar el efecto de su
desnaturalización térmica y la presencia de un inhibidor competitivo, así como la
concentración de sustrato sobre su velocidad de reacción.

INTRODUCCIÓN

ENZIMAS

Una de las funciones más importantes de las proteínas es la catálisis de las reacciones
químicas celulares. Los catalizadores aceleran las reacciones químicas ofreciendo rutas
de reacción cuya energía de activación es menor con respecto a las reacciones sin
catalizar. Las proteínas que tienen función catalítica se denominan ENZIMAS.

De manera general, las reacciones químicas consumen energía (son endergónicas) o
desprenden energía (son exergónicas). En las células, las enzimas catalizan ambos tipos
de reacciones, tanto de síntesis que consumen energía como de degradación que
desprenden energía. Gracias a las enzimas, las reacciones bioquímicas se realizan
rápidamente bajo condiciones suaves de presión y temperatura.

Las enzimas se caracterizan por su gran especificidad, de tal manera que cada enzima
cataliza una reacción particular. Inicialmente, la enzima se une a la sustancia que va a
transformar, denominada SUSTRATO, estableciendo el complejo ENZIMA-SUSTRATO,
a partir del cual se sintetiza y libera el PRODUCTO de la reacción. La enzima queda libre
para iniciar un nuevo ciclo catalítico:


SUSTRATO + ENZIMA E-S → PRODUCTO + ENZIMA


La presencia y actividad de una enzima se demuestra comprobando que puede realizar
una reacción química determinada. Dichas reacciones se clasifican en siete grupos que

85
dan origen a siete clases principales de enzimas, a saber: Óxido-reductasas,
Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, Ligasas y Translocasas.

Para estudiar las enzimas es necesario extraerlas de las células. El proceso de lisis
celular permite romper mediante métodos físicos o químicos las células, liberando sus
componentes internos en el solvente usado para la extracción. En cuanto a la actividad
enzimática, esta se determina con base en la cantidad de producto formado durante el
tiempo de reacción, expresándola usualmente como Unidad Internacional.

LA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA

Enzima clasificada como oxido-reductasa, cataliza una reacción muy importante en el

metabolismo oxidativo de la célula: la conversión del ácido succínico en ácido fumárico,
como parte del ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs. Esta enzima utiliza
como grupo prostético el FAD (dinucleótido de adenina y favina), es decir que es una
flavoproteína.

La reacción catalizada por la deshidrogenasa succínica implica la remoción y
transferencia de 2 H+ y 2 electrones desde el succinato hacia el FAD, produciendo FAD
reducido (FADH2) y fumarato:

A nivel funcional, la propiedad catalítica más notable de la deshidrogenasa succínica es
su especificidad estereoquímica: la deshidrogenación que promueve es
exclusivamente del tipo TRANS. Si no lo fuera, se produciría el isómero CIS (ácido
maleico), en igual cantidad que el isómero TRANS (ácido fumárico):

86
Como oxidante del FADH2 se puede utilizar un aceptor artificial de electrones, por
ejemplo, un colorante, que al reducirse se decolora. En esta práctica se usará el azul de
metileno (AM), cuya decoloración permite observar la actividad enzimática en los
distintos experimentos, puesto que el azul de metileno reducido (AM-H2) es incoloro y
oxidado es azul. La secuencia de reacciones es:

Debe anotarse que una solución de azul de metileno reducido (AM-H2, decolorado), se
tornará azul si entra en contacto con el oxígeno, por lo cual los experimentos deben
realizarse en ausencia de aire, aislando las reacciones con aceite mineral.

La velocidad de una reacción enzimática depende de varios factores como, por ejemplo,
la presencia de inhibidores. Diversos compuestos inhiben la deshidrogenasa succínica,
como los ácidos dicarboxílicos oxálico, malónico, oxalacético, etc. El tipo de inhibición
causada por estos ácidos, que son análogos estructurales del ácido succínico, es de tipo
competitiva. En esta práctica se evaluará la inhibición ejercida por el malonato de sodio
sobre la deshidrogenasa succínica.

BIBLIOGRAFÍA

• Bohinski R.C. Bioquímica. 5ª edición. Addison-Wesley Iberoamericana. 1991.
• Campell M & Farrel S. Bioquímica. 4ª edición. Thompson. 2004
• Nelson D.L. & Cox M.M. Lehninger. Principles of Biochemistry. 6th edition. W.H.
Freeman & Company. 2014. New York, USA.

REACTIVOS

● Arena lavada
● Azul de metileno 0,02% (P/V)
● Buffer de fosfatos 0,02 M, pH 7,4
● Tritón 0,05% (P/P) en buffer fosfato 0,02 M
● Malonato de sodio 85 mM en buffer fosfato 0,02 M
● Muestra de coliflor (La trae el Profesor)
● Succinato de sodio 85 mM en buffer fosfato 0,02 M, fresco

87
PROCEDIMIENTO

1. Preparación del extracto crudo:

a. Colocar en un mortero frío aproximadamente 10 g de coliflor cortado en trozos,

adicionar 10,0 mL de la solución de Tritón 0,05% (P/P) en buffer de fosfatos 0,02 M y
macerar hasta obtener una pasta suave.

b. Pasar la mezcla a un vaso de precipitados y dejarla reposar en un baño de hielo por

5 min. Disponer el extracto en tubos de ensayo y centrifugar por 5 min a 1000 rpm y
4°C. Recoger el sobrenadante en un tubo de ensayo y conservar en baño de hielo.

Este sobrenadante contiene la deshidrogenasa succínica, otras enzimas como la

citocromo oxidasa y la citocromo reductasa, FAD y coenzimas adicionales. Por esta
razón, dicha muestra constituye un Extracto crudo y no una enzima pura.

c. Desnaturalización del extracto: Adicionar 2 mL del Extracto crudo en un tubo de

ensayo y calentar directamente en la resistencia eléctrica hasta ebullición. Prevenir que
la muestra se evapore totalmente.

2. Estudio de la actividad enzimática:

Las reacciones enzimáticas se monitorearán considerando que el azul de metileno

exhibe una longitud de onda de máxima absorción a 660 nm. Entonces, se evaluará la
reducción del azul de metileno y su consecuente decoloración a través del tiempo
mediante el espectrofotómetro.

a. Rotular 5 tubos de ensayo y adicionar en su orden los siguientes reactivos:

REACTIVOS (mL) Blanco T1 T2 T3* T4

Succinato de sodio 85 mM 1 1 1 1 1
Buffer de fosfatos 0,02 M 3 2 1,5 2 1
Azul de metileno 0,02% (P/V) - 1 1 1 1
Malonato de sodio 85 mM - - - - 1
Incubar los tubos en el baño maría a 37 °C durante 5 min. Retirarlos y colocarlos en un vaso de
precipitados que contenga agua a 37 °C y agregar el extracto enzimático atendiendo la
siguiente información:

Adicionar el extracto enzimático a la solución respectiva cuando esta esté dentro de la celda
del espectrofotómetro (previamente calibrado en 0 de absorbancia con el Blanco).

Registrar la medida de absorbancia de inmediato para el t=0 min y de las siguientes, para los
diferentes tiempos como se indica en el apartado b.
Extracto enzimático 1 1 1,5 1* 1
* En este caso se utilizará el extracto crudo desnaturalizado térmicamente.

88
b. Al agregar el extracto enzimático, mezclar por pipeteo, tomar de inmediato la
primera medida de absorbancia (t=0 min) y comenzar a medir el tiempo. Registrar
medidas de absorbancia a los 2, 4 y 6 minutos de reacción. Realizar las reacciones y
medidas de absorbancia para todos los tubos indicados en la tabla arriba.

NOTAS:

1- Cuando la enzima está muy activa o concentrada, al momento de añadir el extracto

enzimático se produce una decoloración muy veloz. En este caso se aconseja diluir el
extracto enzimático con buffer de fosfatos 0,02 M pH 7,4 (1:1, 1:2, 1:3,) hasta lograr una
dilución adecuada de la enzima. Esta dilución se usará en lugar del extracto enzimático
original.

2- Si el extracto enzimático está muy diluido, se espera que la absorbancia no cambie

de forma constante durante los 6 minutos de la reacción. Se aconseja concentrar la
enzima o realizar de nuevo la extracción con menor cantidad de buffer.

3- Si se observa que la absorbancia aumenta a lo largo del tiempo, es recomendable

agregar 1 ó 2 gotas de aceite mineral para evitar la oxidación del azul de metileno.

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar el Informe de Laboratorio correspondiente.

CUESTIONARIO (se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. ¿Qué significa el código EC 1.3.5.1 que identifica la deshidrogenasa succínica?

2. ¿Qué factores afectan la actividad enzimática y cómo podría estudiar
experimentalmente uno de ellos?

3. ¿Cómo es la estructura del azul de metileno en sus formas oxidada y reducida?

4. ¿Cuál es el aceptor normal de electrones y protones del FADH2 en la cadena de
transporte de electrones?

89


90
PRÁCTICA 8: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA DESHIDROGENASA
SUCCÍNICA
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Construya tabla con los datos experimentales obtenidos en la práctica:



























Otras Observaciones:

91


92
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
FORMATO DE LABORATORIO

PRÁCTICA:
DOCENTES:
ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:

Enzimas Succinato deshidrogenasa

Inhibición de enzimas Actividad enzimática

RESULTADOS:
Construya las siguientes gráficas, indicando los resultados obtenidos al cabo de 6 minutos de reacción:
Tubo 1 (control) Tubo 2 (mayor cantidad de extracto)
Abs 660 nm -vs- Tiempo (min) Abs 660 nm -vs- Tiempo (min)

Velocidad de reacción (Abs/min): Velocidad de reacción (Abs/min):

93
 Tubo 3 (extracto desnaturalizado) Tubo 4 (extracto inhibido)
Abs 660 nm -vs- Tiempo (min) Abs 660 nm -vs- Tiempo (min)

Velocidad de reacción (Abs/min): Velocidad de reacción (Abs/min):

DISCUSIÓN
Explique bioquímicamente los resultados obtenidos en la práctica.

94
CONCLUSIONES
1-

2-

CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA

95


96
 PRÁCTICA 9

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA


OBJETIVO

Preparar un extracto enzimático crudo desde la habichuela para detectar la actividad
enzimática de la catalasa y evaluar el efecto de su desnaturalización térmica y la
presencia de un inhibidor sobre la misma.

INTRODUCCIÓN

La catalasa (EC 1.11.1.6) es una enzima que está presente en células animales (glóbulos
rojos, células epiteliales de riñón, hepatocitos), en todos los materiales vegetales y en
los microorganismos diferentes a los anaerobios obligados.

Varias reacciones metabólicas celulares en las que están implicadas las quinonas,
flavoproteínas y proteínas que contengan hierro y azufre, generan especies muy
reactivas provenientes del oxígeno. Entre ellas se encuentran el radical superóxido,
•O2- ; el radical hidroxilo, OH• y el peróxido de hidrógeno, H2O2. Estas especies son
tóxicas y deben ser eliminadas eficientemente de la célula para evitar daños en los
lípidos de las membranas celulares, ADN y proteínas en general. Las células poseen las
enzimas superóxido dismutasa, que transforma el anión superóxido en peróxido de
hidrógeno, el cual es degradado en agua y oxígeno por acción de la catalasa.

Las catalasas son enzimas que exhiben estructura cuaternaria cuyos pesos moleculares
oscilan entre 230-250 kDa. Cada subunidad contiene un grupo hemo (ferro-porfirina)
que participa en la catálisis. El valor de la constante catalítica (KCat = Vmax / [Enz]) de la
catalasa es 107/s. Esto indica que una molécula de enzima puede transformar 107
moléculas de sustrato cada segundo, lo que implica que cada molécula de H2O2
(sustrato) es transformada en 10-7 s.

La reacción química que cataliza la enzima catalasa es la siguiente:


H2O2 → H2O + ½ O2

97
La actividad enzimática de los preparados de catalasa se puede medir por diferentes
técnicas; por ejemplo, es posible monitorear la desaparición del peróxido de hidrógeno
mediante espectrofotometría a 240 nm. Adicionalmente, el peróxido de hidrógeno
remanente (aquel que no reaccionó después de haber detenido la actividad enzimática),
se puede determinar por titulación con permanganato de potasio, KMnO4, siendo la
técnica que se utilizará en esta práctica.

La estequiometría de la reacción de titulación es la siguiente:


2 KMnO4 + 5 H2O2 + 6 H → 5 O2 + 2 Mn2+ + 8 H2O
+

Los iones cianuro (CN-) establecen complejos estables con metalo-proteínas como la
catalasa, dado que estas contienen hierro férrico (Fe+3) en su grupo hemo. Por esta
razón este tipo de iones actúan como potentes inhibidores de la catalasa.


BIBLIOGRAFÍA

• Bohinski R.C. Bioquímica. 5ª edición. Addison-Wesley Iberoamericana. 1991.
• Campell M & Farrel S. Bioquímica. 4ª edición. Thompson. 2004
• Nelson D.L. & Cox M.M. Lehninger. Principles of Biochemistry. 6th edition. W.H.
Freeman & Company. 2014. New York, USA.


REACTIVOS

● Ácido sulfúrico (H2SO4) 6 N o ácido clorhídrico (HCL) 6 N
● Buffer fosfato 0,02 M (pH 7,4)
● Habichuela. La trae el Profesor.
● Permanganato de potasio (KMnO4) 0,005 M
● Peróxido de hidrógeno (H2O2) 0,05 M, preparado en fresco en buffer de fosfatos
(Llevar 10 mL de solución comercial de H2O2 a 250 mL con buffer fosfato)

NOTA MUY IMPORTANTE: El material de vidrio debe estar perfectamente lavado.
Lavar primero con agua de la llave y enjuagar con agua destilada.

98
PROCEDIMIENTO

1. Preparación del extracto crudo:

a. Pesar 2 g de habichuela, disponerla en un mortero frío, adicionar 10,0 mL de buffer

de fosfatos 0,02 M y macerar hasta obtener una solución verde.

b. Filtrar el macerado utilizando un embudo que contenga gasa, algodón o papel de

filtro. Mantener sobre baño de hielo el filtrado resultante, el cual constituye el extracto
enzimático que contiene la catalasa y otros componentes biológicos.

c. Desnaturalización del extracto: Adicionar 2 mL del extracto enzimático en un tubo

de ensayo y calentar directamente en la resistencia eléctrica hasta ebullición. Esta
muestra será empleada en el tubo 3 (T3).

2. Medida de la actividad enzimática:

NOTA IMPORTANTE: Debido a que la catalasa es muy reactiva, es necesario realizar
las mediciones de actividad a baja temperatura (4 ºC). Por lo tanto, todos los reactivos
y tubos de ensayo deben mantenerse en baño de hielo, excepto el tubo 4 (T4).

a. Rotular 7 tubos de ensayo grandes y adicionar en su orden los siguientes reactivos:

Temperatura
4ºC (baño de hielo)
REACTIVOS (mL) ambiente
T1 T2 T3* T4
Buffer de fosfatos 0,02 M 5 5 5 5
Peróxido de hidrógeno
1 1 1 1
(H2O2)
Ácido sulfúrico (H2SO4) o
1 - - -
ácido clorhídrico (HCl) 6N

Mezclar por inversión y alistar el cronómetro. Iniciar la reacción al agregar el
extracto enzimático a cada tubo. Mezclar por inversión y contabilizar 5 min.

Extracto enzimático 0,5 0,5 0,5* 0,5

*Utilizar en el tubo 3 (T3) el extracto enzimático previamente desnaturalizado.

99
b. Detener la reacción al agregar 1 mL de H2SO4 a cada tubo, excepto al tubo 1 (T1) y
mezclar por inversión. NOTA IMPORTANTE: Este paso se debe realizar lo más pronto
posible para asegurar que el tiempo de reacción de cada tubo sea exactamente el
mismo, es decir 5 min.

Titulación del peróxido de hidrógeno remanente:

Una vez detenida la reacción, transferir el contenido de cada tubo a un Erlenmeyer y
titular el peróxido de hidrógeno remanente con KMnO4 contenido en una bureta. El
punto final de la titulación se alcanza cuando aparece un color rosado suave
permanente después de agitar. Registrar la cantidad (mL) de KMnO4 gastado en la
titulación de cada muestra. NOTA IMPORTANTE: Titular las muestras comenzando por
el tubo 1 (T1).

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar el Informe de Laboratorio correspondiente.

CUESTIONARIO (se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. En la práctica se estudió el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
¿Qué otros factores deberían evaluarse para completar el estudio cinético de la
catalasa? Explique.

2. ¿Qué otras fuentes de catalasa existen?

3. ¿Por qué el H2O2 es un producto tóxico a nivel celular y cómo se produce en la célula?

100
PRÁCTICA 9: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Complete la siguiente tabla sobre la actividad enzimática de la catalasa:

Concentración de la solución de permanganato de potasio (KMnO4): __________
μmoles H2O2 μmoles H2O2
KMnO4 μmoles H2O2 μmoles H2O2
TUBO Descompuesto Descompuestos
gastado (mL) Iniciales Residuales
s /(min*mL extracto)

1 - - -


2


3


4


Otras observaciones:

101


102
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
FORMATO DE LABORATORIO

PRÁCTICA:
DOCENTES:
ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-
2-

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:

Estrés oxidativo Mecanismos de defensa antioxidantes

Catalasa (Estructura) Catalasa (Función)

RESULTADOS:
Indique los siguientes cálculos:
μmoles H2O2
Iniciales

103
 μmoles H2O2
Residuales
Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4








μmoles H2O2
Descompuestos
Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4








Velocidad de reacción
μmoles H2O2 Descompuestos / (min*mL extracto)
Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Construya la siguiente gráfica, indicando los resultados obtenidos al cabo de 5 minutos de reacción:
Cálculo de la concentración final de sustrato (indique cálculos):
Vel. Reacción -VS- Tratamiento

104
DISCUSIÓN
Discuta acerca de los hallazgos obtenidos en la práctica sobre la actividad enzimática de la catalasa.

CONCLUSIONES
1-

2-

105
CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA

106
 PRÁCTICA 10

EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN


OBJETIVO

Extraer ADN a partir de muestras vegetales y aplicar análisis espectrofotométricos para

determinar su concentración, pureza y verificar el efecto hipercrómico.

INTRODUCCIÓN

Los genes están presentes en las células de todos los organismos vivos, son segmentos
de ADN de doble cadena enrollado por proteínas que lo estabilizan. El ADN es un
polímero de nucleótidos unidos entre sí mediante enlaces fosfodiéster. Las cadenas de
nucleótidos presentan una secuencia definida que almacena la información genética
necesaria para el funcionamiento del organismo.

Esta práctica está diseñada para extraer ADN de diferentes tipos de células eucariotas
(hongos, plantas, animales) en cantidad suficiente para observarse a simple vista. El
proceso de extracción de ADN es esencial para muchos procedimientos de laboratorio
en biotecnología y para estudios de biología molecular. Por lo tanto, las muestras deben
manipularse con extremo cuidado para evitar la ruptura de la cadena de ADN y el
consecuente cambio de estructura e identidad de la molécula.

El ADN debe separarse de los otros componentes celulares, para purificarlo se aplican
diferentes estrategias que aprovechan las diferencias de solubilidad entre el ADN y las
otras macromoléculas presentes en las células, entre ellas, otros tipos de ácidos
nucléicos: ARNt, ARNr, ARNm. Una vez la pared celular se ha roto por acción de un
detergente, la muestra se calienta promoviendo la desnaturalización y precipitación de
las proteínas presentes. Las proteínas asociadas al ADN se separan tanto por acción del
detergente como de las sales que generan un cambio iónico en el medio manteniendo
el ADN suspendido en la solución. Posteriormente, la adición de alcohol junto con la
fuerza iónica del medio precipita el ADN como una nube blanca.

Los ácidos nucleicos pueden cuantificarse por su capacidad de absorción de luz
ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm, utilizando una celda de cuarzo de 1 cm
de camino óptico. El cuarzo no absorbe luz UV y permite el paso de la luz sin interferir
en el análisis. Dado que una muestra de ADN de doble cadena de concentración 50
μg/mL registra una absorbancia de 1 en una celda de este tipo, entonces es posible
calcular la concentración de ADN en solución.

107

Debido a la diversidad de proteínas en una célula (proteínas con diferentes propiedades
y solubilidades) es difícil obtener ADN completamente puro si se usan estrategias
basadas solamente en solubilidad de las moléculas. Existen diferentes procedimientos
para eliminar las proteínas remanentes después de la extracción, como su
desnaturalización con solventes orgánicos como el fenol. En esta práctica no se
utilizarán estrategias de purificación adicionales, por esta razón se espera que el ADN
resulte contaminado con proteínas.

Las proteínas exhiben un máximo de absorción a 280 nm, por lo tanto, es posible
cuantificarlas en esta longitud de onda. Para evaluar la pureza del ADN extraído se
calcula la relación entre las absorbancias obtenidas a 260 nm y 280 nm (Abs 260/280).
El valor de esta relación en una muestra de ADN con un rango aceptable de pureza debe
ser 1,6 - 1,8. Valores menores indican contaminación con proteínas, valores mayores
indican contaminación con ARN.

Cuando el ADN se somete a desnaturalización térmica, esta puede verificarse por
medición de la absorción a 260 nm, la cual aumenta debido a que las dos cadenas se
separan quedando las bases nitrogenadas expuestas a la interacción con la radiación
incidente. Este fenómeno se conoce como efecto hipercrómico.

Reacción de Fiske-Subbarow (prueba para fosfatos):
Los grupos fosfato de los ácidos nucleicos en presencia de ácido molíbdico generan
fosfomolibdatos, los cuales son reducidos por el ácido ascórbico, produciendo
complejos de óxido de molibdeno de color azul.

BIBLIOGRAFÍA

• Bohinski R.C. Bioquímica. 5ª edición. Addison-Wesley Iberoamericana. 1991.
• Boyer R. Conceptos de Bioquímica. International Thomson Ed. 1999.
• Campell M & Farrel S. Bioquímica. 4ª edición. Thompson. 2004
• Devlin T.M. Bioquímica. Libro texto con aplicaciones clínicas. Reverté, 1999.
• Horton H.R. Principios de Bioquímica. 4ª edición. Pearson – Prentice Hall. 2008.
• Nelson D.L. & Cox M.M. Lehninger. Principles of Biochemistry. 6th edition. W.H.
Freeman & Company. 2014. New York, USA.

108
REACTIVOS

● Acido ascórbico 1 mg/mL, recién preparado
● Acido molíbdico 20 mM
● Etanol 96% frío
● Solución extractora: 2 mL de champú o detergente líquido + 0,5 g de sal de cocina +
agua destilada hasta completar 25 mL
● Muestra problema (fresa, kiwi, papaya, levadura, banano, repollo, tomate de
árbol, uchuva, melón. NO CÍTRICOS)

NOTA: Cada grupo debe traer su propia muestra para la extracción del ADN.

PROCEDIMIENTO

Extracción de ADN:

a. Pelar, cortar en trozos y pesar 4 g de muestra en un vaso de 200 mL. Cubrir la muestra
con 20 mL de la solución extractora.

b. Incubar en baño de agua caliente a 60ºC por 10 min y macerar suavemente el material
vegetal contra el lado del vaso utilizando una cuchara o espátula.

El detergente promueve la disolución de las membranas celulares, liberando el
contenido intracelular, incluyendo el ADN que permanece suspendido en la solución.
Al calentar esta mezcla, las proteínas se desnaturalizan y precipitan. El ADN
se mantiene en suspensión por acción de los iones de la sal.

c. Enfriar la mezcla en baño de hielo por 5 min y filtrar a través de papel de filtro, gasa
o algodón, utilizando un embudo. Recoger 1 mL del filtrado en un tubo de ensayo
pequeño evitando la formación de espuma.

d. Inclinar el tubo y agregar lentamente, con una pipeta o gotero, 1 mL de etanol 96%
frío y agitar suavemente por inversión 3 veces. Incubar la muestra en baño de hielo por
3 min. El ADN precipitará lentamente y podrá observarse como una nube blanca.

e. Centrifugar la muestra a 3000 rpm por 5 min a 4°C. Retirar el sobrenadante y disolver
por inversión el precipitado (ADN) en 5 mL de agua destilada.

109
Medidas espectrofotométricas:

Registrar la absorbancia de la muestra de ADN a 260 y 280 nm. Utilizar agua destilada
como blanco.

Prueba para fosfatos:

Adicionar 1 mL de la muestra de ADN en un tubo de ensayo y agregar 10 gotas de ácido
molíbdico. Agitar y dejar en reposo por 3 minutos. Adicionar 10 gotas de ácido
ascórbico, mezclar e incubar en baño maría por 5 minutos. Observar la coloración
generada.

RESULTADOS

Imprimir, diligenciar y entregar el Informe de Laboratorio correspondiente.

CUESTIONARIO (se debe responder en el Informe de Laboratorio)

1. ¿Qué características presentan las proteínas asociadas al ADN?

2. ¿Por qué los ácidos nucleicos absorben a 260 nm?

3. ¿Qué es el efecto hipercrómico y por qué se genera?

4. ¿Qué es el Tm del ADN (temperatura de fusión) y cómo puede determinarse?

110
PRÁCTICA 10: EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN
COPIA PARA EL PROFESOR

GRUPO No.: ___________ SEMESTRE: ___________ FECHA: _____/_____/______

Cuantificación del ADN extraído:

Muestra utilizada: ______________________________

Valores de absorbancia:
MUESTRA
260 nm 280 nm

ADN original resuspendido en agua

destilada

Describa y realice un esquema o dibujo de la prueba para fosfatos:
















Otras Observaciones:

111


112
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA (1000043)
FORMATO DE LABORATORIO

PRÁCTICA:
DOCENTES:
ESTUDIANTES: GRUPO:

OBJETIVOS:
1-

2-

CONTEXTO: Defina los siguientes conceptos:

Ácidos nucleicos (Funciones) Ácidos nucleicos (Estructura y clasificación)

Cuantificación de ADN Aplicaciones de la extracción de ADN

DATOS: Complete la siguiente tabla de datos para el análisis de la solución de ADN extraída:
FRUTA O MUESTRA: _________________________________
Volumen de la Absorbancia Absorbancia
A260/A280
solución de ADN (mL) 260 nm 280 nm

113
Utilice los datos de la tabla anterior para calcular la concentración y masa total del ADN obtenido,
considerando que 1 unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 50 μg/mL de ADN de doble cadena:

DISCUSIÓN
Discuta sobre el método de extracción y la pureza del ADN obtenido, junto con la prueba para fosfatos.

CONCLUSIONES
1-

2-

114
CUESTIONARIO

BIBLIOGRAFÍA

115


116

ANEXO 1

Ejemplo de Ficha de Seguridad de Reactivo:

NOMBRE DEL REACTIVO: FÓRMULA MOLECULAR: PICTOGRAMA (SGA):

Ácido sulfúrico H2SO4

ESTADO FÍSICO/APARIENCIA: SOLUBILIDAD:

Líquido aceitoso, incoloro e inodoro. Miscible en agua, exotérmico.

PELIGROS QUÍMICOS: PREVENCIÓN:

Ácido fuerte que reacciona violentamente Utilizar traje de protección, manipular con
con bases y agua, es corrosivo. Al calentar se guantes y gafas de seguridad. Trabajar en
forman gases irritantes o tóxicos. cabina de extracción.

RIESGOS SÍNTOMAS PRIMEROS AUXILIOS

Sensación de quemazón. Ardor de Respirar aire limpio, reposar, asistir

INHALACIÓN
garganta. Tos. Síntomas no inmediatos. con respiración artificial.

Corrosivo. Enrojecimiento, dolor. Quitar las ropas contaminadas.

PIEL
Ampollas. Quemaduras graves. Lavar con agua abundante.

Enrojecimiento. Dolor. Quemaduras Retirar lentes de contacto y lavar

OJOS
profundas graves. con agua abundante.

Corrosivo. Dolor abdominal. Sensación Enjuagar la boca, NO provocar el

INGESTIÓN
de quemazón. Shock o colapso. vómito.

117
Modelo para Ficha de Seguridad de Reactivo:

NOMBRE DEL REACTIVO: FÓRMULA MOLECULAR: PICTOGRAMA (SGA):

ESTADO FÍSICO/APARIENCIA: SOLUBILIDAD:

PELIGROS QUÍMICOS: PREVENCIÓN:

RIESGOS SÍNTOMAS PRIMEROS AUXILIOS

INHALACIÓN

PIEL

OJOS

INGESTIÓN

118