GUIA DE

LABORATORIO IAL -110

CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA GABRIEL RENÉ MORENO

Docente: Ing. Ysela Caballero Trujillo

Auxiliar: Daniel Flores Condori
Estudiante: ………………………………
Año: 2023

Santa Cruz – Bolivia

 INDICE

Laboratorio 1: Introducción al trabajo laboratorial en microbiología.

Laboratorio 2: Reconocimiento de material de microbiología
Laboratorio 3: Lavado, Desinfección, Preparación y esterilización de materiales de
Microbiología.
Laboratorio 4: Preparación de medios de cultivos
Laboratorio 5: Técnica aséptica
Laboratorio 6: Técnica de siembra en superficie y profundidad
Laboratorio 7: Pruebas Bioquímicas IMVIC
Laboratorio 8: Técnica del número más probable (NMP) Coliformes totales y E. coli
Laboratorio 9: Detección de Salmonella
Laboratorio 10: Determinación de Staphylococcus Aureus
Laboratorio 11: Mohos y Levadura
Laboratorio 12: Análisis microbiológicos (Método Petrifilm)

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 LABORATORIO N°1
INTRODUCCION AL TRABAJO LABORATORIAL EN
MICROBIOLOGIA

1.-OBJETIVO:
1.1 Conocer el funcionamiento adecuado del laboratorio.
1.2 Conocer y establecer las normas de seguridad laboratorial para microbiología.

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
INOCUIDAD: Que no puede causar daño, libre de bacterias patógenas incapacidad para
hacer daño
INOCULAR: Introducir un organismo biológico (bacterias) a un medio de cultivo para su
posterior estudio.
SEPA: Grupo de microorganismo de una misma especie listo para su estudio.
TECNICA ASEPTICA: Técnica usada para evitar contaminaciones durante la manipulación de
cultivos y de medios de cultivos estériles.
COLONIA: Agrupación de microorganismos de una misma especie.

3.- NORMAS BASICAS DE SEGURIDAD LABORATORIAL PARA MICROBIOLOGIA

• Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos
personales en el lugar que se les indique para tal fin.
• Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer
completamente cerrada.
• Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la

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sesión práctica.
• Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de
salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que
son contaminantes.
• Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura y
estando físicamente cómodo.
• Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de
suela antideslizante en las áreas de laboratorio.
• Evitar llevar en el laboratorio accesorios que podrían ser
fuente de contaminación (por ejemplo, joyas).
• Recoger el cabello largo.
• Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable.
• No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse
cosméticos ni ponerse o quitarse
lentes de contacto en ningún área del laboratorio.
• Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear
antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase
al profesor.
• Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales,
exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo
práctico.
• Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero.
Nunca debe dejar éste desatendido.
• Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios
y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte
cualquier daño de los mismos al profesor.
• Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para
tal fin, por ejemplo: las pipetas en los pipeteros, tubos y placas de Petri en las
ollas de desecho, etc.
• No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las etiquetas de los
mismos y estar seguro de cómo emplearlo.
• No devolver sustancias a sus envases originales.
• Emplear la pro pipeta al medir líquidos. Está rigurosamente
prohibido pipetear con la boca. De igual manera las pipetas tendrán tapones de algodón
para reducir la contaminación de estos dispositivos de pipeteo.
• Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el
profesor, no llevar a cabo experimentos no autorizados.
• Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material
contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como
menor.
• Reducir al mínimo la formación de aerosoles durante la realización de cualquier
trabajo práctico.
• Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculación
accidental y la generación de aerosoles durante su manipulación y desecho.
• Emplear técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos.
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4.- CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS DE LAS COLONIAS
➢ Olor: Del cultivo puede ser agradable o desagradable; fetal o frutal, amoniacal,
nauseabundo.
➢ Tamaño: Grande, medianos, pequeños, pequeñísimas.
➢ Aspecto: Opaco, brilloso, transparente, rugoso, algodonoso, aterciopelado.

5.- ESTUDIO MACROSCOPICO DE LAS COLONIAS

➢ Color: Amarillo, rojizo, blanco, cremas
➢ Forma: Redonda, alargada, irregular
➢ Bordes: Dentados festoneado filiforme, liso.
➢ Altura: Plana, elevada, cóncava, convexa.

7.- CULTIVO CONTAMINADO

➢ Contaminado: Es cuando aparece un germen extraño fuera de la linea de siembra.
➢ Cantidad de crecimiento del cultivo: Abundante, abundantísimo, escaso o muy
escaso.

8.- NORMAS DE SEGURIDAD DE LA UTILIZACION DE EQUIPOS

1. NORMAS GENERALES
Los equipos y aparatos nunca deben colocarse en zonas de paso, en particular en los
pasillos del laboratorio.
Todos los aparatos con toma eléctrica deberán cumplir las normativas de seguridad
correspondientes. Nunca deben utilizarse en zonas mal aisladas y expuestas a la humedad.
Las fuentes de calor (calentadores, termo bloques, etc.), sobre todo si se alcanzan
temperaturas elevadas, deberán estar debidamente señalizadas para evitar quemaduras
accidentales.
Todos los procedimientos de utilización de aparatos deberían contar obligatoriamente con
apartados relativos a su utilización segura.

2. NEVERAS
Un adecuado mantenimiento, limpieza y desinfección sistemáticos de los aparatos reduce
considerablemente los riesgos asociados a su utilización. Sin embargo, aun en estas
condiciones, hay que tener en cuenta lo siguiente:
• No deben almacenarse cultivos de microorganismos patógenos por inhalación en
recipientes que no estén convenientemente cerrados, especialmente si la cámara
tiene un sistema de circulación de aire.
• No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos volátiles inflamables
(éter etílico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de protección anti
deflagración. En los aparatos de tipo doméstico que se utilizan en el laboratorio debe
anularse la lámpara de la luz.

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3. CONGELADORES
La congelación es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes infecciosos,
de ahí un potencial riesgo y las siguientes recomendaciones:
• Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus
riesgos potenciales.
• El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes, etc. bien
cerrados. No se llenarán completamente, para evitar que rebosen por efecto del
aumento de volumen tras la congelación.
• Descongelar periódicamente, limpiar y desinfectar si fuese procedente.
• Utilizar guantes para manipular el contenido. Si la temperatura es baja (por ejemplo -
70ºC o inferior), los guantes representan una protección adicional.

4. INCUBADORAS
La limpieza y la desinfección, periódicas y sistemáticas, son el método recomendable para
reducir los riesgos derivados de la contaminación accidental del personal del laboratorio.

5. MICROONDAS
Los microondas cada vez son más populares en el Laboratorio de Microbiología y
constituyen una nueva fuente de accidentes, entre los más frecuentes las explosiones
cuando se usan para calentar medios con agar, ya que la diferencia de velocidad de
calentamiento produce burbujas que pueden estallar.
• Las botellas o matraces deben tener el tapón aflojado, ya que si está cerrado
estallan fácilmente.
• Estar siempre presente, con la ropa y pantalla facial adecuadas, y controlar la
intensidad del aparato, que sólo puede ser la máxima con agua y la mínima si se usa
con agar.
• Deberá existir una tabla bien visible de los tiempos en cada posición del
potenciómetro y de las cantidades a emplear.
• Los microondas interfieren con los marcapasos. No deben ser colocados a una
distancia inferior a 2 m de las personas que sean portadoras de uno de estos
dispositivos.

6. AUTOCLAVES
Las autoclaves deben poseer manómetro y termostato, así como válvula de seguridad,
sistema de desconexión rápido y la purga del vapor ha de realizarse a un recipiente
estanco y con agua, jamás directamente al exterior.
• No deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su
fundamento.
• Usar guantes especiales para protegerse del calor.
• No abrir jamás si el manómetro no está a "0" y la purga no ha sido abierta.
• Controlar una vez al mes su capacidad de desinfección mediante esporas, no siendo
suficiente el método químico. El uso de registros de presión y temperatura de cada
proceso y la instauración de un programa de mantenimiento también puede ser una
alternativa válida al control mediante esporas. El agua debe ser cambiada
regularmente.
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7. CENTRÍFUGAS
Los mayores riesgos derivan, sobre todo, de la contaminación por los aerosoles generados
durante la centrifugación de materiales biológicos y, en menor medida, de los traumatismos
accidentales. Se recomienda:
• Cuando se centrifugue material biológico potencialmente infeccioso deben utilizarse
tubos cerrados; la centrífuga debe disponer de rotores o cestillos de seguridad que
protejan al operador de los posibles aerosoles.
• La rotura accidental de un tubo y su vertido en la cubeta representa una incidencia
importante que debe ser comunicada inmediatamente al Supervisor o responsable,
de forma que se proceda a la desinfección segura del aparato
• No se deben utilizar centrífugas antiguas que no posean sistema de cierre de
seguridad, del que disponen todos los aparatos actuales, ni manipular éstas de forma
que permitan su apertura mientras están en funcionamiento.
• Si el laboratorio dispone de ultracentrífugas, el equilibrado cuidadoso del rotor es
fundamental.
8.- Expresión de resultados
9.- Conclusión:
10.- Cuestionario
1.- Que es la bioseguridad?
2.- Que es riesgo, y que tipos de riesgos pueden existir en un laboratorio.
3.- Que es un accidente y que factores contribuyen a su aparición.
4.- Mencione los principales agentes de riesgo a que generalmente estamos expuestos en el
laboratorio.
5.- Mencione los accidentes más comunes que se producen en el laboratorio.
11.- Bibliografía

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 LABORATORIO Nº 2
RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPOS DE
MICROBIOLOGIA

1.- OBJETIVO
1.1 Observar , identificar y conocer el uso adecuado de los materiales usados en el area de
microbiologia.
1.2 Familiarizarse con los materiales y equipos de los laboratorios.
1.3 Clasificar los materiales describiendo el tipo de material, principio, usos y caracteristicas
que los conforman.

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
Los materiales de laboratorio son empleados para la comprobacion experimental de las
leyes y fenomenos de las ciencias naturales, estudiadas en la teoria.
Para trabajar con eficiencia en el laboratorio es necesario conocer los nombres de los
diferentes materiales y equipos de laboratorio. Para clasificar la gran variedad de
materiales, instrumentos y equipos se eligen dos criterios generales para su mejor estudio y
son:
2.1.Por su clase de material empleado en su fabricacion.
2.2.Por su uso especifico
2.1.Por su clase de material empleado en su fabricacion.

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2.1.1. MATERIAL DE VIDRIO
El vidrio es un material duro, fragil, transparente y amorfo que se usa para haacer ventanas,
lentes, botellas y una gran variedad de productos.
El vidrio se obtiene por fusion de 1.500 ºC de arena de silice (SiO2), carbomato de sodio
(Na2CO3) y Caliza (CaCO3). No es un material cristalino en el sentido estricto de la palabra,
es mas realista considerando un liquido sub-enfriado o rigido por su alta viscosidad para
fines practicos. Su estructura depende de su tratamiento termico.

2.1.2. MATERIAL DE PLASTICO

Fabricados con polimeros como el polietileno de la mejor resistencia quimica, reusables,
esteriles, economicos, descartables, esterilizados, según sea el caso.
La utilidad de este material en el laboratorio es multiple y variada .Empleandose de muy
diversos quimicos.

2.1.3. MATERIAL DE METAL

Este material de alta resistencia fisica y viene a ser una mezcla de hierro, cromo, niquel,
bronce, laton y carbon.
➢ Hierro
➢ Inoxidable o aleaciones

HIERRO
El hierro se emplea principalmente para accesorios de tipo economico debido que no
puede resistir a la corrosion porque hay formacion y desprendimineto de oxido de hierro y
asi acortando su tiempo de vida util a difeerencia de los materiales de acero inoxidable se
debe tomar medidas de conservacion para mayor tiempo de vida util para su vida

ACERO INOXIDABLE
El aceri inoxidable es un metal reciclable que tiene un minimo efecto en el medio
ambiente, y tiene las ventajas adicionales de ser fuerte, resistente a la corrocion y durable.
En consecuencia, el acero inoxidable esta ganando puntos como “eco-producto”
ofreciendo considerables ventajas economicas para el medio ambiente.
El grado de resistencia a la corrocion del acero inoxidable evita el gasto deuna capa
protectora contra el oxido y tambien brinda una vida util mayor. Los costos de
mantenimiento se reducen.
Compuestos de un solo grado de acero no requieren separacion para su reciclaje y
pueden ser 100% reciclados.

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2.1.4. MATERIAL DE MADERA
Este material ha caido en desuso, desplazado por los plasticos y por el acero inoxidable, son
de menor peso y descartables debido a su facil destruccion cuando esta con agentes
quimicos corrocivos
(Quimica Experimental Luis Carrasco Banegas 1996)

2.2. POR SU USO ESPECIFICO

Se clasifican en:

Instrumento para medicion: Balanza (triple barra, dos platillos, un solo platillo, analitica)
decimetros.
Materiales de separacion: Embudos (Simples de vastago corto y largo, Buchner, de
separacion o decantacion), papel filttro.
Materiales para mezclas: Tubos de prueba (de ignicion, ensayo, graduados), crisoles,
capsulas de evaporacion
Materiales para calentamiento: Mechero bunsen, hornos electricos, mufla electrica, mantas
electricas.
Materiales de soporte: Soporte universal, pinzas (para crisol, vasos precipitados, tubos de
prueba, para buretas ) tripoide, gradillas, nueces, rejillas(metalicas, de asbesto).
Materiales de conservacion: Frascos.

3. ESQUEMA EXPERIMENTAL

NOMBRE TIPO DE MATERIAL DESCRIPCION Y USO

Caja petri Vidrio La placa o caja de petri es un instrumento
de laboratorio que consta de una base
circular y sus paredes son de una altura
baja, aproximadamente de 1 cm. Las
cajas de petri suelen ser empleadas en los
laboratorios. El uso más común de estos
instrumentos es el de ser contenedores
para el cultivo de células, bacterias,
mohos y otros tipos de microorganismos.

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Asas de platino o siembra Metal Las asas bacteriológicas deben ser
totalmente cerradas, de un diámetro no
superior a 3 mm y con un vástago no
mayor de 5 cm y deben sujetarse en
mangos de metal. Se emplea para
transportar o arrastrar o trasvasar inóculos
(pequeño volumen que contiene
microorganismos en suspensión) desde la
solución de trabajo también llamada
“solución madre” al medio de cultivo
(sólido o líquido) o de un medio a otro
(resiembra).

Succionadores o propipeta Plastico Las propipetas con un diseño de bolígrafo

o de lápiz, son ergonómicas y operarlas es
muy fácil, su diseño ha sido pensado para
que se puedan utilizar con una sola mano.
Es tan simple como girar la rueda para
lograr un manejo preciso en la aspiración
y dispensación de los líquidos. Al ejercer
presión en la palanca lateral se logra un
rápido dispensado del contenido. Este tipo
de propipetas son fácilmente
desarmables, algo que facilita su limpieza.
Son resistentes a los ácidos y álcalis. El
color indica su capacidad (ej: roja,
capacidad máxima 25 ml; azul 6ml; verde
10 ml, etc)
Papel Kraf Madera El papel Kraft es una clase de papel
grueso y basto de color marrón. Se fabrica
con pasta química, sin blanquear y se le
somete a una breve cocción. Es muy
resistente al estallido, el desgarro y la
tracción, entre otras peculiaridades. Se
utilizan como sobres para esterilizar
materiales.

Autoclave Acero inoxidable Un autoclave es un recipiente metálico de

paredes gruesas con cierre hermético que
permite trabajar con vapor de agua a
alta presión y alta temperatura, que sirve

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 para esterilizar material médico o de
laboratorio. Muchos autoclaves se usan
para esterilizar equipos y suministros
sometiéndolos a vapor de agua saturado
a alta presión a 121°C durante alrededor
de 15 a 20 minutos dependiendo del
tamaño de la carga y el contenido.

VIDRIO METAL PLASTICO MADERA EQUIPOS

Tubo tapa Espátula con Gradillas. Hisopo. Microondas.
rosca. punta de Dispersor o Cinta maskin. Estufa de cultivo.
Frasco tapa cuchara. esparcidor. Cinta adhesiva Estufa de
rosca. Pinzas para Gradilla para para el control esterilización.
Vaso membrana pipetas. de Homogeneizador
precipitado. filtrante Bandejas. esterilización. stomacher.
Mechero de Tijeras. Jarras. Papel madera. Agitador vortex.
alcohol. Papel aluminio. Bolsas Baño maria.
Probeta. Plato. stomacher. Balanza
Pipetas Cuchillo. Pisetas. semianalitica.
volumétricas. Tenedor. Esponja de Balanza
Tubos Durham. Engrampadora. poliuretano analítica.
Varilla drigaslkyl flexible. Cabina de flujo
o asa de vidrio. laminar.
Contador de
colonias.
Ph-metro.

4.EXPRESION DE RESULTADOS
Los materiales de vidrio tienen requisitos necesarios para que sea un buen material es:
Ser de buena calidad es decir que no sea fácil de quebrarse
Ser de color neutro
Poseer resistencia a las acciones mecánicas y a las variaciones de temperatura

5. CONCLUSION

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6. CUESTIONARIO
1. ¿Características del vidrio utilizado para la fabricación del material de cristalería para los
laboratorios?
2. ¿Cuáles son los instrumentos de laboratorio que se pueden calentar?
3. ¿Qué materiales se utilizan para medir volúmenes aproximados?
4. ¿Cuál es el instrumento más preciso para medir el volumen?
5. ¿Cuáles son los tipos de pipetas que existen?
6. ¿Cómo usar una pipeta de laboratorio?
7. ¿Qué es una micro pipeta y que utilidad tiene?
8. ¿Qué es una pipeta automática?
9. ¿Qué es más exacto la pipeta o una probeta?
10. ¿Cuánto resiste un vaso de precipitado?
7. BIBLIOGRAFIA

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 LABORATORIO Nº3
LAVADO, DESINFECCION, PREPARACION Y
ESTERILIZACION DE MATERIALES DE
MICROBIOLOGIA

1.-OBJETIVO
1.1 Conoer el funcionamiento de los principales equipos de esterilizacion.
1.2 Establecer procediminetos para la preparacion del material utilizado en el area de
microbiologia
1.3 Establecer procedimiento para el lavado y desinfeccion de todo material de vidrio del
area de microbiologia
2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
Esterilizacion: Es un proceso a travea del que se puede lograr la destruccion total de los
microorganismos viables incluyendo esporas presentes en un determinado material o
superficie inanimada.
Germicida: Es un agente que mata las formas vegetativas, mas no necesariamente las
formas esporuladas de los germenes.
Limpieza: Procedimiento destinado a eliminar por arrastre mecanico, suciedad y materias
organicas.
3.- SISTEMAS DE ESTERILIZACION
3.1 Agentes fisicos
3.2 Agentes quimico
3.3 Agentes mecanicos

3.1 Agentes fisicos

3.1.1 Calor: Es considerado el metodo por excelencia de esterilizacion siempre y cuando el
material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningun tipo de daño. El calor puede
aplicarse de dos formas como agente esterilizante:
➢ HUMEDO: AUTOCLAVE (VAPOR A PRESION) El calor humedo el cual destruye a los
microoganismos por desnaturalizacion de las proteinas.

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 ➢ SECO: ESTUFA U HORNO (AIRE CALIENTE) El calor seco destruye a los microorganismos
por oxidacion de sus componentes celulares.
3.1.2 RADIACIONES: La radiacion o emicion y propagacion de la energia a traves de un
medio, son atizadas como agentes para la eliminacion de microorganismos. Asi tenemos la
radiacion ionizada que se utilizan para la esterilizacion de materiales termilabiles, como
materiales plasticos; la radiaciones no son ionizadas como la luz ultravioleta que es
empleada en el control de areas cerradas.
3.2 Agentes quimico
Algunas sustancias quimicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tiene la
capacidad de promover una o mas reacciones quimicas capaces de dañar los
componentes celulares de los microorganismos (proteinas, membranas, etc).
3.2.1 ALCOHOLES: Son desnaturalizadores de proteinas y matan a las celulas pero solo
cuando se aplica en disoluciones al 70% ya que las celulas retienen el agua por donde el
alcohol entra a la celula y la mata cuando se aplica una disolucion al 100% necesita actuar
dentro de la celula junto son agua.
➢ Para desinfectar: Diluir al 70%(etanol,isopropanol)
➢ Para desengrasar: Al 100% seca mejor
Aunque actuen de forma rapida su efecto no es instantaneo. El alcohol isopropilico tiene
mayor poder germicida que el alcohol etilico y tambien es menos corrosivo sobre los
instrumentos pero tiene el incoveniente de que tiene un olor picante (irrita las mucuosas) y
por eso usamos mas el etanol.
El metanol es un alcohol muy toxico y venenoso que se usa para mecheros etc.
3.3 Agentes mecanicos
La filtracion permite la remocion de todos los microorganimos presentes en un liquido en un
gas reteniendolos sobre la superficie de un material. El sistema de filtrado no solo es usado
para liquidos sino tambien para el aire:
CAMPANAS DE FLUJO LAMINAR: Se utilizan como sistemas de esterilizacion de aires con filtros
HEPA que filtran particulas con un diametro mayor a 0,3 um. Para evitar contaminacion
ambiental de las muestras.

4.- PROCEDIMINETO OPERATIVO

PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MATERIAL: Al iniciar el procedimiento visualizar que todos
los materiales se encuentren totalmente limpios, secos y se encuentren en buen estado
Cajas petri:

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 ➢ Colocar las cajas de a 8 unidades todas con las tapas de un solo lado
➢ Envolverlas en papel madera y pegando solo los extremos con cinta maskin
➢ Estas son esterilizadas en estufa a 180ºC durante 1 hora.

Pipetas
Tenedor
Cuchilo
Plato
Varilla drigaskil
Frascos tapa rosca
Tubo tapa rosca

5.-MANEJO DE MATERIAL ESTERIL

➢ Al sacar el material esteril del autoclave no se puede contaminar (no tocar sin
guantes)
➢ Trabajar con placas esteriles
➢ No tocar partes internas ya que se consideran campos esteriles

6.- CONTROL DE ESTERILIZACION

La esterilizacion es eficaz cuando realizamos unos controles de esterilizacion que pueden ser
quimicos, fisicos o mecanicos y biologicos.
6.1 QUIMICOS
Cintas adhesivas: se utilizan en calor seco, humedo, como en oxido de etileno y que su
funcion de esterilizacion puede ser ademas de control de esrterilizacion al cambiar de color.

7.- ESTERILIZACION DE MESONES

➢ Utilizar desinfectantes san-t 10% y limpiar el meson con hojas de papel
➢ Por ultimo hechar alcohol sobre el meson y secar con hojas de papel

8.- DESINFECCION Y LAVADO DE MATERIAL

➢ Para desinfectar el material usado en lass practicas laboratoriales es necesario

primero autoclavar (autoclave 121ºC por 1 hora) lo que son los tubos tapa rosca,
frascos tapa rosca y asi todo material que contenga soluciones o medios de cultivos
ya inoculados.
➢ En el caso de la pipetas primero se lavan despues luego se las lleva a la estufa para
desinfectarlas y tenerlas esteriles para una proxima utilidad. En otras palabras la
desinfeccion del material sera correspondiente a donde se lon esteriliza.
➢ Todo material de vidrio debe de ser lavado de forma manual con un detergente
neutro y con ayuda de cepillos y/o esponjas de acuerdo a las necesidades del
material que se lave de manera que no queden residuos de ninguna indole.
➢ En el caso de las pipetas se debe dejar remojando en lavadores de pipetas con
detergentes neutroaproximadamente durante 1 hora.
➢ Todo material de vidrio se enjuaga con agua de grifo, asegurandose asi que no
queden residuos de detergentes u otras impurezas, finalmente se termina de
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 enjuagar con agua destilada ya que esta libre de sales minerales como el agua de
grifo y no dejaria manchas de color blancos (sarro).
➢ Si el material se encuentra mal lavado no sera aceptado por los auxiliares de
laboratorio y se dejara en remojo con una mezcla sulfocromica para luego lavarlo
adecuadamente como se describio antes.
9.- MATERIALES /EQUIPOS
➢ Autoclave
➢ Estufa de esterilizacion
➢ Papel madera
➢ Engampadora
➢ Cinta maskin
➢ Esponja, cepillos y paños
➢ Pipetas
➢ Cuchillos
➢ Tenedores
➢ Platos
➢ Cajas petri
➢ Varillas drigaskil
➢ Tubos tapa rosca
➢ Frascos tapa rosca

10.- MUESTRAS/REACTIVOS
➢ Alcohol al 70%
➢ Agua destilada
➢ San-t al 10%
➢ Detergente neutro
➢ Mezcla sulfocromica

11.- EXPRESION DE RESULTADOS

Todos los matriales a esterilizar deben llevar cinta de control, lo que verifica que todos los
materiales se encuentran esteriles al oscureserse dicha cinta
Esta cinta se coloca en el documento de control de esterilizacion

12.- CONCLUSION
13.- CUESTIONARIO
1. Esquematice una autoclave, indicando cuales son las partes que la conforman, así
como la función de cada una de ellas.
2. ¿Qué es y como se lleva a cabo la esterilización por calor húmedo?
3. ¿Qué es y como se lleva a cabo la esterilización por calor seco?
4. Describe los siguientes métodos de esterilización: tindalización, pasteurización,
filtración, radiaciones, gases.

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5. ¿Qué es una sustancia termolábil? y ¿Cómo se esteriliza?
6. ¿Qué significa termorresistencia en Microbiología?
7. ¿Qué tipo de indicadores se utilizan para verificar el proceso de esterilización?
8. ¿Qué es una espora bacteriana?
14.- BIBLIOGRAFIA

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 LABORATORIO N°4
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS

1.- OBJETIVOS:
➢ Determinar las condiciones óptimas para el desarrollo y multiplicación de lops
microorganismos proporcionándoles los nutrientes adecuados y condiciones exigidas
para cada especie de cultivo.
➢ Conocimientos de los tipos de cultivo e identificarlos
➢ Preparar medios de cultivo para poder identificar microorganismos en muestras de
diferentes alimentos.

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
MEDIO DE CULTIVO: Los medios de cultivos son una mezcla equilibrada de nutrientes que en
concentraciones adecuadas y condiciones físicas optimas permiten un buen crecimiento de
los microorganismos.
Contienen una base mineral; fuente de carbono, nitrógeno y azufre.
Formula básica de los medios de cultivos: Agua cloruro de sodio, peptona, extracto de carne
o levadura.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS:
➢ Medios Generales. - Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismo.
➢ Medios de enriquecimiento. - Medio al que se le añaden nutrientes extra y se utiliza
para microorganismos que tienen exigencias nutricionales. Ej. Agar chocolate, Agar
cerebro corazón etc.
➢ Medio que favorece al crecimiento de microorganismos determinados sin llegar a
inhibir a totalmente el crecimiento del resto.
➢ Medios selectivos. - Medio que solo permite el crecimiento de un solo grupo de
microorganismo e inhibe el de otros. Permite seleccionar aislar microrganismos a partir
de poblaciones mixtas
➢ Medios diferenciales. - Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que
un determinado tipo de microorganismo posee.

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3.-TIPOS BASICOS DE MEDIOS DE CULTIVO POR CONSISTENCIA
El tipo de medio de cultivo a utilizar depende de microorganismo de interés y de la necesidad
de realizar ese cultivo.
Los medios se pueden utilizar para el crecimiento de una especie o para diferenciar entre
cepas o especies.

SEGÚN SU CONSISTENCIA O ESTADO FISICO PUEDEN SER:

Líquidos o caldos: se emplean fundamentalmente para cultivar los microorganismos y
obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos,
estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se
multipliquen, identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.
Semisólidos: Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen estudiado
es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda.
Solidos o agares: Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. A diferencia
de los líquidos se les agrega agar. El agar es un polisacárido acido producido por ciertas algas
rojas, es un elemento solidificante que se licua completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40ºC. El agar se usa a una concentración del 15%. Con
mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado
por aquellas que crecen en él. La gelatina es otro agente solidificante, pero se emplea mucho
menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS

➢ AGAR. - El agar no se utiliza como nutriente solo para darle solidez a los medios de
cultivo. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido al que
acompañan algunas impurezas y que se obtienen de ciertas algas marinas. Un gel de
agar 1-2% en agua licua hacia los 100ºC, dependiendo de sagrado de pureza. Con la
excepción de algunos microorganismos marinos.
➢ EXTRACTOS. - Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (ej:
carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y calor, y posteriormente
concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados
son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivos. Ej: extracto
de carne, de levadura, de malta, etc.
➢ PEPTONAS. - Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales
minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales
o vegetales (soya, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en
pépticos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y
sales.
➢ Fluidos corporales. - Sangre completa, sangre desfribinada, plasma o suero sanguíneo
son frecuentes añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por lo tanto, ser obtenida en
condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no
solamente contribuyen con factores de crecimiento de algunas bacterias.
➢ Sistemas amortiguadores. - Algunos componentes son incorporados al medio de
cultivo para mantener el pH dentro del rango optimo del crecimiento bacteriano. Los
microorganismos más comunes son los neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento

pág. 19
 está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisodicos o sustancias como la
peptona, provienen de una desviación del pH.
➢ Indicadores de PH. - Indicadores acido-base, se añaden a menudo a los medios de
cultivo con objeto de detectar variaciones del PH.
➢ Agentes reductores. - Cisterna, tioglucolato y otros son agentes reductores que se
añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permiten el desarrollo de
los gérmenes micro aerobios anaerobios.
➢ Agentes selectivos. - Adición de determinadas sustancias al medio de cultivo pude
convertirse en selectivo. Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, asida sódica, telurito
potásico, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente
a determinados microorganismos.

4.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

En la actualidad la mayoría de los medios de cultivo se encuentran normalmente
comercializados bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la
preparación de un medio se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y
disolverlo en agua destilada (libre de inhibidores de crecimiento) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de
los componentes previamente esterilizados en la autoclave.

5.- MATERIALES / EQUIPOS

➢ Autoclave
➢ Baño maría
➢ Tubos de ensayo tapa rosca
➢ Pipetas de 1ml, 5ml, 10ml.
➢ Frascos tapa rosca de 250ml, 500ml.
➢ Tubos Durham.
➢ Mechero bunsen.
➢ Microondas.
➢ Balanza analítica.
➢ Espátulas.

6.- PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS.

• En general la preparación de un medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad
deseada del mismo
• Disolverla con agua destilada (libre de inhibidores de crecimiento) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
• Las sustancias termófilas se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los
componentes previamente esterilizados en autoclave.
• Para esterilizar los medios líquidos en caldo se distribuyen en recipientes adecuados
(tubos o matraces), en ningún la altura del líquido en el recipiente debe exceder en
tercio del volumen total de este.
• Si es medio solido se procede a fundir el agar en baño maría antes de esterilizarlo.
• Una vez listo los medios se proceden a esterilizar los medios de cultivo en la autoclave
a 121ºC durante 15min.
• Finalizada la esterilización en autoclave los medios líquidos se dejan enfriar a
temperatura ambiente.

pág. 20
 • Los medios solidos contenidos en tubos deben inclinarse para que al solidificarse
adopten la forma de agar inclinado si tal es su finalidad.
• Las cajas Petri pueden ser preparadas ahora, vertiendo el medio a u fundido y estéril
dentro de ellas en un ambiente aséptico, es posible a si mismo conservar el medio
destinado a las placas solidificados y estéril en tubos, que se fundieran en baño maría
en el momento de prepararlas.
• Caldos y medios de cultivo solidos pueden conservarse una vez esterilizados a
temperatura ambiente, sin embargo, para reducir su deshidratación y el consiguiente
cambio de las concentraciones de los componentes es preferible conservarlos a
refrigerados a 4ºC.

7.- MEDIOS DE CULTIVOS LIQUIDOS Y SOLIDOS

Agua de peptona tamponada

• 10g peptona bacteriológica
• 5g de cloruro de sodio + 9g de hidrogeno fosfato de sodio
• 1,5g hidrogeno de potasio
• 1lt de agua destilada hervida a 25ºC
• Regular a pH (8,7 + - 0,2) Colocar en frascos de 225g, esterilizar en autoclave a
121ºC/15min.

Agua de Peptona 0,1%

• 1g de peptona bacteriológica
• 1lt de agua destilada hervida a 25ºC
• Colocar en frasco de 225ml y en tubos de a 9ml
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min

Agua triptonada
• Pesar 10g de triptona
• 5g de cloruro de sodio por litro de agua destilada
• 1lt de agua destilada hervida a 25ºC y enfriada, mezclar
• Regular el Ph (7,3)
• Colocar en volúmenes de 5ml en tubos tapa rosca
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min

Agua Fosfatada
• Tomar 1,25ml de solución madre de fosfato
• 1lt de agua destilada hervida a 25ºC y enfriada, mezclar
• Transferir en frascos o tubos tapa rosca
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min
• Refrigerar a una temperatura de 4 – 8ºC.

Caldo Tetrationato
• Pesar 4,6g de caldo de tetrationato bajo campana
• 100ml de agua destilada estéril, calentar hasta disolver por completo, enfriar
• Agregar 2ml de solución de yodo yodurada (una vez agregada usarse ese mismo día)
• Agregar 1ml de indicador verde brillante

pág. 21
Caldo Rapapport vassiliadis (RV)
• Pesar 30g caldo rapapport
• 1lt de agua destilada
• Calentar suavemente hasta la dilución completa
• Esterilizar en autoclave 115ºC / 15min

Caldo de urea
• Pesar 0,9g de caldo de urea
• 95ml agua destilada, hervida y enfriada
• Distribuir en volúmenes de 10ml en tubos con tapa rosca
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min

MR-VP Médium
• Pesar 17g MR-VP Medium
• 1Lt agua hervida y enfriada, verificar el pH
• Repartir 5ml en tubos tapa rosca
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min

Caldo infusión cerebro corazón (BHI)

• 37g caldo (BHI)
• 1Lt agua destilada y enfriada
• Colocar a 5ml y de 10ml con tubos tapa rosca
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min

Caldo lauril sulfato – triptosa

• Pesar 35,6 caldo lauril sulfato
• 1Lt agua destilada hervida y enfriada a 25ºC
• Colocar de a 10ml en tubos tapa rosca con campana Durham
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min

Caldo E. Coli
• Pesar 37g caldo E. coli
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Colocar de a 10ml en tubos tapa rosca con campana Durham
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min

Caldo Verde Brillante Bilis 2%

• Pesar 40gr caldo verde brillante
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Colocar de a 10ml en tubos tapa rosca con campana Durham
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min

Plasma humano (Prueba de la coagulasa positiva)

• Cada vez que se adquiera un plasma nuevo, deberá ser probado utilizando las cepas
de Staphylococcus aureus como prueba positiva.

pág. 22
Plate count agar
• Pesar 17,6g Plate count agar
• 5g de Agar bacteriologico
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Disolver por ebullición agitando frecuentemente
• Colocar en frascos no mas de la mitad del volumen en autoclave a 121ºC/15min

Citrato de Simmons Agar

• Pesar 23g de citrato Simmons agar
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• Colocar de a 5ml en tubos tapa rosca
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min
• Dejar enfriar en posición inclinada para que solidifique en pico de flauta con un fondo
alto

Lisina Hierro – Agar

• Pesar 34g Lisina hierro agar
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• Colocar en tubos de a 5ml
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min
• Dejar enfriar en posición inclinada para que solidifique en pico de flauta con un fondo
alto

Agar Triple azúcar hierro (TSI)

• Pesar 34g Agar triple azúcar hierro
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• Colocar en tubos de a 5ml
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min
• Dejar enfriar en posición inclinada para que solidifique en pico de flauta con un fondo
lleno de unos 2cm de altura
Baird Parker
• Pesar 31,5g Baird Parker
• 500ml de agua destilada hervida y enfriada
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• Esterilizar a 121ºC / 15min y enfriar a 45ºC y agregar asépticamente 25ml de emulsión
de yema de huevo y telurito, mezclar bien.
• Verter en cajas Petri y dejar solidificar, luego guardar en la heladera invertidamente a
4 – 8ºC.
Mac-conkey agar
• Pesar 51,5g Mac-conkey agar
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• Colocar en frascos no más de la mitad del volumen de su capacidad
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min
pág. 23
 • Enfriar a 45ºC y verter en placas de Petri solidificar
• Guardar en la heladera a una temperatura de 4 – 8ºC.

Agar Nutriente
• Pesar 23g de agar nutriente
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min
• Enfriar a 45ºC y verter en placas de Petri solidificar
• Guardar en la heladera a una temperatura de 4 – 8ºC
Agar Oxitetraciclina glucosa de levadura
• Pesar 20g de glucosa
• 15g de agar bacteriológico
• 5g Extracto de levadura
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min
• La adición de la oxitetraciclina se dará cuando vaya a usarse el medio
• Para ello disolver el medio y enfriar a 45ºC y agregar la oxitetraciclina en una relación
de 0,1g/lt en forma de solución acuosa

Agar MLCB
• Pesar 49g de MLCB
• 1Lt Agua destilada estéril, hervida y enfriada 25ºC
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• Enfriar a 50ºC y distribuir en cajas Petri
• No autoclavar

Agar Xilosa Usina Desoxicolato (XLD)

• Pesar 53g XLD
• 1Lt Agua destilada, hervida y enfriada 25ºC
• Calentar con agitación frecuentemente hasta que el medio entre en ebullición y se
disuelve totalmente
• Enfriar a 45ºC y vaciar en cajas Petri bajo campana
• Dejar solidificar y guardar en heladera a 4 – 8ºC

Agar Salmonella Shigela (SS)

• Pesar 60g SS
• 1Lt Agua destilada estéril, hervida y enfriada 25ºC
• Llevar a ebullición hasta la dilución completa
• NO AUTOCLAVAR. Enfriar a 50ºC y verter a cajas Petri estériles
• Dejar solidificar y guardar en heladera a 4 – 8ºC

Hecktoen Enteric Agar (HE)

• Pesar 76g de HE
• 1Lt de agua destilada estéril y dejar por unos segundos hasta la dilución completa del
agar
• NO AUTOCLAVAR. Enfriar a 50ºC y verter en cajas Petri estériles
pág. 24
Agar rojo – violeta billis
• Pesar 35,5g de rojo violeta billis
• 1Lt de agua destilada estéril y se hierve disolviendo el medio completo
• No resulta necesario ni deseable una nueva esterilización
• Se mezcla bien antes de verter a las cajas Petri

Agar Oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (agar – OGYE)

• Pesar 18,5g de agar OGYE
• 500ml de agua destilada a 115ºC/15min dejar enfriar el medio a 50ºC
• Agregar asépticamente el contenido de un vial de suplemento selectivo tetraciclina
• Mezclar bien y verter en cajas Petri

Agar verde brillante y rojo fenol lactosa – sacarosa

• Pesar 50g agar verde brillante y rojo de fenol lactosa
• 1Lt de agua destilada y se hierve disolviendo el medio completo
• Esterilizar en autoclave a 121ºC / 15min
• Dejar enfriar a 45ºC vaciar en caja Petri
• Guardar en heladera 4 – 8ºC

8.- PH DE LOS MEDIOS

MEDIOS PH
AGAR NUTRIENTE (25ºC) 6.8±0.2
AGAR VERDE BRILLANTE 6.9±0.2
AGUA TRIPTONADA 7.3
BAIRD PARKER 6.8±0.2
BHI 7.4±0.2
CALDO E.COLI 6.9±0.2
CALDO VERDE BRILLANTE BILIS 7.4±0.2
CITRATO SIMMONS 7.0±0.2
CALDO LAURIL 6.8±0.2
LIA 6.7±0.2
MULLER-HINTON 7.3±0.1
MAC-CONKEY 7.4±0.2
MR-VP 7.5±0.2
OXITETRACIDINA GLUCOSA 6.5±0.2
PEPTONA BACTERIOLOGICA 0,1% 7.0±0.1
PEPTONA TAMPONADA 7.0±0.2
PCA 7.0±0.2
RAPPAPORT VASSILIADY 5.2±0.2
TSI 7.4±0.2
UREA 6.8±0.2
XLD MEDIUN 250ºC 7.4±0.2
OPSP 7.3±0.2

pág. 25
9.- EXPRESION DE RESULTADOS

10.- CONCLUSION

11.- CUESTIONARIO

1. ¿A qué se le llama medio de cultivo? y ¿Para qué se utiliza?

2. ¿Qué es el agar? Menciona la forma de obtención, así como su uso.
3. Indica la clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su estado físico y la
utilidad de cada uno de ellos
4. ¿Qué en un medio de cultivo natural o complejo?
5. ¿Qué en un medio de cultivo sintético?
6. Define los medios de cultivo de acuerdo a su utilidad: enriquecido,
enriquecimiento, selectivo, diferencial, prueba bioquímica, de transporte y de
conservación. Menciona un ejemplo de cada uno de ellos.
7. ¿Qué es un factor de crecimiento?
8. Indica los cuidados que se deben tener al preparar los medios de cultivo
9. Escribe el nombre y fórmula de 3 ejemplos de sustancias que son utilizadas en los
medios de cultivo como fuente de: Carbono, Nitrógeno, Fósforo y Azufre.
10. ¿Qué factores físicos y químicos afectan la estabilidad de los medios de cultivo?
12.BIBLIOGRAFIA

pág. 26
 LABORATORIO Nº5
TECNICA ASEPTICA

1.- OBJETIVO:
➢ Crear un ambiente apto para el trabajo de microbiología.
➢ Aplicar las técnicas asépticas en el manejo de microorganismos.
➢ Conocer los procedimientos a seguir para el correcto control de higiene del personal.
➢ Control de limpieza en superficie, ambiente e higiene personal.

2.- Principio/Fundamento
Antisepsia-antiséptico: Es la desinfección sobre los seres vivos ej.: la piel
Asepsia: Sin organismos, no contaminación.
Antisepsia: Sin organismos patógenos mediante productos desinfectantes y antisépticos
Soluciones antisépticas: Productos químicos que eliminan los microorganismos de la piel,
actúan como desinfectantes, deben deben usarse después de una limpieza de la piel para
asegurar su efectividad.
Limpieza: Procedimiento, destinado a eliminar por arrastre mecánico, suciedad y materiales
orgánicos.
Descontaminación: Procedimiento, destinado a disminuir la carga microbiana que se
encuentran en superficies.
Desinfección: Procedimiento, destinado a eliminar de las superficies limpia la carga
microbiana a través de sustancias químicas.
Esterilización: Proceso destinado a eliminar toda forma de vida microbiana, incluyendo las
esporas, de las superficies inanimadas. Es un término absoluto.
Técnica aséptica: Técnica usada para evitar contaminaciones durante la manipulación de
cultivos y de medios de cultivos estériles.

pág. 27
Las técnicas asépticas requieren un ambiente limpio para trabajar y ordenado evitando
contaminaciones como requisitos básicos:
▪ Restringir la presencia de microorganismos en el estudio de un determinado cultivo y
así también evitar contaminación del operario.
▪ Evitar contaminaciones ambientales para ello el operario deberá esta
adecuadamente vestido u con instrumento para crear un ambiente estéril.

3.- MATERIALES/EQUIPOS
• ESTUFA DE CULTIVO
• Mechero
• Pipetas diferenciadas (1,10ml)
• Frascos tapa rosca de (100, 250, 500ml)
• Cajas Petri
• Varillas drigaslky
• Tubos de vidrio tapa rosca
• Autoclave
• Guantes térmicos
• Asa de platino
• Hisopo estéril
• Toallas de papel
• Agitador vortex

4.- REACTIVOS
• Agua fosfatada
• Plate count agar
• Agua destilada
• Alcohol al 70%

5.- PROCEDIMINETOS OPERATIVOS

EXPERIENCIA #1
TECNICA ASEPTICA
1º Coloque frente a usted el mechero y la preparación o la muestra que contiene los
microorganismos, así como el resto de los materiales y reactivos necesarios. Todo ello debe
ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos.
2º Tome el asa de siembra y flamee el filamento hasta que este alcance un rojo
incandescente. Enfríelo en la proximidad de la llama (10min).
3º Tome con la otra mano el recipiente que contiene la muestra o los microorganismos, si la
muestra en un tubo quiete la tapa con los dedos meñique y anular y flamee la boca del
tubo, si la muestra en la caja Petri, coloque la caja invertida sobre la mesa de trabajo y
levante la parte de la caja que contiene el medio de cultivo con los microorganismos
llévelo a la proximidad de la llama del v
Mechero.
4º Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama introduzca el esa de siembra
y tome una pequeña muestra de cultivo, si el medio es liquido agite ligeramente el tubo y
tome una muestra que quedara adherida, por tensión superficial, en el extremo del
pág. 28
filamento del asa de siembra, si los microorganismos se desarrollan sobre el medio sólido,
tome una pequeña porción de ellas mediante un ligero roce con el asa de siembra, si la
muestra se encuentra en la profundidad del agar, hunda el filamento dentro del medio
hasta tomar una pequeña porción de la misma.
5º Trasfiera el inoculo a otro medio de cultivo estéril, tomando las mismas precauciones en su
manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad de la llama, etc.) o bien
proceda a preparar un frotis para tinción.
6º Si la transferencia se va a realizar a un caldo estéril, descargue el inoculo mediante
agitación del asa de siembra en aquel.
6º Si la transferencia se va a realizar en un medio estéril en una caja Petri, deposite el inocuo
en área pequeña de la superficie de la caja Petri, próxima al borde. Extienda el inocuo
formando estrías muy juntas sobre la superficie de una porción pequeña de la caja,
tomando esta vez como inoculo el obtenido mediante el rozamiento del asa de siembra
con la estría sembradas por primera vez, realice la segunda tanda de estrías sobre una
porción virgen repita la operación tres o cuatro veces.
7º En caso de los tubos flamee la boca de estos antes de colocar la tapa marque los tubos
con la identificación del cultivo, la fecha y el nombre incube a temperatura adecuada el
tiempo necesario para que se desarrollen los microorganismos.
8º Si se realiza sobre un medio contenido en una caja Petri tape la caja esta se incubará en
posición invertida para evitar que el agua de condensación se deposite sobre la superficie
del agar, lo cual impedirá la obtención de colonias aisladas.
9º Marque en la base de las cajas Petri la identificación del cultivo, fecha y nombre.
10º Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa, flaméela de nuevo con el objeto de
esterilizarla.

EXPERIENCIA #2
CONTROL DE LIMPIEZA EN SUPERFICIES
1º. Humedecer un hisopo con solución de agua fosfatada al 0,1% y frotar 10cm2 de la
superficie.
2º. Introducir el hisopo cuidadosamente en el agua fosfatada restante, dejar reposar por
20min.
3º. Homogenizar y sembrar 0,1ml en caja Petri que contiene agar plate count agar.
4º. Esparcir el inoculo con varillas drigalsky estéril, tapar la caja Petri.
5º. Incubar en estufa durante 48hrs a 35 ± 2ºC.
6º. Transcurrido el tiempo de incubación hacer el recuento de las colonias registrar el
recuento como ufc/cm2 (unidades formadoras de colonias por centímetro cuadrado).

EXPERIENCIA #3
CONTROL DE HIGIENE PERSONAL

1º. Tome una caja Petri con PCA (Plate count agar) destápela y pida a la persona
seleccionada que haga una ligera presión con la yema de los dedos sobre el medio de
cultivo tape e invierta la caja Petri.
2º. Lleve a incubar en estufa durante 48hrs a 35 ± 2ºC.

pág. 29
3º. Transcurrido el tiempo de incubación hacer el recuento de las colonias registrar el
recuento como ufc/impresión digital (unidades formadoras de colonias por impresión
digital).
4º. Para el recuento se procura utilizar la caja Petri entre 30 y 300 colonias (esto
proporcionara una precisión estadística y no es engorrosa de hacer).

EXPERIENCIA #4
CONTROL DE AMBIENTE
1º. Tome una caja Petri con PCA (Plate count agar) destápela por completa en el ambiente
designado por 20min.
2º. Lleve a incubar en estufa durante 48hrs a 35 ± 2ºC.
3º. Transcurrido el tiempo de incubación hacer el recuento de las colonias registrar el
recuento como ufc/m3l (unidades formadoras de colonias por metro cubico).

6.- CALCULOS

7.- EXPRESION DE RESULTADOS

MESON LUGAR SUPERFICIE HIGIENE PERSONALUFC/IMPRESIÓN AMBIENTE

UFC/CM2 DIGITAL UFC/M3
1 DENTRO DEL LAB.
2 COMEDOR
3 CENTRO INTERNO
4 AULA
5 BAÑO

8.- CONCLUSION
9.- CUSTIONARIO
1 ¿Cuáles son las técnicas de la microbiología?
2 ¿Qué es la Microbiostasis?
3 ¿Qué es una técnica Aséptica en microbiología?
4 ¿Cuáles son los principios de la asepsia?
5 ¿Qué significa el término asepsia?
6 ¿Qué es un área aséptica?
7 ¿Qué es una técnica estéril?

10.- BIBLIOGRAFIA

pág. 30
 LABORATORIO Nº6
TECNICA DE SIEMBRA EN SUPERFICIE Y
PROFUNDIDAD

1.- OBJETIVO
➢ Aplicar las diferentes técnicas de siembra.
➢ Preparar diluciones a partir de una muestra de alimento
➢ Aplicar estos dos métodos de siembra para la determinación BMA.
➢ Hacer los recuentos de los m.o. desarrollados.

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
SIEMBRA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inoculo) es un
medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio
de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
La siembra pude realizarse en medio líquido, solido o semisólido, utilizando punta de asa,
hisopo o pipeta estéril.
Cultivo en medio liquido: Habitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se
pude manifestar por enturbiamiento, formación de gases, formación de velo o película, o
por sedimento.
Cultivo en medio solido: Pueden ser en tubos o en cajas Petri.
✓ Tubos con agar inclinado: Para sembrarlos, se mueve el asa o la punta suavemente
sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la
parte superior, cuidando de no dañar el agar.

pág. 31
 ✓ Tubos sin inclinar: Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar.
También se llama por picadura.
Siembra en caja Petri: Puede ser en superficie o incorporada. Las cajas Petri se incuban
invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio pude provocar condensación
durante la incubación y si cae en la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento
confluente.
En medio solido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en
cajas Petri se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar
y aislar.
En general cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado,
es necesario diluir la muestra en tubos con suero fisiológico estéril.

AISLAMIENTO
Es separar un tipo de microorganismo a partir de una población que los contiene de varios
tipos. En habitas naturales, raramente encontrados a los microorganismos en cultivos, pero
(un solo tipo de microorganismo), por lo tanto, es necesario hacer algún procedimiento de
aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de m.o. presentes.
El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los m.o.
están en una proporción adecuada.
Cuando el m.o. que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la
muestra, o interesa un solo m.o. se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda que
involucra una primera etapa de aumento del número de microorganismo del tipo que se
desea aislar con relación al resto de la población. Luego se aislar por el método de estrías o
por dilución y se identifica.
Para aislar se utiliza de los siguientes procedimientos:
✓ Aislamiento por estrías
✓ Aislamiento por dilución
✓ Aislamiento por estrías en caja Petri

EXISTEN DISTINTAS TECNICAS, EL OBJETO ES OBTENER COLONIAS AISLADAS

TECNICA A
Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la
superficie de la caja Petri; se quema el asa, se enfría, se gira la caja Petri a 90º y se vuelve a
estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrado inicialmente y cubriendo otro cuarto de la
caja. Por último, sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.
TECNICA B
Con el asa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el asa, se hacen 3 o 4 estrías
perpendiculares a las anteriores, se quema el asa y se repite el procedimiento hasta agotar
la superficie de la caja Petri.

AISLAMIENTO POR DILUCIONES EN MEDIO SOLIDO

✓ Se emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembra en
superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se pude preparar las

pág. 32
 diluciones decimales en condiciones asépticas usando suero fisiológico o algún otro
diluyente.
✓ La siembra incorporada se realiza tal como se describió anteriormente. También se
pueden preparar las diluciones directamente en tubos de agar fundido y
termostatizado (20ml) se agita por rotación entre las manos y se vierte en cajas Petri
estériles

3.- MATERILAES/EQUIPOS
• Asas de siembra
• Mechero
• Estufa de cultivo
• Autoclave
• Cajas Petri estériles
• Pipetas de 1,10ml estériles
• Succionadores
• Tubos tapa roscas estériles
• Bolsa stomacher
• Homogeneizador stomacher
• Marcador de vidrio
• Balanza semianalitica

4.-MUESTRA/REACTIVOS
• Plate count agar
• Plate count agar fundido
• Muestra de alimento solido
• Agua fosfatada
• Desinfectante
• Detergente

5.- PROCEDIMINETOS OPERATIVOS

EXPERIENCIA #1
PESADO, HOMEGENIZADO DE LAS MUESTRAS Y PREPARACION DE DILUCIONES

1º Pesar 25g de muestra en una bolsa stomacher estéril, previamente tarado.

2º Agregar 225ml de agua fosfatada en un ambiente estéril.
3º Eliminar todo el aire de la bolsa.
4º Colocar la bolsa en el stomacher y homogenizar durante 30seg a 230 r.p.m. o de acuerdo
al tiempo que el alimento necesite para poder ser bien homogenizado.
5º Una vez homogenizado obtenemos la dilución (10-1=0.1).
6º Agregar 1ml de la dilución (10-1=0.1). Se transfiere a un tubo que contiene 9ml de agua
fosfatada, obteniendo la dilución (10-2=0.01).
7º Añadir 1ml de la dilución (10-2=0.01), se transfiere a otro tubo que contenga 9ml de agua
fosfatada, adquiriéndose la dilución (10-3=0.001), y así sucesivamente obtenemos las
diluciones deseadas.
pág. 33
 EXPERIENCIA #2
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

1º De la bolsa stomacher dilución (10-1=0.1), tome 1ml y llévelo a una caja Petri estéril, que se
encuentre vacía. Marque la caja Petri como 1:10.
2º De la misma manera proceda con las siguientes diluciones, marque cada caja Petri con
su respectivo factor de dilución.
3º Vierta sobre el inoculo de las cajas Petri el Plate count agar (PCA), fundido y atemperado
(44 a 46Cº).
4º Homogenice la muestra con el medio de cultivo con movimientos circulares en sentido
horario (aproximadamente 5 veces) y luego en sentido anti horario.
5º Espere a que el medio solidifique, e invierta las cajas Petri.
6º Incubar las cajas Petri invertidas a 35±2Cº por 48hrs.
7º Despues del periodo de incubación examinar las cajas. Cada colonia representa los
descendientes de una bacteria o que es mas correcto, de una unidad formadora de
colonia. (UFC).
8º Llevar a cabo el recuento y expresar los resultados como UFC/gr. o ml.

EXPERIENCIA #3
SIEMBRA EN SUPERFICIE

1º Marque las cajas Petri que contengan agar (PCA) con sus respectivas diluciones.
2º Tome con la otra mano el tubo que contiene el inoculo, retire la tapa y flamee la boca
del tubo.
3º Agite ligeramente el tubo y tome una muestra de 0,1ml
4º Inocule en una caja Petri los 0,1ml esparcir con una varilla estéril extendiendo las muestras
por toda la caja, tape la caja Petri.
5º Lleve a incubar en posición invertida para evitar que el agua de condensación se
deposite sobre la superficie del agar, lo cual impedirá la obtención de colonias aisladas.
6º Antes de dejar la varilla sobre la mesa, flaméela por el mechero con el objeto de
esterilizarla y luego deposítela en una fuente que contenga desinfectante.
7º Repita para todas las diluciones el mismo procedimiento.
8º Lleve a incubar las cajas Petri invertidas a 35±2Cº por 48hrs.
9º Llevar a cabo el recuento y expresar los resultados como UFC/gr. o ml

6.- CALCULOS

pág. 34
7.- EXPRESION DE RESULTADOS
MESON/MUSTRA SUPERFICIE PROFUNDIDAD
10 -1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3
1
2
3
4
5

8.- CONCLUSION

9.- CUESTIONARIO

1.- ¿Cuáles son los métodos de siembra?

2.- ¿Cuándo se puede sembrar?
3.- ¿Qué es la siembra en línea?
4.- ¿Qué es sembrar o inocular?
5.- ¿Qué es un asa de siembra?
6.- ¿Qué es una siembra por Estría?
7.- ¿Qué es un medio de cultivo puro?
8.- ¿Qué es inoculadas?
9.- ¿Qué es la resiembra?
10.- ¿Cómo se puede obtener un cultivo puro?

10.- BIBLIOGRAFIA

pág. 35
 LABORATORIO Nº7
PRUEBAS BIOQUIMICAS IMVIC

1.- OBJETIVO
➢ Aprender a interpretar algunas de las pruebas bioquímicas de identificación
bacteriana de mayor utilidad IMVIC.
➢ Aplicar estas pruebas bioquímicas para identificar bacterias coliformes
➢ Conocer la técnica, pasos procedimientos operativos necesarios para realizar este
análisis.

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
Bacterias coliformes/E. coli: El género Escherichia y su principal especie, E. coli están
constituidos por enterobacterias móviles que fermentan la lactosa (bacilos coliformes) y la
glucosa, con producción de gas y ácidos diversos (fermentación acido mixta) y que
representan una respuesta característica al grupo de pruebas IMVIC (++--).
Son bacilos cortos Gram negativos pocos exigentes a sus necesidades nutritivas y
relativamente resistentes a los agentes externos, que se cultivan en medios comunes, incluso
a temperatura de 45ºC lo que permite diferéncialos de los demás coliformes.
Forman la mayor parte de la flora comensal aeróbica y anaeróbica facultativa del tubo
digestivo, y se eliminan por las heces al exterior. Por esto no es infrecuente que se encuentre
en el medio ambiente donde son capaces de sobrevivir durante cierto tiempo en el agua y
los alimentos de manera que su aislamiento constituye un indicador de contaminación fecal
reciente. Por otra parte, pueden intervenir en procesos patológicos como patógenos
verdaderos en la producción de cuadro intestinales con diarrea o como oportunistas en

pág. 36
infecciones extra intestinales diversas, que también pueden ser producidas por otra
enterobacteria.
Identificación bioquímica: Se basa en la habilidad que tienen las bacterias de producir
enzimas fácilmente detectables, en las características metabólicas específica de cada m.o.
La identificación bacteriana se realiza tras el estudio de las características tintoriales,
morfológicas y bioquímicas de los m.o. Como la mayor parte de los seres vivos, las bacterias
son capaces de modificar el ambiente que los rodea, captando sustancia necesaria para la
multiplicación y liberando el medio producto de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Por ello
la caracterización de dichas enzimas es una útil herramienta para la identificación y
clasificación bacterianas.
TEST IMVIC
Se realizan los ensayos como Indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y citrato Simmons
a.-PRUEBA DE ROJO DE MEETILO
Las bacterias que en anaerobiosis fermentan los azucares pueden realizar esto por distintas
rutas. Las enterobacterias son anaerobias facultativos que utilizaran la glucosa en dos fases:
Fermentación acido-mixta: Las bacterias que en anaerobiosis son ácidos orgánicos (ácidos
fórmicos, acético, láctico, succínico y etanol) la liberación de ácidos orgánicos genera un
descenso del pH como el rojo de metilo (rojo a pH 4).
b.-PRUEBA DE VOGES PROSKAUER
Fermentación bultilen glicolica: Si la fermentación que se ha llevado a cabo es del tipo
bultilen glicolica la producción de acetona puede ser detectada añadiendo KOH y alfa-
naftol que reacciona con este compuesto produciendo un color rojo característico.
c.-PRUEBA DE INDOL
Esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las baterías.
Esta enzima degrada el aminoácido triptófano a Indol, que es el compuesto que se detecta
en este ensayo para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva en un caldo triptona
NACL al 0,5% este digerido de proteína animales es especialmente rico en triptófano. Si la
bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio el reactivo de kovacs, se producirá
un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva.
El reactivo de kovacs contiene para-dimetilaminobenzaldehido, que puede reaccionar tanto
con el Indol como el triptófano, produciendo compuestos de coloración rojiza.
Para evitar la interferencia del triptófano, el para-dimetilaminobenzaldehido esta disuelto en
alcohol isoamilico inmisible en agua.
A diferencia del triptófano, el Indol es soluble en alcohol isoamilico y por tanto solo el
reaccionara con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba.
d.- PRUEBA DE CITRATO: Este método indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el
citrato. Contiene como única fuente de carbohidrato, fosfato de amonio y azul de bromo
timol como indicador de pH.

3.- MATERIALES/EQUIPOS
• Asa platino punta plana
• Estufa de incubación
• Homogeneizador stomacher
• Tubos tapa rosca de7ml
• Pipetas estériles de 1ml
pág. 37
 • Marcador de vidrio
• Mechero
• Gradillas

4.- REACTIVOS
• Caldo MR-VP
• Agua triptonada
• Agar citrato Simmons
• Solución alfa naftol
• Indicador rojo de metilo
• Reactivo de kovacs
• Cepa E. coli
• Detergente
• Desinfectante

5.- PROCEDIMKIENTO OPERATIVO

EXPERIENCIA #1
PRUEBA DE ROJO DE METILO
1º. Se inocula un tubo que contenga caldo MR-VP
2º. Incubar a una temperatura de 35ºC±2ºC por 48hrs
3º. Añadir 0,5ml (5 gotas) del indicador rojo de metilo
4º. Mezcla bien y examinar después de 1min
5º. Expresión de resultados:
✓ Prueba positiva: Color rojo intenso en la superficie del medio
✓ Prueba negativa: Color amarillo en la superficie del medio

EXPERIENCIA #2
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER
1º. Se inocula un tubo que contenga caldo MR-VP
2º. Incubar a una temperatura de 35ºC±2ºC por 48hrs
3º. Añadir 0,6ML (2 gotas) de la solución de alfa-naftol y 0,2ml (2 gotas) de la solución de
KOH al 40%
4º. Mezcla bien y examinar después de 1min
5º. Expresión de resultados:
✓ Prueba positiva: Color rosa carmín
✓ Prueba negativa: Color pardo

EXPERIENCIA #3
PRUEBA DE INDOL
1º. Se inocula un tubo que contenga agua triptonada (caldo tristona)
2º. Incubar a una temperatura de 35ºC±2ºC por 48hrs
3º. Añadir 0,2 a 0,3 ml (2 a 3 gotas) del reactivo de kovacs
4º. Mezcla bien y examinar después de 1min
5º. Expresión de resultados:
pág. 38
 ✓ Prueba positiva: Formación de un anillo color rojo (anillo o solución alcohólica)
✓ Prueba negativa: Se mantiene el color del reactivo

EXPERIENCIA #4
PRUEBA DE CITRATO SIMMONS
1º. Se inocula un tubo que contenga agar citrato Simmons
2º. Incubar a una temperatura de 35ºC±2ºC durante 2-5 dias
3º. Expresión de resultados:
✓ Prueba positiva: Color azul
✓ Prueba negativa: Color verde

6.- INTERPRETACION DE LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS

INDOL ROJO DE METILO VOGES CITRATO SIMMONS TIPO
PROSKAUER
+ + - - E.coli típico
- + - - E.coli atípico
+ + - + Típico intermedio
- + - + Atípico intermedio
- - + + E. aerogenes
+ - + + E. aerogenes atípico

7.- EXPRESION DE RESULTADOS

MESON TIPO DE E.COLI
1
2
3
4
5

8.- CONCLUSION
9.- CUESTIONARIO
1.- ¿Qué indica la prueba rojo de metilo?
2.- ¿Qué es la prueba de Voges Proskauer?
3.- ¿Qué significan las siglas IMVIC?
4.- ¿Qué indica una prueba de Indol positiva?
5.- ¿Qué es el reactivo de Kovacs?
6.- ¿Qué es el Indol en microbiología?
10.- BIBLIOGRAFIA

pág. 39
 LABORATORIO Nº 8
TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

1.- OBJETIVO
➢ Aplicar la técnica del número más probable para cuantificar m.o. coliformes.
➢ Diferenciar el test de presunción de el de confirmación.
➢ Detectar la presencia de la flora patogena que suponga riesgo para el consumidor
en un alimento contaminado.

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
Bacterias coliformes.- Las bactetrias coliformes son bacilos cortos Gram – positivo, aerobicos
y anaerobicos facultativos no esporulados que fermentan la lactosa con formacion de
acido y gas.
Los coliformes son buenos indicadores de un proceso o de un estado sanitario inadecuado
indica:
• Mala manipulacion y/o procesamiento de alimento.
• Mayor probabilidad de encontrar bacterias patogenas como salmonella, shiguella y
otros.
Escherichia Coli.- Dentro de las bacterias pertenencientes a la familia enterobacterias que
son los que aislan con mayor frecuencia de las muestras clinicas, daremos un particular
estudio al genero escherichia: especie E.coli que son bacilos gram negativos, cuyo natural
habitad de esta especie es el tubo intestinal del hombre y los animales. Son capaces de
desarrollar en todos los medios para crecimineto (aar sangre y agar chocolate) y formar
colonias distintivas en los medios selectivos que dependen de sus propiedades metabolicas
y de los componentes del medio. Estas enterobacterias son anaerobicas o aerobicas
facultativas, fermentan la lactosa con formacion de acido y gas poseen una estructura
antigenica ompleja y producen diversas toxinas y otros factores de virulencia.
E.coli se utiliza como m.o. indicador de la contaminacion de origen fecal.
pág. 40
Se pueden confirmar la presencia de bacterias coliformes mediante la tecnica del numero
mas probable.

PRINCIPIO DEL METODO

El método se basa en la propiedad que tiene el m.o. de fermentar la lactosa con
producción de gas a una temperatura entre 35 a 37ºC durante 24 a 48hrs.
Consiste en un ensayo presuntivo en caldo lauril sulfato triptosa, seguido de una prueba
confirmativa de los tubos que han producido gases por lo cual se utiliza un caldo verde
brillante bilis lactosa al 2% incubando cada tubo durante 24 a 48hrs/37ºC para comprobar
la presencia de E.coli, de cada uno de los tubos que contiene caldo E.coli con formación
de gas, se extrae una porción con el asa de inoculación y se siembra en estrías, sobre la
superficie Agar rojo violeta bilis, se incuba las cajas Petri a 37ºC por 24hrs luego se examinan
las caja Petri sospechosas de E.coli y se realizan cuatro ensayos: Indol, Rojo de Metilo, Voges
Proskauer Y Citrato Simmons.
3.- MATERILAES/EQUIPOS
• Asa de platino
• Bolsa stomacher
• Homogeneizador stomacher
• Estufa de cultivo
• Tubos tapa rosca
• Pipetas de 1ml estériles
• Marcador de vidrio
• Mechero
• Tubos Durham
• Cabina de flujo laminar

4.- REACTIVOS/MUESTRA
• Agua fosfatada
• Caldo lauril sulfato
• Caldo E. coli
• Caldo verde brillante
• Agar rojo violeta bilis
• Muestra liquida refrescos (no procesados, ni zumos de frutas)

5.- PROCEDIMINETOS OPERATIVOS

EXPREIENCIA #1
PREPARACION DE LA MUESTRA
• Pesar 25g de la muestra en una bolsa stomacher, previamente tarado.
• Agregar 225ml de agua fosfatada en un ambiente estéril.
• Colocar la bolsa en el stomacher y homogenizar durante 30seg a 230 r.p.m, o de
acuerdo al tiempo que el alimento necesite para poder ser bien homogenizada.
• Una vez homogeneizado, obtendremos la dilución (10-1=0.1).

pág. 41
 EXPEREIENCIA #2
PRUEBA PRESUNTIVA

• Se inocula cada uno de los tubos que contiene caldo lauril sulfato y tubos Durham
invertidos con 1ml de la dilución 10-1 =0,1.
• Se repite la misma operación con las diluciones 10-2 y 10-3 de la siguiente manera:
3 tubos con 1ml de la dilución 10-1
3 tubos con 1ml de la dilución 10-2
3 tubos con 1ml de la dilución 10-3
• Se incuban a 35±2ºC por un periodo de 24 a 48 hrs.
EXPEREIENCIA #3
LECTURA DE LA PRUEBA PRESUNTIVA

• Observar la formación de gas en los tubos.

• Anotar los tubos en los que se ve presencia de gas al cabo de 24hrs. Incubar los
negativos 24hrs adicionales.
• La ausencia de gas a las 48hrs significa prueba presuntiva es negativa para los
coliformes
• Si existe formación de gas en los tubos, registrar el número de tubos positivos de cada
dilución.
EXPEREIENCIA #3
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES

• De cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato que han producido gas se hace
una toma, con un asa de inoculación, se inocula en tubos, registrar con caldo verde
brillante bilis lactosa, y tubos durham invertidos.
• Incubar a 35±2ºC DE 24 a 48hrs. L a formación de gas confirmara la presencia de
bacterias coliformes, se anota entonces el numero de tubos cuya reacción es
positiva.

EXPEREIENCIA #4
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES FECALES

• De cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato que han producido gas se hace una
toma con un asa de inoculación y se inocula en tubos con caldo de E.coli (EC) con
tubos durhan invertidos (atemperados previamente a 44,5ºC por 30min).
• Los tubos sembrados se incuban a 44.5ºC por 24hrs.
• La presencia de gas indica una prueba presuntiva para coliformes fecales, se anota
entones el numero de tubos cuya reacción es positiva

pág. 42
 EXPEREIENCIA #5
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA E. COLI

• De cada tubo que contiene caldo E. coli con formación de gas se extrae
una porción con el asa de inoculación y se siembra por agotamiento sobre
la superficie de cajas Petri que contiene agar selectivo (Agar violeta cristal –
rojo neutro – bilis – lactosa). Es esencial que la porción de la caja Petri
muestre colonias bien aisladas.
• Se incuban las cajas Petri a 35±2ºC de 18 a 24hrs y luego se examina las
colonias sospechosas de E. coli.
• Se pican las colonias típicas de cada placa para realizar las pruebas
bioquímicas IMVIC.

CALCULO (NMP) DE COLIFORMES

Se indica el número más probable adecuado al número de tubos positivos
basándose en la tabla siguiente. Ejemplo:
3 tubos (+) en la dilución 1:10 → (10-1)
1 tubos (+) en la dilución 1:100 → (10-2)
0 tubos (+) en la dilución 1:1000 → (10-3)
La tabla nos da como NMP: 22.7 coliformes/g o ml

10-1 10-2 10-3 NMP 10-1 10-2 10-3 NMP 10-1 10-2 10-3 NMP 10-1 10-2 10-3 NMP
0 0 0 <3 1 0 0 3.6 2 0 0 9.1 3 0 0 14.6
0 0 1 3 1 0 1 7.2 2 0 1 14 3 0 1 20.8
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 29
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 37
0 1 0 3 1 1 0 7.3 2 1 0 15 3 1 0 22.7
0 1 1 6.1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 29
0 1 2 9.2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 39
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 49
0 2 0 6.2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 31
0 2 1 9.3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 41
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 50
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 60
0 3 0 9.4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 42
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 52
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 64
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 77

pág. 43
6.- CALCULOS

7.- EXPRESION DE RESULTADOS

MESON/MUESTRA NMP TIPO DE E.COLI
1
2
3
4
5

8.- CONCLUSION
9.- CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un coliformes?
2. ¿Cuál es el significado de detectar coliformes en alimentos?
3. Si encontramos en contaje alto de coliformes en el alimento, ¿significa que ha
habido contaminación fecal? ¿Porqué o por qué no?
4. ¿Por qué se escogió, (el alimento que analizaste) para este experimento?
¿Podrías
sugerir otros alimentos que serían ideales para hacer ésta prueba?
5. ¿Qué significa 3 NMP g?
6. ¿Cuáles son las características generales de los coliformes?
7. ¿Cómo se definen las bacterias coliformes?
8. ¿Que causan las bacterias coliformes?
9. ¿Cómo se determinan los coliformes totales?
10. ¿Qué significa la presencia de coliformes en el agua?
10.- BIBLIOGRAFIA

pág. 44
 LABORATORIO Nº9
DETECCION DE SALMONELLA

1.- OBJETIVO

➢ Desarrollar las diferentes etapas para la detección de salmonella

➢ Aplicar las pruebas bioquímicas IMVIC (TSI, LIA, MIO, UREA).
➢ Interpretar los resultados de cada una de estas pruebas.

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
✓ Salmonella. - La salmonella es una bacteria que puede causar fiebres
entéricas (tifoidea y paratifoidea) e infección intestinal por intoxicación con
alimentos contaminados o crudos. La enfermedad se denomina
salmonelosis.

Esta bacteria es patógena tanto para el hombre y animales que ingieren

alimentos contaminados con bacterias vivas. Estos alimentos pueden ser
contaminados en cualquier fase del proceso, desde la materia prima hasta el
producto terminado, los vehículos más comunes son: agua, carne, huevo,
huevo, leche y productos que contienen estas materias primas.

La salmonella son bacilos Gram (-) negativos, no esporulados, de longitud

variable; la mayoría de las especies son móviles merced a los flagelos peritricos.
Crecen fácilmente en los medios de cultivo ordinarios, pero no fermentan la
lactosa, sacarosa, salicina; acidifican el medio y generalmente desprenden gas
a partir de la glucosa, maltosa, manitol y dextrina, son generalmente resistentes
a la congelación en agua y aciertos agentes químicos por ejemplo al verde
brillante y oxicolato sódico.
Las especies de salmonella pueden ser tipificadas y/o identificadas por
reacciones bioquímicas y por análisis antigénicos.
pág. 45
PRINCIPIO DEL METODO
La detección de salmonella a partir de alimentos se realiza por etapas, una de pre-
enriquecimiento no selectivo que permite que la bacteria se libere del estrés al que
posiblemente fue sometida en el alimento y posterior resiembra en caldos de
enriquecimientos selectivo y pruebas diferenciales. Finalmente realizar la
confirmación con pruebas serológicas.

Pre-enriquecimiento
En la etapa de pre-enriquecimiento no selectivo se logra la revivificación de las
salmonellas lesionadas, se incrementas su vitalidad y adquieren condiciones
fisiológicas adecuadas para su desarrollo.

Enriquecimiento
Etapa destinada a promover el crecimiento de las salmonellas, e inhibir la flora
acompañante. Se realiza en un medio liquido selectivo, mediante siembra del
sustrato procedente del pre-enriquecimiento.

Aislamiento
Se efectúa sembrando el substrato procedente del enriquecimiento en medios
solidos selectivos que nos permiten la visualización característica de salmonella.

Confirmación
Las colonias selectivas (presuntas salmonellas) se confirman mediante pruebas
bioquímicas.

Identificación serológica
Las pruebas serológicas permiten la identificación de las colonias sospechosas
como miembros del genero salmonella.
3.- MATERIALES/EQUIPOS
• Asa de platino
• Bolsa stomacher
• Estufa de incubación
• Homogeneizador stomacher
• Tubos tapa rosca
• Pipetas graduadas de 1, 10ml
• Marcador de vidrio
• Mechero de alcohol
• Gradillas
• Cabina de flujo laminar
• Caja Petri
• Frasco tapa rosca de 250, 500ml
• Estufa de esterilización
• Cinta maskin
• Papel craff

pág. 46
4.- REACTIVOS
• Caldo MR-VP
• Caldo rapapport
• Caldo tetrationato
• agua triptonada
• agua peptonada
• agar LIA
• Agar MIO
• Agar TSI
• Agar UREA
• Agar XLD
• Agar HE
• Agar Citrato Simmons
• Detergentes
• Desinfectantes

5.- PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS

PREPARACION DE LA MUESTRA

✓ Pesar 25g de la muestra en una bolsa stomacher estéril previamente tratado.

✓ Agregar 225ml de agua peptonada en ambiente estéril.
✓ Colocar la bolsa stomacher y homogeneizar durante 30seg a 230 r.p.m, o de
acuerdo al tiempo que el alimento necesite para poder ser bien
homogeneizada.
✓ Una vez homogeneizado se obtiene la dilución (10-1=0.1)

LA DETECCION DE SALMONELLA SE LA REALIZA MEDIANTE 5 ETAPAS SUCESIVAS

EXPERIENCIA #1
PRE-ENRIQUECIMINETO

✓ La finalidad es permitir que un número pequeño de bacterias normales o

parcialmente afectadas, comiencen el proceso de multiplicación normal sin
estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas del medio que pueden
ser desfavorables para estas bacterias.
✓ Para este efecto incubamos la muestra ya homogeneizada con agua
peptonada tamponada por 24hrs a 35±2ºC.

EXPERIENCIA #2
ENRIQUECIMINETO

✓ Después de la incubación empleando una pipeta estéril transferir 0,1ml de

la bolsa stomacher a 10ml del caldo rapapport vassiliadis (RV) y 0,1ml a 10ml
del caldo tetrationato (previo agregado de 0,2ml de lugol y 0,1 de solución
indicador verde brillante).
✓ Incubar 24±2hrs a 42±1ºC
pág. 47
 EXPERIENCIA #3
AISLAMIENTO

✓ De cada caldo de enriquecimiento inoculado e incubado, con la ayuda de

un asa bacteriológica cerrada (punta redonda), repicar de forma
independiente por agotamiento sobre la superficie de los siguientes agares:
xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar entérico Hecktoen (HE).
✓ Incubar las cajas invertidas de 24-48hrs a 35±2ºC.
✓ Examinar las cajas después de 24-48hrs de incubación para ver si contienen
colonias presuntivas de salmonella, basándose en las siguientes
características:
✓ Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): colonias rosadas con o sin precipitado
central negro grande y lustroso o la colonia puede ser casi completamente
negra. Atípicamente algunas especies de salmonella producen colonias
amarillas con o sin precipitado negro central.
✓ Agar enterico Hecktoen (HE): colonias verdes azuladas con o sin precipitado
negro. Muchos cutivos de salmonella pueden producir colonias con un
centro negro grande y lustroso o la colonia puede ser casi completamente
negra. Atípicamente algunas colonias de salmonella producen colonias
amarillas con o sin centro negro.

EXPERIENCIA #4
CONFIRMACION BIOQUIMICA

Agar triple azúcar hierro (TSI)

✓ Se extiende en estrías la superficie inclinada del agar y se pincha el agar y

se pincha el extremo
✓ Se incuba durante 20-24hrs a 35±2ºC.

Agar hierro tres azucares (TSI)

Reaccion
Fermentación de la glucosa Fermenta (fondo amarillo) +
No fermenta (fondo rojo) -
Fermentación de la lactosa Fermenta (Pico amarillo) +
No fermenta (Pico rojo o sin cambio) -
Fermentación de la sacarosa Fermenta (Pico amarillo) +
No fermenta (Pico rojo o sin cambio)-
Producción de H2S Produce (ennegrecimiento del medio) +
No produce (sin cambio) -
Producción de gas, burbujas, Produce (ruptura o desplazamiento del
ruptura del medio medio)
No produce (sin cambio)

Tipicamente el TSI, los cultivos de salmonella muestran el pico alcalino (rojo) y el

fondo acido (amarillo), fondo con formación de gas (burbujas) y cerca del 90% de
los casos formación de H2S (ennegrecimiento del agar).

pág. 48
Agar Urea

✓ Se extiende en estrías la superficie inclinada del agar y se pincha el agar y

se pincha el extremo
✓ Se incuba durante 20-24hrs a 35±2ºC.

Medio Reacción
Agar Urea Reacción positiva: Coloración rosa
intenso
Reacción negativa: Amarillo o sin cambio

Si la reacción es positiva, la hidrolisis de la urea libera amoniaco que cambia el

color del rojo fenol a rosado y luego a cereza oscuro. La reacción suele hacerse
visible después de 2 a 4 horas.
Agar MIO

✓ Se extiende en estrías la superficie inclinada del agar y se pincha el agar y

se pincha el extremo
✓ Se incuba durante 20-24hrs a 35±2ºC.

Movilidad Los microorganismos inmóviles (-) solo crecen

en la linea de siembra y los móviles (+) se
reconocen por su desarrollo difuso alejado
de la linea de inoculación.
Indol (Agregar sobre la Formación de anillo rojo o rosado al agregar
superficie 3 o más gotas de el reactivo de kovacs (+)
kovacs después de leer las Formación de anillo amarillo (-)
anteriores reacciones)
Descarboxilacion de la Coloración azul puede ser de distintas
ornitina intensidades debido a la reducción del
indicador (+)
Coloración amarilla (-)

NOTA: El reactivo de kovacs se añade después de la lectura de la inmovilidad y la

ornitina.
Agar LIA

✓ Se extiende en estrías la superficie inclinada del agar y se pincha el agar y

se pincha el extremo
✓ Se incuba durante 20-24hrs a 35±2ºC.

pág. 49
 Agar LIA Reacción
Descarboxilacion de la lisina Descarboxila (Fondo y tendido purpura) (+)
No descarboxila (Fondo amarillo) (-)
Desanimación de la lisina Desamina (Pico rojo) (+)
No desamina (Pico purpura) (-)
Producción de H2S Produce (ennegrecimiento del medio)
No produce (Sin cambio)
Producción de gas Produce (Ruptura o desplazamiento del
medio) (+)
No produce (sin cambio) (-)

6.-INTERPRETACION DE RESULTADOS

Cepas de Salmonella
Ensayos S. Typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B S. Paratyphi C Otras cepas
Reacción %b Reacción %b Reacción %c Reacción %c Reacción %b
TSI – acido a + 100 + 100 + + + 100
partir de la
glucosa
TSI – con gas a -d 0 + 100 + + + 92
partir de la
glucosa
TSI – Lactosa - 2 - 100 - - - 1
TSI – Sacarosa - 0 - 0 - - - 1
TSI - H2S + 97 - 10 + + + 92
Hidrolisis de urea - 0 - 0 - - - 1
Descarboxilación + 98 - 0 + + + 95
de lisina
Reacción a la β – - 0 - 0 - - - 2e
Galactosidasa
Producción de - 0 - 0 - - - 1
indol

b. Los porcentajes indican que no todos los serotipos aislados de Salmonella

aislados muestran las reacciones marcadas como + o -. Estos porcentajes podrían
variar dentro de un mismo serotipo y entre serotipos de los causantes de
toxiinfecciones alimentarias de diferentes procedencias.
c. Estos porcentajes no tienen referencia dentro de la literatura
d. Salmonella Typhi es anaerogena
e. La Salmonella Enterica, dentro, subespecie Arizonae, da reacciones lactosa + o
– mas siempre da positiva para la prueba de β-Galactosidasa. Para el estudio de
estas cepas se pueden utilizar pruebas bioquímicas complementarias

pág. 50
7.- EXPRESION DE RESULTADOS

MESON/TIPO MARCA DE TIPO DE SALMONELLA

DEMUESTRA MUESTRA/LUGAR
1
2
3
4
5

8.- CONCLUSION
9.- CUESTIONARIO
1.- ¿Qué es lo que provoca la salmonella?
2.- ¿Cuánto tiempo duran los síntomas de la salmonelosis?
3.- ¿Cómo se transmite la Salmonella de una persona a otra?
4.- ¿Qué antibióticos matan la salmonella?
5.- ¿Qué tan grave es la salmonelosis?
6.- ¿Cómo afecta al organismo la salmonella?
7.- ¿Cómo saber si una persona tiene salmonella?
8.- ¿Qué es KPC Cómo se contagia?
9.- ¿Dónde se encuentra la salmonella en los huevos?
10.- ¿Cómo se puede evitar la salmonella?
11.- ¿Qué tan grave es la salmonelosis?
12.- ¿Qué parte del cuerpo afecta la salmonelosis?
13.- ¿Qué es la Salmonella en la sangre?
14.- ¿Qué es la listeriosis y sus síntomas?
10.- BIBLIOGRAFIA

pág. 51
 LABORATORIO Nº10
DETERMINACION DE STAPHYLOCOCCUS
AUREUS

1.- OBJETIVO
➢ Establecer un procedimineto para el aislamineto, la diferenciacion y
recuento de staphylococcus aureus.
➢ Determinar la presencia de staphylococcus aureus

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
Terminos y definiciones
El genero staphylococcus esta conformado por celulas esfericas (cocos) Gran
positivas (Gram + ) generalmente agrupadas en racimos irregulares, crecen con
facilida en diferentes medios de cultivos y son metabolicamente muy activos,
fermentan muchos carbohidratos y producen pigmentos que van desde el blanco
amarillo intenso. El staphylococcus aureus generalmente hemolitico y coagula el
plasma.
La presencia de staphylococcus aureus en un alimento se interepreta como
indicativo de contaminacion a partir de la piel, boca y fosa nasales de los
manipuladores del alimento, material equipos sucios y materias primas de origen
animal contaminados. Las intoxicaciones estafilococicas son causadas por la
ingestion de alimentos que contienen una de las enterotoxinas preformadas
producidas por el Staphylococcus Aureus.

Principio del metodo

Este metodo consdiste en extender un volumen determionado de las diluciones
correspondientes de alimentos homogeneizados sobre la superficie del agar Baird
Parker, en este medio se forman colonias negras redondeadas de zonas clars
caracteristicas de staphylococcus aureus, como procediminetos confirmatorio
para determinar la identidad de staphylococcus aureus es te metodo utiliza la
prueba de la coagulasa por el staphylococcus aureus.

pág. 52
Este medio Bair Parker contiene cloruro de litio y telurito de potasio para la inhibicion
de la flora acompañnte, en tanto que el piruato by la glicocola favoreciendo
selectivamente el crecimineto de staphylococcus aureus.
SDobre el medio de cultivo, opaco por su contenido de yema de huevo, las
colonias de staphylococcus aureus muestran dos caracterisaticas diagnosticadas:
por lipolisis y proteolisis se producen alos y anillos caracteristicos y debido a la
reduccion de telurito se presentan con una colonia negra. La reaccion con la yema
de huevo y la reduccion de telurito se presentan con notables paralelismo co la
coagulasa positiva, por tanto puede utilizarse como indice de esta ultima.
SMITH Y BAIRD PARKER (1964) recominedan añadir sulfametacina para inhibir el
crecimineto de proteus.

3.-MATERIALES /EQUIPOS

• Estufa de cultivo
• Cabina de flujo laminar
• Contador de colonias
• Homogeneizador stomacher
• Agitador vortex
• Blanza semianalitica
• Autoclave
• Pipetas esteriles de 1ml (eteriles )
• Frascos de vidrio de 250ml
• Tubos t5apa rosca de 15ml
• Caja petri
• Asa de siembra punta redonda
• Gradillas
• Varillas drigalsky
• Vandejas de plasticos

4.- REACTIVOS
• Solucion madre de fosfato
• Agar baird parker
• Caldo infusion cerebro corazon (BHI)
• Emulcion de yema de huevo y telurito
• Agua destilada
• Detergentes
• Desinfectantes

5.- PROCEDIMINETO
Preparacion y pesado y homogenizacvion de la muestra

✓ Realizar la preparacion de la muestra y las dilusiones según el laboratorio de

preparacion, y homogeneizacion de las muestras.

pág. 53
Inoculacion de la cajas petri

✓ Colocar 0,1ml de cada dilucion equivalente en la superficie de la placa que

contiene agar bair parker, por duplicado.
✓ Extender sobre la superficie del agar utilizando varillas drigalsky esteriles.
✓ Mantener las cajas en su posicion, hasta que el inoculo bsea absorbido por
el agar.

Tiempo y temperatura de incubacion

✓ Incubar las cajas petri en posicion invertidas a 35ºC±2ºC durante un periodo

de 24hrs a 48hrs.

Recuento de las colonias

✓ Transcurridas las 48hrs, se eligen las cajas con 20 a 200 colonias separadas
que sean negras brillantes, con bordes reducidos blancos y que aparezcan
rodeadas de zonas claras que contrasten con el medio opaco, estas son
colonias presuntas de staphylococcus auereus.
✓ Se cuentan todas las colonias que tienen el aspecto descrito, que han
desarrollado durante el periodo de incubacion y se someten a prueba de
confirmacion.

Prueba de confirmacion
Para realizar la prueba de la coagulasa, seleccionar el numero de colonias de
acuerdo al siguiente cuadro:

Nº de colonias Colnias a probar

sospechosoas en
la caja
Menos de 50 3
51 a 100 5
101 a 200 7

✓ El numero de colonias sospechosas de staphylococcus aureus

seleccionadas de acuerdo al cuadro se pasan a tubos individuales de
ensayo que contienen 5ml de caldo infusion cerebro corazon (BHI) y se
incuban a 35ºC±2ºC durante 24hrs.
✓ Despues del periodo de incubacion se transfiere 0,1ml de los cultivos
resultantes a tubos que contienen o,3ml de plasma humano preparado y se
incuban 35ºC±2ºC durante 6hrs.
Se examinan los tubos despues de las 6hrs de incubacion para ver si hay
coagulacion, si los resultados son negativos, se vuelven a incubar y examinar
despues de 24hrs.

pág. 54
Designaciones
Negativos ninguna evidencia de fibra
1+ positivo coagulos pequeños separados
2+ positivo coagulos pequeño aglomerado
3+ positivo coagulos grande aglomerado
4+ positivo todo el contenido del tubo ha coagulado y no se desplaza cuando se
invierte el tubo.
Interpretacion
Una reaccion 3+ o 4+ es consideerado como identificacion positiva + de
staphylococcus aureus.
Una reaccion 1+ o 2+ pueden ser consideradas como presuntivas y sr
eventualmente confirmadas previo enriquecimineto.
6.- CALCULOS
El numero de staphylococcus aureus debe calcularse basandose en el numero de
colonias sospechosas totales, el numero de colonias confirmadas, la dilusion y el
volumen del inoculo.

#de staphylococcus aureus = #de colonias sospechosas x grado de coagulo/Colonias a probar

Ejemplo: Si la dilucion 1:1000 presenta 80 colonias se tomara 5 colonias a probar

para la prueba de la coagulasa. Si estas dan 4 positivas el calculo sera:
80x4/5= 64
Entonces:
64x1000x10= 640000
Es decir
64x104 UFC/g o ml

7.- EXPRESION DE RESULTADOS

MESON/TIPO DE # DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

MUESTRA
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
#1 UFC/g o UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml
ml
#2 UFC/g o UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml
ml
#3 UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml

#4 UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml

#5 UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml

8.- CONCLUSION

pág. 55
9.- CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál es antibiótico para combatir el estafilococo aureo?
2.- ¿Cómo se elimina la bacteria Staphylococcus aureus?
3.- ¿Dónde se encuentra la bacteria Staphylococcus?
4.- ¿Cuáles son los exámenes de Bacteriologia?
5.- ¿Qué enfermedad produce la bacteria Staphylococcus aureus?
6.- ¿Qué enfermedad provoca la bacteria Staphylococcus aureus?
7.- ¿Cómo se transmite la bacteria estafilococo?
8.- ¿Cuántos tipos de estafilococos existen y cuáles son?
9.- ¿Cómo se contagia la bacteria Staphylococcus aureus?
10.- ¿Cuáles son los síntomas de la bacteria Staphylococcus aureus?
10.- BIBLIOGRAFIA

pág. 56
 LABORATORIO Nº11
MOHOS Y LEVADURA

1.- OBJETIVO
➢ Aplicar un procedimineto para la determinacion de mohos y levaduras en
un alimento.
➢ Establecer un procedimineto para el recuento de mohos y levadura.
Utilizando agar glucosa extracto de levadura-oxitetraciclina.

2.- PRINCIPIO/FUNDAMENTO
MOHO
El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos
multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer
fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado.
Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo.
La
identificación y clasificación de los mohos se basa en observaciones
macroscópicas y
microscópicas.
Hifas y micelio. El talo de los mohos está formado por una masa de filamentos
ramificados, llamados hifas, llamándose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas
pueden ser sumergidas o aéreas. También se pueden clasificar en hifas vegetativas
o en crecimiento, las cuales se encargan de la nutrición del moho, y en hifas fértiles
o hifas que producen los órganos reproductores. Los mohos se dividen en dos
grupos: separados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las
hifas, y no separados cenocíticos, cuyas hifas están formadas por cilindros sin
tabiques transversales. Este tipo de hifas posee núcleos diseminados a lo largo del
cilindro y se les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o
pág. 57
determinados órganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo, los rizoides o
“anclajes” de los géneros Rhizopus o Absidia, la célula basal del género Aspergillus
y la ramificación dicotómica, o en forma de Y, del género Geotrichum.

Órganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por

medio de esporas asexuales. Algunos mohos también producen esporas sexuales.
A tales hongos se les denomina “perfectos”, los cuales se dividen en Oomycetes y
Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son
septados, en contraposición a los mohos “imperfectos”, Fungi Imperfecti, los cuales
sólo poseen esporas asexuales. Esporas asexuales. Los mohos producen gran
cantidad de esporas asexuales, son pequeñas, ligeras y resistentes a la desecación.
Se diseminan fácilmente por la atmósfera para sedimentar y originar el talo de un
nuevo moho. Los tres tipos principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2)
artrosporas u oidios y (3) esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en
determinadas hifas fértiles denominadas conidióforos y generalmente son libres, es
decir, no se encuentran dentro de ningún receptáculo, en contraposición a las
esporangiosporas, las cuales se encuentran dentro de un esporangio o
receptáculo, situado en el extremo de una hifa fértil, el esporangióforo. Las
artrosporas se forman por fragmentación de una hifa. El extremo engrosado del
esporangióforo se denomina columnela y adopta formas típicas en cada una de
las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios comprimidos uno
contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una célula especializada, el
esterigma o fiálide situada en el extremo del conidióforo.
Algunos géneros de mohos importantes en alimentos.
Mucor. Intervienen en la alteración de algunos alimentos y se utilizan en la
fabricación de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificación del almidón, para la
maduración de quesos y para la fabricación de algunos alimentos orientales.
Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy común e interviene en
la alteración de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc.
Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies
intervienen en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros
son de utilidad para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la
producción industrial de ácido cítrico y glucónico y de algunas enzimas. A. flavus
se utiliza para la fabricación de ciertos alimentos orientales y en la obtención de
enzimas.
Penicillium. Es otro género de mohos de frecuente incidencia y de importancia en
los alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P.
digitatum y P italicum producen la podredumbre de frutas cítricas. Las especies P.
camemberti, P. roqueforti se utilizan en la maduración de quesos.
LEVADURAS
El término levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son
filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen
por gemación o por fisión. Las levaduras que se encuentran en los alimentos
pueden ser benéficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboración de
alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, también se utilizan en
la obtención de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales

pág. 58
cuando producen la alteración del sauerkraut, de los zumos de frutas, de los
jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros
alimentos.
La mayoría de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No
obstante, crecen mejor que la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen
elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo, carbohidratos o cloruro de
sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo, la mayoría de las levaduras
necesitan mayor humedad que los mohos. Para la mayoría de las levaduras la Aw
mínima de crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de
crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno a
los 25 a 30°C y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C. Crecen mejor en
aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer,
aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azúcares son la fuente energética más
apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los ácidos
orgánicos y el alcohol.
Algunos géneros de importancia en alimentos son:
Schizosaccharomyces. Levaduras de este género se han encontrado en frutas
tropicales, en la melaza y en la miel.
Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias
alimentarias, como en la fermentación del pan, fermentación de la cerveza,
fermentación de los vinos, en la producción de alcohol, glicerol e invertasa.
Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la
obtención de productos lácteos por su capacidad de fermentar la lactosa.
Zygosaccharomyces. Las levaduras de este género son importantes por su
capacidad para crecer en medios con elevadas concentraciones de azúcar
(osmófilas), intervienen en la alteración de la miel, jarabes y melazas, y también en
la fermentación de la salsa de soya y de algunos vinos.
Pichia. Crecen en la superficie de los líquidos formando una película. P.
membranafaciens produce una película en la superficie de las cervezas y vinos.
Debaromyces. Forman película en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece
en la superficie de los quesos y de los embutidos.
Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limón y crecen en los zumos de
frutas. Torulopsis. Originan problemas en las fábricas de cervezas. T. sphaerica
fermenta la lactosa, alterando productos lácteos. Otras especies alteran la leche
condensada azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos
ácidos.
Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtención de proteína unicelular
para incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a
piensos. La especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos
lácteos. C. lipolytica produce alteración de la mantequilla y margarina.
Brettanomyces. Producen grandes cantidades de ácido e intervienen en la
fermentación de la cerveza belga de tipo “lambic”, de las cervezas inglesas y de
los vinos franceses. Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas
bajas, encontrándose en las fábricas cerveza y en la superficie de vacuno
refrigerada.

pág. 59
Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir
manchas en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o
zonas de color rosado en el sauerkraut.
Principio del método
El método se basa en la siembra de una suspensión obtenida de una muestra con
el diluyente y sus dilusiones decimales en un medio de cultivo selectivo, incubandos
a una temperatura entre 20-25ºC durante 72hrs (levaduras) y 121hrs (mohos), para
obtener colonias visibles.

3.- MATERIALES/EQUIPOS
• Estufa de cultivo
• Cabina de flujo laminar
• Contador de colonias
• Microondas
• Balanza semianalitica
• Autoclave
• Homogeneizador stomacher
• Agitador vortex
• Cajas Petri estériles
• Frascos tapa rosca de 250ml
• Pipetas estériles de 1ml
• Succionador de 1ml
• Gradillas

4.- REACTIVOS
• Solución madre de fosfato
• Agar oxitetraciclina glucosa de levadura
• Detergentes
• Desinfectantes

5.- PROCEDIMINETO
Preparación, pesado y homogeneizado de las muestras
✓ Realizar la preparacion de la muestra y las dilusiones según el laboratorio de
preparacion, y homogeneizacion de las muestras.

Inoculación de las cajas

✓ Con una pipeta estéril transferir por duplicado 1ml de cada una de las
diluciones preparadas a cajas Petri estériles vacías adecuadamente
codificar e individualizarlas.
✓ Inmediatamente adicionar 20 a 25 ml de agar fundido y enfriado a
temperatura de 45-47ºC. previa adición de los antibióticos.
✓ Desde la primera preparación de las diluciones hasta la adición del agar a
la última caja el periodo de tiempo no debe extender los 20min. Lo óptimo
debe ser 10min inmediatamente después de la adición del medio de cultivo,
homogeneizar cuidadosamente el contenido de la caja mediante
movimientos regulares y uniformes, sobre una superficie plana, evitando
rebalses y toda contaminación externa.
pág. 60
 Nota: Asegurarse que todas las cajas estén en posición horizontal, durante la
solidificación del medio

Tiempo y temperatura de incubación

✓ Solidificado el medio de cultivo, incubar las cajas Petri sin invertir a la
temperatura de 22-25ºC durante 72hrs (3dias) para el recuento de levaduras
y 121hrs (5dias) para el recuento de mohos.
✓ Es recomendable no mover las cajas antes del tercer día de incubación para
evitar la formación de colonias secundarias por dispersión de esporas.
6.- RECUENTO E INTERPRETACIÓN Y CÁLCULOS DE COLONIAS
✓ Las colonias deben contarse en las 4 horas siguientes al final del periodo de
incubación. Para facilitar el recuento se utiliza un contador de colonias y se
deben considerar los casos que se detallan en el recuento y cálculo de
colonia.
✓ Pero tomando en cuenta las siguientes variaciones:
Escoger para el recuento las cajas que contienen entre 10 y 150 colonias,
contar las cajas de mohos que se presenten bajo la forma filamentosa
característica y de color variable, las levaduras se presentan en formas de
colonias de colonias cremosas blancas o coloreadas.
Contar por separado las colonias de levadura y mohos.

7.- EXPRESION DE RESULTADO

MESON/TIPO DE # DE MOHO Y LEVADURA

MUESTRA
10-1 10-2 10-3
#1 UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml
#2 UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml
#3 UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml
#4 UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml
#5 UFC/g o ml UFC/g o ml UFC/g o ml

8.- CONCLUSION

9.- CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál es la diferencia entre mohos y levaduras?
2.- ¿Qué tipo de agar se utiliza en el cultivo de mohos y levaduras?
3.- ¿Por qué se deja incubar por más tiempo el cultivo de hongos a diferencia del
cultivo de bacterias?
4.- ¿Cómo se realiza el recuento de mohos y levaduras?
5.- ¿Qué son los mohos en microbiología?
6.- ¿Cuáles son los mohos más comunes?
pág. 61
7.- ¿Qué daño puede causar el moho?
8.- ¿Dónde viven los mohos?
9.- ¿Qué es una levadura en microbiología?
10.- ¿Qué tipo de células son los mohos?
11.- ¿Cuál es el tipo de respiración de las levaduras?
12.- ¿Cuáles son las características de la levadura?

10.- BIBLIOGRAFIA

pág. 62
 LABORATORIO Nº12
ANALISIS MICROBIOLOGICOS (METODO
PETRIFILM)

1.- OBJETIVO
➢ Conocer otros metodos de analisis microbiologicos
➢ Diferenciar las placas petrifilm de (BMA, E.COLI y Coliformes, MyL,
Enterobacteria y Staphylococcus Aureus)

2.- FUNDAMENTO/PRINCIPIO
Las placas Petrifilm ™ de 3M ™ están diseñadas para la ciencia moderna
El panorama mundial de seguridad alimentaria está cambiando continuamente.
Con una creciente y cada vez más acelerada demanda, la necesidad de tener
resultados confiables en el menor tiempo posible es crucial para competir en
mercados globales.
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alimentos y bebidas, 3M Food Safety le ofrece una línea completa de productos
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importante: calidad y eficiencia. Es hora de tomar una nueva mirada a la seguridad
alimentaria.
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tradicionales de agar
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lote de placas 3M Petrifilm pasa por rigurosas pruebas de calidad en nuestras
plantas de fabricación, certificadas bajo la Norma ISO 9001
pág. 63
 ✓ El diseño compacto de las placas ahorra espacio en el laboratorio
(almacenamiento
/ incubadora)

3.- MATERIALES/EQUIPOS
• Frascos de vidrio de 250ml
• Pipetas esteriles de 1ml
• Succionadores de 1ml
• Tubos tapa rosca de 15ml
• Gradillas
• Marcador de vidrio
• Estufa de cultivo
• Estufa de esterilizacion
• Cabina de flujo laminar
• Autoclave
• Homogeneizador Stomacher
• Agitador vortex
• Contador de colonias

4.- REACTIVOS
• Placa petrifilm de Bacteria Msofilas Aerobias
• Placa petrifilm de E.Coli y Coliformes
• Placa petrifilm de Staphylococcus Aureus
• Placa petrifilm de Mohos y Levadura
• Placa petrifilm de Enterobacteria

5.- PROCEDIMINENTO
EXPERIENCIA #1
Placas para Recuento de Bacterias Mesofilas Aerobias (BMA)

pág. 64
pág. 65
Recuento = 0
La interpretación de la placa Petrifilm para Aerobios resulta muy fácil. La Figura 2
muestra una placa Petrifilm Recuento de Aerobios sin colonias
Recuento = 16
La Figura 3 muestra una placa Petrifilm Recuento de Aerobios con pocas colonias
bacterianas. Un indicador rojo presente en la placa colorea todas las colonias.
Contar todas las colonias rojas independientemente de su tamaño y de la
intensidad de color. Usar un contador estándar tipo Quebec o un lector de placas
3MTM Petrifilm para leer la placa Petrifilm.

pág. 66
Recuento = 143
Al igual que con una placa Petri normal, el rango de recuento para una placa
Petrifilm de Aerobios es de 10 - 300 colonias. Ver Figura 4.

Recuento estimado = 420

Cuando el número de colonias es superior a 300 como ocurre en la Figura 5, se
puede realizar una estimación. Contar las colonias de una cuadrícula (1 cm2) y
multiplicar por 20 para obtener el recuento total por placa. El área de inóculo de
una placa Petrifilm de Aerobios es de 20 cm2 aproximadamente

Recuento = Incontable (TNTC)

La Figura 6 muestra una placa Petrifilm de Aerobios con un número incontable de
colonias (TNTC).

Recuento = Incontable (TNTC)

Con recuentos muy altos, todo el área de crecimiento puede virar al rosa como
muestra la Figura 7. Alguna colonia individual podría observarse en el borde del
área de crecimiento. Registrar este resultado como incontable (TNTC).

pág. 67
Recuento = Incontable (TNTC)
Ocasionalmente las colonias aparecen distribuidas de manera desigual como
ocurre en la Figura 8. Es también un resultado incontable (TNTC). De hecho la
distribución es uniforme.

Recuento = Incontable (TNTC)

Las colonias de la placa Petrifilm de Aerobios de la Figura 9 parecen contables a
primera vista. Sin embargo, cuando se miran los bordes del área de creci-miento
puede verse una alta concentración de colonias. Registrar este resulta-do como
incontable (TNTC).

Recuento estimado = 160

Algunas bacterias licúan el gel en la placa Petrifilm de Aerobios como muestra la
Figura 10. Cuando esto ocurre, realizar un recuento aproximado en las cua-drículas
no afectadas y luego estimar el recuento total. No contar las manchas rojas de la
zona licuada.

Recuento = 83
Las colonias de las placas Petrifilm de Aerobios son rojas y pueden distinguirse
fácilmente de las partículas alimenticias opacas que causan confusión en las
placas Petri normales. Ver Figura 11.

pág. 68
 EXPERIENCIA #2
Placas para Recuento de Enterobacterias

pág. 69
pág. 70
Recuento de Enterobacteriaceae = 13
Resulta fácil contar las colonias de enterobacterias en las placas Petrifilm para
Enterobacteriaceae. Un indicador rojo en la placa colorea todas las colonias y el
film superior atrapa el gas en caso de que éste sea producido por las bac-terias.
Las bacterias acidificantes aparecen como colonias rojas rodeadas por una zona
amarilla asociada a la producción de ácido que es detectado por el indicador de
pH del medio.
Las colonias de enterobacterias tienen las siguientes características en las pla-cas
Petrifilm para Enterobacteriaceae: Las enterobacterias pueden producir co-lonias
asociadas a burbujas de gas (ver figura 1, círculo 1). Las enterobacterias pueden
producir también colonias rojas con zonas ácidas solamente (ver figura 1, círculo
2). Por último, las enterobacterias pueden producir colonias rojas aso-ciadas a zona
ácida y burbujas de gas (ver figura 1, círculo 3).
Los círculos 1 y 3 de la figura 1 muestran también como las formas de las bur-bujas
pueden variar. A veces el gas deforma la colonia y hace que ésta “perfile” la
burbuja como el círculo 3.
Recuento de Enterobacteriaceae = 9
La figura 2 muestra una placa Petrifilm para Enterobacteriaceae con algunas
enterobacterias y un gran número de colonias Gram negativas que no son ente-
robacterias al no ser acidificantes o formadoras de gas.

Recuento de Enterobacteriaceae = 0 Recuento de Enterobacteriaceae = 3

pág. 71
Observar el cambio de color del gel en las figuras 3 a 8. Al aumentar el recuento
de enterobacterias, el color del gel se aclara, virando del violeta al amarillo o
crema.

Recuento de Enterobacteriaceae = 77
El rango de recuento recomendado para las placas Petrifilm par Enterobacte
riaceae es entre 15-100 colonias. Las muestras con recuentos mayores de 100
colonias de enterobacterias por placa deben de estimarse. Ver figura 5.

Recuento de Enterobacteriaceae = Incontable (estimado)

Las placas con una cantidad incontable (TNTC) de colonias de enterobacterias
aclaran el color del gel y además ofrecen una o las dos siguientes características:
1) colonias muy pequeñas, o, 2) muchas burbujas de gas. Ver figura 6.

Recuento de Enterobacteriaceae = Incontable (estimado)

En la figura 7, el recuento es tan alto que las zonas ácidas y las burbujas de gas no
se ven claramente. Un color amarillento del gel es indicativo de un resultado
incontable (TNTC).

pág. 72
Recuento de Enterobacteriaceae = Incontable (estimado)
La placa Petrifilm para Enterobacteriaceae de la figura 8 tiene dos características
que indican un resultado incontable (TNTC):
1)color amarillento del gel, y
2)muchas colonias pequeñas.

Recuento de Enterobacteriaceae = 44
Pueden aparecer burbujas de aplicación debido a una siembra inadecuada en
las placas Petrifilm para Enterobacteriaceae. No confundir con las burbujas de gas
de las colonias. En el caso de burbujas de aplicación, tienen una forma irregular y
no están asociadas a colonias rojas. Ver figura 9

Recuento de Enterobacteriaceae = 2
Las partículas de alimento tienen a menudo formas irregulares o filamentosas y no
estánasociadas a burbujas de gas o zonas ácidas. Ver figura 10.

pág. 73
Recuento de Enterobacteriaceae = 29
Las partículas de alimentos también pueden aparecer como puntos oscuros pero
no asociados a burbujas de gas o zonas ácidas. Ver figura 11.

EXPERIENCIA #3
Placas para Recuento de E.COLI y COLIFORME

Las Placas Petrifilm™ para el Recuento de E.coli/Coliformes (Placa Petrifilm EC)

contienen nutrientes de Bilis Rojo Violeta (VRB), un agente gelificante soluble en
agua fría, un indicador de actividad de la glucuronidasa y un indicador que facilita
la enumeración de las colonias. La mayoría de las E. coli (cerca del 97%) produce
beta-glucuronidasa, la que a su vez produce una precipitación azul asociada con
la colonia. La película superior atrapa el gas producido por E. coli y coliformes
fermentadores de lactosa. Cerca del 95% de las E. coli producen gas, representado
por colonias entre azules y rojo-azules asociadas con el gas atrapado en la Placa
Petrifilm EC (dentro del diámetro aproximado de una colonia).
La AOAC Internacional y el Manual de Análisis Bacteriológico de la FDA de los
Estados Unidos definen los coliformes como colonias de bastoncillos gram-
negativos que producen ácido y gas de la lactosa durante la fermentación
metabólica de la lactosa. Las colonias coliformes que crecen en la Placa Petrifilm
EC, producen un ácido que causa el oscurecimiento del gel por el indicador de
pH. El gas atrapado alrededor de las colonias rojas de coliformes confirma su
presencia.

pág. 74
pág. 75
pág. 76
La identificación de la E. coli puede variar de país apaís (ver en "Recomendaciones
de uso" tiempos de incubación y temperaturas).
Método validado por la AOAC Internacional E. coli = 49 (colonias azules con gas)
Total coliformes = 87 (colonias rojas y azules con gas)
(NO use esta placa sola para la detección de E. coli O157. Como la mayoría de
otros medios para enumeración de E. coli coliformes, esta placa no señalará
específicamente si está presente algún O157).

No crecimiento = 0
Observe el cambio de color del gel de las figuras 2 a 8. Mientras el recuento de E.
coli o coliformes aumenta, el color del gel se vuelve rojo oscuro o púrpura azulado.
Las burbujas del fondo son características del gel y no son el resultado del
crecimiento de E. coli o coliformes. Ver el círculo 1.

Recuento de E. coli = 13
Total de recuento de coliformes = 28
El rango de recuento de la población en las Placas Petrifilm EC es de 15 a 150.

pág. 77
No cuente las colonias que aparecen sobre la barrera de espuma, ya que han sido
removidas de la influencia del medio selectivo. Ver el círculo 1 (ver figura 3)

Recuento de E. coli = 3
Cualquier azul en una colonia (de azul a rojo-azul) indica la presencia de E. coli. La
luz de frente mejorará la detección del precipitado azul formado por una colonia.
El círculo 1 muestra una colonia rojo-azul cuyo conteo se hizo con luz de atrás. El
círculo 2 muestra la misma colonia con luz de frente. El azul precipitado es más
evidente en el círculo 2 (ver figura 4).
Recuento de E. coli = 17
Recuento total estimado de coliformes = 150
El área circular de crecimiento es de aproximadamente 20 cm2. El recuento
estimado se puede hacer en las placas que contienen más de 150 colonias, al
contar el número de colonias en uno o más de los cuadrados representativos y al
determinar el promedio por cuadrado. Multiplique el número promedio por 20 y
determine el conteo estimado por placa. (ver figura 5)

pág. 78
Recuento actual aprox. ~ 106
Las Placas Petrifilm EC con colonias que son MNPC, tienen una o más de las
siguientes características: Muchas colonias pequeñas, muchas burbujas de gas y el
oscurecimiento del gel de un color rojo a un azul púrpura. (ver figura 6)

Recuento actual aprox. ~ 108

Una alta concentración de E. coli puede causar que el área de crecimiento se
haga azul púrpura. (ver figura 7)

Recuento presuntivo de E. coli ~ 8

Recuento total estimado de coliformes aprox. ~ 108
Cuando existen cifras altas de coliformes (108), algunos tipos de E. coli presuntiva
pueden producir menos gas y las colonias azules pueden ser menos definitivas.
Cuente todas las colonias azules sin gas y/o zonas azules como E. coli. Si es
necesaria la confirmación, aisle las colonias azules con gas para su posterior
identificación. (ver figura 8)

Recuento actual aprox. de ~ 108

Cuando un número alto de organismos no-coliformes, como las Pseudomonas,
estén presentes en las Placas Petrifilm EC, el gel puede volverse amarillo. (ver figura
9)

pág. 79
Recuento total de coliformes = 3
Las partículas de alimento tienen forma irregular y no tienen burbujas de gas. ( ver
figura 10)

Recuento total de coliformes = 78

Los patrones de burbujas pueden variar. El gas puede romper la colonia y así, esta
última 'delinea' a la burbuja. Vea los círculos 1 y 2.
Las burbujas pueden aparecer como resultado de una inoculación impropia o de
aire atrapado dentro de la muestra. Tienen forma irregular y no se asocian con una
colonia. Vea el círculo 3. (ver figura 11)

Los ejemplos 1 a 10 muestran varios patrones deburbujas asociados con colonias

que producen gas. Todas deben ser enumeradas.

pág. 80
 EXPERIENCIA #4
Placas para Recuento de Staphylococcus Aureus (Staph Express)

El sistema de recuento Petrifilm Staph Express consiste en una placa de recuento

Petrifilm Staph Express y un disco de confirmación Petrifilm Staph Express
La placa de recuento Petrifilm Staph Express contiene un sistema de medio de
cultivo preparado. El medio cromogénico tipo Baird-Parker modificado es selectivo
y diferencial para Staphylococcus aureus. El Staphylococcus aureus se manifiesta
en la placa bajo la forma de colonias rojo-violeta (figura 1). Pueden también
aparecer en la placa otras colonias que no sean de color rojo-violeta (figura 5).
El disco Petrifilm Staph Express ha sido diseñado para la detección de las reacciones
de desoxiribonucleasa (DNasa) específicas de Staphylococcus aureus aislado en
la placa de recuento Petrifilm Staph Express; contiene azul-O toluidina que facilita
la visualización de las reacciones de DNasa (figura 2). El disco Petrifilm Staph Express
debe de usarse siempre que aparezcan en la placa otras colonias que no sean de
color rojo-violeta.

pág. 81
pág. 82
pág. 83
La figura 1 muestra las colonias rojo-violeta de S. aureus. Las colonias de S. aureus
pueden variar de tamaño.
La figura 2 muestra las zonas rosa que se forman cuando ocurre la reacción de
DNasa de S. aureus. Las zonas rosas pueden variar de tamaño debido a la cantidad
variable de DNasa en diferentes S. aureus

1. Recuento de colonias en las placas Petrifilm Staph Express.

Después de 24 h. de incubación, si únicamente aparecen colonias de color rojo-
violeta, proceder al recuento. Contar todas las colonias rojo-violeta como
Staphylococcus aureus. Usar una lupa iluminada para una más fácil visualización
de las colonias.

Recuento de S. aureus = 0 La figura 3 muestra la placa de Petrifilm Staph Express sin

colonias después de 24 horas de incubación.
Recuento de S. aureus = 20 La figura 4 muestra la placa Petrifilm Staph Express con
colonias rojo-violeta unicamente. Contar todas las colonias rojo violeta como S.

pág. 84
aureus indepen-dientemente de su tamaño. Pueden verse también en esta placa
partículas de alimento de forma irregular.

2. Recuento de zonas rosas de DNasa con el sistema Petrifilm Staph Express

Siempre que se vean en la placa colonias que no sean de color rojo-violeta, usar el
disco Petrifilm Staph Express para el recuento de Staphylo-coccus aureus. Las figuras
5 y 6 muestran el mismo sistema Petrifilm Staph Express antes y después de usar el
disco.

La figura 5 muestra los diferentes colores de colonias que pueden aparecer en las
placas Petrifilm Staph Express
-Las colonias rojo-violeta son S. aureus
-Las colonias azul-verde no son S. aureus
-Las colonias negras pueden ser o no S. aureus
En este caso de la figura 5, usar un disco antes de proceder al recuento definitivo
de S. aureus.
Recuento de S. aureus = 33
La figura 6 muestra 33 zonas rosas producidas por igual número de colonias de S.
aureus. Contar todas las zonas rosas como S. aureus. Las flechas en la figura
muestran desdoblamiento del gel. El desdobla-miento del gel no afecta al sistema
de recuento.

EXPERIENCIA #5
Placas para Recuento de Moho y Levadura

Hacer un recuento con placas Petrifilm Levaduras y Mohos es fácil. Contienen un

indicador colorante para levaduras y mohos para proporcionar contraste y facilitar
el recuento. Para diferenciar las colonias de levaduras y mohos en las placas
Petrifilm Levaduras y Mohos, buscar una o más de las siguientes características
típicas:
pág. 85
LEVADURAS
- Colonias pequeñas
- Las colonias tienen bordes definidos
- De color rosa-tostado a azul-verdoso
- Las colonias pueden aparecer alzadas ("3D")
- Generalmente no tienen un foco (centro negro) en el centro de la colonia

MOHOS
- Colonias grandes
- Las colonias tienen bordes difusos
- Color variable (los mohos pueden producir sus propios pigmentos)
- Las colonias son planas
- Generalmente con un foco en el centro de la colonia Las colonias en la figura l
son ejemplos de levaduras características: colonias pequeñas, de color azul-
verdoso, con
bordes definidos y sin foco (Recuento de levaduras = 44). Las colonias de la figura
2 son ejemplos de mohos característicos: grandes, colonias de color variable, con
bordes difusos y un foco en el centro (Recuento de mohos = 27).

La placa Petrifilm Levaduras y Mohos de la figura 3 contiene un número

fácilmente contable de mohos, (colonias grandes, verdes, con bordes difusos y un
foco central) y un gran número de colonias de levaduras. Las colonias de
levaduras son pequeñas, de color tostado, con bordes definidos y sin foco.
Cuando el número de colonias es más de ISO, se debe hacer una estimación:
determinar el número medio de colonias en un cuadrado (1 cm2) y multiplicar por
30 para obtener el recuento total por placa. El área inoculada de una placa
Petrifilm Levaduras y Mohos es de aproximadamente 30 cm2 (Recuento de
levaduras = 480 (estimado); Recuento de mohos = 21). La placa de Petrifilm
Levaduras y Mohos de la figura 4 contiene un elevado número de colonias de
levaduras, demasiado numeroso para ser contado (TNTC). Las colonias pequeñas
pág. 86
y azules en el borde de la placa la diferencian de una placa de mohos TNTC
(Recuento de levaduras = TNTC, recuento actual >104). Algunas veces las placas
Petrifilm Levaduras y Mohos con un número alto de colonias de levaduras pueden
parecer que tengan un crecimiento azul sólo en los bordes (figura 5). También es
un recuento de levaduras TNTC (Recuento de levaduras = TNTC, recuento actual
>106). Si las placas Petrifilm Levaduras y Mohos parecen no tener crecimiento,
levantar el film superior (figura 6). Si hay presentes muchas levaduras, se verán
colonias blancas en el gel. Se anota como un recuento de levaduras TNTC
(Recuento de levaduras = TNTC).

Mohos
Las colonias de mohos en la placa Petrifilm Levaduras y Mohos de la figura 7 son
colonias de pigmentación variable, con bordes difusos y un foco central. Son
grandes, empezando a esporular y superponerse entre sí en la placa. Para facilitar
el recuento dividir la placa en secciones y buscar focos que permitan distinguir
colonias individuales. El recuadro muestra 15 mohos (Recuento de mohos = 59).
Notar la pigmentación variable con bordes vellosos en la placa de la figura 8,
causado por el elevado número de colonias de mohos y la esporulación que ha
tenido lugar. Estimar el número contando los focos. En el cuadrado que se muestra
hay 4 colonias (Recuento de mohos = 120 (estimado)). Igual que con todos los
pág. 87
métodos de recuento en placas, las placas con muchas colonias pueden mostrar
características de colonias atípicas. Es importante hacer una correcta dilución para
asegurar un recuento exacto. Las placas Petrifilm Levaduras y Mohos de las figuras
9 y 10 son diluciones l : 10 y l : 100, respectivamente, del mismo producto. Las
colonias de la figura 9 son pequeñas, pálidas y numerosas, haciendo el contaje
difícil de estimar. Hay una burbuja como artefacto (Recuento de mohos = TNTC). La
dilución del producto para obtener un recuento de colonias en el margen deseado
(15-150 colonias) facilita el recuento. Los mohos de la figura 10 son grandes, con
bordes difusos y focos centrales (Recuento de mohos = 58). El apiñamiento de las
colonias de la placa en la figura 9 impide su crecimiento típico.

Reacción de la fosfatasa
Todas las células vivas contienen el enzima fosfatasa. En presencia de la fosfatasa
el indicador de las placas de Petrifilm Levaduras y Mohos se activa y las colonias
de levaduras y mohos se colorean de azul. Algunos alimentos crudos o
procesados que contienen células vivas (y por tanto, fosfatasa) pueden dar

pág. 88
reacción a color azul. A veces pueden observarse 2 tipos diferentes de
reacciones de color de los productos: un color azul uniforme del medio o puntos
azules intensos (se ven a menudo en especias o productos granulados). La
reacción de color por la fosfatasa natural en un producto se puede distinguir de
las colonias de levaduras y mohos mediante una o varias de las siguientes
técnicas:
1) DILUCION: Si es posible, una mayor dilución eliminará el color azul del medio, o
reducirá el número de puntos azules.
2)SOBRENADANTE DE LA PLACA: Mezclar la muestra y dejar reposar 3-5 minutos
para eliminar partículas grandes del producto que pueden a menudo causar las
reacciones de color de tipo puntiforme.

3) TEMPERATURA DE INCUBACION: Incubar las placas a la temperatura apropiada:

25 ± 1°C. Las reacciones enzimáticas (fosfatasa) ocurren más rápidas al
incrementar la temperatura.

4) CONTROL: Leer las placas Petrifilm Levaduras y Mohos tras 24-28 horas. Observar
cualquier cambio de color que pueda ser de ayuda en la interpretación final. La
placa de Petrifilm Levaduras y Mohos de la figura 11 es un ejemplo de una placa
con un color uniforme del medio causado por la "fosfatasa natural" presente en la
muestra analizada. El aspecto "granuloso", se debe a las partículas de producto
que se hallan en la dilución inoculada. Para distinguido de un recuento de
levaduras o mohos TNTC, observar los bordes de la placa (Recuento de levaduras
y mohos = O).
La figura 12 es un ejemplo de reacción con puntos azules, que se pueden ver con
la "fosfatasa natural" en algunos alimentos. Observar su forma: pequeñas,
puntiformes o irregulares y el color azul intenso, que a menudo colorea los bordes
de algunas de las partículas más grandes (Recuento de levaduras y mohos = O).
Otro ejemplo de reacciones que dan puntos de color azul se muestra en la figura
13. Los puntos son muy brillantes, pequeños y de forma irregular. Las colonias de
levaduras son pequeñas, azul-verdosas, con bordes definidos.
Las colonias de mohos son grandes, de pigmentación variable, con bordes
difusos y foco en el centro (Recuento de levaduras = 7; Recuento de mohos = 7).
La figura 14 tiene el mismo producto que el de la figura 13, inoculado tras dejar
reposar 3-5 minutos las partículas del producto. Todavía hay algunas manchas
puntiformes (encuadradas) causadas por las partículas del producto, pero la
mayor parte de la interferencia del producto se ha eliminado (Recuento de
levaduras = 12; Recuento de mohos = 4).

pág. 89
Tiempo y temperatura
El tiempo y temperatura adecuada de incubación es importante para asegurar el
crecimiento de los tipos de levaduras y mohos que pueden causar alteraciones.
Estas levaduras y mohos crecen generalmente despacio, y son sensibles a altas
temperaturas, sin tener en cuenta el método usado. Para asegurar un crecimiento
adecuado, incubar las placas de Petrifilm Levaduras y Mohos a 25°C ± 1°C, y leer
las placas a los 3 y 5 días. Como que las colonias de mohos crecen entre los films,
la lectura de las placas Petrifilm no originará colonias adicionales a partir de
nuevas esporas. La incubación de las placas Levaduras y Mohos a una
temperatura más alta no implica un resultado más rápido, sino que puede
significar un resultado inexacto como se muestra en las placas Petrifilm Levaduras
y Mohos de las figuras 15 y 16. Son placas duplicadas con el mismo producto y
dilución, pero incubadas a diferentes tiempos y temperaturas.

pág. 90
pág. 91
pág. 92
Comentarios adicionales
•los pasos 9 y 10 son únicos para las placas Petrifilm levaduras y Mohos.
•Nota: recordar inocular y poner el aplicador antes de pasar a la siguiente placa.

6.- CALCULOS
7.- EXPRESION DE RESULTADOS

Tipode Tipo de 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1

muestra microoganismo
Meson#1 Staphylococcus
Aureus
Meson #2 B.M.A
Meson #3 E.Coli y Coliformes
Meson #4 Enterobacterias
Meson #5 Mohos y Levaduras

pág. 93
8.- CONCLUSION
9.- CUESTIONARIO
1.- ¿Qué son y para que se usan las placas petrifilm?
2.- ¿Cite al menos 5 diferencias del metodo petrifilm vs Método tradicional?
3.- ¿Qué es el TTC?
4.- ¿Cuál es la compposicion de las placas petrifilm?
5.- ¿mencione al menos 7 tipos de petrifilm para sus respectivos estudios de
diferentes microorganismnos?
10.- BIBLIOGRAFIA

pág. 94
FORMATO Y PONDERACION DE PRESENTACIÓN DE INFORME SOBRE 100%
Tipo de hoja: Hoja Bond tamaño carta
Esquema: Representación gráfica del procedimiento. Requisito para ingresar al
aula a realizar el laboratorio.
1. Objetivos (5%): Transcribir completo de la guía proporcionada.
2. Principio/Fundamento Teórico (10%): Transcribir completo de la guía
proporcionada.
3. Materiales, Equipos (5%): Transcribir y aumentar si se utilizase otros.
4. Reactivos (5%): Transcribir y aumentar si se utilizase otros.
5. Procedimiento/Esquema (10%): Transcribir de la guía proporcionada, puede
agregar fotos si tiene, o también puede dibujar a mano describiendo paso a paso
el procedimiento de la experiencia que se esta realizando.
6. Cálculos (15%): Realizar cálculos si es necesario (solamente de su propio mesón
que realizo la experiencia).
7. Expresión de Resultados (10%): Transcribir el cuadro de la guía proporcionada en
el cual se llenarán los resultados finales de los 5 mesones previamente haciendo
cálculos si es necesario
8. Conclusión (30%): Relacionadas a los objetivos propuestos. Considerar
normativas vigentes que se apliquen a los resultados hallados y verificar su
cumplimiento de los límites establecidos.
9. Cuestionario (5%): Investigar las respuestas a las preguntas planteadas en libros,
sitios web, etc.
10. Bibliografía (5%): Nombrar las fuentes donde obtuvo la información para el
cuestionario por lo menos 5 fuentes.

pág. 95
RECOMENDACIONES
1.- Leer detalladamente el formato de presentación de informenes y el formato de
evaluación de la materia.
2.- Presentar su esquema antes de ingresar al laboratorio caso contrario no podrá
entrar a realizar la experiencia.
3.- Ingresar al laboratorio con mandil y ropa adecuada de la siguiente manera:
Hombres: Pantalón de jeans no rotos en la rodilla ni en cualquier otra parte del
pantalón, uñas cortas y limpias, no utilizar gorras en el laboratorio, utilizar zapatos o
tenis cerrados.
Mujeres: Pantalón de jeans no rotos en la rodilla ni en cualquier otra parte del
pantalón, uñas cortas y limpias (no pintadas), cabello recogido (con moña), no
utilizar maquillaje, zapatos o tenis cerrados (no sandalias ni zapatos altos), no utilizar
aretes grandes.
4.- Se dará 15min de tolerancia para ingresar al laboratorio una vez pasado el
tiempo no podrá entrar al laboratorio, (NO INSISTIR).
5.- Una vez terminado con los laboratorios del semestre se deberá devolver aquellos
materiales rotos, rajados o perdidos durante la experiencia NOTA: avisar cuando se
rompe cualquier tipo de material no quedarse callado, tampoco botar al basurero
sin avisar. El material faltante se tendrá que comprar al final de semestre para su
devolución ojo el total de lo acumulado se dividirá entre todos los estudiantes del
curso.

pág. 96
PONDERACION DEL LABORATORIO SOBRE EL 20% DE LA NOTA FINAL DE LA MATERIA
1.-Informenes (5%): Se debera presentar el informe previo al formato mencionado
anteriormente caso contrario el informe no tendra nota , laboratorio avanzado
informe a presentar a la siguiente clase no se permitira presentar informenes
atrasados, los alumnos que no asistan al lab. y/o a los recuentos no tendran
derecho a presentar su informe al menos que tengan su carta o (baja medica) que
por fuerzas mayores no pudo asistir.
NOTA: No insistir en presentar informens atrasados.
2.-Examen Teorico y Practico (10%): Para ingresar al examen el estudiante debera
presentar una guia anillada con separadores con los 12 laboratorios realizados
durante el semestre ademas el estudiante debera tener una asistencia mayor o
igual al 90% en laboratoio y recuentos.
Se debera presentar al examen con lapiz, lapicero,borrador, tajador y calculadora
asi mismo con su guia en mano.
NOTA: Se dara tolerancia de 15min de retraso una vez pasado ese tiempo no podra
entrar al examen.
3.-Preparacion y Lavado de material (2%): El estudiante a lo largo del semestre
podra asistir a un lavado y preparado de material.
4.- Asistencia y recuento de microorganismo (1%): El estudiante debe asistir a las
practicas de laboratorios incluyendo los recuentos de microorganismo para
acceder a los examenes.
5.- Trabajo Practico (2%) Durante el semestre el estudiante debera realizar los
trabajos practicos designados por el auxiliar.
NOTA: No esperar al ultimo laboratorio para preparar y lavar material, ojo este
ultimo punto no es obligatorio.

pág. 97