2020 i ep_tema_3._calculo_de_biomasa

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  COMO ABORDAR YRESOLVER ASPECTOS PRÁCTICOS DE MICROBIOLOGÍA 3.3.3.3. CÁLCULOS DE BIOMASA Inés Arana, Maite Orruño e Isabel Barcina Departamento Inmunología, Microbiología y Parasitología Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea
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  3. CÁLCULO DEBIOMASA Cuando usamos el término biomasa nos referimos a la cantidad de masa de material vivo y se expresa como gramos o calorías (julios) por ml o g de muestra. Mide la cantidad de energía que se almacena en un segmento determinado de una comunidad biológica. Para cuantificar la biomasa de una población/comunidad microbiana disponemos de diferentes métodos. Alguno de estos métodos es muy sencillo y no requiere manipulaciones complejas; otros métodos son más complejos, siendo necesarias medidas indirectas. Veremos algunos casos sencillos. Uno método directo y sencillo de cuantificación de la biomasa de una población es la estimación del peso seco por g ó ml de muestra. Se requieren una balanza (precisión g x 0,001), un cestillo para colocar la muestra que puede elaborarse con papel de aluminio y una mufla para secar la muestra. Este método es válido, y muy utilizado, con cultivos puros (de levaduras, etc.); pero su utilización con muestras naturales (sedimentos, muestras de agua de mar, etc.) es problemática. Nuevamente, se deben proponer soluciones para los problemas siguientes: 3.1. Para determinar el peso seco de un cultivo de Saccharomyces cerevisiae, 10 ml de una suspensión de levadura se centrifugaron a 5.000 g. Tras retirar el sobrenadante, se añadieron 3 ml de solución salina estéril y se agitó hasta homogeneizar. 1 ml de esta nueva suspensión se colocaron en un cestillo metálico (peso del cestillo vacío; 0,300 g) y se secaron en estufa a 105ºC durante 24 h. Tras ese periodo de secado, el peso del cestillo fue de 0,350 g. ¿Cuál es el peso seco, expresado como g/ml, del cultivo? Otro método de determinación de biomasa, válido para poblaciones naturales pero más complejo y laborioso, es la determinación de la biomasa a través del biovolumen. En este método, en preparaciones para microscopia fotónica, de epiflluorescencia, etc. Se determina la longitud, anchura o diámetro de un número determinado de microorganismos de esa muestra. Los microorganismos de la muestra se asimilan a figuras geométricas más o menos complejas y se calcula el biovolumen de cada uno de ellos. Aplicaremos la siguiente ecuación: Biomasa (µg C/ml) = N * Bv * F
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  Siendo: N, elnúmero de microorganismos enumerados por ml de muestra, Bv, el biovolumen expresado como µm3 por microorganismo, F, factor de conversión, µg de Carbono por µm3 . En la bibliografía se encuentran diferentes valores de F calculados tanto para cultivos puros como para muestras naturales, fundamentalmente de sistemas acuáticos. 3.2. Una muestra bacteriana se tiñó con naranja de acridina y se preparó para microscopia de epifluorescencia. Mediante un sistema de análisis de imagen se procedió a medir la longitud y anchura de 10 células, obteniéndose los siguientes resultados: Célula A: Anchura (µµµµm) L: Longitud (µµµµm) 1 0,51 1,0234 2 0,50 1,0342 3 0,51 1,1091 4 0,50 1,0921 5 0,49 1,0456 6 0,49 1,1001 7 0,50 1,1000 8 0,50 1,0761 9 0,51 1,0345 10 0,49 1,0555 Sabiendo que la densidad del cultivo es 4,8 107 bacterias/ml y el factor de conversión a carbono es 164 fg C/µm3 , ¿cuál es biomasa de este cultivo? Se recomienda emplear la siguiente ecuación para el cálculo del biovolumen en bacterias bacilares: π 1 Bv = A2 (L - A) 4 3 Siendo: A, anchura, L, longitud. 3.3. Suponga que trabaja en el laboratorio de una empresa de producción de cultivos iniciadores (inóculos) para varias empresas de productos lácteos. Dispone de dos nuevas cepas (Lactobacillus adidophilus y Lactobacillus fermentum) en las que se está comprobando la capacidad de producir elevadas densidades celulares y biomasa. En su laboratorio, hacen crecer los dos Lactobacillus, por separado y en condiciones óptimas. Al llegar a la fase estacionaria de crecimiento (24 h) se recogen muestras y, • Los resultados obtenidos utilizando microscopia de epifluorescencia son los siguientes:
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  Lactobacillus Bacterias/campo Vol.Filtrado (ml) Dil. Factor microscopio (campos/filtro) L. acidophilus 25/32/30/28/33/34/35/29/28/24 15/32/33/18/20/22/18/23/19/26 0,5 10-2 14.520 L. fermentum 5/12/13/8/13/8/15/9/8/14 15/12/13/8/10/7/8/9/9/6 1 10-3 7.220 ¿Cuál de los dos microorganismos alcanza una mayor densidad celular en la fase estacionaria de crecimiento? • Se miden 200 células. Resultados obtenidos: Si la fórmula del biovolumen es (L - A/3) πA2 /4 ¿Cuál de los dos microorganismos alcanza una mayor biomasa en la fase estacionaria de crecimiento? 3.4. Se lleva a cabo un estudio de densidad de unidades formadoras de colonia (UFC) en agar nutritivo y biomasa bacteriana en un sistema acuático a 3 profundidades diferentes (5, 25 y 50 m). Para ello se utilizan las técnicas de recuento en placa y recuento directo mediante microscopía. Para el recuento de UFC. se sembraron 3 réplicas de 100 l de diferentes diluciones de la muestra en Agar Marino. Los resultados se presentan en la siguiente tabla: Para la determinación de la biomasa se llevaron a cabo recuentos directos mediante microscopía de epifluorescencia previa tinción de las bacterias con naranja de acridina. Asímismo, se midió el biovolumen bacteriano mediante análisis de imagen de las preparaciones de estas muestras. Los resultados se presentan en la siguiente tabla en la cual se indican las diluciones de la muestra empleadas y el volumen filtrado por 0,2 m en cada caso. El número de campos observados fueron 10 por muestra: Profundidad (m) Dil. Volumen Filtrado ( l) Recuentos (Bacterias/campo) Biovolumen ( m3 /célula) 5 10-1 100 30/35/40/25/30/25/33/25/27/30 0,15 25 10-1 200 31/25/40/37/20/15/32/26/25/31 0,45 50 100 100 31/33/37/43/23/34/21/19/26/30 0,47 Lactobacillus Longitud (µµµµm) Anchura (µµµµm) Factor de conversión (mg C/µµµµm3 ) L. acidophilus 1,7 0,6 L. fermentum 2 0,4 170 10-10 Profundidad (m)Dilución 5 25 50 10-2 Incontables 500/617/593 363/303/395 10-3 357/452/403 53/67/60 35/30/40 10-4 35/45/40 5/7/6 4/2/5
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  El factor deconversión del microscopio utilizado fue: 30.954 campos/filtro, y el factor de conversión del volumen en biomasa fue: 2,2 10-7 gC/ m3 . • ¿A qué profundidad se observa mayor densidad de UFC? ¿Cuál es la densidad de UFC a esta profundidad? • ¿A qué profundidad se observa la mayor biomasa bacteriana? ¿Cuales son los valores máximos de biomasa bacteriana? 3.5. Como inóculo para la elaboración de yogur, se prepara un cultivo mixto compuesto por un 60% de Lactococcus thermophilus y un 40% de Lactobacillus bulgaricus (porcentajes respecto a biomasa). La biomasa del cultivo es de 3 mg C/ml. Sabiendo que: • el diámetro (D) medio de Lactococcus es 1,2 m; y la longitud (L) y anchura (A) medias de Lactobacillus son 1,8 y 0,5 m, respectivamente; • la ecuación del biovolumen en el caso de los cocos es Bv = πD3 /6; y en el caso de los bacilos, Bv = (L - A/3) πA2 /4; • el factor de conversión de biovolumen en carbono (F) es 170 10-10 mg C/ml; ¿Cuál será la densidad de las poblaciones de Lactococcus y de Lactobacillus en el cultivo mixto que hemos preparado?
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  PROPUESTAS DE RESOLUCIÓN 10ml suspensión/ 3 ml diluyente =10 ml suspensión/ 3 ml diluyente =10 ml suspensión/ 3 ml diluyente =10 ml suspensión/ 3 ml diluyente = 3,333,333,333,33 = Factor de concentración= Factor de concentración= Factor de concentración= Factor de concentración 0,3500,3500,3500,350 –––– 0,300 = 0,050 g0,300 = 0,050 g0,300 = 0,050 g0,300 = 0,050 g 0,050 g = 0,0150,0150,0150,015 g/mlg/mlg/mlg/ml 3,33 ml CélulaCélulaCélulaCélula A: Anchura (A: Anchura (A: Anchura (A: Anchura (µµµµm)m)m)m) L: Longitud (L: Longitud (L: Longitud (L: Longitud (µµµµm)m)m)m) Biovolumen (Biovolumen (Biovolumen (Biovolumen (µµµµmmmm3333)))) 1 0,51 1,0234 0,1743 2 0,50 1,0342 0,1903 3 0,51 1,1091 0,1918 4 0,50 1,0921 0,1817 5 0,49 1,0456 0,1664 6 0,49 1,1001 O,1767 7 0,50 1,1000 0,1833 8 0,50 1,0761 0,1786 9 0,51 1,0345 0,1766 10 0,49 1,0555 0,1682 BiovolumenBiovolumenBiovolumenBiovolumen mediomediomediomedio ((((µµµµmmmm3333/bacteria)/bacteria)/bacteria)/bacteria) 0,17170,17170,17170,1717 BiomasaBiomasaBiomasaBiomasa (µg C/ml) = N * Bv * F BiomasaBiomasaBiomasaBiomasa (µg C/ml) = 4,8 107 bacterias/ml * 0,1717 µm3/bactéria * 164 fg C/µm3 = 1,35161,35161,35161,3516 µµµµmmmm3333/ml/ml/ml/ml LactobacillusLactobacillusLactobacillusLactobacillus Bacterias/campoBacterias/campoBacterias/campoBacterias/campo Vol. FiltradoVol. FiltradoVol. FiltradoVol. Filtrado (ml)(ml)(ml)(ml) Dil.Dil.Dil.Dil. Factor microscopioFactor microscopioFactor microscopioFactor microscopio (campos/filtro)(campos/filtro)(campos/filtro)(campos/filtro) DensidadDensidadDensidadDensidad (bacterias/ml)(bacterias/ml)(bacterias/ml)(bacterias/ml) L. acidophilus 25/32/30/28/33 34/35/29/28/24 15/32/33/18/20 22/18/23/19/26 0,5 10-2 14.520 7,61 107,61 107,61 107,61 107777 L. fermentum 5/12/13/8/13 8/15/9/8/14 15/12/13/8/10 7/8/9/9/6 1 10-3 7.220 7,7,7,7,29292929 101010107777 LactobacillusLactobacillusLactobacillusLactobacillus Longitud (Longitud (Longitud (Longitud (µµµµm)m)m)m) Anchura (Anchura (Anchura (Anchura (µµµµm)m)m)m) Factor de conversión (mg C/Factor de conversión (mg C/Factor de conversión (mg C/Factor de conversión (mg C/µµµµmmmm3333)))) Biomasa (Biomasa (Biomasa (Biomasa (mmmmg Cg Cg Cg C/ml)/ml)/ml)/ml) L. acidophilus 1,7 0,6 0,5490,5490,5490,549 L. fermentum 2 0,4 170 10-10 0,2910,2910,2910,291 3.1. ¿Peso seco (g/ml) de un cultivo de Saccharomyces cerevisiae? 3.2. ¿Biomasa de un cultivo? 3.3. ¿Mayor densidad? Similares ¿Mayor biomasa? L. acidophilusL. acidophilusL. acidophilusL. acidophilus
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  ProfundidadProfundidadProfundidadProfundidad (m)(m)(m)(m) Dil.Dil.Dil.Dil. VolumenVolumenVolumenVolumen Filtrado (l)Filtrado ( l)Filtrado ( l)Filtrado ( l) RecuentosRecuentosRecuentosRecuentos (Bacterias/campo)(Bacterias/campo)(Bacterias/campo)(Bacterias/campo) Bacterias/mlBacterias/mlBacterias/mlBacterias/ml BiovolumenBiovolumenBiovolumenBiovolumen ( m( m( m( m3333/célu/célu/célu/célula)la)la)la) BiomasaBiomasaBiomasaBiomasa ((((µµµµg C/ml)g C/ml)g C/ml)g C/ml) 5555 10-1 100 30/35/40/25/30/ 25/33/25/27/30 9,29 109,29 109,29 109,29 107777 0,15 3,063,063,063,06 25252525 10-1 200 31/25/40/37/20/ 15/32/26/25/31 4,364,364,364,36 101010107777 0,45 4,324,324,324,32 50505050 100 100 31/33/37/43/23/ 34/21/19/26/30 9,209,209,209,20 101010106666 0,47 0,950,950,950,95 MicroorganismoMicroorganismoMicroorganismoMicroorganismo %%%% BiomasaBiomasaBiomasaBiomasa ((((µµµµg C/ml)g C/ml)g C/ml)g C/ml) Medidas (Medidas (Medidas (Medidas (µµµµm)m)m)m) ForForForFormulamulamulamula BiovolumenBiovolumenBiovolumenBiovolumen ( m( m( m( m3333/célula)/célula)/célula)/célula) DensidadDensidadDensidadDensidad ((((bacteriasbacteriasbacteriasbacterias/ml)/ml)/ml)/ml) Lactococcus thermophilus 60 1,81,81,81,8 D = 1,2 ππππDDDD3333/6/6/6/6 0,9048 1,17 101,17 101,17 101,17 108888 Lactobacillus bulgaricus 40 1,21,21,21,2 L = 1,8 A = 0,5 (L(L(L(L ---- A/3)A/3)A/3)A/3) ππππAAAA2222/4/4/4/4 0,3207 2,20 102,20 102,20 102,20 108888 Profundidad (m)Profundidad (m)Profundidad (m)Profundidad (m)DiluciónDiluciónDiluciónDilución 5555 25252525 50505050 10-2 Incontables 500/617/593 363/303/395 10-3 357/452/403 53/67/60 35/30/40 10-4 35/45/40 5/7/6 4/2/5 UFC/mlUFC/mlUFC/mlUFC/ml 4 104 104 104 106666 6 106 106 106 105555 5,5 105,5 105,5 105,5 105555 3.4. ¿Densidad en las diferentes profundidades? Volumen sembrado/placa = 100 µl. ¿Mayor densidad? ¿Biomasa en las diferentes profundidades? Factor del microscopio: 30.954 campos/filtro. Factor de conversión dl volumen en biomasa: 2,2 10-7 gC/ m3 . 3.5. ¿Densidad de Lactococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus en el cultivo mixto preparado? Biomasa del cultivo = 3 mg C/ml. Factor de conversión = 170 10-10 mg C/ml.