INSTRUMENTACION HPLC
Fase mvil (eluyente)
Sistema de impulsin (bomba)
Sistema de inyeccin
de muestra (inyector)
Columna
Detector
Sistema de adquisicin
de datos
FASE MOVIL
Caractersticas de un solvente:
Disponible comercialmente
Precio
Pureza y Estabilidad.
Miscibles con otros solventes
TIPOS DE ELUYENTES
Agua ( con o sin sal)
Disolventes
TIPOS DE ELUCION
Isocratica
Gradiente
HPLC
FASE MOVIL
ELIMINACIN DE PARTCULAS.
Filtracin a travs de 0.45 m
Existen 3 mtodos comunes que se utilizan para filtracin
previa de solventes para el HPLC.
Filtro a la entrada de solvente
Filtracin al vaco
Filtracin en lnea
DESGASIFICACION
Sonificazion
Burbujeo de Helio
Al vaco en lnea
HPLC
BOMBAS
EXIGENCIAS:
Presin 0-400 atm
Salida libre de pulsos
Caudales entre 0.1y 10 ml/min
Reproductibilidad de caudales
Resistencia a la corrosin por los disolventes
Existen varios tipos de bombas entre ellas
estn:
Bomba de pistn reciproco
Bombas tipo jeringa
Bombas de presin constante
HPLC
BOMBAS TIPO JERINGAS:
Flujo libre de pulsos
Baja capacidad (aprox. 250 ml)
No adecuada para cambios de
disolvente
HPLC
SISTEMA DE INYECCION
INYECTOR MANUAL CON BUCLE
Recomendaciones:
Mantener la jeringa en la puerta
evitar
de inyeccin para
succiones involuntarias de la muestra a extraer
Mantener la vlvula en posicin inject
Emplear jeringas adecuadas( punta cuadrada)
HPLC
COLUMNAS PARA CROMATOGRAFIA DE
LIQUIDOS
se realizan con tubos de
acero
inoxidables
de
dimetro interno uniforme,
aunque se encuentran tubos
de
vidrio
de
paredes
resistentes. Estas ultimas
solo se utilizan a presiones
menores a 600psi.
COLUMNAS ANALITICAS
Longitud 10 a 30 cm. El diametro
interno de 4 a 10 mm y el tamaos
de particulas de 5 o 10 m.
pero comunmente
L=25cm Y
Dint=4,6mm y relleno de particulas 5
m,
presentan 40.000 a 60.000
platos/metro.
columnas de alta eficiencia mas
rapidas sus dimenciones oscilan
entre:
Longitud de 3 a7.5 cm
Diametro interno de 1 a 4.6 mm
Tamao de la particula 3 o 5m
Numero
de
platos
=
100.000platos/metro
PRECOLUMNAS
La pre columna se
coloca
delante
de
columna
analtica,
elimina
no
solo
la
mtrica en suspensin y
los contaminantes de los
disolventes sino tambin
componentes
de
la
muestra que se unen
irreversiblemente a la
fase estacionaria.
TIPOS DE RELLENO DE LA COLUMNA
Pelicular: consiste en bolsas de vidrio o de poli mero no
porosa y esfricas con un dimetro de 30 a 40 m. Por lo
general los rellenos peliculares se utilizan en las
precolumnas y no en las columnas analticas.
Partculas porosas: Estn formadas por micro partculas
porosas con dimetro de 3 a 10 m
DETECTORES:
DETECTORES QUE SE BASAN ENLA MEDIDA DE UNA
PROPIEDAD DE LA DISOLUCION
Propiedad del eluyente tal como el ndice de refraccin,
la constante dielctrica o la densidad, que modifica por
la presencia del analito.
DETECTORES BASADOS EN UNA PROPIEDAD DEL
SOLUTO Responden a alguna de las propiedades del
soluto, como la absorbancia en el UV, fluorescencia, o
corriente limite, que no son inenertes a la fase mvil .
TIPOS DE DETECTORES
Detectores de absorbancia:
Detectores UV, VIS y PDA
Detector de ndice de refraccin
Espectrmetro de masas
Detector de conductividad
Detector de fluorescencia
Detector electroqumico
DETECTORES DE
ABSORBANCIA:
Los detectores UV, VIS, y
PDA se clasifican como
detectores de absorbancia.
Proporcionan una buena
sensibilidad
para
que
compuestos que absorbe la
luz. Son fciles de operar y
proporcionar una buena
estabilidad. Detectores de
UV es un detector muy
comnmente utilizado para
el anlisis HPLC
DETECTOR DE NDICE DE
REFRACCIN
Estos detectores miden la
diferencia de ndice de
refraccin,
entre
el
disolvente
que en su camino hacia la
columna pasa a travs de
una mitad de la cubeta y
el efluente de la columna
que pasa por la otra mitad
Espectrmetro de Detector de
conductividad
Masas
Los analitos se
detectan
basndose en su
peso molecular.
La informacin
obtenida es
especialmente
til para la
identificacin de
compuestos
estructurales
Las soluciones
que conducen la
electricidad.
mide la
resistencia
electrnica y el
valor medido es
directamente
proporcional a la
concentracin de
los iones
Detector de
Fluorescencia
La ventaja del
mtodo de
fluorescencia es su
alta sensibilidad para
determinados grupos
de compuestos a ~
nivel fg. Mediante el
uso de una longitud
de onda especfica,
tomos de analito
son excitados y luego
emitir la seal de luz.
Detector electroqumico
Hay varios tipos
diferentes de ECs. La
deteccin se basa en
amperometra,
polarografa,
culoumbimetra y
conductrometria.
Ofrecen una alta
sensibilidad,
simplicidad,
conveniencia y
aplicabilidad
generalizada.
PROBLEMAS
MS
COMUNES
ENCONTRADOS EN HPLC
Presin Alta
Prdida de la Resolucin
Picos Hendidos
Variacin en los Tiempos de Retencin
Variaciones de la Lnea Base
Lnea Base con mucho Ruido
Picos Falsos (Detectores Electroqumicos y de
Fluorescencia)
APLICACIONES
Campos
de Aplicacin de HPLC
Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos
Bioqumica:
lpidos
Aminocidos,
protenas,
carbohidratos,
Productos de alimentacin: Edulcorantes
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
artificiales,
Productos
de
la
industria
qumica:
Aromticos
condensados, tenso activos, propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre,
narcticos
Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas,
extractos de orina, estrgenos.
