Secuenciamiento de
nueva generación en
454 ROCHE
Presentado por:
Karen Echeverri Restrepo
Daniela Munera Castro
Camila Orozco Cataño
María Palacio Duque
Isabel Vargas
Biología Molecular, tercer semestre en Biotecnologia
Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia
2017
Introducción
Los métodos de la primera generación son
capaces de secuenciar hasta 100 kb al día,
con lo que se necesitan varios años para
secuenciar el genoma humano. Durante
esta última década se han desarrollado los
denominados "métodos de segunda
generación" que son capaces de llevar a
cabo el proceso de secuenciación de forma
muchísimo más rápida.
Esquema de la secuenciación de próxima
generación Roche 454 ™. Se lleva a
cabo una reacción de PCR usando
cebadores con adaptadores diseñados
específicamente. Estas plantillas están
ligadas a perlas y amplificadas mediante
PCR en emulsión. Cada cuenta se carga
en una placa de picotitro y se secuencia
en paralelo haciendo fluir los reactivos de
pirosecuenciación a través de la placa.
Secuenciación en 454 ROCHE
La nueva tecnología evita los
problemas del método Sanger, en el
que algunos fragmentos de ADN no
podían copiarse en el interior de
bacterias, por lo que quedaban huecos
por descifrar. Con la nueva técnica,
cada fragmento de ADN es capturado
de forma individual en una gota de
líquido y amplificado a 10 millones de
copias por medio de la PCR.
Secuenciación en 454 ROCHE
ASPECTOS NEGATIVOS ASPECTOS POSITIVOS
La máquina presenta también • No es necesario usar geles,
aún limitaciones, ya que por el marcadores fluorescentes o
momento sólo es capaz de leer ddNTPs.
fragmentos de una longitud igual • Realiza largos tamaños de
o menor a 100 unidades, muy lectura y los tiempos de
por debajo de las 800 unidades ejecución son rápidos.
que permite la tecnología basada
en el método Sanger.
Secuenciación en 454 ROCHE
COMPONENTES:
ADN molde de cadena sencilla
Un cebador para iniciar la síntesis de ADN
Tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) y
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato dATP-S
Cuatro enzimas: ADN Polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y
apirasa
Adenosina 5’-fosfosulfato (APS)
Luciferina
Secuenciación en 454 ROCHE
Secuenciación en 454 ROCHE
Secuenciación en 454 ROCHE
Secuenciación en 454 ROCHE
polimerasa
T T
T
GC
AC G
T
TT
T T T
T sulfurilasa
Apirasa luciferasa
Secuenciación en 454 ROCHE
polimerasa
G
G
G
G
GC
AC G
G G G
TT
PPi
sulfurilasa
ATP
luciferina
Apirasa ATP + luciferasa
oxiluciferina
Secuenciación en 454 ROCHE
Secuenciación en 454 ROCHE
https://www.youtube.com/watch?v=rsJoG-AulNE&t=182s
Bibliografía
• Secuenciación del ADN, archivo en PDF: http://
www.ehu.eus/biofisica/juanma/bioinf/pdf/tema_2a.pdf
