Universidad de Sonora
Departamento de Ciencias Químico Biológicas
Laboratorio de Microbiología General
Práctica #6: Preparación y esterilización de material y
medios de cultivo
Integrantes:
Prof. Griselda Nuñez Mejía
Hermosillo, Sonora. 26 - Septiembre - 2023
Objetivo:
➢ Que el alumno se involucre en la preparación de algunos medios de cultivo y
materiales para el cultivo de microorganismos, así como en la técnica para su
esterilización por vapor húmedo.
Introducción:
Cuando se habla acerca del término ¨crecimiento microbiano¨ no se refiere a la
cantidad y ni en sí al tamaño. Cuando los microbios están en crecimiento aumentan
en número y forman colonias. En cuestión de tiempo las colonias crecen en un corto
periodo de tiempo si se les brindan las condiciones adecuadas. Para lo cual es
necesario tener en consideración aspectos como la temperatura y el pH, entre otros.
Un medio de cultivo es un material nutritivo preparado para el crecimiento de
microorganismos. Existen varias bacterias que pueden crecer en cualquier medio de
cultivo; otras requieren de medios especiales y otras ni siquiera crecen. Inóculo son
aquellos microbios que se introducen en un medio de cultivo para que comiencen a
crecer. Lo cual realizaremos en la práctica No.7 con el objetivo de obtener un cultivo
puro.
Los cultivos deben satisfacer ciertos criterios para que los microorganismos crezcan
como mencionamos antes, por ejemplo contener nutrientes adecuados para los
microorganismos que deseamos desarrollar, un pH ajustado, concentración
adecuada de oxígeno.
Ahora, un concepto importante que debemos tener en cuenta que va de la mano
con los medios de cultivos es la esterilidad, obviamente no vamos a sembrar en un
medio que no esté esteril ya que este no debe contener microorganismos viables.
Esterilidad es un proceso a través del que se logra la destrucción total de los
microorganismos viables presentes en un determinado material. El proceso de
esterilización de material de laboratorio tiene como fin eliminar cualquier carga
microbiana, ya sea patógena o no, de los productos que por su uso lo requieran. De
igual manera es necesaria la esterilidad de material, además de los cultivos. Las
técnicas de esterilización son fundamentalmente de carácter físico, a través de
autoclaves que exponen el material a vapor o gas esterilizante.
Materiales, muestras y reactivos:
● Matraz Erlenmeyer 500 mL ● Guantes
● Mechero Bunsen ● Cubrebocas
● Pipeta serológicas 10 mL ● Agar Sabouraud
● 2 Tubos de ensaye 13x100 ● Agar nutritivo
c/tapón.
Procedimiento:
1. Leer cuidadosamente las instrucciones del frasco contenedor del medio.
2. Pesar el medio de acuerdo a las instrucciones y la cantidad a preparar.
3. En un matraz Erlenmeyer (que sea al menos el doble de capacidad del
volumen a preparar), agregar la mitad del agua destilada medida.
4. Añadirle el medio de cultivo pesado y agitar suavemente para revolverlo.
Adicionar el resto del agua destilada.
5. Utilizando un mechero de Fisher, calentar lentamente y con agitación
continua hasta que el medio esté completamente homogéneo. Tapar con
algodón y gasa.
6. Agregar los medios que van en tubo, dejando el tapón flojo sin riesgo de caer
para permitir que el vapor entre.
7. Comprobar el nivel de agua de la autoclave y asegurar que el dren se
encuentre bien cerrado.
8. Distribuir el material de forma ordenada, evitando tocar las paredes de la
autoclave y sin acumular el material en un área específica.
9. Colocar la ampolleta del indicador biológico en un lugar donde difícilmente
llegue el vapor.
10. Cerrar o colocar la válvula, dejar subir la temperatura hasta 121 ℃ (15 lb de
presión) e iniciar el conteo del tiempo, manteniendo la temperatura constante.
11. Esterilizar por 15 minutos o de acuerdo a las instrucciones del proveedor.
12. Una vez terminado el tiempo de esterilización, esperar a que baje la presión
(se indica cero en el manómetro) antes de abrir la autoclave.
13. Abrir con mucha precaución y sacar el material con ayuda de un guante de
asbesto.
14. Retirar el incubador biológico e incubar bajo las condiciones señaladas por el
fabricante.
15. Dejar enfriar los tubos cerrados y el matraz a temperatura ~45 ℃ hasta poder
tolerarlo en el dorso de la mano. Distribuirlo en las cajas Petri estériles, son
aproximadamente 15 a 20 mL por caja.
16. Para hacer esta operación, retirar el tapón del matraz sin dejarlo en la mesa y
pasar por la flama del mechero la boca de éste. Luego levantar la tapa de la
caja de Petri estéril, solamente lo necesario para permitir la entrada del cuello
del matraz para vaciar el agar. Es necesario mover ligeramente la caja para
distribuir el medio.
17. Una vez solidificado y frío el agar, cerrar las placas, etiquetar y someterlas a
la prueba de esterilidad
Prueba de esterilidad:
1. Colocar las placas Petri con agar nutritivo en incubación a 37 ℃ por 24 hrs,
mientras que las de agar Sabouraud cinco días a temperatura ambiente.
2. Al finalizar la incubación revisar y descartar las placas contaminadas, estas
se guardan en el refrigerador para su posterior esterilización.
3. Las placas que no estén contaminadas etiquetarlas (tipo de medio, equipo,
grupo y fecha de elaboración). Guardar en forma invertida y almacenarlas en
el refrigerador.
Resultados y observaciones:
Al hacer las observaciones de las placas, pudimos notar que no
hubo contaminación alguna, esto se puede ver en la limpieza del
contenido en el agar contenido en la caja Petri, donde no hubo
crecimiento alguno.
En los agares nutritivos pudimos
observar que en uno de ellos hubo un
pequeño microorganismo sin identificar,
por lo que se considera contaminada,
en la segunda placa no hubo ningún
problema.
En el agar Sabouraud que nos
llevamos, hubo un gran crecimiento de
microorganismos, en su mayoría
hongos, que aún sin identificar, se puede ver que hay más
de uno en la placa, todos los observados tienen ”vellos”, lo que más los distingue
son los colores, que va desde un beige verdoso, un verde bosque oscuro y un color
negro.
Discusión:
Basándonos en lo que pudimos observar, confirmamos que, en la mayoría de los
casos, se trabajó en un ambiente de esterilidad, a excepción de uno de los agares
nutritivos, en la cual se observó el crecimiento de una colonia de un microorganismo
no identificado, esto se pudo deber a que no se trabajó correctamente en el
ambiente de esterilidad indicado, bien dejaron abiertas las cajas Petri o no
esterilizaron correctamente.
En la placa de Sabouraud que nos llevamos, sabemos qué sus componentes y
características sirven para el cultivo de hongos, que fue lo que creció en la misma.
Conclusión:
Aprendimos lo que es el cultivo de microorganismos, y las diferencias entre un
medio sólido, semi-sólido y un caldo, también para qué sirven, así como la manera
correcta de preparar y esterilizar todo al momento de su elaboración, cumpliendo de
esta manera el objetivo indicado al principio de esta práctica.
Cuestionario:
1. Investigue la composición de cada uno de los medios utilizados y su
fundamento.
Agar Sabouraud: En el medio de cultivo, la peptona, la tripteína y la glucosa
son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de
glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido, inhiben el desarrollo
bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y levaduras. El agar es el
agente solidificante. Puede ser suplementado con otros agentes selectivos de
crecimiento.
Agar nutritivo: Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la
pluripeptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono,
nitrógeno y aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El agregado de
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente
solidificante. Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estéril
para favorecer el crecimiento de microorganismos exigentes en sus
requerimientos nutricionales y permite una clara visualización de las
reacciones de hemólisis.
BHI: Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado
desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de
corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y
vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de
sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad
buffer. El agar es el agente solidificante. El agar cerebro corazón mantiene
los mismos principios que el caldo para el cultivo de estreptococos y otras
bacterias exigentes. Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada
estéril o con sangre equina desfibrinada estéril, permitiendo así el desarrollo
de hongos de difícil crecimiento. Con el agregado de 10% de sangre de
caballo desfibrinada, fue utilizado para el crecimiento de Histoplasma
capsulatum y de hongos patógenos. Por tratarse de un medio que contiene
glucosa, no es un agar sangre apropiado para la observación de reacciones
de hemólisis. Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 40 µg/ml de
estreptomicina, se utiliza este medio para el aislamiento selectivo de hongos
patógenos.
SIM: Medio de cultivo en el cual la tripteína y la peptona aportan nutrientes
para el desarrollo microbiano. El triptófano es un aminoácido constituyente de
muchas peptonas y particularmente de la tripteína y puede ser metabolizado
por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto
de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el
aldehido del reactivo de Ehrlich (Indol Reactivo REF B1550361) o de Kovac
´s, para originar un compuesto de color rojo. A partir del tiosulfato de sodio
los microorganismos pueden generar ácido sulfhídrico que reacciona con el
hierro presente formándose un compuesto de color negro. El agar es el
agente solidificante y a esta concentración le otorga al medio la propiedad de
ser semisólido, condición necesaria para detectar movilidad, que se evidencia
por el enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la
línea de siembra del microorganismo en estudio
2. ¿Qué tipo de material se puede esterilizar por calor húmedo?
Textil (ropa, gasa, algodón, etc.), vidrio (tubos, frascos etc.), goma, teflón,
polipropileno, acero inoxidable, contenidos acuosos, elementos con mercurio.
3. ¿A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las
formas vegetativas?
El agua a presión atmosférica hierve a 100ºC. A presiones superiores, la
temperatura de ebullición aumenta por lo que se pueden calentar soluciones
acuosas (como los medios de cultivo) a temperaturas superiores a 100ºC. El
autoclave permite elevar la presión de una a dos atmósferas sobre la presión
atmosférica.
4. ¿Cuáles son las condiciones de temperatura y presión que permiten la
destrucción de endosporas?
Una temperatura de 121 °C (una atmósfera de presión) con un tiempo de
exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores de
esporas.
5. ¿Por qué es necesario trabajar en una zona o área estéril y con material
esterilizado?
Para evitar la contaminación de los medios a preparar.
Bibliografía:
Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introducción a la
microbiología. Ed. Médica Panamericana.
Microbiología clínica práctica.. (1994). España: Servicio de Publicaciones.
Universidad de Cádiz.
PORRES OSANTE, N., RUIZ RUIZ, E. (2018). Microbiología clínica. España:
Ediciones Paraninfo, S.A.
