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las habilidades de los estudiantes en la aplicación
del diagnóstico diferencial y tratamiento
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médicos más importantes
• Alcance de conocimiento que refleja las últimas
técnicas en las tecnologías de laboratorio y
diagnóstico
• Imágenes y micrografías a todo color
• Resúmenes al final de cada capítulo
• Revisiones de capítulo
Imágenes a todo color que vuelven
realidad los conceptos estudiados
Diagramas que resumen
lo expresado en el texto
Estudio completo de los conceptos
esenciales, como la virología
Éstas son algunas de las razones por las cuales la Microbiología médica de Jawetz,
Melnick & Adelberg es esencial para la preparación de los exámenes de certificación
USMLE:
296 SECCIÓN III Bacteriología
FIGURA 211 Especies del género Actinomyces. A: Colonia de
especies de Actinomyces después de 72 h de cultivo en agar con
infusión de cerebro y corazón, que por lo general produce colonias de
casi 2 mm de diámetro; a menudo se les denomina colonias “de dientes
molares”. (Cortesía de CDC Public Health Image Library, L. Georg.)
B: Gránulo de Actinomyces en tejido con tinción de Brown y Breen.
Aumento original × 400. Los filamentos de los bacilos ramificados son
visibles en la periferia del gránulo. Estos gránulos suelen denominarse
“gránulos de azufre” debido a su color amarillo burdo no teñido.
(Cortesía de CDC Public Health Image Library.) C: Actinomyces
naeslundii en un absceso cerebral teñido con tinción con metilamina
argéntica. Son visibles los bacilos ramificados. Aumento original
× 1000. (Cortesía de CDC Public Health Image Library, L. Georg.)
A
B
C
de gota o microesfera, y a veces formas cocoides o esféricas.
Propionibacterium acnes, a menudo considerado un microor-
ganismo patógeno oportunista, produce la enfermedad del
acné vulgar y se relaciona con diversos trastornos inflamato-
rios. Este microorganismo causa acné cuando produce lipasas
que desdoblan ácidos grasos libres fuera de los lípidos de la piel.
Estos ácidos grasos pueden producir inflamación del tejido que
contribuye a la formación del acné. Además, P. acnes suele ser
una causa de infecciones posoperatorias de heridas quirúrgi-
cas, sobre todo las que implican la inserción de dispositivos,
por ejemplo, infecciones de prótesis articulares, en particular
del hombro, infecciones de derivaciones del sistema nervioso
central, osteomielitis, endocarditis y endoftalmitis. Puesto que
es parte de la microflora cutánea habitual, P. acnes a veces con-
tamina los cultivos de sangre o líquido cefalorraquídeo que se
obtienen al penetrar la piel. Por lo tanto, es importante (pero a
menudo difícil) distinguir un cultivo contaminado de uno que
es positivo y que indica infección.
3. Clostridium. Los clostridios son bacilos grampositivos,
formadores de esporas (capítulo 11).
B. Cocos grampositivos
El grupo de los cocos grampositivos anaerobios ha experi-
mentado una expansión taxonómica muy importante. Muchas
especies de Peptostreptococcus fueron reasignadas a nuevos
géneros como Anaerococcus, Finegoldia y Peptoniphilus. Las
especies que contienen estos géneros, al igual que Peptococ-
cus niger, son miembros importantes de la microflora habitual
de la piel, la cavidad bucal, las vías respiratorias altas, el tubo
digestivo y el aparato genitourinario de la mujer. Los miem-
bros de este grupo son microorganismos patógenos oportunis-
tas y muy a menudo se detectan en infecciones mixtas, sobre
todo de muestras que no se obtienen en forma meticulosa. Sin
embargo, estos microorganismos se han relacionado con infec-
ciones graves como abscesos cerebrales, infecciones pleuro-
pulmonares, fascitis necrosante y otras infecciones profundas
de la piel y los tejidos blandos, infecciones intraabdominales e
infecciones del aparato genital femenino.
PATOGENIA DE LAS INFECCIONES
ANAEROBIAS
Las infecciones causadas por anaerobios suelen deberse a com-
binaciones de bacterias que funcionan en patogenicidad sinér-
gica. Aunque los estudios sobre la patogenia de las infecciones
anaerobias a menudo se han centrado en una sola especie, es
importante reconocer que las infecciones por anaerobios muy a
menudo se deben a varias especies de estos últimos que actúan
en conjunto para producir infección.
B. fragilis es un microorganismo patógeno muy impor-
tante entre los anaerobios que forman parte de la microflora
habitual. La patogenia de la infección por anaerobios se ha
estudiado en forma muy amplia con B. fragilis utilizando un
modelo de rata de infección intraabdominal, que en muchos
aspectos se parece a la enfermedad de los seres humanos. Se
produce una secuencia característica después que se coloca
contenido del colon (que incluye B. fragilis y un anaerobio
Membrane
Membrane
–
–
–
–
Se sintetizan derivados UDP
de NAM y NAG (no se muestra).
El complejo NAM-pentapéptido se
transfiere al fosfato de bactoprenol.
Se unen por medio de enlaces
de pirofosfato.
El UDP transfiere NAG al complejo
bactoprenol-NAM-pentapéptido.
Si se necesita la interposición de pentaglicina,
se crea con moléculas especiales de glicil-tRNA,
pero no con ribosomas. La formación de puentes
ocurre en la membrana.
Adición secuencial de aminoácidos
a UDP-NAM para formar el complejo
NAM-pentapéptido. Se utiliza ATP
para favorecer la reacción,
pero no participan el RNA
y los ribosomas en la formación
de enlaces peptídicos que
unen los aminoácidos.
Los enlaces cruzados entre las cadenas
de peptidoglucano se forman por
transpeptidación (no se muestran).
El transportador bactoprenol se desplaza
a través de la membrana. A medida que
lo hace, pierde un fosfato y se convierte
en fosfato de bactoprenol. Ahora está
preparado para iniciar un nuevo ciclo.
Los transportadores de bactoprenol
transportan las unidades repetidas
del complejo NAG-NAM pentapéptido
a través de la membrana.
El complejo NAG-NAM pentapéptido
se une al extremo en crecimiento
de la cadena de peptidoglucano,
lo que aumenta la longitud de la cadena
en repeticiones de una unidad.
Periplasma
Membrana
Bactoprenol
Bactoprenol Bactoprenol
Citoplasma
L-Ala L-Ala
D-Glu
D-Ala D-Ala
UDP NAM
L-Lys (DAP)
NAM
UDP NAG
Lípido I
Pentapéptido
NAM NAG
Pentapéptido
Bactoprenol
NAM
Lípido II
Pentapéptido
Bactoprenol
UDP
D-Ala
UDP NAM
Pentapéptido
NAG
Cicloserina
Peptidoglucano Peptidoglucano
NAM NAG
Pentapéptido
Pi
A
Bacitracina
Vancomicina
P P P
P P P P
P P
7
2
1
3
3
4
5
6
4
2
8 7
5
6
UMP
B
D Ala
L
Ala
D Ala
Ala
L
D Glu
Ala
DAP
D
D Ala
D Glu
D
DAP
H2N
Ala
D
NAG
L Ala
NAM
•••
•••
•••
D
NAG
•••
NAM
L Ala
Glu
Ala
D
DAP
D
Glu
D
Ala
DAP
Penicilinas
L
L
D
L
Ala
Ala
NAM
NAG
•••
••• •••
•••
NAG NAM
NAG
•••
NAG
•••
NAM
NAM
•••
•••
•••
•••
NAG NAM
L
•••
NAM
•••
NAG
Ala
D
D
GluNH2
GluNH2
Ala
Lys D
D Ala
Lys
(Gly)5
D
Ala
Ala
L
D
L Ala
GluNH2
-GluNH2
D Ala
Lys D
D Ala
Lys
(Gly)5
Ala
L
L
Transpeptidación de Escherichia coli
Transpeptidación de Staphylococcus aureus
H2N
FIGURA 620 A: Síntesis de peptidoglucano. Los pentapéptidos contienen L-lisina en el peptidoglucano de Staphylococcus aureus y
ácido diaminopimélico (DAP) en Escherichia coli. También se muestra la inhibición con bacitracina, cicloserina y vancomicina. Los números
corresponden a seis de las ocho etapas revisadas en el texto. Se ilustra la etapa ocho en B. NAM corresponde a ácido N-acetilmurámico y NAG
a N-acetilglucosamina; UDP, difosfato de uridina. B: Transpeptidación. Reacciones de transpeptidación en la formación de peptidoglucanos de
Escherichia coli y S. aureus. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. ed,
McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, Inc.)
95
400 SECCIÓN IV Virología
DNA virus
Virus del RNA
dsDNA ssDNA
dsDNA (RT)
dsRNA ssRNA (–)
ssRNA (+)
ssRNA (RT)
Asfarviridae Poxviridae
Herpesviridae
Polyomaviridae
Papillomaviridae Adenoviridae
Bunyaviridae
Retroviridae
Arenaviridae
Bornaviridae
Paramyxoviridae
Coronaviridae Arteriviridae Togaviridae Flaviviridae
Orthomyxoviridae Rhabdoviridae
Filoviridae
Caliciviridae
Hepeviridae Astroviridae Picornaviridae
Hepadnaviridae
Reoviridae
Picobirnaviridae
Iridoviridae
Parvoviridae
Circoviridae
100 nm
FIGURA 292 Formas y tamaños relativos de las familias de virus de animales que infectan vertebrados. En algunos diagramas, se representan
ciertas estructuras internas de las partículas. Sólo se incluyen aquellas familias que son patógenas para los seres humanos y se enumeran en
el cuadro 29-1 y se describen en el texto. (Con autorización de van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, et al. [editors]: Virus taxonomy:
Classification and nomenclature of viruses. Seventh report of the International Commmittee of Viruses. Academic Press, 2000).
M_Caroll_4R.indd xi
M_Caroll_4R.indd xi 15/04/16
15/04/16](https://image.slidesharecdn.com/microbiologiamedica-220508174646-3f85e51a/75/Microbiologia-Medica-pdf-12-2048.jpg)
![CAPÍTULO 1 La ciencia de la microbiología 5
CUADRO 12 Características distintivas de los virus,
viroides y priones
Virus Viroides Priones
Microorganismos
intracelulares
obligados
Microorganismos
intracelulares
obligados
Forma anormal
de una proteína
celular
Constan de DNA o RNA
rodeado por una
cápside proteínica
Constan sólo
de RNA; no
tienen cápside
proteínica
Constan sólo
de proteínas;
sin DNA ni
RNA
Reimpreso con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT
(editores): Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 13.
CUADRO 11 Principales enfermedades en seres humanos y animales causadas por priones
Tipo Nombre Causa
Enfermedades por
priones en seres
humanos
Adquiridas Variante de enfermedad de Creutzfeldt-Jakoba
Asociada con la ingestión o inoculación de material infectado por priones
Kuru
Enfermedad iatrógena de Creutzfeldt-Jakobb
Esporádicas Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Se desconoce el origen de la infección
Familiares Gerstmann-Sträussler-Scheinker Asociadas con mutaciones específicas dentro del gen que codifica PrP
Insomnio familiar letal
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
Enfermedades por
priones en animales
Ganado vacuno Encefalopatía espongiforme bovina Contacto con carne y alimento de harina de hueso contaminados
con priones
Ovejas Encefalopatía espongiforme ovina Ingestión de material contaminado con encefalopatía espongiforme ovina
Venados, alces Enfermedad por consunción crónica Ingestión de material contaminado con priones
Visón Encefalopatía transmisible del visón Se desconoce la fuente de la infección
Gatos Encefalopatía espongiforme felinaa
Exposición a carne y alimento de harina de hueso contaminado con priones
PrP, proteína priónica.
a
Vinculado con el contacto con materiales contaminados por encefalopatía espongiforme bovina.
b
Vinculado con materiales biológicos contaminados por priones como injerto de duramadre, trasplante de córnea, hormona del crecimiento humana derivada de cadáver o
instrumentos quirúrgicos contaminados por priones.
Reimpreso con autorización de American Society for Microbiology. Priola SA: How animal prions cause disease in humans. Microbe 2008;3(12):568.
asegurada en el interior de un clon. También es probable que el
alto número de células dentro de los clones ofrezca protección
fisiológica cuando menos a algunos integrantes del grupo. Por
ejemplo, los polisacáridos extracelulares confieren protección
contra algunos elementos potencialmente letales, como los
antibióticos o iones de metales pesados. La gran cantidad de
polisacáridos producidos por el gran número de células den-
tro de un clon permite que las células que están en el interior
sobrevivan al contacto con un elemento letal a una concentra-
ción que aniquilaría a células individuales.
Muchas bacterias utilizan un mecanismo de comunicación
intercelular llamado quórum sensing o sensor de quórum que
regula la transcripción de los genes que participan en diversos
procesos fisiológicos, como bioluminiscencia, transferencia de
plásmidos conjugativos y producción de los factores determi-
nantes de virulencia. La percepción del quórum depende de la
producción de una o más moléculas de señalización difusibles
(p. ej., lactona acetilada de hemosiderina [AHL], denominadas
autoinductores o feromonas que permiten que las bacterias
vigilen su propia densidad poblacional (figura 1-4). Las acti-
vidades de cooperación que conducen a la formación de una
bioplaca son controladas por la percepción del quórum. Es un
ejemplo de conducta multicelular en procariotas.
Una característica que distingue a las procariotas es su
capacidad de intercambio de pequeños paquetes de informa-
ción genética. Esta información es llevada en los plásmidos,
elementos genéticos pequeños y especializados que se pueden
multiplicar en el interior de cuando menos una línea celular
procariótica. En algunos casos, los plásmidos se transfieren
de una célula a otra y, por lo tanto, llevan consigo grupos de
información genética especializada a través de una población.
Algunos plásmidos exhiben un espectro amplio de hospe-
dadores que les permite transmitir grupos de genes a distin-
tos microorganismos. Algunos que despiertan preocupación
particular son los plásmidos de resistencia farmacológica,
que inducen resistencia bacteriana al tratamiento con antimi-
crobianos.
La estrategia de supervivencia de una sola línea celu-
lar procariótica conduce a una variedad de interacciones con
otros microorganismos. Éstas comprenden relaciones simbió-
ticas que llevan a complejos intercambios nutricionales entre
los microorganismos dentro del intestino humano. Estos in-
tercambios benefician tanto a los microorganismos como a sus
hospedadores humanos. Algunas veces las interacciones pa-
rasitarias son nocivas para el hospedador. La simbiosis o el
parasitismo avanzado provocan la pérdida de ciertas funciones
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![6 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
que no permiten el crecimiento del simbionte o parásito inde-
pendientemente de su hospedador.
Por ejemplo, los micoplasmas son parásitos procariotas,
que han perdido la capacidad de sintetizar una pared celular.
La adaptación de estos microorganismos a su ambiente para-
sitario ha tenido como resultado la incorporación de una can-
tidad importante de colesterol en sus membranas celulares. El
colesterol, que no se observa en otras procariotas, es asimi-
lado del ambiente metabólico del hospedador. La pérdida de la
función también se ejemplifica con los parásitos intracelulares
obligados, las clamidias y las rickettsias. Estas bacterias son
muy pequeñas (0.2 a 0.5 μm de diámetro) y dependen de una
célula hospedadora que les suministra metabolitos esenciales
y coenzimas. Esta pérdida de la función se refleja por la pre-
sencia de un cromosoma más pequeño con muy pocos genes
(cuadro 7-1).
Los mejores ejemplos de simbiontes bacterianos son los
cloroplastos y las mitocondrias, que son los organelos especia-
lizados en la producción de energía de las eucariotas. Nume-
rosos datos indican que los antecesores de estos organelos
eran endosimbiontes, es decir, procariotas que establecieron
simbiosis dentro de la membrana celular de un hospedador
eucariótico ancestral. La presencia de múltiples copias de los
organelos quizá contribuyó al tamaño relativamente grande
de las células eucarióticas y a su potencial de especialización,
rasgo que finalmente se ha reflejado en la evolución de los
microorganismos multicelulares diferenciados.
Clasificación de las procariotas
Para comprender cualquier grupo de microorganismos, es
necesario hacer una clasificación. Un buen sistema de cla-
sificación permite al científico elegir las características con
las que se puede catalogar con rapidez y exactitud cualquier
microorganismo nuevo. La categorización permite pronosticar
muchos rasgos adicionales que comparten otros integrantes de
la misma categoría. En el ámbito hospitalario, la clasificación
correcta de un microorganismo patógeno ofrece la vía más
directa para eliminarlo. Asimismo, la clasificación permite
comprender mejor las relaciones entre diferentes microorganis-
mos y esta información tiene un gran valor práctico. Por ejem-
plo, un microorganismo patógeno se podrá eliminar por un
FIGURA 14 Percepción del quórum. (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT (editores):
Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 181).
Célula bacteriana
Cuando hay pocas células,
la concentración de la molécula de
señalización lactona acetilada
de hemosiderina (AHL) es baja.
Cuando hay muchas células,
la concentración de AHL es alta.
Las concentraciones altas de AHL
inducen la expresión de genes específicos.
Molécula
de señalización
tiempo relativamente largo si su hábitat es ocupado por una
variedad no patógena.
En el capítulo 3 se describen los principios de la clasifica-
ción procariótica. Para empezar, es importante reconocer que
cualquier característica procariótica puede servir como criterio
potencial de clasificación. Sin embargo, no todos los criterios
son tan efectivos para agrupar microorganismos. Por ejemplo,
que contenga DNA constituye un criterio inútil para distinguir
los microorganismos puesto que todas las células lo contienen.
La presencia de un plásmido con un espectro amplio de hospe-
dadores no es un criterio útil porque estos plásmidos existen
en distintos hospedadores y no es necesario que existan todo el
tiempo. Los criterios útiles pueden ser estructurales, fisiológi-
cos, bioquímicos o genéticos. Las esporas, estructuras celula-
res especializadas que permiten la supervivencia en ambientes
extremos, son criterios estructurales útiles para la clasificación
porque solo subgrupos bien clasificados de bacterias forman
esporas. Algunos grupos de bacterias se pueden subdividir
con base en su potencial para fermentar ciertos carbohidratos.
Estos criterios son poco efectivos cuando se aplican a otros
grupos bacterianos que carecen de potencial de fermentación.
Existe una prueba bioquímica, la tinción de Gram, que cons-
tituye un criterio efectivo de clasificación porque la respuesta
a la tinción refleja diferencias fundamentales y complejas en la
superficie celular bacteriana que dividen a la mayor parte de las
bacterias en dos grupos principales.
Los criterios genéticos cada vez se utilizan más en la clasi-
ficación bacteriana y muchos de estos adelantos han sido posi-
bles gracias al desarrollo de tecnologías basadas en DNA. En la
actualidad es posible diseñar sondas de DNA o realizar análisis
de amplificación del DNA (p. ej., reacción en cadena de la poli-
merasa [PCR, polymerase chain reaction]) que identifican con
rapidez microorganismos que poseen regiones genéticas espe-
cíficas con un linaje común. Al comparar las secuencias del
DNA de algunos genes se pudieron conocer las relaciones filo-
genéticas entre las procariotas. Es posible encontrar los linajes
celulares ancestrales y agrupar a los microorganismos con base
en sus afinidades evolutivas. Estas investigaciones condujeron
a conclusiones sorprendentes. Por ejemplo, la comparación de
las secuencias del citocromo c sugiere que todos los organismos
eucariotas, incluidos los seres humanos, se originaron a partir
de uno de tres grupos de bacterias fotosintéticas púrpuras. Esta
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![14 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
mismos y un citoesqueleto complejo, compuesto por microtú-
bulos, microfilamentos y filamentos intermedios.
El retículo endoplásmico es una red de conductos limita-
dos por membranas que tienen continuidad con la membrana
del núcleo. Se identifican dos tipos de ER: rugoso, al cual se
unen ribosomas 80S y liso, sin dichos ribosomas (figura 2-3). El
ER rugoso es el principal productor de glucoproteínas y tam-
bién produce nuevo material de membrana que se transporta a
través de la célula; el ER liso participa en la síntesis de lípidos y
en algunos aspectos del metabolismo de los carbohidratos. El
aparato de Golgi consiste en un conjunto de membranas que
funcionan en combinación con el ER para modificar y orga-
nizar productos químicos del retículo endoplásmico que más
tarde serán secretados y aquellos que participan en la produc-
ción de otras estructuras de la membrana celular.
Losplástidosincluyenmitocondriasycloroplastos.Varias
pruebas sugieren que las mitocondrias y cloroplastos son des-
cendientes de microorganismos procariotas antiguos y que se
originaron del englobamiento de células procariotas por célu-
las de mayor tamaño (endosimbiosis). Las mitocondrias tienen
el tamaño de una célula procariota y su membrana, que carece
de esteroles, es mucho menos rígida que la membrana citoplás-
mica de las células eucariotas, las cuales contienen esteroles.
FIGURA 23 Células eucariotas. A: Representación esquemática de una célula animal. B: Representación esquemática de una célula vegetal.
C: micrografía de una célula animal que muestra varias estructuras unidas a la membrana, incluidas mitocondrias y núcleo [figura 2-3 (A) y (B)].
Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT: Microbiology: a Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009.
Figura 2-3 (C) reproducida con autorización de Thomas Fritsche, MD, PhD).
Las mitocondrias contienen dos grupos de membranas. La
membrana más externa es permeable y cuenta con numero-
sos conductos diminutos que permiten el paso de iones y mo-
léculas pequeñas (p. ej., trifosfato de adenosina [ATP, adeno-
sine triphosphate]). La invaginación de la membrana externa
forma un sistema de membranas plegadas internas denomi-
nadas crestas. Las crestas son los sitios donde se encuentran
las enzimas que participan en la respiración y producción de
ATP. También contienen proteínas de transporte específico
que regulan el paso de metabolitos hacia el interior y el exte-
rior de la matriz mitocondrial. Dicha matriz contiene varias
enzimas, en particular aquellas que participan en el ciclo del
ácido cítrico. Los cloroplastos son organelos celulares fotosin-
téticos capaces de convertir la energía de la luz solar a energía
química por medio de la fotosíntesis. La clorofila y todos los
demás componentes necesarios para la fotosíntesis se ubican
en una serie de discos aplanados de la membrana denomina-
dos tilacoides. El tamaño, forma y número de cloroplastos por
célula varía notablemente; a diferencia de las mitocondrias,
los cloroplastos por lo general son mucho más grandes que las
células procariotas. Las mitocondrias y cloroplastos contienen
su propio DNA, el cual se encuentra en forma circular cerrada
por medio de enlaces covalentes y codifica algunas proteínas
Membrana
celular
Mitocondria
Núcleo
Membrana
nuclear
1 μm
A
B
C
Complejo
de Golgi
Citoesqueleto
Filamentos
de actina
Microtúbulos
Filamentos
intermedios
Retículo
endoplásmico
liso
Envoltura nuclear
Nucléolo
Núcleo
Citoplasma
Pared celular
de la célula
adyacente
Cloroplasto (abierto
para mostrar los tilacoides)
Peroxisoma
Vacuola
central
Lisosoma
Ribosomas
Mitocondrias
Retículo
endoplásmico
rugoso
Membrana
plasmática
Pared
celular
Complejo de Golgi
Citoesqueleto
Filamentos
de actina
Microtúbulo
Filamento
intermedio
Retículo
endoplásmico
liso
Cubierta
nuclear Nucléolo
Núcleo
Citoplasma
Membrana
plasmática
Peroxisoma
Lisosoma
Ribosoma
Mitocondrias
Retículo
endoplásmico
rugoso
Centríolo
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![16 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
primeras no cuentan con un aparato similar al huso mitótico.
La región nuclear (figura 2-6) está llena de fibrillas de DNA. El
nucleoide de la mayor parte de las células bacterianas consiste
en una molécula circular única y continua, que varía en tamaño
de 0.58 a casi 10 millones de pares de bases. Sin embargo, unas
cuantas bacterias han demostrado poseer dos, tres o incluso
cuatro cromosomas diferentes. Por ejemplo, Vibrio cholerae y
Brucella melitensis tienen dos cromosomas distintos. Hay dos
excepciones a esta regla de material genético circular porque
algunas células procariotas (Borrelia burgdorferi y Streptomy-
ces coelicolor) han mostrado poseer cromosomas lineales.
En las bacterias, el número de nucleoides y por lo tanto
el número de cromosomas, depende de las condiciones de
B
A
Cabeza del rayo
Brazo externo
de dineína
Brazo interno
de dineína
Rayo
Vínculo
de nexina
Vaína central
Subtúbulo B
Subtúbulo A
Microtúbulo
central
Microtúbulo
doble
FIGURA 25 Estructura de cilios y flagelos. A: Micrografía electrónica de un corte transversal de un cilio. Obsérvense los dos microtúbulos
centrales rodeados por nueve dobletes de microtúbulos (160000×). (Reproducida de KG Murti/Visuals Unlimited) B: Diagrama de la estructura de
cilios y flagelos. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [eds]: Prescott, Harley, and Klein’s Microbiology, 7a. ed.
Nueva York: McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Will Companies, Inc.)
FIGURA 26 Nucleoide. A: Microfotografía electrónica de transmisión resaltada con color de una Escherichia coli con su DNA en rojo. (© CNRI/
SPL/Photo Researchers, Inc.) B: Cromosoma liberado de una célula de E. coli que fue lisada con delicadeza. Obsérvese qué tan comprimido debe
encontrarse el DNA dentro de la bacteria. (© Dr. Gopal Murti/SPL/Photo Researchers).
proliferación. Las bacterias con rápido crecimiento tienen
nucleoides más grandes por célula que las de crecimiento lento;
sin embargo, cuando se presentan múltiples copias, todas son
similares (es decir, las células procariotas son haploides).
Estructuras citoplásmicas
Las células procariotas carecen de plástidos autónomos, como
las mitocondrias y cloroplastos; las enzimas de transporte de
electrones se localizan en la membrana citoplásmica. Los pig-
mentos fotosintéticos (carotenoides, bacterioclorofila) de bac-
terias fotosintéticas se encuentran contenidos en sistemas de
membranas intracitoplásmicas de varias morfologías. Las ve-
0.5 μm
A
B
Fibras de DNA
Célula rota
Membrana
apter 02_Carroll_4R.indd 16
apter 02_Carroll_4R.indd 16 14/04/16
14/04/16](https://image.slidesharecdn.com/microbiologiamedica-220508174646-3f85e51a/75/Microbiologia-Medica-pdf-29-2048.jpg)
![22 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
Las vías de secreción de tipos I y III son independientes
de sec y por lo tanto no incluyen el procesamiento del extremo
aminoterminal de las proteínas secretadas. La secreción de pro-
teínas por estas vías ocurre en forma de un proceso continuo
sin la presencia de un intermediario citoplásmico. La secreción
de tipo I se ejemplifica con la hemolisina α de E. coli y la ade-
nilil-ciclasa de la Bordetella pertussis. La secreción de tipo I
requiere de tres proteínas secretoras: un casete de unión a ATP
en la membrana interna (transportador ABC), que proporciona
energía para la secreción de proteínas; una proteína de mem-
brana externa y una proteína de difusión de membrana, que se
encuentra fija a la membrana interna y abarca la totalidad del
espacio periplasmático (figura 2-13). En lugar del péptido de
señalización, la información se ubica en los 60 aminoácidos del
extremo carboxilo terminal de la proteína secretada.
La vía de secreción de tipo III es un sistema dependiente
del contacto, que se activa por el contacto con una célula del
hospedador y a continuación se inyecta una proteína tóxica
directamentealacélulahospedadora.Elaparatodesecreciónde
tipo III está compuesto por casi 20 proteínas, la mayor parte
de las cuales se ubican al nivel de la membrana interna. La
mayor parte de estos componentes de la IM son homólogos al
aparato de biosíntesis flagelar de las bacterias grampositivas y
gramnegativas. Al igual que la secreción de tipo I, las proteínas
secretadas por la vía de tipo III no son objeto de procesamiento
en el extremo amino terminal durante su secreción.
La vía de tipo IV secreta toxinas polipeptídicas (dirigidas
contra células eucariotas) o complejos de proteína-DNA ya sea
entre dos células bacterianas o entre una célula bacteriana y
una célula eucariota. Un ejemplo de la secreción de tipo IV
Proteína
Citoplasma
Espacio
periplásmico
YscJ
Yop
Chaperona
Chaperona
Tat
PulS
SecD
EFGY
Sec
ATP ATP
ATP
ADP
+ Pi
ATP
ADP
+ Pi
ATP
ADP
+ Pi
ATP
ADP
+ Pi
ADP
+ Pi
Membrana
plasmática
TolC
Exterior de la célula
Tipo I Tipo III Tipo II Tipo V Tipo IV
Membrana
exterior
FIGURA 213 Sistemas de secreción de proteínas de bacterias gramnegativas. Se muestran cinco sistemas de secreción de las bacterias
gramnegativas. Las vías dependientes de Sec y Tat suministran proteínas del citoplasma al espacio periplásmico. Los sistemas de tipos II, V
y en ocasiones el IV completan el proceso de secreción por una vía dependiente de Sec. El sistema Tat parece suministrar proteínas sólo a la
vía de tipo II. Los sistemas de tipos I y III evitan las vías dependientes de Sec y Tat, desplazando proteínas directamente del citoplasma a través
de la membrana externa y hacia el espacio extracelular. El sistema de tipo IV puede trabajar ya sea con una vía dependiente de Sec o puede
trabajar sola para transportar proteínas al espacio extracelular. Las proteínas translocadas por la vía dependiente de Sec y la vía de tipo III
son suministradas a estos sistemas por proteínas chaperonas. ADP, adenosin difosfato; ATP, adenosin trifosfato; EFGY; PulS; SecD, TolC; Yop.
(Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [eds]: Prescott, Harley, and Klein’s Microbiology, 7a. ed. Nueva York:
McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Will Companies, Inc.)
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![CAPÍTULO 2 Estructura celular 25
de dicho aminoácido (figura 6-19). Los mutantes bacterianos
que son bloqueados antes de la síntesis de ácido diaminopi-
mélico por lo común proliferan de forma normal cuando se
encuentra dicho ácido en su entorno; cuando se administra
L-glicina sola se destruyen, porque continúan proliferando
pero son específicamente incapaces de sintetizar nuevo pepti-
doglucano para su pared celular.
El hecho de que las cadenas de peptidoglucanos tengan
enlaces cruzados significa que cada capa de peptidoglucanos
tiene una sola molécula gigante. En una bacteria grampositiva
hay hasta 40 hojas de peptidoglucanos, lo que constituye hasta
50% del material de la pared celular; en las bacterias gramne-
gativas parece haber sólo una o dos hojas, lo que constituye 5
a 10% del material de la pared. La bacteria adquiere su forma,
que es característica para cada especie en particular, por la
estructura de su pared celular.
B. Componentes especiales de las paredes celulares
de bacterias grampositivas
La mayor parte de las paredes celulares de las bacterias gram-
positivas contienen cantidades considerables de ácidos tei-
coico y teicurónico, los cuales pueden constituir hasta 50% del
peso seco de la pared y 10% del peso seco de la totalidad de
la célula. Además, algunas paredes de bacterias grampositivas
pueden contener moléculas de polisacáridos.
1. Ácidos teicoico y teicurónico. El término ácido tei-
coico abarca la totalidad de la pared celular, membrana o polí-
meros capsulares que contienen glicerofosfato o residuos de
O
O
CH2
CH2
CH2
CH2
O
O R
C
H
O R
C
H
A
O
O–
O–
P
O
O P
O
O
O–
O P
Espacio
periplásmico
Peptidoglucano
Membrana
plasmática
Ácido lipoteicoico
Ácido teicoico
B
FIGURA 216 A: Estructura del ácido teicoico. Segmento de ácido teicoico constituido por fosfato, glicerol y una cadena lateral, R. R puede
representar a D-alanina, glucosa u otras moléculas. B: Ácidos teicoico y lipoteicoico de una envoltura de una bacteria grampositiva. (Reproducida
con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [eds]: Prescott, Harley, and Klein’s Microbiology, 7a. ed. Nueva York: McGraw-Hill; 2008.)
ribitol fosfato. Estos polialcoholes están conectados por enla-
ces fosfodiéster y por lo común se encuentran unidos con
otros carbohidratos y con d-alanina (figura 2-16A). Como tie-
nen carga negativa, el ácido teicoico es en parte la causa de la
carga negativa de la superficie celular en su conjunto. Hay dos
tipos de ácidos teicoico: ácido teicoico de la pared (WTA, wall
teichoic acid) que tiene unión covalente con los peptidogluca-
nos y ácido teicoico de la membrana que tiene unión covalente
con glucolípidos de la membrana. Como estos últimos tienen
asociación estrecha con los lípidos, también se han denomi-
nado ácidos lipoteicoicos (LTA, lipoteichoic acids). En con-
junto con los peptidoglucanos, WTA y LTA constituyen una
red polianiónica o matriz que proporciona funciones relacio-
nadas con la elasticidad, porosidad, fuerza tensil y propiedades
electrostáticas de la envoltura. No todas las bacterias grampo-
sitivas tienen LTA y WTA convencionales, pero aquellas que
carecen de tales polímeros por lo común son similares desde el
punto de vista funcional.
La mayor parte de los ácidos teicoicos contienen grandes
cantidades de d-alanina, por lo común unida a la posición 2 o
3 del glicerol o a la posición 3 o 4 del ribitol. En algunos áci-
dos teicoicos más complejos la d-alanina se une a uno de los
residuos de azúcar. Además de la d-alanina, otros sustitutos
pueden unirse a los grupos hidroxilo libres del glicerol y ribitol
(por ejemplo, glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina, N-ace-
tilgalactosamina o succinato). Una especie dada puede tener
más de un tipo de azúcar sustituto además de la d-alanina; en
tales casos, no se sabe si los diferentes carbohidratos se presen-
tan en la misma molécula o en moléculas separadas de ácido
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![28 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
hierro-sideróforo. Muestran gran afinidad por sus sustratos y
probablemente actúen como sistemas de transporte en forma
de acarreadores clásicos de la membrana citoplásmica. Para el
funcionamiento correcto de estas proteínas se requiere energía
acoplada a través de una proteína denominada TonB. Las pro-
teínas menores adicionales incluyen un número limitado de
enzimas, entre ellas las fosfolipasas y proteasas.
En la figura 2-17 se muestra la topología de las principa-
les proteínas de la membrana externa, basada en estudios de
enlaces cruzados y análisis de relaciones funcionales. La mem-
brana externa se conecta a la capa de peptidoglucanos y a la
membrana citoplásmica. La conexión con la capa de peptido-
glucanos está mediada principalmente por lipoproteínas de la
membrana externa (véase adelante). Casi una tercera parte de
las moléculas de lipoproteínas tienen enlace covalente con los
peptidoglucanos y ayudan a mantener las estructuras juntas.
Una asociación no covalente de algunas de las porinas en la
capa del peptidoglucano desempeña una función menor en
conectar las membranas externas con esta estructura. Las pro-
teínas de la membrana externa se sintetizan en los ribosomas
unidos a la superficie citoplásmica de la membrana celular; sin
embargo, aún se desconoce la forma en que se transfieren a la
membrana externa, una hipótesis sugiere que la transferencia
Glc NAG
Gal
Gal
Glc
Hep
Hep P
P
P
P
P Etanolamina
KDO
KDO KDO Etanolamina
Polisacárido central
Lípido A
Ácido graso
Man Abe
Rha
Gal
Man Abe
Rha
Gal
n
Lado O de
la cadena
A B
GlcN GlcN
ocurre en zonas de adhesión entre las membranas citoplásmica
y externa, lo que puede observarse en la microscopia electró-
nica. Por desgracia, se ha demostrado que es difícil obtener evi-
dencias firmes de la adhesión a tales áreas.
2. Lipopolisacáridos (LPS). Los LPS de las paredes celu-
lares de bacterias gramnegativas consisten en un glucolípido
complejo, denominado lípido A, el cual está unido a un polisa-
cárido constituido por una porción central y series terminales
de unidades repetidas (figura 2-19A). El lípido A se encuentra
embebido en la hoja externa de la membrana a la cual se unen
los LPS. Estos últimos se sintetizan en la membrana citoplás-
mica y se transportan a su posición exterior final. La presencia
de LPS es necesaria para la función de muchas proteínas de la
membrana externa.
El lípido A consiste en unidades de disacárido de glucosa-
mina fosforilada a la cual se unen varios ácidos grasos de cadena
larga (figura 2-19). El ácido β-hidroximirístico es un ácido graso
de 14 carbonos que siempre está presente y es característico de
este lípido; los otros ácidos grasos, junto con sus grupos sustitu-
tos de fosfatos, varían de acuerdo al género bacteriano.
En la figura 2-19A y B se muestra la región central del
polisacárido; éste es similar en la mayor parte de los géneros de
FIGURA 219 Estructura de los lipopolisacáridos. A: Lipopolisacárido de Salmonella. Este esquema ligeramente simplificado ilustra una
forma de lipopolisacárido (Abe, abecuosa; Gal, galactosa; GlcN, glucosamina; Hep, heptulosa; KDO, 2-ceto-3 desoxioctonato; Man, manosa;
NAG, N-acetilglucosamina; P, fosfato; Rha, L-ramnosa). El lípido A se encuentra sepultado en la membrana externa. B: Modelo molecular de
lipopolisacárido de Escherichia coli. El lípido A y los polisacáridos centrales tienen una disposición recta; el lado O de la cadena se encuentra
doblado en ángulo en este modelo. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [eds]: Prescott, Harley, & Klein’s
Microbiology, 7a. edition, McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Will Companies, Inc.)
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![36 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
los factores más significativos. La esporulación ocurre masiva-
mente en cultivos que han terminado su crecimiento exponen-
cial como consecuencia del casi agotamiento de los nutrientes.
La esporulación implica la producción de muchas estruc-
turas, enzimas y metabolitos nuevos junto con la desaparición
de varios componentes de la célula vegetativa. Estos cambios
representan un verdadero proceso de diferenciación; se acti-
va una serie de genes cuyos productos determinan la forma-
ción y composición final de la espora. Tales cambios implican
alteraciones en la especificidad transcripcional de la poli-
merasa de RNA, que depende de la asociación de la proteína
central de polimerasa con una u otra proteína promotora espe-
cífica denominada factor sigma. Durante el crecimiento vege-
tativo, predomina un factor sigma designado como σA
. Más
tarde, durante la esporulación se forman otros cinco factores
sigma que causan la expresión de varios genes de la espora a
diferentes tiempos en ubicaciones específicas.
La secuencia de eventos en la esporulación es sumamente
compleja: la diferenciación de una célula vegetativa de B. sub-
tilis en una endospora tarda casi 7 h en condiciones de labo-
ratorio. Distintos eventos clínicos y morfológicos ocurren en
etapas secuenciales del proceso. Se han identificado siete etapas
diferentes.
Desde el punto de vista morfológico, la esporulación inicia
con la formación de un filamento axil (figura 2-27). El proceso
continúa con el plegamiento de la membrana de forma que se
produce una doble membrana cuyas superficies corresponden
a la superficie de síntesis de la pared celular de la envoltura
celular. Los puntos de crecimiento se desplazan de manera
progresiva hacia el polo de la célula de forma que pueda englo-
bar la espora en formación.
Las dos membranas de la espora inician la síntesis activa de
capas especiales que formarán la envoltura celular: la pared
de la espora y la corteza que se encuentran fuera de las mem-
branas en aposición. En el nuevo citoplasma aislado muchas
enzimas de la célula vegetativa sufren degradación y son sus-
tituidas por un grupo de constituyentes singulares para la
espora.
B. Propiedades de las endosporas
1. Región central. La región central es el protoplasto de la
espora. Contiene un núcleo completo (cromosomas), todos los
componentes del aparato de síntesis de proteínas y el sistema
productor de energía que depende de la glucólisis. Se carece de
citocromos incluso en especies aerobias y por lo tanto las esporas
dependen de una vía de transporte de electrones acortada que
incluye flavoproteínas. Varias enzimas de células vegetativas se
incrementan en cantidad (p. ej., alanina racemasa) y se forman
varias enzimas singulares (p. ej., sintetasa de ácido dipicolí-
nico). Las esporas no contienen nucleótidos de piridinas redu-
cidos o ATP. La energía para la germinación se almacena en
forma de 3-fosfoglicerato en lugar de almacenarse como ATP.
La resistencia al calor de las esporas se debe en parte a su
estado de deshidratación y a la presencia de grandes cantidades
de dipicolinato cálcico en la región central (5 a 15% del peso
seco de la espora) que se forma a partir de un intermediario de
la vía biosintética de glicina (figura 6-19). En alguna forma que
aún no se comprende por completo, estas propiedades causan
la estabilización de las enzimas de la espora, la mayor parte
de las cuales muestran labilidad normal al calor cuando se aís-
lan en forma soluble.
2. Pared de la espora. La capa más interna que rodea la
membrana interna de la espora se denomina pared de la espora.
Contiene peptidoglucano normal y se convierte en la pared
celular de la célula vegetativa en germinación.
3. Corteza. Es la capa más gruesa de la envoltura de la
espora. Contiene un tipo inusual de peptidoglucano, con
muchos menos enlaces cruzados de los que se encuentran en
FIGURA 226 Células en esporulación del género bacilos. A: Bacilos no identificados provenientes del suelo. B: Bacillus cereus. C: Bacillus
megaterium. (Reproducida con autorización de Robinow CF, Structure. En Gunsalus IC, Stanier RY [eds]. The Bacteria: A Treatise on Structure and
Function. Vol 1. Academic Press, 1960.)
A B C
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![CAPÍTULO 2 Estructura celular 37
el peptidoglucano de la pared celular. El peptidoglucano de la
corteza es extremadamente sensible a las lisozimas y su autóli-
sis participa en la germinación de la espora.
4. Cubierta. La cubierta se compone de proteínas simila-
res a la queratina que contienen muchos enlaces disulfuro
intramoleculares. La impermeabilidad de esta capa confiere
a las esporas su relativa resistencia a los agentes químicos
antibacterianos.
5. Exosporio. El exosporio está compuesto por proteínas,
lípidos y carbohidratos. Consiste de una capa basal paracris-
talina y una región externa con aspecto piloso. La función del
exosporio es poco clara. Las esporas de algunos microorganis-
mos del género Bacillus (p. ej., B. anthracis y B. cereus) poseen
un exosporio, en tanto que microorganismos de otros géne-
ros (p. ej., B. atrophaeus) poseen esporas que carecen de esta
estructura.
C. Germinación
El proceso de germinación ocurre en tres etapas: activación,
inicio y retoño.
1. Activación. La mayor parte de las endosporas no pueden
germinar de inmediato después de su formación. Pueden ger-
minar después de que han permanecido en reposo por varios
FIGURA 227 Etapas de la formación de endosporas. (Reproducida con autorización de Merrick MJ: Streptomyces. En: Parish JH [ed].
Developmental Biology of Procaryotes. Univ California Press, 1979.)
Pared celular
Corteza
Pared celular
germinativa
Cubierta
de la espora
Espora
Espora
madre
DNA
Formación
del filamento axial
Englobamiento de la preespora
Depósito de la cubierta
Maduración
Destrucción
de la célula
madre
Síntesis de la corteza
Formación del tabique
de la preespora
0 1
2
3
4
5
6
7
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![CAPÍTULO 2 Estructura celular 41
(D) Nucleoide
(E) Positivo con la tinción de Feulgen
9. El lisosoma parte el enlace β1→4 entre:
(A) d-alanina y el puente de pentaglicina
(B) Ácido N-acetilmurámico y d-alanina
(C) Lípido A y KDO
(D) Ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina
(E) d-Alanina y d-alanina
10. ¿De cuáles de los componentes siguientes carecen las especies de
Mycoplasma?
(A) Ribosomas
(B) Membrana plasmática
(C) Tanto DNA como RNA
(D) Lípidos
(E) Peptigloglicano
Economou A, Christie PJ, Fernandez RC, Palmer T, Plano GV, Pug-
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Respuestas
1. C
2. A
3. D
4. C
5. B
6. B
7. C
8. B
9. D
10. E
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![56 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
importante, como las proteínas, o al determinar el volumen
ocupado por células establecidas fuera de la suspensión.
CRECIMIENTO EXPONENCIAL
Constante de la tasa de crecimiento
Las tasa de crecimiento de células ilimitado por nutriente es: la
tasa de crecimiento (medida en gramos de biomasa producidos
por hora) es el producto del tiempo (t), la constante de la tasa
de crecimiento (k) y la concentración de la biomasa B:
=
t
kB
dB
d
(1)
El despeje de la ecuación 1 demuestra que la constante de
la tasa de crecimiento es la tasa a la cual las células producen
más células:
=
k
t
Bd
dB
(2)
Una constante de la tasa de crecimiento de 4.3 h−1
, una de
las más altas registradas, indica que cada gramo de células pro-
duce 4.3 g de células por hora durante este periodo de incre-
mento. Organismos que crecen con más lentitud pueden tener
constantes de tasas de crecimiento tan bajas como 0.02 h−1
. Con
este valor de k, cada gramo de células en el cultivo produce 0.02
g de células por hora.
La integración de la ecuación 2 es igual a :
= = −
B
B
B
B
k t t
ln 2.3 log ( )
1
0
10
1
0
1 0 (3)
El logaritmo natural del cociente entre B1
(la biomasa en
el tiempo 1 [t1
]) y B0
(la biomasa en el tiempo cero [t0
]) es igual
al producto de la constante de la tasa de crecimiento (k) y la
diferencia de tiempo (t1
− t0
). El crecimiento que obedece a la
ecuación (3) se denomina exponencial debido a que la biomasa
se incrementa de esta forma respecto al tiempo. Para obtener
correlaciones lineales de crecimiento exponencial se debe gra-
ficar el logaritmo de la concentración de biomasa (B) como una
función del tiempo (t).
Cálculo de la constante de la tasa de
crecimiento y predicción de la magnitud
de crecimiento
Las bacterias se reproducen por fisión binaria; el tiempo
promedio requerido para que la población, o la biomasa, se
duplique se conoce como tiempo de generación o tiempo de
duplicación (td
). Por lo general, el td
se determina graficando la
cantidad de crecimiento en una escala semilogarítmica como
una función del tiempo; el tiempo necesario para duplicar la
biomasa es el td
(figura 4-1). La constante de la tasa de creci-
miento puede deducirse a partir del tiempo de duplicación,
sustituyendo el valor 2 por B1
/B0
y td
por t1
− t0
en la ecuación
3, lo cual es igual a:
=
=
kt
k
t
ln2
ln2
d
d
(4)
Un tiempo de duplicación rápido corresponde a una
elevada constante de la tasa de crecimiento. Por ejemplo, un
tiempo de duplicación de 10 min (0.17 h) corresponde a valor
de k de 4.1 h−1
. Un tiempo de duplicación de 35 h (relativa-
mente largo) indica una constante de la tasa de crecimiento
de 0.02 h−1
.
La constante de la tasa de crecimiento resultante puede
utilizarse para calcular la cantidad de crecimiento que ocurrirá
en un periodo específico o para prever el tiempo necesario para
un crecimiento determinado.
El crecimiento en un lapso específico se puede pronosticar
con base en el siguiente despeje de la ecuación 3:
=
−
B
B
k t t
log
( )
2.3
10
1
0
1 0
(5)
FIGURA 41 Gráfica de biomasa contra tiempo de duplicación,
que muestra el crecimiento exponencial lineal que ocurriría en un
sistema cerrado. La biomasa (B) aumenta al doble con cada tiempo de
duplicación (td
).
td 2td 3td 4td
Tiempo de duplicación (td)
1
2
4
Biomasa
(B)
8
16
CUADRO 41 Ejemplo de un recuento de células
viables
Dilución Conteo en placaa
Sin diluir Incontable
10−1
Incontable
10−2
510
10−3
72
10−4
6
10−5
1
a
Cada recuento es el promedio de tres réplicas.
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![62 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
Compuestos de amonio
cuaternario R1
N
R3
R2
R4
X–
+ Desinfección, antisepsia y preservación
Agente Fórmula Usos
Cetrimida
H3C CH3
H3C C0H2n+1
N Br
+
–
Desinfección, antisepsia y preservación
Cloruro de benzalconio
CH2 CH3
H3C C0H2n+1
N Cl
+
–
Fase de vapor
Óxido de etileno
H2C CH2
O
Esterilización y desinfección
Formaldehído
H
H
C O
Peróxido de hidrógeno H2
O2
CUADRO 43 Algunos biocidas comunes que se utilizan para antisepsia, desinfección, preservación y otros
propósitos (continuación)
células hay enzimas portadoras de grupos sulfhidrilo y por lo
tanto los agentes oxidantes y los metales pesados generan daño.
Daño al DNA
Un número de agentes físicos y químicos actúan dañando el
ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid); entre
éstos se encuentran las radiaciones ionizantes, la luz ultravio-
leta y las sustancias químicas que reaccionan con el DNA. En
la última categoría están los agentes alquilantes y otros com-
puestos que reaccionan de manera covalente con las purinas
y las pirimidinas para formar compuestos de DNA o enlaces
cruzados entre las cadenas. La radiación puede dañar al DNA
de muchas maneras; la luz ultravioleta, por ejemplo, induce
entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes que permite la
formación de dímeros pirimídicos, ya sea en una de las cadenas
o entre ambas; las radiaciones ionizantes producen roturas en
cadenas individuales o en moléculas bicatenarias. Las lesiones
del DNA inducidas por radiaciones o por medios químicos
matan a las células en primera instancia al interferir con la
replicación del DNA. En el capítulo 7 se revisan los sistemas
de reparación del DNA.
Antagonismo químico
El antagonismo químico ocurre cuando un agente inter-
fiere en la reacción normal entre una enzima específica y su
sustrato. El agonista actúa al combinarse con alguna parte de
la holoenzima (la apoenzima [región proteínica de la holoen-
zima], el activador mineral o la coenzima), con lo que se impide
la adhesión del sustrato normal. En este caso el término sus-
trato se utiliza en sentido general para incluir casos en los que
el inhibidor se combina con la apoenzima, impidiendo de esta
manera la adhesión a la coenzima.
Un antagonista se combina con una enzima gracias a su
afinidad química por un sitio esencial en la última. Las enzi-
mas realizan su función catalítica por su afinidad a sus sustra-
tos naturales; por lo tanto un compuesto que se asemeja a un
sustrato en términos estructurales esenciales también puede
tener afinidad por la enzima. Si esta afinidad es lo suficien-
temente grande, el “análogo” desplazará al sustrato normal e
impedirá que ocurra la reacción adecuada.
Muchas holoenzimas incluyen un ion mineral que actúa
como puente entre la enzima y la coenzima o entre la enzima
y el sustrato. Los agentes químicos que se combinan con facili-
dad con estos minerales impiden la adhesión de la coenzima o
del sustrato (p. ej., el monóxido de carbono y el cianuro se com-
binan con el átomo de hierro de las enzimas que contienen gru-
pos hemo e impiden su función en el proceso de la respiración).
Los antagonistas químicos pueden dividirse en: a) anta-
gonistas de procesos generadores de energía y b) antagonistas
de procesos biosintéticos. Los primeros incluyen venenos que
afectan a enzimas respiratorias (monóxido de carbono y cia-
nuro) y la fosforilación oxidativa (dinitrofenol). Los últimos
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![69
5
Cultivo de microorganismos
C A P Í T U L O
El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al
proporcionarles un entorno apropiado. Los microorganismos
en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan los
elementos presentes en su composición química. Los nutrien-
tes deben proporcionar estos elementos en una forma que
sea accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los
microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar
macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a
través de sus membranas. Los factores que deben controlarse
durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura,
aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio.
NECESIDADES PARA EL CRECIMIENTO
La mayor parte del peso seco de los microorganismos es mate-
ria orgánica que contiene elementos como carbono, hidrógeno,
nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre. Además, se necesitan iones
inorgánicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcio y clo-
ruro para facilitar los procesos enzimáticos y mantener los gra-
dientes químicos a través de la membrana celular.
En su mayor parte, la materia orgánica consiste en macro-
moléculas formadas por enlaces anhidro entre los bloques de
construcción. La síntesis de enlaces anhidro requiere energía
química, que es proporcionada por dos enlaces fosfodiéster
contenidos en el trifosfato de adenosina (ATP, adenosine tri-
phosphate [capítulo 6]). La energía adicional necesaria para
mantener la composición citoplásmica relativamente constante
durante la proliferación se deriva de la fuerza motriz protó-
nica, que consiste en energía potencial que puede derivarse del
paso de protones a través de una membrana. En células euca-
riotas, la membrana puede ser parte de las mitocondrias o de
los cloroplastos. En células procariotas, la membrana corres-
ponde a la membrana citoplásmica de la célula.
La fuerza motriz protónica es un gradiente electroquímico
con dos componentes: una diferencia en pH (concentración
de iones de hidrógeno) y diferencia en la carga iónica. La
carga en el exterior de la membrana bacteriana es más positiva
que en el interior, y la diferencia en las cargas contribuye a
la liberación de energía libre cuando un protón entra al cito-
plasma desde fuera de la membrana. El proceso metabólico
que genera la fuerza motriz protónica se revisa en el capítulo
6. La energía libre puede utilizarse para el desplazamiento de
la célula, para mantener los gradientes iónicos o moleculares
a través de la membrana, para sintetizar enlaces anhidro en
el ATP o para diversos propósitos combinados. Asimismo, la
célula puede utilizar una fuente de ATP con sus enlaces anhi-
dro de energía para crear una fuerza motriz protónica que a
su vez puede utilizarse para desplazar la célula y conservar los
gradientes químicos.
Para su desarrollo, un microorganismo requiere todos los
elementos en su materia orgánica y cantidades adecuadas de
iones para la producción de energía y reacciones catalíticas.
Además, debe haber una fuente de energía para establecer la
fuerza motriz protónica y permitir la síntesis de macromo-
léculas. Los microorganismos varían de manera amplia en sus
demandas nutricionales y sus fuentes de energía metabólica.
FUENTES DE ENERGÍA METABÓLICA
Los tres mecanismos principales para la generación de energía
metabólica son fermentación, respiración y fotosíntesis. Para
el desarrollo del microorganismo debe utilizarse al menos uno
de estos mecanismos.
Fermentación
La formación de ATP en la fermentación no se acopla con la
transferencia de electrones. La fermentación se caracteriza por
la fosforilación del sustrato, un proceso enzimático en el cual
los enlaces de pirofosfato se donan directamente al difosfato de
adenosina (ADP, adenosine diphosphate) por un intermediario
metabólico fosforilado. El intermediario fosforilado se forma
por procesos metabólicos de sustrato susceptibles de fermenta-
ción como la glucosa, lactosa o arginina. La fermentación no se
acompaña de cambios en el estado general de oxidación-reduc-
ción del sustrato fermentable y por lo tanto la composición ele-
mentaldelosproductosdefermentacióndebeseridénticaalade
los sustratos. Por ejemplo, la fermentación de una molécula
de glucosa (C6
H12
O6
) por la vía de Embden-Meyerhof (capítu-
lo 6) produce una ganancia neta de dos enlaces de pirofosfato
en el ATP y produce dos moléculas de ácido láctico (C3
H6
O3
).
Respiración
La respiración es análoga a los procesos de acoplamiento
dependientes de energía para descargar una batería. La reduc-
ción química de un oxidante (aceptor de electrones) a través
de una serie específica de transportadores de electrones en la
membrana establece la fuerza motriz protónica a través de
la membrana bacteriana. El reductor (donador de electrones)
puede ser un compuesto orgánico o inorgánico (p. ej., el ácido
láctico actúa como reductor en algunos microorganismos, en
tanto que el gas hidrógeno es reductor para otros). A menudo
se utiliza oxígeno gaseoso (O2
) como oxidante, pero algunos
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![CAPÍTULO 5 Cultivo de microorganismos 73
extractos celulares. Los microorganismos comparten con las
plantas y animales la respuesta al golpe de calor, que consiste
en la síntesis transitoria de un grupo de “proteínas de golpe de
calor” cuando se exponen a incrementos súbitos en la tempe-
ratura por arriba de la temperatura óptima de proliferación.
Tales proteínas parecen ser inusualmente resistentes a la tem-
peratura y estabilizan a proteínas celulares sensibles al incre-
mento térmico.
La relación de la tasa de proliferación con la temperatura
para cualquier microorganismo dado se observa en el gráfico
típico de Arrhenius (figura 5-3). Arrhenius demostró que el
logaritmo de la velocidad de cualquier reacción química (log
k) es una función lineal del recíproco de la temperatura (1/T);
como el crecimiento celular es consecuencia de un grupo de
reacciones químicas, cabría esperar que se observe esta rela-
ción. En la figura 5-3 se muestra el caso de temperaturas por
arriba de intervalos normales para una especie dada; el log k
disminuye linealmente con 1/T. Sin embargo, por arriba y por
abajo del intervalo normal, log k disminuye con rapidez, de
forma que se definen las temperaturas máxima y mínima.
Además de sus efectos sobre la tasa de proliferación, las
temperaturas extremas matan a los microorganismos. La tem-
peratura muy elevada se utiliza para esterilizar preparaciones
(capítulo 4); el frío extremo también destruye microorganis-
mos, aunque no puede utilizarse con seguridad con fines de
esterilización. Las bacterias también muestran el fenómeno
conocido como choque de enfriamiento; en éste, las células
mueren con el enfriamiento rápido (a diferencia de lo que ocu-
rre con el enfriamiento lento). Por ejemplo, el enfriamiento
rápido de Escherichia coli de 37 a 5 °C puede destruir 90% de
las células. Varios compuestos protegen a éstas del choque
de calor o de congelamiento; a menudo se utilizan glicerol y
dimetil sulfóxido.
Aireación
En el capítulo 6 se revisa la función del oxígeno como aceptor
de hidrógeno. Muchos microorganismos son aerobios estric-
tos, esto es, necesitan oxígeno como aceptor de hidrógeno;
otros son anaerobios facultativos, es decir, tienen la capaci-
dad de vivir en forma aerobia o anaerobia; otros son anaero-
bios estrictos, pues necesitan una sustancia distinta al oxígeno
como aceptor de hidrógeno y son sensibles a la inhibición de
oxígeno; otros más son microaerófilos, que necesitan peque-
ñas cantidades de oxígeno (2 a 10%) para la respiración aerobia
(la concentración más elevada es inhibidora); otros son anae-
robios aerotolerantes, pues son indiferentes al oxígeno. Éstos
pueden crecer en su presencia pero no lo utilizan como aceptor
de hidrógeno (figura 5-4).
Los productos secundarios naturales del metabolismo
aerobio son compuestos reactivos de peróxido de hidrógeno
(H2
O2
) y superóxido (O2
−
). En presencia de hierro, estas sus-
tancias generan radicales hidroxilo (•OH) que pueden dañar
cualquier macromolécula biológica:
O H O O OH OH
2 2 2
Fe /Fe
2 2
3 2
+ → + +•
+
− −
Muchos microorganismos aerobios y anaerobios toleran-
tes al aire se protegen de estos productos por la presencia de
superóxido dismutasa, una enzima que cataliza la reacción
2O 2H O H O
2 2 2 2
+ → +
− +
y por la presencia de una catalasa, una enzima que cataliza la
reacción
2H O 2H O O
2 2 2 2
→ +
Índice
de
crecimiento
Temperatura (°C)
–10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Psicrófilos
Psicrótrofos
Mesófilos Termófilos
Hipertermófilos
FIGURA 52 Necesidades de temperatura para el crecimiento.
Las células procariotas por lo general se dividen en cinco grupos
con base en su temperatura óptima de crecimiento. Obsérvese que
la temperatura óptima, que es el punto donde el crecimiento es
mayor, es cercana al límite superior del espectro. (Reproducida con
autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT [eds]:
Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 91. ©
The McGraw-Hill Companies, Inc.)
Mínimo
Temperatura
elevada
Temperatura
normal
1/T (K)
Temperatura
baja
Óptimo
Máximo
Log
k
FIGURA 53 Forma general del gráfico de Arrhenius de la
proliferación bacteriana. (Reproducida con autorización de Ingraham
JL: Growth of psychrophilic bacteria. J Bacteriol 1958; 76(1):75-80.)
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![74 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
Algunos microorganismos fermentados (p. ej., Lactobaci-
llus plantarum) son tolerantes al aire pero no contienen catalasa
o superóxido dismutasa. No hay reducción del oxígeno y por
tanto no se producen H2
O2
y O2
−
. Todos los anaerobios estrictos
carecen de superóxido dismutasa y catalasa. Algunos microor-
ganismos anaerobios (p. ej., Peptococcus anaerobius) tienen
tolerancia considerable al oxígeno como consecuencia de su
capacidad para producir cifras elevadas de la enzima (NADH
oxidasa) que reduce oxígeno a agua con base en la reacción
NADH H / O NAD H O
1
2 2 2
+ + → +
+ +
El peróxido de hidrógeno debe gran parte de su toxicidad
al daño que causa al DNA. Los mutantes con reparación defi-
ciente del DNA son excepcionalmente sensibles al peróxido de
hidrógeno; el producto génico recA participa en la recombina-
ción genética y en la reparación, y ha mostrado ser más impor-
tante que la catalasa o la superóxido dismutasa para proteger
células de E. coli contra la toxicidad por peróxido de hidrógeno.
El proporcionar aire a los cultivos de bacterias aerobias es
un problema técnico mayor. Por lo común se lleva a cabo un
mezclado mecánico para introducir oxígeno al medio de cul-
tivo o bien se fuerza el paso de aire a través del medio de
cultivo por medio de presión. La difusión de oxígeno a menudo
se vuelve un factor limitante en la proliferación de bacterias
aerobias; cuando se alcanza una concentración de 4 a 5 × 109
/
ml de células, la tasa de difusión de oxígeno limita la tasa de
proliferación de las células en gran medida.
Por otra parte, los anaerobios estrictos presentan el pro-
blema de la eliminación del oxígeno. Se dispone de muchos
métodos para lograr esto: pueden añadirse agentes reductores
como el tioglicolato de sodio a los cultivos líquidos; los tubos
de agar pueden sellarse con una capa de vaselina y parafina;
las placas de cultivo deben colocarse en un contenedor al cual
se le retira el oxígeno por medio de vacío o por agentes quími-
cos, o bien el microorganismo puede manipularse en una caja
cerrada en un medio anaerobio.
Concentración iónica y presión osmótica
En menor grado, deben controlarse factores como la presión
osmótica y concentración de sales. Para la mayor parte de los
microorganismos, las propiedades de los medios de cultivo
Aerobio estricto Anaerobio estricto Microaerófilo Aerotolerante
Anerobio
facultativo
Bacterias
Bacterias
Enzimas en las células
para la destoxificación de O2
Catalasa: 2H2O2 2H2O + O2 Catalasa,
superóxido
dismutasa
Ni catalasa
ni superóxido dismutasa
en la mayor parte
Pequeñas cantidades
de catalasa
y superóxido dismutasa
Superóxido
dismutasa
2O2
– + 2H+
O2 + H2O2
Superóxido dismutasa:
FIGURA 54 Requisitos de oxígeno (O2
) de las células procariotas. (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE,
Nester MT [editores]: Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 92. © The Mc Graw-Hill Companies, Inc.)
ordinarios son satisfactorias; sin embargo, para formas mari-
nas y microorganismos adaptados para crecer en soluciones
hipertónicas de azúcar, por ejemplo, deben tomarse en con-
sideración tales factores. Los microorganismos que requieren
concentraciones elevadas de sales se denominan halófilos;
aquellos que requieren presiones osmóticas elevadas se deno-
minan osmófilos.
La mayor parte de las bacterias son capaces de tolerar
amplias variaciones de presión osmótica externa y de fuerza
iónica, debido a su capacidad para regular la osmolaridad
interna y la concentración iónica. La osmolalidad está regu-
lada por transporte activo de iones de K+
hacia el interior de la
célula; la concentración iónica interna se mantiene constante
por excreción compensadora de putresceína, una poliamina
orgánica con carga positiva. Como la putresceína transporta
varias cargas positivas por molécula, una gran reducción en la
concentración iónica se lleva a cabo con un pequeño costo en
la concentración osmótica.
MÉTODOS DE CULTIVO
Deben considerarse dos problemas: elección del medio de cul-
tivoapropiadoyaislamientodeunmicroorganismobacteriano.
Medios de cultivo
La técnica y medio de cultivo utilizados dependen de la natura-
leza de la investigación. En términos generales, pueden encon-
trarse tres situaciones: 1) tal vez sea necesario cultivar un grupo
de células de una especie en particular que se encuentran a la
mano; 2) puede ser necesario establecer el número y tipo de
microorganismos presentes en un material dado; o 3) podría
desearse el aislamiento de un tipo particular de microorga-
nismo a partir de una fuente natural.
A. Desarrollo celular de una especie dada
Los microorganismos observados en el microscopio pueden
proliferar en su ambiente natural y pueden ser extremadamente
difíciles de hacer crecer en un medio de cultivo artificial puro.
Ciertas formas parasitarias nunca han sido cultivadas fuera del
hospedador. Sin embargo, en términos generales puede dise-
ñarse un medio de cultivo apropiado para reproducir de forma
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![82 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
carbonos de una molécula donadora a una aceptora. Estas
reacciones permiten que se produzcan pentosas o que éstas se
formen de carbohidratos con diferentes longitudes de cadena.
Como se muestra en la figura 6-6, 2 moléculas de pentosa
5-fosfato (n = 5) se interconvierten con triosa 3-fosfato (n = 3)
y heptosa 7-fosfato (n = 7); la pentosa 5-fosfato (n = 5) y tetrosa
4-fosfato (n = 4) se interconvierten con triosa 3-fosfato (n = 3) y
hexosa 6-fosfato (n = 6).
La cadena hexosa (de seis carbonos) de la fructosa 6-fosfato
puede convertirse a dos moléculas de triosa (tres carbonos) por
la acción consecutiva de cinasas y aldolasas que actúan sobre la
fructosa 6-fosfato. También, las aldolasas actúan en combina-
ción con las fosfatasas que en conjunto pueden utilizarse para
incrementar la longitud de las moléculas de carbohidratos: las
moléculas de triosa-fosfato pueden dar origen a fructosa 6-fos-
fato; una triosa-fosfato y tetrosa 4-fosfato pueden dar origen
a heptosa 7-fosfato. La forma final de la interconversión en la
longitud de la cadena del carbohidrato es la reacción de tran-
saldolasa, en la cual ocurre la interconversión de heptosa 7-fos-
fato y triosa 3-fosfato a tetrosa 4-fosfato y hexosa 6-fosfato.
Lavíaalternativadelashexosasmonofosfatadas(figura6-7)
ilustra la coordinación de diferentes reacciones que implican el
Estructuras celulares
(pared celular, membrana,
ribosomas, estructuras
de la superficie)
Macromoléculas
(proteínas, ácidos nucleicos)
Subunidades
(aminoácidos,
nucleótidos)
Fuente de energía
(glucosa)
Energía
Energía
Energía
CATABOLISMO ANABOLISMO
Nutrientes
(fuente de nitrógeno,
azufre, etc).
Productos de desecho
(ácidos, bióxido
de carbono)
Precursores
FIGURA 61 Relación entre el catabolismo y anabolismo. El
catabolismo comprende procesos que albergan energía liberada
durante la desintegración de compuestos, utilizándola para sintetizar
trifosfato de adenosina (ATP); además, proporciona los metabolitos
precursores utilizados en la biosíntesis. El anabolismo, o biosíntesis,
comprende procesos que utilizan ATP y metabolitos precursores para
sintetizar y forma subunidades de macromoléculas que componen
la célula. (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG,
Roberts CE, Nester MT [eds]: Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed.
McGraw-Hill, 2009, p. 127. © The Mc Graw-Hill Companies, Inc.)
reordenamiento de carbohidratos para cumplir con un obje-
tivo metabólico general. Las cianobacterias aprovechan este
ciclo para reducir la molécula dinucleótido de nicotinamida y
adenina (NAD+
, nicotinamide adenine dinucleotide) en dinu-
cleótido de nicotinamida y adenina reducido (NADH, redu-
ced nicotinamide adenine dinucleotide), el cual funciona como
reductor para procesos de respiración que ocurren durante la
oscuridad. Numerosos microorganismos utilizan la vía alter-
nativa de las hexosas monofosfatadas para reducir el dinucleó-
tido de noctinamida y adenina fosfatado (NADP+
, nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate) en dinucleótido de noctina-
mida y adenina fosfatado reducido (NADPH, reduced nicotina-
mide adenine dinucleotide phosphate), una molécula que se usa
en reacciones de reducción biosintéticas. El primer paso en la
vía de monofosfato de hexosa son reacciones de oxidación que
acortan las moléculas de hexosa 6-fosfato (abreviado como C6
en la figura 6-7) a pentosa 5-fosfato (abreviado como C5
). Las
reacciones de reordenamiento de los carbohidratos convier-
ten seis moléculas de C5
a cinco moléculas de C6
, de forma que
puede continuar el ciclo de oxidación.
Por supuesto, no todas las reacciones para la intercon-
versión de carbohidratos con incremento de la longitud de las
cadenas se llevan a cabo al mismo tiempo. La selección de gru-
pos específicos de enzimas, que en esencia determinan la vía
metabólica que se seguirá, depende de la fuente de carbono y
de las demandas biosintéticas de las células. Por ejemplo, una
célula que utiliza triosa-fosfato como fuente de carbohidratos
utilizará una combinación de aldolasa-fosfatasa para dar ori-
gen a fructosa 6-fosfato; no es de esperarse que la cinasa que
actúa sobre la fructosa 6-fosfato en su interconversión a trio-
sa-fosfato se active bajo tales circunstancias. Si las demandas
de pentosa 5-fosfato son altas, como en el caso de la asimila-
ción fotosintética de dióxido de carbono, las transcetolasas que
pueden dar origen a pentosa 5-fosfato son muy activas.
En suma, la G6PD puede considerarse como un metabolito
focal porque actúa como precursor directo para la construc-
ción de bloques metabólicos y como fuente de carbohidratos
de longitud variable que se utilizan con fines biosintéticos. La
G6PD misma puede generarse con otros carbohidratos fos-
forilados por la selección de vías de entre un grupo de reac-
ciones para la interconversión de longitudes de cadenas de
carbohidratos. Las reacciones elegidas dependen del potencial
genético de la célula, de la fuente primaria de carbono y de las
demandas biosintéticas del microorganismo. Es necesaria la
regulación metabólica para asegurar que las reacciones satis-
fagan las necesidades del microorganismo.
Formación y utilización
de fosfoenolpiruvato
Las moléculas de triosa-fosfato, formadas por la interconver-
sión de fosfoésteres de carbohidrato, se interconvierten a fos-
foenolpiruvato por una serie de reacciones que se muestran
en la figura 6-8. La oxidación de gliceraldehído 3-fosfato por
NAD+
se acompaña de la formación de enlaces anhídrido en
uno de los carbonos de la molécula de 1,3-difosfoglicerato.
Este anhídrido de fosfato se transfiere en una fosforilación
de sustrato a difosfato de adenosina (ADP, adenosine diphos-
phate), lo que da origen a enlaces ricos en energía en el ATP.
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![84 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
capítulo, pueden utilizarse en la identificación de bacterias de
importancia clínica.
La formación de fosfoenolpiruvato a partir de piruvato
exige cantidades sustanciales de energía metabólica e invaria-
blemente en el proceso se invierten dos enlaces anhídrido de
ATP. Algunos microorganismos (p. ej., Escherichia coli) pro-
ducen directamente la fosforilación del piruvato con ATP, lo
que da origen a monofosfato de adenosina (AMP, adenosine
monophosphate) y fosfato inorgánico (Pi
, inorganic phosphate).
Otros microorganismos utilizan dos pasos metabólicos: se
invierte un enlace de pirofosfato de ATP en la carboxilación del
piruvato a oxaloacetato y un segundo enlace de pirofosfato (a
menudo donado por trifosfato de guanosina [GTP, guanosine
triphosphate], en vez de ATP) para generar fosfoenolpiruvato a
partir de oxaloacetato.
Formación y utilización de oxaloacetato
Como se describió antes, muchos microorganismos producen
oxaloacetato por una carboxilación de piruvato dependiente de
ATP. Otros microorganismos, como E. coli, que forman fosfo-
enolpiruvato directamente de piruvato, sintetizan oxaloacetato
por carboxilación de fosfoenolpiruvato.
La succinil-CoA es necesaria como precursor biosintético
para la síntesis de porfirinas y de otros compuestos esencia-
les. Algunos microorganismos forman succinil-CoA por la
reducción de oxaloacetato a través de malato y fumarato. Estas
reacciones representan un flujo metabólico invertido que se
observa en el ciclo del ácido tricarboxílico (figura 6-11).
Metabolito focal
Lisina
Glutamina
Glutamato
Semialdehído glutámico Arginina
Prolina
Intermediarios Productos terminales
Cetoglutarato α
Metabolito focal
Isoleucina
Coenzimas
Ácidos nucleicos
Asparagina
Treonina
Metionina
Pirimidinas
Productos terminales
Oxaloacetato Aspartato
FIGURA 64 Productos biosintéticos terminales formados de oxaloacetato. Los productos terminales aspartato, treonina y las pirimidinas
sirven de intermediarios en la síntesis de compuestos adicionales.
FIGURA 65 Productos biosintéticos terminales formados de cetoglutarato α.
Formación de cetoglutarato α
a partir de piruvato
Las conversiones de piruvato a cetoglutarato α necesitan una
vía metabólica que diverge y luego converge (figura 6-9). En
una vía, se forma oxaloacetato por carboxilación de piruvato
o fosfoenolpiruvato. En la otra vía, se oxida el piruvato a ace-
til-CoA. Vale la pena destacar que, sin importar el mecanismo
enzimático utilizado para la formación de oxaloacetato, se
necesita acetil-CoA como efector metabólico positivo para este
proceso. Así, la síntesis de oxaloacetato se equilibra con la pro-
ducción de acetil-CoA. La condensación de oxaloacetato con
acetil-CoA da origen a la formación de citrato. La isomeriza-
ción de la molécula de citrato produce isocitrato, el cual sufre
descarboxilación oxidativa para dar origen a cetoglutarato α.
VÍAS DE ASIMILACIÓN
Crecimiento con acetato
El acetato se metaboliza a través de acetil-CoA, y muchos
microorganismos poseen la capacidad de formar acetil-CoA
(figura 6-10). La molécula de acetil-CoA se utiliza para la bio-
síntesis de cetoglutarato α y en la mayor parte de los microor-
ganismos con mecanismos respiratorios, los fragmentos acetilo
de acetil-CoA sufren oxidación completa a dióxido de carbono a
través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (figura 6-11). La capa-
cidad de utilizar acetato como fuente neta de carbono se limita
a unos cuantos microorganismos y plantas. La síntesis neta de
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![CAPÍTULO 7 Genética microbiana 109
CUADRO 72 Ejemplos de actividades metabólicas
determinadas por plásmidos
Microorganismo Actividad
Pseudomonas sp. Degradación de alcanfor, tolueno,
octano, ácido salicílico
Bacillus stearothermophilus Amilasa α
Alcaligenes eutrophus Utilización de H2
como fuente de
energía oxidable
Escherichia coli Captación y metabolismo de sacarosa,
captación de citrato
Klebsiella sp. Fijación de nitrógeno
Streptococcus (grupo N) Utilización de lactosa, sistema
de galactosa fosfotransferasa,
metabolismo de citrato
Rhodospirillum rubrum Síntesis de pigmento fotosintético
Flavobacterium sp. Degradación de nailon
genética de DNA (p. ej., la transposasa). Por lo tanto, los genes
con orígenes evolutivos independientes pueden asimilarse por
los plásmidos y más tarde se diseminan de forma amplia entre
la población bacteriana. Una consecuencia de tales eventos
genéticos se ha observado en la modificación entre las pobla-
ciones bacterianas de resistencia originada por plásmidos a los
antibióticos después de su uso liberal en hospitales.
Los transposones son elementos genéticos que contienen
varios genes, lo que incluye aquellos necesarios para la migra-
ción de un locus genético a otro. Al hacerlo de esta forma,
crean mutaciones de inserción. La participación de transposo-
nes relativamente cortos (longitud de 0.75 a 2 kbp), conocidos
como elementos de inserción, produce la mayor parte de las
mutaciones de inserción. Estos elementos de inserción (tam-
bién conocidos como elementos de secuencias de inserción [IS,
insertion sequence]) transportan sólo los genes para las enzi-
mas necesarias a fin de favorecer su propia transposición a otro
locus genético, pero no pueden replicarse por sí mismos. Casi
todas las bacterias transportan elementos IS y cada especie
porta sus propias características. Los elementos IS relacionados
pueden encontrarse en ocasiones en diferentes bacterias, lo que
implica que en algún punto de la evolución ocurrieron recom-
binaciones con otras bacterias. Los plásmidos también portan
elementos IS, que son importantes para la formación de cepas
recombinantes de alta frecuencia (Hfr, high-frequency recom-
binant) (véase adelante). Los transposones complejos portan
genes para funciones especializadas como resistencia a anti-
bióticos y están rodeadas por secuencias de inserción.
Los transposones no portan información genética necesa-
ria para acoplarse a su propia réplica de la división celular, y
por esta razón su propagación depende de su integración física
con un replicón bacteriano. Dicha relación se induce por enzi-
mas que confieren a los transposones la capacidad de formar
copias de sí mismos; dichas enzimas permiten a los transpo-
sones integrarse dentro del mismo replicón o de otro indepen-
diente. La especificidad de la secuencia en el punto de inserción
suele ser pequeña de tal forma que los transposones a menudo
se insertan de manera aleatoria pero tienden a hacerlo en regio-
nes que codifican tRNA. De una a otras bacterias son trans-
feridos muchos plásmidos y la inserción de un transposón en
un plásmido de ese tipo constituye un vehículo que permite la
diseminación del transposón en toda la población bacteriana.
Genoma viral
Los virus son capaces de sobrevivir, pero no de proliferar en
ausencia de una célula hospedadora. La replicación del genoma
viral depende de la energía metabólica y maquinaria de sín-
tesis de macromoléculas del hospedador. Con frecuencia, esta
forma de parasitismo genético da origen a la debilitación o
muerte de la célula hospedadora. Por lo tanto, para la propaga-
ción exitosa de los virus se requiere: 1) una forma estable que
permita que el virus sobreviva en ausencia de su hospedador;
2) un mecanismo para la invasión de la célula hospedadora; 3)
información genética necesaria para la replicación de los com-
ponentes virales en el interior de la célula y 4) información adi-
cional que pueda ser necesaria para el empaquetamiento de los
componentes virales y la liberación del virus resultante desde
la célula hospedadora.
Con frecuencia se hacen distinciones entre los virus rela-
cionados con células eucariotas y aquellos relacionados con
las procariotas; a estas últimas se les denomina bacteriófago
o fago. Cuando el DNA viral se incorpora al genoma eucarió-
tico, recibe el nombre de provirus; cuando un fago se incor-
pora a un genoma bacteriano o episoma, se denomina profago.
Con más de 5000 aislamientos de morfología conocida, los
bacteriófagos constituyen el mayor grupo de todos los virus.
Gran parte de la comprensión actual de los virus (y muchos
conceptos fundamentales de biología molecular) han surgido
de investigaciones de bacteriófagos.
Los bacteriófagos se presentan en más de 140 géneros bac-
terianos y en diversos hábitat. La molécula de ácido nucleico
de los bacteriófagos está rodeada por una cubierta proteí-
nica. Existe una variabilidad notable en el ácido nucleico de
los bacteriófagos. Muchos de éstos contienen DNA bicatena-
rio (dsDNA, double-stranded DNA); otros contienen RNA
bicatenario (dsRNA, double-stranded RNA), ssRNA, o DNA
monocatenario (ssDNA, single-stranded DNA). En ocasiones se
encuentran bases poco comunes como hidroximetilcitosina en
el ácido nucleico de bacteriófagos. Éstos muestran una amplia
gama de morfologías. Muchos contienen estructuras especiali-
zadas con forma similar a jeringas (colas) que se unen a recep-
tores sobre la superficie celular e inyectan el ácido nucleico del
bacteriófago en la célula hospedadora (figura 7-5).
FIGURA 75 Ilustraciones del fago T2 con o sin ácido nucleico.
Obsérvese que cuando el fago se encuentra cargado con ácido
nucleico adquiere una forma diferente que cuando carece del mismo.
Este diagrama se dibujó con base en observaciones realizadas en una
micrografía electrónica.
Cabeza (ácido
nucleico presente)
Cabeza
vacía
Centro hueco
Placa de la base
Vaina
(expandida)
Vaina
(contraída)
Fibras
de la cola
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![CAPÍTULO 7 Genética microbiana 113
que se unen a las células del donador al organismo receptor que
carece de factor de fertilidad. Un puente entre las células per-
mite que una cadena de plásmido F+
, sintetizada por el dona-
dor, pase hacia el receptor, donde se forma una cadena de DNA
complementario. El factor de fertilidad F+
puede integrarse en
numerosos locus en los cromosomas de las células donadores.
El factor de fertilidad integrado crea donadores con recombina-
ciones de alta frecuencia (Hfr) en la cual se transfiere DNA cro-
mosómico (del sitio de inserción) en una dirección determinada
por la orientación de la inserción (figura 7-9).
La tasa de transferencia cromosómica de las células Hfr
es constante y la compilación de resultados de muchos expe-
rimentos de conjugación ha permitido la preparación de un
mapa genético de E. coli, en el cual se mide la distancia entre
los locus en el número de minutos necesarios para la trans-
ferencia en la conjugación. Se ha construido un mapa similar
para coliformes relacionadas como Salmonella typhimurium
y de la comparación de los dos mapas se han mostrado tipos
de organización genómica relacionados. En la actualidad esta
clase de mapeo ha sido reemplazado por secuenciación genó-
mica de alto rendimiento.
La integración del DNA cromosómico en un plásmido
de conjugación puede producir un replicón recombinante (un
cebador F [de fertilidad] o R [de resistencia], lo que depende
del plásmido) en el cual el DNA cromosómico integrado puede
replicarse en el plásmido de manera independiente del cromo-
soma. Esto ocurre cuando el plásmido integrado (p. ej., F) es
rodeado por dos copias de un elemento IS. Las bacterias que
portan copias de genes, un grupo completo de cromosomas
y un grupo parcial de cebadores, son parcialmente diploides
o merodiploides y son útiles para estudios de complementa-
ción. Un gen natural con frecuencia se complementa con un
homólogo mutante y la selección de un fenotipo natural puede
permitir el mantenimiento de merodiploides en el laboratorio.
Es posible que tales cepas permitan el análisis de interaccio-
nes entre los diferentes alelos, variantes genéticas del mismo
gen. Los merodiploides con frecuencia son inestables desde el
punto de vista genético porque las recombinaciones entre los
plásmidos y el cromosoma homólogo pueden ocasionar pér-
dida o cambio del mutante o alelos de tipo natural. Este pro-
blema a menudo se supera al conservar los merodiploides en
un entorno genético en el cual se haya inactivado el gen recA,
que es necesario para la recombinación entre segmentos homó-
logos de DNA.
Los genes homólogos de diferentes organismos pueden ser
divergentes en un área tal que evite la recombinación homó-
loga entre ellos, pero que no se altere la capacidad de un gen
para complementar la actividad perdida de otro. Por ejemplo,
el origen genético de una enzima necesaria para la biosínte-
sis de un aminoácido probablemente no influya la actividad
catalítica en el citoplasma de un hospedador distante desde el
punto de vista biológico. Un merodiploide que porta un gen
para tal enzima podría estar rodeado por genes derivados del
organismo donador. Por lo tanto, la genética microbiana con-
vencional, con base en la selección de plásmidos cebadores,
puede utilizarse para aislar genes de un organismo de creci-
miento lento para utilizarse en E. coli o P. aeruginosa.
B. Transducción
La transducción es una recombinación genética en las bac-
terias mediada por bacteriófagos. En términos simples, una
partícula de transducción puede considerarse como el ácido
nucleico bacteriano en un fago cubierto. Incluso una población
de fagos líticos puede contener algunas partículas en las cuales
la cubierta del fago está rodeada por DNA derivado de la bacte-
ria más que del propio fago. Tal población se ha utilizado para
transferir genes de una bacteria a otra. Los fagos moderados
son los vehículos preferidos para la transferencia génica porque
la infección de las bacterias receptoras bajo condiciones
que favorecen la lisogenia reduce la lisis celular y por lo tanto
favorece la supervivencia de las cepas recombinantes. Además,
la bacteria receptora porta un profago apropiado que puede
formar un represor que a su vez da origen a inmunidad celular
FIGURA 78 A: Las células macho y hembra se unen por medio de una pilosidad F (pilosidad sexual). B: Parejas las células de E. coli. Hay
elongación de las células Hfr. C: Micrografía electrónica de un corte delgado de una pareja de células. Las paredes celulares se encuentran
en contacto íntimo con un área en la que se ha formado un “puente” (Fotografía [A]: por cortesía de Carnahan J y Brinton C. Fotografías B y C
reproducidas con autorización de Gross JD and Caro LG: DNA transfer in bacterial conjugation. J Mol Biol 1966;16:269).
A B C
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![130 SECCIÓN II Inmunología
protección inmediata contra microorganismos. La vía alterna-
tiva del complemento se activa por superficies microbianas y
puede proceder en ausencia de anticuerpos. De forma similar,
la vía de la lectina (que utiliza lectina fijadora de manosa [MBL,
mannose-binding lectin]) evita el uso de anticuerpos y para ini-
ciar eventos. Las proteínas del complemento logran su misión
defensiva de muchas formas, incluyendo la opsonización, la
lisis de bacterias y la amplificación de respuestas inflamatorias
a través de anafilatoxinas, C5 y C3a. El complemento se des-
cribe con mayor detalle más adelante.
Algunos microbios han desarrollado mecanismos para
sabotear al sistema del complemento y evadir las respuestas
inmunitarias. Por ejemplo, los poxvirus, como el virus de la
variolovacuna y el virus de la viruela, producen una proteína
soluble que inhiben a este sistema.
E. Mediadores de la inflamación e interferones
En la sección sobre mecanismos de la inmunidad innata se
mencionó que varias células y los componentes del complemen-
to de la inmunidad innata orquestan sus efectos a través de la
producción de mediadores solubles. Éstos incluyen las citosi-
nas, las prostaglandinas y los leucotrienos. En esta sección se
resume la función de estos mediadores en los procesos infla-
matorios. En la sección de la respuesta inmunitaria adaptativa
se describen las citosinas de forma detallada.
La lesión de los tejidos inicia una respuesta inflamato-
ria dominada en primera instancia por mediadores solubles,
conocidos como citosinas. Éstas son moléculas inflamato-
rias o antiinflamatorias, quimiocinas, moléculas de adhesión
y factores de crecimiento. Durante la respuesta inmunitaria
innata, leucocitos, como los macrófagos, liberan una variedad
de citosinas, incluidas IL-1, TNF-α e IL-6. Otros mediadores
que liberan macrófagos activados y otras células son las pros-
taglandinas y los leucotrienos. Estos mediadores inflamatorios
regulan cambios en vasos sanguíneos locales caracterizados
por dilatación de arteriolas y capilares. Durante la dilatación
escapa plasma que se acumula en el área de la lesión. Después
se forma fibrina que ocluye los conductos linfáticos y limita así
la diseminación del organismo.
Un segundo efecto de estos mediadores es inducir cam-
bios en la expresión de moléculas de adhesión expresadas en la
superficie de células endoteliales y leucocitos. Estas proteínas
(p. ej., selectinas e integrinas) provocan que los leucocitos se
adhieran a las células endoteliales y en consecuencia promue-
van su movimiento a través de la pared vascular. Por lo tanto, las
células se pegan a las paredes de los capilares y después migran
hacia fuera de ellos (extravasación) dirigiéndose hacia el irri-
tante. Esta migración (quimiotaxia) la estimulan proteínas del
exudado inflamatorio, incluyendo algunas quimiocinas. Una
variedad de tipos celulares, incluidos los macrófagos y las célu-
las endoteliales, pueden producir quimiocinas. Una vez que los
fagocitos migran al sitio de la infección inician la fagocitosis de
microorganismos.
La fiebre es otra manifestación sistémica común de res-
puestas inflamatorias y es un síntoma cardinal de las enfer-
medades infecciosas. El principal regulador de la temperatura
corporal es el centro termorregulador que se encuentra en
el hipotálamo. Entre las sustancias capaces de inducir fiebre
(pirógenos) se encuentran las endotoxinas de bacterias gram-
negativas y algunas citosinas (p. ej., IL-1, IL-6, TNF-α y los
interferones) liberadas por una variedad de células.
Los interferones (IFN) son citosinas importantes que
tienen una función esencial en la defensa contra infecciones
víricas y otros organismos intracelulares, como Toxoplasma
gondii. Aunque los IFN se identificaron por primera vez en 1957
como proteínas antivirales, ahora se reconocen como proteí-
nas reguladoras de las respuestas inmunitarias fundamentales,
capaces de alterar diversos procesos celulares como el creci-
miento, la diferenciación, la transcripción génica y traducción.
La familia de IFN está formada por tres grupos. Los IFN tipo I
comprenden numerosos genes y en primera instancia incluyen
a los interferones α y β. El IFN tipo II es un solo gen que pro-
duce IFN-γ. El IFN-λ es un tercer grupo de citosinas similares a
los IFN, que se descubrieron en fecha reciente. Una infección
víricaactivaporsímismalaproduccióndeinterferonesdetipoI.
Despuésdeentraraunacélula,unvirusinicialareplicaciónysu
ácido nucleico interactúa con sensores microbianos especí-
ficos (TLR3, TLR7, TLR9, RIG-1 y MDA-5). Esta interacción
inicia la producción de IFN por parte de la célula infectada. En
contraste, el IFN-γ se produce por linfocitos NK activados
en respuestas inmunitarias innatas y por linfocitos T especí-
ficamente sensibilizados en respuestas inmunitarias adaptati-
vas. Además, las citosinas IL-2 e IL-12 son capaces de activar la
producción de IFN-γ por parte de los linfocitos T.
El sistema de IFN consiste en una serie de eventos que pro-
tege a las células de la replicación vírica. Ya que fue producido
por la célula infectada o por los linfocitos NK o T activados,
el IFN se une a su receptor celular específico. Esta interacción
activa las vías de señalización JAK-STAT, lo cual activa los
genes que inician la producción de proteínas específicas que
inhiben la replicación de los virus. Todos los IFN comparten
actividades biológicas que se superponen, como acciones anti-
virales, efectos contra la proliferación y actividades inmuno-
rreguladoras. Sin embargo, también tienen funciones únicas
que no coinciden. Por ejemplo, el IFN-β se utiliza de forma
exitosa para tratar pacientes con esclerosis múltiple. Por otra
parte, se ha demostrado que el IFN-γ exacerba esta enferme-
dad. Estas potentes acciones de los IFN y los avances en bio-
tecnología son los factores subyacentes que han identificado la
relevancia clínica de dichas moléculas. De hecho, la Food and
Drug Administration (FDA) de Estados Unidos aprobó muchos
de los IFN para el tratamiento de infecciones, procesos cance-
rígenos, trastornos autoinmunes e inmunodeficiencias.
INMUNIDAD ADAPTATIVA
A diferencia de la inmunidad innata, la inmunidad adaptativa
es muy específica, tiene memoria y puede responder de forma
rápida y contundente a una segunda exposición de antíge-
nos. La respuesta inmunitaria adaptativa involucra respues-
tas inmunitarias mediadas por anticuerpos y conducidas por
células. A continuación se resumen los componentes de la res-
puesta inmunitaria adaptativa y sus interacciones. Los detalles
se presentan a lo largo de este capítulo.
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![132 SECCIÓN II Inmunología
promuevan eventos de hipersensibilidad tardía, mientras que
los linfocitos T CD8+
destruyen células de injertos, canceríge-
nas o infectadas por virus.
Antígenos
Un antígeno es una sustancia que reacciona con un anti-
cuerpo. Los inmunógenos inducen una respuesta inmunita-
ria y la mayoría de los antígenos también son inmunógenos.
Hay muchas características que determinan en gran medida
la inmunogenicidad. Entre ellas se encuentran las siguientes:
1) reconocimiento de agentes externos: en general, las mo-
léculas reconocidas como “propias” no son inmunógenas. Para
que lo sean, deben ser reconocidas como externas (“ajenas”);
2) tamaño: los inmunógenos más potentes por lo general son
grandes proteínas complejas; moléculas con un peso molecular
(MW, molecular weight) menor a 10 000 Da son poco inmunó-
genas, y, como se esperaría, moléculas muy pequeñas no lo son.
Algunas moléculas pequeñas, llamadas haptenos, se vuelven
inmunógenassólocuandoseunenaunaproteínaportadora.Un
ejemplo son los lípidos y los aminoácidos que son haptenos no
inmunógenos. Requieren unirse a una proteína o una molécula
de polisacárido portadora para ser inmunógenas o generar una
respuesta inmunitaria; 3) complejidad estructural y química:
la complejidad química es otra característica fundamental
de la inmunogenicidad. Por ejemplo, los homopolímeros de
aminoácidos son menos inmunogénicos que los heteropolíme-
ros que contienen dos o más aminoácidos diferentes; 4) cons-
titución genética del hospedador: debido a diferencias en los
alelos del MHC, dos razas de la misma especie animal pueden
responder de forma distinta al mismo antígeno y 5) dosis, vía
y momento de la administración de antígenos: otros factores
que afectan la inmunogenicidad incluyen la concentración, la
vía y el momento de la administración de antígenos.
Estos conceptos son importantes para diseñar vacunas
para potenciar la inmunogenicidad. Sin embargo, para elabo-
rar fármacos proteínicos se consideran métodos para inhibir
las respuestas inmunitarias. Esto puede observarse en un indi-
viduo capaz de responder a cierto medicamento y producir
anticuerpos contra él. Estos anticuerpos contra fármacos pue-
den inhibir la eficiencia de los fármacos.
Por último, cabe mencionar que es posible potenciar la
inmunogenicidad de una sustancia al combinarla con un
adyuvante. Éste es una sustancia que estimula las respuestas
inmunitarias al facilitar la actividad fagocítica de las APC.
Moléculas para el reconocimiento
de antígenos
Durante una respuesta inmunitaria, es esencial un sistema de
reconocimiento capaz de distinguir lo “propio” de lo “ajeno”
para una inmunidad eficaz. Esta sección del capítulo se con-
centra en las moléculas utilizadas para reconocer antígenos
externos. Primero se revisan las moléculas del MHC y la pre-
sentación de antígenos, después se resumen la estructura y la
función de los anticuerpos y por último se presenta una sinop-
sis de los receptores específicos para el reconocimiento de antí-
genos (p. ej., el receptor de linfocito B [BCR, B-cell receptor] y
el TCR).
Complejo mayor de histocompatibilidad
Desde el punto de vista histórico, el complejo mayor de his-
tocompatibilidad (MHC, major histocompatibility complex)
se descubrió primero como un locus genético que codificaba
a un grupo de antígenos responsables del rechazo de injertos
tumorales. Ahora se sabe que los productos de los genes de esta
región son los principales antígenos reconocidos en el rechazo
de trasplantes. También está claro que las moléculas del MHC
se unen a antígenos peptídicos y los presentan a los linfocitos T.
Por lo tanto, estas moléculas son responsables del reconoci-
miento de antígenos por parte de dichas células y tienen una
función importante en el control de una variedad de funciones
inmunitarias básicas. También debe notarse que el TCR no es
un anticuerpo. Éstos se unen a los antígenos de forma directa,
mientras que el TCR sólo reconoce antígenos peptídicos pre-
sentados por el MHC de una APC. El TCR es específico para
antígenos, pero éstos deben ser presentados por moléculas de
MHC propias. El TCR también es específico para la molécula
de MHC. Si un antígeno es presentado por otra forma alélica de
MHC in vitro, el TCR no reconoce al complejo. A esto se le
conoce como restricción del MHC.
El MHC es un grupo de genes bien estudiados que están
vinculados de forma estrecha en el cromosoma 6 en seres huma-
nos. El MHC humano se llama complejo antígeno leucocitario
humano (HLA, human leukocyte antigen). Entre los numerosos
genes importantes que se encuentran en el MHC humano están
los que codifican a las proteínas de los MHC de las clases I, II
y III. Como se resume en el cuadro 8-1, las proteínas del MHC
clase I son codificadas por los genes HLA-A, -B y -C. Estas pro-
teínas están formadas por dos cadenas: 1) una glucoproteína
transmembrana con peso molecular de 45000 Da, vinculada
de forma no covalente a 2) un polipéptido no codificado por
el MHC (con un peso molecular de 12000 Da) llamado micro-
globulina β2
. Las moléculas del MHC clase I se expresan en casi
todas las células nucleadas del cuerpo. Algunas excepciones
importantes son ciertas células del cerebro y la retina.
Las proteínas de clase II están en la región HLA-D. Las
proteínas del MHC clase II se agrupan en tres familias: las mo-
CUADRO 81 Características importantes
de los productos génicos de los MHC clases I y II
Clase I Clase II
Loci genético
(lista parcial)
HLA-A, -B y -C HLA-DP, -DQ y -DR
Composición
de polipéptidos
MW de 45000 Da + β2
M
(12000 Da)
Cadena α (33000 Da),
Cadena β (29000 Da),
Cadena li (30000 Da)
Distribución
celular
En la mayoría de las
células somáticas
nucleadas, excepto
células del cerebro
y la retina
En células presentadoras
de antígenos
(macrófagos, células
dendríticas, linfocitos
B, etc.) y células
activadas por el IFN-γ
Presenta antígenos
peptídicos a
Linfocitos T CD8+
Linfocitos T CD4+
Tamaño del
péptido unido
8 a 10 residuos 10 a 30 residuos o más
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![CAPÍTULO 8 Inmunología 133
Complejo MHC
clase II-antígeno
en la superficie
Complejo MHC
clase I-antígeno
en la superficie
Hacia la
superficie
celular
Antígeno
exógeno
Péptidos
Endosoma
Vesícula
exocítica
Fusión vesicular
Procesamiento
Endocitosis
Hacia la
superficie
celular
Superficie
celular
Transportador de péptidos Vía del MHC clase I
Péptidos
endógenos
Núcleo
Síntesis de proteínas víricas
Proteína vírica intacta
Proteasoma
MHC clase II
Vía del MHC clase II
MHC
clase I
β2m
β2m
α
α
αβ
RER
Ii
Golgi
Vesícula
FIGURA 82 Vías de procesamiento de antígenos (MHC clases I y II). (Modificada y reproducida con autorización de Parslow T. G. et al.,
[editores]: Medical immunology, 10a. edición. McGraw-Hill, 2001. © The McGraw-Hill Companies, Inc.)
léculas codificadas HLA-DP, -DQ y -DR (cuadro 8-1). Este
locus controla la reactividad inmunitaria y distintas formas
alélicas de estos genes confieren diferencias en la capacidad de
un individuo para montar una respuesta inmunitaria.
Las moléculas codificadas en el locus HLA-D son hetero-
dímeros de la superficie celular que contienen dos subunidades
llamadas α y β, que tienen pesos moleculares cercanos a 33000
y 29000 Da, en dicho orden. A diferencia de las proteínas de
clase I, las proteínas del MHC clase II tienen una distribución
hística bastante restringida y se expresan de forma constitu-
tiva en los macrófagos, las células dendríticas y los linfocitos B.
Sin embargo, la expresión de estas moléculas en otros tipos de
células (p. ej., células endoteliales o células epiteliales) requiere
inducción por el IFN-γ.
El locus del MHC clase I también contiene genes que codifi-
can proteínas necesarias para el tratamiento de antígenos (p. ej.,
transportadores asociados al procesamiento de antígenos [TAP,
transporters associated with antigen processing]) (figura 8-2). El
locus del MHC clase III codifica proteínas del complemento y
numerosas citosinas.
Los genes de los MHC de las clases I y II exhiben una
variabilidad extraordinaria. Estudios de mapeo genético
demostraron que hay una alto nivel de polimorfismo en el
MHC y diferentes individuos por lo general expresan distintas
variantes alélicas de dicho complejo (restricción del MHC). Se
han definido cerca de 300 variantes alélicas en algunos loci del
HLA. En la actualidad, los genes del MHC son los más poli-
morfos conocidos. Cada individuo hereda un grupo restrin-
gido de alelos de alguno de sus padres. Un grupo de genes del
MHC vinculados de manera estrecha se heredan como un blo-
que o haplotipo.
En 1987 se reveló la estructura tridimensional de las
proteínas de los MHC de las clases I y II utilizando cristalo-
grafía por rayos X. Este elegante trabajo proporcionó informa-
ción fundamental sobre la forma en la que las proteínas del
MHC funcionan y activan las respuestas inmunitarias. Análisis
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![134 SECCIÓN II Inmunología
C
N
N
C
β2m
α3
α1
α2
Cadena
plegada β
de ocho
cadenas
Hendidura
de unión a
péptidos
Hélice α
FIGURA 83 Diagrama de una molécula de HLA clase I.
(Reproducida con autorización de Macmillan Pubishers Ltd: Bjorkman
P.J., et al.: Structure of the human class I histocompatibility antigen,
HLA-A2. Nature 1987;329:506. Derechos de autor © 1987.)
A B
Vα Vβ
Superantígeno
MHC clase II
Linfocito T
APC
Cα Cβ Cα Cβ
Péptido
antigénico
Vα Vβ
Linfocito T
APC o célula diana
MHC
FIGURA 84 Unión de antígenos al MHC y al receptor de linfocito T (TCR). En el panel A se muestra un modelo de la interacción entre un
péptido antigénico, el MHC y el TCR. Se muestran las regiones Vα
y Vβ
del TCR, interactuando con las hélices α que forman la hendidura de unión
a péptidos el MHC. En el panel B se muestra un modelo de la interacción entre un superantígeno, el MHC y el TCR. El superantígeno interactúa con
la región Vβ
del TCR y con el MHC clase II fuera de la hendidura de unión a péptidos. (Adaptada con autorización de DG, et al. [editores]: Medical
Immunology, 9a. ed. McGraw-Hill, 1997. © The McGraw-Hill Companies, Inc.)
con rayos X (figura 8-3) demuestran que la estructura completa
parece una hendidura cuyas paredes están formadas por las
hélices α y el piso está moldeado por láminas plegadas β. El
análisis con rayos X muestra que la hendidura está ocupada
por un péptido. En esencia, el TCR reconoce al antígeno pep-
tídico unido a una hendidura proporcionada por el MHC. La
figura 8-4A ilustra esta interacción.
Las proteínas del MHC tienen una especificidad amplia
por antígenos peptídicos. De hecho, muchos péptidos dife-
rentes pueden ser presentados por un alelo del MHC distinto.
Un concepto clave de este modelo implica que el polimorfismo
del MHC permite la unión de muchos péptidos específicos y
diferentes en la hendidura. Esto significa que alelos distintos
pueden unirse a diferentes antígenos peptídicos y presentarlos.
Presentación y procesamiento de antígenos
El procesamiento y la presentación de antígenos son distintivos
de la respuesta inmunitaria adaptativa. Este complejo meca-
nismo comienza con antígenos que se vinculan con moléculas
del MHC propias para ser presentados a linfocitos T con recep-
tores apropiados. Proteínas provenientes de antígenos exóge-
nos, como bacterias, son internalizados por las APC (células
dendríticas o macrófagos) y experimentan desnaturalización
o proteólisis parcial en las vesículas endocíticas. Mientras
se encuentran en el interior del endosoma, estos fragmentos
peptídicos se fusionan con vesículas exocíticas que contienen
moléculas del MHC clase II. Como se observa en la figura
8-2, en este paso se expone el fragmento peptídico apropiado
que eventualmente se expresará en la superficie de la APC (en
forma del complejo “péptido-MHC”).
Las moléculas del MHC clase II se sintetizan en el retícu-
lo endoplásmico (ER, endoplasmic reticulum) rugoso y después
pasan a través del aparato de Golgi. La cadena invariable, un
polipéptido que ayuda a transportar las moléculas del MHC,
forma un complejo con el MHC clase II en un endosoma. Esta
vesícula se llama compartimento del MHC clase II; esta cadena
invariable es útil y bloquea la unión de péptidos celulares endó-
genos propios con el complejo MHC clase II. La cadena inva-
riable es entonces removida por medios enzimáticos. A través
de una serie de pasos, el MHC clase II se une al antígeno exó-
geno (fragmentos peptídicos) y lo transporta a la membrana
celular para su presentación.
En la figura 8-2 se ilustra la interacción entre los antígenos
endógenos de una célula infectada por un virus y una molécu-
la de MHC clase I. En resumen, un complejo proteolítico, lla-
mado endosoma, fragmenta proteínas citosólicas. Los péptidos
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![CAPÍTULO 8 Inmunología 135
citosólicos resultantes se unen a las moléculas nacientes del
MHC clase I en el ER rugoso mediante sistemas transportado-
res de péptidos (TAP). Los genes de las proteínas TAP también
están en el MHC. En la luz del ER, antígenos peptídicos de ocho
a 10 residuos de longitud se asocian a proteínas nacientes del
MHC clase I y cooperan con la microglobulina β2
para crear
un estable complejo MHC clase I-antígeno peptídico completa-
mente plegado. Éste después se transporta a la superficie celular
para ser exhibido y reconocido por los linfocitos T citotóxico
CD8+
. La hendidura de unión de la molécula de clase I está
más restringida que la de la molécula de clase II y, por lo tanto,
ostenta péptidos más pequeños. Una vez que los linfocitos T
citotóxicos reconocen los complejos MHC clase I-péptido anti-
génico, pueden matar a las células colonizadas por virus.
Muchos virus intentan derrotar a la respuesta inmunitaria
al interferir con las vías de procesamiento de antígenos. Por
ejemplo, una proteína Tat del VIH es capaz de inhibir la expre-
sión de moléculas del MHC clase I. Una proteína del virus del
herpes se une a los TAP, e impide el transporte de péptidos
víricos al interior del ER, donde las moléculas del MHC clase I
se sintetizan. Una consecuencia de este mecanismo inhibidor
es que las células infectadas no son reconocidas por linfocitos
citotóxicos.
Algunos antígenos bacterianos y otros víricos son capa-
ces de activar grandes cantidades de linfocitos T a través de
una vía especial. Estas proteínas se denominan superantíge-
nos. Estas moléculas no necesitan ser procesadas y por lo tanto
son capaces de unirse a moléculas del MHC fuera de la hendi-
dura de unión a péptidos (figura 8-4B). En comparación con la
respuesta estándar de los linfocitos T inducida por antígenos
(donde un pequeño número de estas células es activado), los
superantígenos pueden estimular a muchos más linfocitos T
(cerca de 25% más). Algunas toxinas bacterianas son ejemplos
clásicos de superantígenos, como las enterotoxinas estafilocó-
cicas, la toxina del síndrome de choque tóxico y la exotoxina A
pirogénica estreptocócica del grupo A. Una consecuencia de
esta activación masiva de linfocitos T es la sobreproducción
de citosinas, en particular de IFN-γ. Dicha molécula a su vez
activa a los macrófagos para que éstos produzcan IL-1, IL-6
y TNF-α, los cuales pueden contribuir a la formación de una
“tormenta de citosinas” que provoca muchos de los síntomas
de estados de choque e insuficiencia de órganos múltiple.
Linfocitos B y anticuerpos
La respuesta humoral es mediada por anticuerpos. Cada indi-
viduo tiene un gran acervo de linfocitos B únicos (cerca de
1011
) que tienen un tiempo de vida de días o semanas y que se
encuentran en la sangre, la linfa, la médula ósea, los ganglios
linfáticos y los tejidos linfáticos relacionados con el intestino
(p. ej., las amígdalas, las placas de Peyer y el apéndice).
A. Receptor de antígenos de los linfocitos B
Los linfocitos B exhiben un solo tipo de molécula clonal homo-
génea de inmunoglobulina (alrededor de 105
copias/célula) en
su superficie. Estas inmunoglobulinas actúan como recepto-
res (receptores de linfocitos B [BCR, B-cell receptors]) para un
antígeno específico, de tal manera que cada linfocito B puede
responder a sólo un antígeno o a un grupo de antígenos estre-
chamente relacionados. Todos los linfocitos B inmaduros por-
tan inmunoglobulina M (IgM) en su superficie, y la mayoría
también expresan IgD. Además, los linfocitos B tienen recepto-
res en su superficie para la porción Fc de las inmunoglobulinas
y para muchos elementos del complemento.
UnantígenointeractúaconellinfocitoBconelque“encaja”
mejor por virtud de su inmunoglobulina receptora en la super-
ficie. Cuando un antígeno se une a su BCR, se estimula la
división del linfocito B y se forma un clon (selección clonal).
Estos linfocitos B seleccionados proliferan y se transforman en
plasmocitos que secretan anticuerpos. Debido a que cada per-
sona puede crear cerca de 1011
moléculas de anticuerpo dife-
rentes, hay un sitio de unión a antígenos en un linfocito B que
empalma con casi cualquier determinante antigénico.
El paso inicial para la formación de anticuerpos comienza
con la unión de un antígeno a una inmunoglobulina de super-
ficie (BCR). Después: 1) el BCR con su antígeno unido es
internalizado por el linfocito B y el antígeno se degrada para
generar péptidos que después regresan a la superficie celular
unidos a moléculas del MHC clase II; 2) este complejo MHC
clase II-péptido expuesto sobre el linfocito B es reconocido por
linfocitos T cooperadores (CD4+
) específicos para antígenos.
Estos linfocitos interactuaron antes con células dendríticas
presentadoras de antígenos y se transformaron en respuesta al
mismo patógeno. Esta interacción es posible debido a que el
linfocito B y el linfocito T que se han encontrado con un antí-
geno, migran hacia las fronteras entre dichas células en tejidos
linfáticos secundarios; 3) las quimiocinas, como CXCL13 y su
receptor CXCR5, tienen una función importante en este pro-
ceso migratorio; 4) el ligando CD40 ubicado sobre el linfocito
T se une al CD40 del linfocito B, lo cual induce que el primero
produzca IL-4, IL-5 e IL-6, moléculas que promueven la pro-
liferación de linfocitos B y 5) por último, los linfocitos B acti-
vados migran al interior de folículos y proliferan para formar
centros germinativos; ahí ocurren hipermutación somática y
cambio de la clase de inmunoglobulina. Los linfocitos B del
centro germinativo que sobreviven este proceso se transfor-
man en plasmocitos productores de anticuerpos o en linfocitos
B de memoria. En el capítulo de referencia de Murphy et al.,
(2012) se encuentran detalles adicionales sobre este tema.
Es importante mencionar que algunos antígenos bacte-
rianos pueden estimular de forma directa esta producción de
anticuerpos y no requieren la ayuda de linfocitos T para activar
linfocitos B. Estos antígenos por lo general son polisacáridos
bacterianos y LPS. Estos antígenos tímicos independientes de
linfocitos T inducen respuestas de los linfocitos B (cambios
de clase limitados) y no promueven la formación de linfoci-
tos B de memoria. Al evitar la participación de los linfocitos T
puede representarse una ventaja para el hospedador, debido a
que puede generarse una respuesta inmunitaria expedita (por
la producción de IgM) contra organismos selectos, como Hae-
mophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae.
B. Estructura y función de los anticuerpos
Los anticuerpos son inmunoglobulinas, las cuales reaccionan
de forma específica con el antígeno que estimuló su produc-
ción. Representan cerca de 20% de las proteínas plasmáticas.
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![138 SECCIÓN II Inmunología
C. IgA
La IgA es la inmunoglobulina más importante en la inmunidad
en las mucosas. Sus niveles en el suero son bajos; representan de
10 a 15% del total de las inmunoglobulinas séricas. En contraste,
esta inmunoglobulina predomina en las secreciones vascu-
lares. Los plasmocitos localizados en glándulas y membranas
mucosas producen principalmente IgA, por lo tanto ésta se
encuentra en sustancias como la leche, la saliva y las lágrimas,
y en otras secreciones de los sistemas respiratorio, intestinal y
genitourinario. Debido a sus ubicaciones, este anticuerpo entra
en contacto con el ambiente externo y en consecuencia es la
primera línea de defensa contra virus y bacterias.
Las propiedades de la IgA difieren dependiendo de su
localización. En el suero, este anticuerpo se secreta como un
monómerosemejanteala IgG. En secrecionesmucosases un dí-
mero, denominado IgA secretora, formado por dos monóme-
ros que contienen dos polipéptidos adicionales: la cadena J que
estabiliza la molécula y un componente secretor que se incor-
pora a la IgA secretora cuando se transporta a través de una
célula epitelial. Hay al menos dos subclases de IgA: la IgA1 y
la IgA2. Algunas bacterias (p. ej., Neisseria spp.) son capaces
de destruir la IgA1 al producir una proteasa y en consecuen-
cia pueden superar la resistencia mediada por anticuerpos en
superficies mucosas.
D. IgE
La inmunoglobulina IgE está presente en muy pequeñas can-
tidades en el suero. La región Fc de esta inmunoglobulina se
une a su receptor de alta afinidad ubicado en la superficie de
mastocitos, basófilos y eosinófilos. Este anticuerpo actúa como
receptor de los antígenos específicos que estimularon su pro-
ducción. El complejo antígeno-anticuerpo resultante desenca-
dena respuestas alérgicas inmediatas (anafilácticas) a través de
la liberación de mediadores inflamatorios como la histamina.
E. IgD
La IgD está presente en pequeñas cantidades en el suero. Sin
embargo, es la principal inmunoglobulina de superficie en lin-
focitos B maduros que no se han expuesto a ningún antígeno.
Estos linfocitos portan IgD e IgM en una proporción de tres a
uno. Aún no se conoce por completo la función de la IgD.
Genes de inmunoglobulinas
y generación de diversidad
La capacidad que tiene un individuo para producir un número
muy grande de moléculas de inmunoglobulina (cerca de 3 ×
1011
), con una cantidad relativamente pequeña de genes, ha
evolucionado a través de mecanismos genéticos especiales.
Esto ocurre porque los genes de las Ig experimentan recombi-
nación somática, la cual genera una gran diversidad de especi-
ficidades de anticuerpos.
Cada cadena de inmunoglobulina está formada por una
región variable (V) y una constante (C). Para cada cadena
(p. ej., cadena ligera kappa [κ], cadena ligera lambda [λ] y cinco
cadenas pesadas [γH, μH, αH, δH y εH]) hay un acervo sepa-
rado de segmentos de genes localizados en cromosomas dis-
tintos. En seres humanos, las familias de genes múltiples se
encuentran en los siguientes cromosomas: λ en el cromosoma
22, κ en el cromosoma 2 y la familia de cadenas pesadas en el
cromosoma 14. Cada uno de estos tres loci contiene un grupo
de segmentos de genes V diferentes que están separados de los
segmentos de genes C. Durante la diferenciación de los linfo-
citos B, el DNA se reordena para agrupar los segmentos de los
genes identificados que sean adyacentes en el genoma.
En resumen, el proceso de reordenamiento de genes es
complejo e implica un número de pasos. La región variable
de cada cadena L es codificado por dos segmentos de genes:
V y J. La región variable de cada cadena H es codificada por
tres fragmentos génicos: V, D y J. Los segmentos se unen para
formar un gen variable-V funcional por reordenamiento del
DNA. Después cada uno de estos genes se transcribe junto con
el gen constante-C apropiado para producir una RNA mensa-
jero (mRNA, messenger RNA) que codifica la cadena peptídica
completa. Las cadenas L y H se sintetizan por separado en poli-
somas y después se ensamblan en el citoplasma para formar
las unidades catenarias H2
L2
. Después se agrega la porción de
carbohidratos de la molécula de Ig, durante su paso a través
de los organelos membranosos celulares (p. ej., el aparato de
Golgi), y es liberada.
Este mecanismo de reordenamiento de genes genera una
enorme variedad de moléculas de inmunoglobulina. La diver-
sidad de anticuerpos depende de: 1) segmentos múltiples de
genes V, D y J; 2) la asociación combinatoria, es decir, la con-
jugación de cualquier segmento de gen V con cualquier seg-
mento D o J; 3) la combinación aleatoria de diferentes cadenas
L y H; 4) hipermutación somática y 5) diversidad de unión pro-
ducida por la adhesión imprecisa durante el reordenamiento.
Cambio de clase de inmunoglobulina
Al inicio, todos los linfocitos B unidos a un antígeno portan
IgM específica para él y producen dicho anticuerpo. Después,
el reordenamiento de genes genera anticuerpos de diferente
clase pero con la misma especificidad antigénica. En el cam-
bio de clase, el mismo gen VH
ensamblado puede vincularse
de manera secuencial con diferentes genes CH
, de tal manera
que la inmunoglobulina que se produce (IgG, IgA o IgE) tiene
la misma especificidad que la IgM original pero con diferen-
tes características biológicas. El cambio de clase depende de
citosinas liberadas de los linfocitos T. En fecha reciente se ha
demostrado que la IL-4, la IL-5, el IFN-γ y el factor transfor-
mador de crecimiento β (TGF-β, transforming growth factor-β)
participan en la regulación del cambio de clase de Ig.
Respuestas mediadas por anticuerpos
A. Respuesta primaria
Cuando un individuo se encuentra con un antígeno por pri-
mera vez, el anticuerpo que se produce se detecta en el suero
días o semanas después. Este lapso varía dependiendo de la
naturaleza, la dosis y la vía de administración del antígeno
(p. ej., oral o parenteral). La concentración sérica de anticuer-
pos continúa elevándose durante muchas semanas y después
disminuye, en ocasiones hasta niveles muy bajos (figura 8-7).
Los primeros anticuerpos que se producen son IgM. Después,
IgG o IgA, o ambas. Los niveles de IgM tienden a disminuir
antes que los de IgG.
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![142 SECCIÓN II Inmunología
través de la vía clásica. Además, sólo las subclases 1, 2 y 3 de la
IgG fijan al complemento, a diferencia de la IgG4.
Un ejemplo de la vía clásica del complemento en acción se
puede observar en las infecciones por el virus del herpes simple
(HSV, herpes simplex virus). La replicación de este virus den-
tro de las células está acompañada de la inserción de proteínas
víricas en la superficie de la membrana celular. Un anticuerpo
anti-HSV específico puede unirse a la superficie de la célula
infectada por su fragmento Fab. La porción Fc del complejo
antígeno-anticuerpo queda ahora expuesta y está lista para que
se adhiera la proteína C1. La vía clásica ahora queda activada y
la célula infectada es destruida por el MAC.
Vía alternativa
La vía alternativa del complemento puede ser activada por agen-
tes infecciosos que inducen el sistema del complemento al iniciar
la producción celular de los factores B, D y properdina. Estos
factores dividen a C3 y generan convertasa de C3. Esta molécula
(C3bBb)queseprodujoenlavíaalternativacreamásC3b.LaC3b
Complejo de ataque de membrana
C5b–C9
Lisis celular
Convertasas de C3
C5b
C6,C7,C8,C9
Factor B
Factor D
Properidina
C4
C2
C1
activado
Complejo
inmunitario
Superficies
microbianas
Vía
clásica
Vía
alternativa
C3
[C4b2b] [C3bBb]
Convertasas de C5
[C4b2bC3b] [C3bBbC3b] Anafilatoxinas
C3b
C3a
C3
C5a
C5
Vía de la lectina
fijadora de manosa
Superficies
microbianas
MBL
FIGURA 88 Secuencia de reacciones del sistema del
complemento.
adicional se une a la convertasa de C3 para formar C3bBbC3b.
Esta enzima es la convertasa C5 de la vía alternativa que genera
C5b, lo que provoca la producción del MAC antes descrito.
Vía de la lectina fijadora de manosa
La vía de la lectina es un componente importante de la res-
puesta inmunitaria innata y es similar a la vía clásica en el
punto de división de C4. Sin embargo, la diferencia principal
radica en que inicia por la unión de lectina fijadora de manosa
(MBL, mannose-binding lectin) a polisacáridos localizados en
la superficie de las bacterias. La unión de MBL a un patógeno
resulta en la formación de un complejo triple de MBL con dos
proteasas de serina (MASP-1 y MASP-2). Este complejo triple
ahora es activado para dividir a C4 en C4a y C4b y a C2 en C2a
y C2b. El nuevo complejo C4bC2a es una convertasa de C3 y la
serie de reacciones procede como en la vía clásica.
A. Regulación del sistema del complemento
Para evitar la constante activación del complemento, existe
una red reguladora para terminar su actividad. Muchas pro-
teínas séricas regulan el sistema del complemento en etapas
diferentes: 1) la proteína inhibidora C1 se une a C1r y C1s e
inactiva su actividad de proteasa de serina, provocando que se
disocien de C1q; 2) el factor I divide a C3b y a C4b, reduciendo
así la cantidad de convertasa de C5 disponible; 3) el factor H
potencia el efecto del factor I sobre C3b y (4) el factor P (pro-
perdina) protege a C3b y estabiliza la convertasa de C3 de la vía
alternativa. Proteínas con la capacidad de acelerar la destruc-
ción de las proteínas del complemento también sirven como
reguladores, tales como el factor de aceleración de la destruc-
ción (DAF, decay-accelerating factor) que se expresa en la san-
gre y las células endoteliales, y puede apresurar la disociación
de convertasas C3 de las tres vías.
Deficiencias del complemento
y evasión de patógenos
Se han descrito muchas deficiencias genéticas de las proteínas
del complemento; éstas por lo general incrementan la sus-
ceptibilidad a desarrollar enfermedades infecciosas (p. ej., la
deficiencia de C2 a menudo provoca infecciones piogénicas
graves). La deficiencia de los componentes de la MAC mejora
de manera considerable la susceptibilidad a las infecciones por
neisseria. También se conocen deficiencias de los componentes
de la vía alternativa (p. ej., la insuficiencia de properdina está
relacionada con mayor susceptibilidad a enfermedades menin-
gocócicas). También hay deficiencias de proteínas que regulan
al complemento. Por ejemplo, la falta de la proteína inhibidora
C1 causa angioedema hereditario.
El complemento es un importante sistema protector del
hospedador. Sin embargo, algunas bacterias han desarrollado
mecanismos para evadir la actividad del complemento. Por
ejemplo, son capaces de interferir con la opsonización u obs-
truir la inserción del MAC. La activación del complemento
también se inhibe por la presencia de proteínas producidas por
las bacterias, como la proteína A y la proteína C, que se unen a
la porción Fc de la IgG. Por último, pueden producir enzimas
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![CAPÍTULO 8 Inmunología 143
que degradan componentes del complemento. Los organis-
mos que poseen estas propiedades inhibidoras por lo general
son más patogénicos.
El sistema del complemento también ha desarrollado
estrategias para atacar a virus libres y a células infectadas por
virus. En respuesta, los virus han desarrollado mecanismos
para evadir el ataque del complemento. Algunos virus, como el
de la viruela, codifican proteínas capaces de inhibir la función
del complemento del hospedador. Otros virus con envoltura,
como un citomegalovirus, pueden recoger algunas de las pro-
teínas reguladoras del complemento conforme maduran salen
de la célula infectada. Estas proteínas reguladoras (CD46,
CD55 y CD59) presentes en la envoltura del virus son capaces
de inhibir la activación del complemento. Por último, muchos
virus (p. ej., el virus de Epstein-Barr [EBV, Epstein-Barr virus]
y el del sarampión) utilizan receptores del complemento para
entrar a las células e infectarlas.
CITOSINAS
En las dos últimas décadas se ha incrementado en gran medida
el estudio de la biología de las citosinas. Estas moléculas son
potentes reguladores celulares proteínicos de bajo peso mo-
lecular, que son producidos de forma transitoria y regional
por numerosos tipos de células. Hoy se reconoce que las cito-
sinas son proteínas multifuncionales cuyas propiedades bioló-
gicas sugieren una función importante en la hematopoyesis,
la inmunidad, las enfermedades infecciosas, la formación de
tumores, la homeostasis, la reparación de los tejidos y el desa-
rrollo y el crecimiento celulares.
Las citosinas por lo general actúan como moléculas de
señalización al unirse a sus propios receptores glucoproteínicos
localizados en las superficies celulares. Esta interacción inicial
es seguida por la transmisión de la señal al núcleo de la célula.
La transducción de señales es mediada, como en muchos siste-
mas receptores de hormonas, a través de la fosforilación de pro-
teínas citoplasmáticas mediante cinasas. De hecho, la actividad
de cinasa de tirosina es característica de muchos receptores de
citosinas. Debido a su participación en múltiples actividades
inmunitarias, las citosinas se mencionan a lo largo de este
capítulo. En los siguientes párrafos se describen las citosinas
principales y sus funciones.
Clasificación y funciones
Las citosinas se categorizan en grupos con base en sus funcio-
nes comunes. Algunos ejemplos de categorías funcionales son la
inmunorregulación, la proinflamación e inhibición de la infla-
mación, la quimiotaxia, la adhesión molecular, el crecimiento
y la diferenciación. El IFN-γ es una citosina inmunorregu-
ladora importante, debido a su importante participación en la
presentación de antígenos. Las citosinas proinflamatorias por
lo general proliferan en enfermedades infecciosas e incluyen
la IL-1, la IL-6, el TNF-α y los interferones. Algunas citosinas
antiinflamatorias son el TGF-β, el IFN-β y las interleucinas 10
y 11. Éstas pueden ser necesarias para disminuir una respuesta
inflamatoria hiperactiva. Entre las citosinas importantes para
el crecimiento o la diferenciación se encuentran los factores
estimulantes de colonias (CSF, colony-stimultating factors) y el
factor de células madre. En el cuadro 8-3 se muestran las fuen-
tes y las principales actividades de citosinas selectas.
Citosinas en el desarrollo de células
inmunitarias y defensa del hospedador
contra infecciones
Los linfocitos T CD4+
vírgenes se transforman en clases dife-
rentes dependiendo del ambiente exógeno de citosinas. Las
células Th1 se desarrollan en presencia de IL-12; las Th2 se
forman gracias a la acción de IL-4; las células Th17 se produ-
cen en presencia de TGF-β, IL-6 e IL-23, y las T reg se crean
en presencia sólo de TGF-β. Cada uno de estos cuatro linajes
produce citosinas que tienen una función primordial en la
defensa del hospedador contra microorganismos selectivos.
Las células Th1 producen IL-2 e IFN-γ, citosinas capaces de
controlar con eficacia infecciones víricas y organismos intra-
celulares como micobacterias y Toxoplasma gondii. El IFN-γ
es un importante activador de macrófagos y linfocitos T cito-
tóxicos CD8+
. Las células Th2 producen las interleucinas 4, 5,
6, 10 y 13, citosinas que dirigen respuestas mediadas por IgE y
ayudan a controlar infecciones parasitarias. Las células Th17
producen IL-17, una citosina que atrae neutrófilos y protege al
hospedador en barreras epiteliales y mucosas. Se ha demos-
trado que la IL-17 limita infecciones en la piel por Staphylo-
coccus aureus, en el colon por Citrobacter rodentium, en los
pulmones por Klebsiella pneumoniae, en la boca por Candida
albicans y en la vagina por Chlamydia. También se ha demos-
trado que la IL-17 inhibe infecciones fúngicas provocadas por
Pneumocystis carinii. Estudios recientes han demostrado que
mutaciones en los genes que codifican la IL-17 y sus receptores
predisponen a los individuos a experimentar mucocandidia-
sis crónica por C. albicans. Por último, los linfocitos T reg son
células reguladoras que ayudan a suprimir la proliferación de
linfocitos T y a mantener la tolerancia a los antígenos propios.
Se ha sugerido que la función de los linfocitos T reg es facili-
tada en parte por la producción de citosinas inmunosupreso-
ras, como la IL-10 y el TGF-β.
EsteanálisissobreladiferenciacióndelinfocitosTdemues-
tra la forma en la que subgrupos de estas células secretan sus
propias citosinas con distintas propiedades reguladoras. Por
lo tanto, las citosinas dirigen el tipo de respuesta inmunitaria
protectora que se genera.
Aplicaciones clínicas
Hasta la fecha hay al menos cuatro aplicaciones clínicas para
las citosinas. En primer lugar, estas moléculas pueden actuar
como biomarcadores de enfermedades y proporcionar pistas
para descifrar mecanismos fisiopatogénicos. Por ejemplo, las
citosinas proinflamatorias TNF-α, IL-1 e IL-6 pueden detec-
tarse en el suero de pacientes con choque séptico. Estas molécu-
las parecen tener una función importante en el desarrollo de
choque séptico, y monitorizar su presencia puede tener valor
pronóstico en casos de septicemia grave. En segundo lugar,
la medición de la producción de citosinas in vitro sirve para
monitorizar el estado del sistema inmunitario. El funcio-
namiento de los linfocitos T se refleja en su capacidad para
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![148 SECCIÓN II Inmunología
La enzima se detecta buscando la actividad enzimática con
su sustrato. Para medir la concentración de anticuerpos, se
adhieren antígenos conocidos a una fase sólida (p. ej., una
placa de plástico microtitulada) que se incuba con diluciones
de anticuerpos, se lava y se incuba de nuevo con una antiin-
munoglobulina marcada con una enzima (p. ej., peroxidasa de
Armoracia rusticana [rábano picante]). La enzima conjugada
a la fracción de detección produce color cuando se agrega el
sustrato específico. Entre más antígenos se unan a los anticuer-
pos, mayor será la concentración de enzima y la tinción será
más notable. En consecuencia, la intensidad de color generada
es directamente proporcional a la concentración de anticuer-
pos adheridos. Esta prueba serológica se utiliza para detectar
anticuerpos en un gran número de enfermedades infeccio-
sas, como anticuerpos contra proteínas del VIH en muestras
de sangre o anticuerpos contra Treponema pallidum, el orga-
nismo causante de la sífilis. Este ensayo se usa con frecuencia
para detectar autoanticuerpos presentes en la circulación de
pacientes con enfermedades autoinmunitarias sistémicas o
de órganos específicos (p. ej., anticuerpos en pacientes con
lupus eritematoso sistémico, escleroderma y el síndrome de
Sjögren). La prueba tradicional de inmunoadsorbente ligado
a enzimas tiene algunas variaciones nuevas, como el ensayo
de quimioluminiscencia (CIA, chemiluminescence assay) y los
análisis múltiplex basados en partículas.
B. Inmunofluorescencia
Cuando un anticuerpo es marcado con un tinte fluorescente
(p. ej., fluoresceína o rodamina), es posible observar su presen-
cia utilizando luz ultravioleta en un microscopio de fluores-
cencia. Este sistema puede ser directo o indirecto. En el ensayo
de fluorescencia directa, se marca un anticuerpo específico
conocido con un tinte fluorescente. Se agrega una muestra con
organismos desconocidos a un portaobjetos y se incuba con el
anticuerpoespecíficomarcadoconfluoresceína(p.ej.,anticuer-
po contra estreptococos). Después se lava la muestra y se ana-
liza con un microscopio de fluorescencia. Si la muestra contiene
estreptococos, se observará fluorescencia de color verde. En los
ensayos de fluorescencia indirecta se utiliza un procedimiento
de dos pasos para detectar la presencia de anticuerpos especí-
ficos para organismos determinados (como anticuerpos con-
tra treponema) en una muestra de suero. Primero se coloca
un antígeno conocido (treponema) en un portaobjetos, el cual
se incuba con una muestra de suero. Después se remueve la
muestra, se lava la laminilla y se agrega una segunda anti-in-
munoglobulina macada con fluoresceína. A continuación se
lava el portaobjetos y se examina con un microscopio de fluo-
rescencia. Si el suero del paciente contenía anticuerpos contra
treponema, el organismo se verá de color verde. Este ensayo se
ha utilizado para detectar anticuerpos contra ciertos organis-
mos (p. ej., T. pallidum) y es el procedimiento estándar para
identificar autoanticuerpos en pacientes con enfermedades
autoinmunitarias (p. ej., anticuerpos antinucleares).
C. Inmunotransferencia Western
La inmunotransferencia Western se utiliza para identifi-
car un antígeno en una mezcla compleja de proteínas. Ésta
(p. ej., microorganismos) se analiza mediante el método de
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, polyacrylamide
gel electrophoresis)-dodecilsulfato de sodio (SDS, sodium dode-
cyl sulfate). Con este procedimiento se separan las proteínas en
un gel según su carga y su peso molecular. Después se cubre
el gel con una membrana (por ejemplo de nitrocelulosa) para
transferir las proteínas a ella. La membrana, que ahora con-
tiene las proteínas separadas, se incuba con una muestra de
suero. Si éste contiene un anticuerpo específico que reacciona
con una proteína de la membrana, el anticuerpo permanecerá
en la nitrocelulosa. A continuación se incuba la membrana con
una antiinmunoglobulina marcada con una enzima. Después
se lava la membrana y se incuba nuevamente con el sustrato
de la enzima. La mezcla que contiene la enzima y su sustrato
permite la detección colorimétrica. El complejo antígeno-an-
ticuerpo es visible como una banda separada. Este método se
utiliza mucho como prueba secundaria para diagnosticar la
enfermedad de Lyme y detectar al HCV. En la actualidad esta
tecnología se aplica para identificar autoanticuerpos en enfer-
medades autoinmunitarias específicas (p. ej., polimiositis).
Algunas variaciones de este método son los ensayos de hibri-
dación dot o slot blot, los cuales utilizan antígenos purificados
que se adhieren a una membrana de nitrocelulosa.
D. Otros estudios de laboratorio
Otros estudios de laboratorio a menudo disponibles son la
electroforesis de proteínas y la electroforesis por inmunofija-
ción, exámenes esenciales para identificar la producción irre-
gular de inmunoglobulinas en el suero o la orina de pacientes
con mieloma. La nefelometría es otra prueba de laboratorio
que cuantifica una amplia variedad de análitos en el suero o
en el plasma. Éste es el método de elección para cuantificar los
componentes del complemento, las inmunoglobulinas y otros
analitos séricos. Estos ensayos también se utilizan para valo-
rar otras irregularidades relacionadas con estas infecciones
específicas (p. ej., el HCV puede relacionarse con una proteína
monoclonal y la presencia de crioglobulinas).
Evaluación de respuestas celulares
A. Citometría de flujo
La citometría de flujo es un método basado en láser que se uti-
liza para analizar células y sus componentes particulares. Una
de las aplicaciones más populares de este método es la deter-
minación del inmunofenotipo de poblaciones celulares. En
este método se hacen fluir suspensiones con una sola célula a
través de una celda de flujo en la que las células pasan por un
láser y son detectadas por la luz que dispersan. Si las células
también contienen moléculas fluorescentes, esto se revelará. La
luz dispersada y la fluorescencia se registran y analizan para
identificar subpoblaciones en la muestra. Es relativamente fácil
separar las células en clases mayores; los linfocitos, que son
pequeños, se aíslan de los granulocitos, que son más grandes y
contienen más gránulos (y que por lo tanto disipan más la luz).
Una segunda manera de analizar estas células es evaluar
moléculas de su superficie marcadas con tintes fluorescentes.
Se usa la nomenclatura de los conglomerados de diferenciación
(CD). En la actualidad se han identificado más de 300 CD. Hay
disponibles anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD que
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![CAPÍTULO 9 Patogenia de la infección bacteriana 155
de Koch o los postulados moleculares de Koch. La reacción en
cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) se
utiliza para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos espe-
cíficas de cada microorganismo a partir de los tejidos o líquidos
del hospedador. Estas secuencias se utilizan para identificar a
los microorganismos causales. En el cuadro 9-1 se enumeran los
postulados moleculares para establecer la causa de una enfer-
medad microbiana. Este método se ha utilizado para establecer
la causa de diversas enfermedades como la enfermedad de Whi-
pple (Tropheryma whipplei), angiomatosis bacilar (Bartonella
henselae), ehrlichiosis monocítica humana (Ehrlichia chaffeen-
sis), síndrome pulmonar por hantavirus (virus Sin Nombre) y
sarcoma de Kaposi (herpesvirus humano 8).
El análisis de la infección y la enfermedad aplicando una
serie de normas como los postulados de Koch, permite clasi-
ficar a las bacterias en patógenas, patógenas oportunistas o
no patógenas. Algunas especies de bacterias siempre se con-
sideran patógenas y su presencia es anormal; dos ejemplos de
esto son Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) y Yersinia
pestis (peste). Estas bacterias cumplen con facilidad los pos-
tulados de Koch. Otras especies que a menudo forman parte
de la microbiota normal de los seres humanos (y animales)
también producen enfermedades con frecuencia. Por ejemplo,
E. coli forma parte de la microbiota digestiva de los seres hu-
manos sanos, pero también constituye una causa frecuente de
infecciones urinarias, diarrea del turista y otras enfermedades.
Las cepas de E. coli que causan enfermedades se distinguen de
las que no lo hacen al establecer: 1) si son virulentas en mode-
los animales o modelos in vitro y 2) si tienen una composi-
ción genética ligada a la generación de enfermedades. Otras
bacterias (p. ej., especies de Pseudomonas, Stenotrophomonas
maltophilia y levaduras y mohos) sólo causan enfermedad en
personas inmunodeprimidas y débiles, por lo que son patóge-
nos oportunistas.
TRANSMISIÓN DE LA INFECCIÓN
Las bacterias (y otros microorganismos) se adaptan a diversos
ambientes que comprenden fuentes externas como tierra, agua
y materia orgánica o fuentes internas encontradas dentro de
los insectos vectores, animales y seres humanos, donde por lo
general habitan y subsisten. Al hacerlo, las bacterias aseguran
su supervivencia y aumentan la probabilidad de transmisión.
Al producir una infección asintomática o enfermedad leve, en
lugar de la muerte del hospedador, los microorganismos que
habitan normalmente en las personas aumentan la probabili-
dad de transmisión de una persona a otra.
Algunas bacterias que con frecuencia causan enfermeda-
des en los seres humanos, existen principalmente en animales
e infectan de manera incidental al ser humano. Por ejemplo,
algunas especies de Salmonella y Campylobacter infectan a
los animales y son transmitidas en productos alimenticios al
ser humano. Otras bacterias generan infecciones en los seres
humanos de manera involuntaria, un error en el ciclo vital nor-
mal del microorganismo; éstos no se han adaptado a las per-
sonas y la enfermedad que generan en ocasiones es grave. Por
ejemplo, Y. pestis (peste) tiene un ciclo vital bien establecido en
los roedores y pulgas de roedores y su transmisión a través de
las pulgas a los seres humanos es involuntaria; Bacillus anthra-
cis (carbunco) vive en el medio ambiente; en ocasiones infecta a
los animales y se transmite a los seres humanos a través de cier-
tos productos como pelo natural de animales infectados. Las
especies de Clostridium se encuentran en el medio ambiente y
se transmiten al ser humano a través de su ingestión (p. ej., gas-
troenteritis por C. perfringens y C. botulinum [botulismo]) o
cuando las heridas se contaminan con tierra (p. ej., C. perfrin-
gens [gangrena gaseosa] y C. tetani [tétanos]). Tanto Bacillus
anthracis como las especies de Clostridium, elaboran esporas
para proteger el ácido nucleico del microorganismo de diver-
sos factores ambientales nocivos como la luz ultravioleta, la
desecación, los detergentes químicos y los pH extremos. Estas
esporas garantizan la supervivencia en ambientes externos,
incluidos los alimentos que ingiere el ser humano. Después
de ser ingeridas o inoculadas, las esporas germinan para for-
mar una estructura vegetativa y metabólicamente activa del
microorganismo patógeno.
Las manifestaciones clínicas de las enfermedades (p. ej.,
diarrea, tos, secreción genital) producidas por los microorga-
nismos, a menudo facilitan su transmisión. Algunos ejemplos
de síndromes clínicos y la manera como facilitan la transmi-
sión de la bacteria causal son los siguientes: Vibrio cholerae pro-
voca diarrea abundante que contamina el agua salada y el agua
dulce; el agua potable o los mariscos como ostiones y cangrejos
también se contaminan; al consumir agua o mariscos conta-
minados la persona se infecta y enferma. Asimismo, la con-
taminación de los productos alimenticios con aguas residuales
que contienen E. coli que provoca diarrea, tiene como resultado
la transmisión de las bacterias. M. tuberculosis (tuberculosis)
infecta de manera natural sólo al ser humano; causa una enfer-
medad respiratoria con tos y producción de aerosoles, lo que
provoca la transmisión de la bacteria de persona a persona.
Muchas bacterias se transmiten de persona a persona a
través de las manos. El individuo con S. aureus en las narinas
se frota la nariz, recoge los estafilococos en las manos y dise-
mina las bacterias hacia otras partes del cuerpo o a otra per-
sona, donde genera una infección. Muchos microorganismos
patógenos oportunistas que causan infecciones hospitalarias
se transmiten de un paciente a otro a través de las manos del
personal que trabaja en el hospital. Por lo tanto, el hecho
de lavarse las manos constituye un componente importante en
el control de infecciones.
Las vías de entrada de bacterias patógenas al cuerpo más
frecuentes son los sitios donde las mucosas se unen con la piel,
p. ej., aparato respiratorio (vías respiratorias superiores e infe-
riores), tubo digestivo (principalmente la boca), aparato genital
y urinario. Las áreas anormales de mucosas y piel (p. ej., lace-
raciones, quemaduras y otras lesiones) también constituyen
sitios frecuentes de entrada. La piel y mucosas íntegras propor-
cionan la defensa principal contra la infección. Para producir
una enfermedad, los microorganismos patógenos deben vencer
estas barreras.
PROCESO INFECCIOSO
En el organismo, la mayor parte de las bacterias que generan
enfermedades lo hacen al adherirse a las células del hospedador,
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![160 SECCIÓN III Bacteriología
A. Exotoxinas
Muchas bacterias tanto grampositivas como gramnegativas
producen exotoxinas que tienen gran importancia médica.
Algunas de estas toxinas han tenido una participación muy
importante en la historia mundial. Por ejemplo, el tétanos cau-
sado por la toxina de C. tetani mató cerca de 50 000 soldados de
la Potencias del Eje (Axis powers) en la Segunda Guerra Mun-
dial; sin embargo, las fuerzas aliadas vacunaron a sus soldados
contra el tétanos y muy pocos murieron por esta enfermedad.
Se han creado vacunas contra algunas enfermedades mediadas
por exotoxinas y siguen siendo importantes en la prevención de
la enfermedad. Estas vacunas, llamadas toxoides, son elabora-
das a base de exotoxinas, que se modifican para que ya no sean
tóxicas. Muchas exotoxinas consisten en subunidades A y B
(a menudo llamadas toxinas binarias o toxinas de tipo III). Por
lo general la subunidad B controla la adhesión del complejo de
toxina a una célula hospedadora y ayuda a que la exotoxina
penetre en la célula hospedadora. La subunidad A proporciona
actividad tóxica. A continuación se ofrecen algunos ejemplos
de los mecanismos patógenos ligados a las exotoxinas. En los
capítulos que tratan sobre estas bacterias se describen otras
toxinas bacterianas.
C. diphtheriae es un bacilo grampositivo que se reproduce
en las mucosas del aparato respiratorio superior o en heridas
cutáneas menores (capítulo 12). Las cepas de C. diphtheriae
que transportan un corinebacteriófago temperado y lisógeno
(fago β o fago ω) con el gen estructural para la toxina, son toxí-
genos y producen la toxina de la difteria que causa difteria.
Son numerosos los factores que regulan la producción de la
toxina; cuando la disponibilidad de hierro inorgánico consti-
tuye el factor que limita la velocidad de proliferación, entonces
se produce la máxima cantidad de toxina. La toxina es secre-
tada como una sola molécula de polipéptido (peso molecu-
lar [MW, molecular weight] 62000). Esta toxina natural sufre
degradación enzimática para formar dos fragmentos, A y B,
unidos por un puente disulfuro. El fragmento B (PM 40 700)
se une a ciertos receptores de la célula hospedadora y facilita la
penetración del fragmento A (MW 21150) hacia el citoplasma.
El fragmento A inhibe al factor de elongación EF-2 de la cadena
peptídica, al catalizar una reacción que adhiere un difosfato de
adenosina–ribosilo al EF-2, lo que genera un complejo inactivo
de difosfato de adenosina-ribosa-EF-2. La interrupción de la
síntesis de proteínas altera las funciones fisiológicas celulares
normales. La toxina diftérica es muy potente.
C. tetani es un bacilo anaerobio grampositivo que causa
tétanos (capítulo 11). C. tetani del medio ambiente contamina
las heridas y sus esporas germinan en el medio anaerobio del te-
jido desvitalizado. Con frecuencia la infección es leve y no tiene
manifestaciones clínicas. Las formas vegetativas de C. tetani
producenlatoxinatetanoespasmina(MW150000)queesfrag-
mentada por una proteasa bacteriana hasta formar dos pépti-
dos (MW 50000 y MW 100000) unidos por un puente disul-
furo. Al principio la toxina se fija a receptores en las membra-
nas presinápticas de las neuronas motoras. Después migra por
el sistema de transporte axonal retrógrado hasta los cuerpos
celulares de estas neuronas y hasta la médula espinal y tronco
del encéfalo. La toxina se difunde hasta las terminales de las
células inhibidoras incluidas interneuronas glicinérgicas y
neuronas secretoras de ácido aminobutírico gamma (GABA,
gamma-aminobutyric acid) del tronco del encéfalo. La toxina
degrada a la sinaptobrevina, proteína necesaria para el aco-
plamiento de las vesículas neurotransmisoras en la membrana
presináptica. La liberación de glisina inhibidora y GABA se
bloquea y las neuronas motoras no se inhiben. El resultado
es una parálisis espástica. Incluso una cantidad sumamente
pequeña de toxina es mortal para el ser humano. El tétanos se
puede evitar en las personas con una inmunidad normal vacu-
nándolos con toxoide tetánico.
C. botulimun produce botulismo. Este microorganismo
anerobio, grampositivo productor de esporas se encuentra en
la tierra o el agua y algunas veces crece en los alimentos (p. ej.,
alimentos envasados o enlatados) cuando el ambiente es lo sufi-
cientemente anaerobio. Produce una toxina sumamente po-
tente (la más potente que se conoce). Es termolábil y por lo tanto
se destruye con calor suficiente. Existen siete tipos serológicos
de toxina. Los que con mayor frecuencia causan enfermedad en
el ser humano son los tipos A, B, E y F. La toxina es muy simi-
lar a la toxina tetánica, con una proteína con un peso mo-
lecular de 150000 que se fragmenta hasta formar una proteína
con un peso molecular de 100000 y otra con peso molecular
de 50000 unidas por un puente disulfuro. La toxina botulínica
es absorbida en el intestino, se adhiere a los receptores de las
membranas presinápticas de las neuronas motoras, localiza-
das en el sistema nervioso periférico y pares craneales. La pro-
teólisis, a través de la cadena ligera de la toxina botulínica, en
las neuronas, inhibe la liberación de acetilcolina en la sinapsis,
lo que tiene como resultado ausencia de contracción muscular
y parálisis flácida.
Las esporas de C. perfringens se introducen en las heridas
por contaminación con tierra o materia fecal. En presencia de
tejido necrótico (ambiente anaerobio), las esporas germinan
y las células vegetativas producen muchas toxinas distintas.
Muchas de éstas son necrosantes y hemolíticas y, junto con
la distensión de los tejidos por el gas formado a partir de los
carbohidratos y la interferencia con la irrigación, favorecen la
diseminación de gangrena gaseosa. La toxina alfa de C. per-
fringens es una lecitinasa que daña las membranas celulares al
degradar a la lecitina para formar fosforilcolina y diglicérido.
La toxina teta también posee un efecto necrosante. Las especies
de Clostridium también producen colagenasas y DNAsas.
Algunas cepas de S. aureus que proliferan en las membra-
nas mucosas (p. ej., la vagina durante la menstruación) o en
las heridas, elaboran toxina-1 del síndrome de choque tóxico
(TSST-1, toxic shock syndrome toxin-1), que causa el síndrome
de choque tóxico (capítulo 13). Esta enfermedad se caracteriza
por choque, fiebre elevada y un eritema rojo difuso que más
tarde se descama; abarca muchos otros órganos y sistemas.
TSST-1 es un superantígeno (también denominado toxina de
tipo I), y los superantígenos no necesitan entrar a las células
para causar su potente alteración celular. La TSST-1 estimula a
la mayor parte de linfocitos T mediante unión directa a recep-
tores de MHC-II y a linfocitos T. El resultado neto es la produc-
ción de cantidades grandes de citocinas interleucina 2 (IL-2,
interleukin-2), interferón gamma y factor de necrosis tumoral
(TNF, tumor necrosis factor) (capítulo 8). Las manifestaciones
clínicas principales de la enfermedad parecen ser secundarias
a los efectos de las citocinas. Los efectos sistémicos de TSST-1
se deben a la estimulación masiva de citocina. Ciertas cepas
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![172 SECCIÓN III Bacteriología
Glabella
Pliegue alar
Conducto auditivo
externo
Narinas
Manubrio
Cúpula axilar
Fosa cubital
anterior
Cara volar
del antebrazo
Porción hipotenar
de la palma de la
mano
Espacio
interdigital
Pliegue inguinal
Ombligo
Espacios interdigitales
de los pies
Pliegue
retroauricular
Occipucio
Espalda
Nalgas
Pliegue
glúteo
Fosa poplítea
Talón
Sebáceas
Húmeda
Secas
Actinobacterias Bacteroidetes Proteobacterias
Divisiones que contribuyen a menos de 1%
Sin clasificar
Cyanobacteria
Firmicutes
Corynebacteriaceae
Propionibacteriaceae
Micrococciaceae
Otras actninobacterias
Otros firmicutes
Staphylococcaceae
FIGURA 101 Distribución topográfica de las bacterias en las regiones cutáneas. El microbioma cutáneo depende en gran parte del
microambiente de la región de donde se obtiene la muestra. Se señala la clasificación a nivel de familias de las bacterias que colonizan a un sujeto
con la fila en negritas. Las regiones seleccionadas fueron las que exhibían cierta predilección por las infecciones cutáneas bacterianas
y se agrupan en sebáceas o grasas (círculos azules); húmedas (típicamente los pliegues cutáneos; círculos verdes) y superficies secas u opacas
(círculos rojos). Las regiones sebáceas son la glabela (entre las cejas), el pliegue alar (a los lados de las narinas); el conducto auditivo externo [dentro
del oído]), el plieque retroauricular (detrás del pabellón auricular), el occipucio (detrás de la cabeza), el pliegue cubital anterior (cara interna del
codo), los pliegues interdigitales (entre los dedos medio y anular), el pliegue inguinal (dentro de la ingle), el pliegue glúteo (la parte superior
del pliegue entre los glúteos), la fosa poplítea (detrás de la rodilla), el talón plantar (porción inferior del talón del pie), espacios interdigitales de los
pies y ombligo. Las regiones secas son la cara volar del antebrazo (cara interna del antebrazo), porción hipotenar de la palma (porción de la palma
proximal al dedo meñique) y glúteo. (Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd.: Grice EA, Segre JA, The Skin microbiome. Nat Rev
Microbiol 2011;9:244-253. Copyright © 2011.)
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![CAPÍTULO 11 Bacilos grampositivos formadores de esporas: Bacillus y Clostridium 181
característica. Se acompañan de edema pronunciado. Algunas
veces también existe linfangitis y linfadenopatía, además de
signos y síntomas generales, como fiebre, malestar general y
cefalea. Después de 7 a 10 días, la escara alcanza su máximo
desarrollo. Por último se seca, debilita y desprende. La cica-
trización se lleva a cabo por granulación y deja una cicatriz.
Algunas veces la lesión tarda varias semanas en cicatrizar y el
edema el mismo tiempo en desaparecer. Al parecer la antibio-
ticoterapia no modifica la evolución natural de la enfermedad,
pero previene su diseminación. Hasta en 20% de los pacientes,
el carbunco cutáneo genera septicemia, las consecuencias de
una infección generalizada, incluida meningitis, y la muerte.
El periodo de incubación del carbunco pulmonar puede ser
hasta de seis semanas. Las primeras manifestaciones clínicas
son las de necrosis hemorrágica pronunciada y edema medias-
tínico. Algunas veces predomina el dolor retroesternal y se
acompaña de ensanchamiento pronunciado del mediastino en
la radiografía de tórax. Una vez que se extiende a la pleura, apa-
recen derrames pleurales hemorrágicos; la tos es secundaria a
sus efectos sobre la tráquea. Lo siguiente es la septicemia, con
diseminación del micoorganismo por vía hematógena hacia el
aparato digestivo, lo cual provoca úlceras intestinales, o hacia
las meninges, situación que causa meningitis hemorrágica. La
mortalidad del carbunco pulmonar es alta cuando ha existido
un contacto previo; es mayor si el diagnóstico no se sospecha
desde el principio.
Los animales adquieren el carbunco al ingerir esporas y
la diseminación ulterior está dada por los microorganismos
desde el aparato digestivo. Esto es inusual en el ser humano y
el carbunco del tubo digestivo es muy poco frecuente. Algu-
nos signos clínicos abarcan dolor abdominal, vómito y diarrea
hemorrágica.
El carbunco por inyección se caracteriza por edema
extenso, indoloro, subcutáneo y ausencia notable de las costras
clásicas del carbunco cutáneo. Los pacientes pueden evolucio-
nar a inestabilidad hemodinámica debido a la septicemia.
Pruebas diagnósticas de laboratorio
Las muestras que se examinan son líquido o pus de las lesiones
locales, sangre, y líquidos pleural y cefalorraquídeo en el car-
bunco pulmonar, acompañados de septicemia y heces fecales u
otros contenidos intestinales en el caso del carbunco digestivo.
Los frotis teñidos de la lesión circunscrita o la sangre de ani-
males muertos a menudo muestran cadenas de grandes baci-
los grampositivos. El carbunco se identifica en frotis secos por
medio de técnicas de tinción inmunofluorescente.
Cuando se cultivan en placas de agar sangre, los microor-
ganismos producen colonias no hemolíticas de color gris o
blanco, con una textura rugosa y aspecto de vidrio esmerilado.
Algunas veces producen prolongaciones con forma de coma
(“cabeza de Medusa”) en la colonia. Para demostrar la presencia
de una cápsula es necesario cultivarlas en un medio de cultivo
con bicarbonato en dióxido de carbono al 5 a 7%. La tinción
de Gram permite observar los bacilos grampositivos grandes.
La fermentación de carbohidratos es inútil. En medio semisó-
lido, los bacilos del carbunco son inmóviles mientras que los
microorganismos afines (p. ej., B. cereus) presentan movilidad
por “amontonamiento”. Cuando un laboratorio clínico obtiene
bacilos grampositivos grandes en sangre, líquido cefalorraquí-
deo o lesiones cutáneas sospechosas, cuyo fenotipo concuerda
con la descripción de B. anthracis, es necesario ponerse en con-
tacto de inmediato con el laboratorio de salud pública y enviar
el microorganismo para su confirmación. La identificación
definitiva requiere de lisis con un bacteriófago-γ específico
para carbunco, detección de la cápsula por medio de anticuer-
pos fluorescentes o identificación de los genes de la toxina por
medio de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, poly-
merase chain reaction). Estas pruebas se realizan en casi todos
los laboratorios de salud pública.
La Food and Drug Administration (FDA) de Estados Uni-
dos diseñó un enzimoinmunoanálisis (ELISA, enzyme–linked
immunoassay) para medir los anticuerpos totales contra el PA,
pero el resultado no es positivo al principio de la enfermedad.
Resistencia e inmunidad
La vacunación para prevenir el carbunco se basa en los expe-
rimentos clásicos de Louis Pasteur. En 1881, este científico
demostró que los cultivos en caldo de 42 a 52 °C, durante varios
meses, pierden gran parte de su virulencia y se pueden inyectar
en ganado vacuno o bovino sin generar la enfermedad. Tiempo
después se comprobó que estos animales eran inmunes. Tam-
bién es posible inducir inmunidad activa al carbunco en ani-
males susceptibles al vacunarlos con bacilos vivos atenuados,
suspensiones de esporas o PA proveniente de filtrados de culti-
vos. Los animales que pastan en zonas donde se sabe que pre-
valece el carbunco deben vacunarse cada año.
En Estados Unidos, la vacuna aprobada por la FDA (va-
cuna adsorbida contra carbunco [AVA, anthrax vaccine adsor-
bed]) se elabora con sobrenadante de un cultivo de células libres
de una cepa no encapsulada pero toxígena de B. anthracis, que
contiene PA adsorbido a hidróxido de aluminio. La posología
es de 0.5 ml administrados por vía intramuscular las semanas
0 y 4, y después a los seis, 12 y 18 meses seguidos de refuerzos
anuales. Esta vacuna se encuentra disponible de forma exclu-
siva para el Department of Defense de Estados Unidos y para
las personas con riesgo de tener contactos repetidos con B.
anthracis. Dado que las vacunas actuales contra el carbunco
proporcionan inmunidad de corta duración y, por lo tanto,
se requieren vacunaciones repetidas, se ha perfeccionado una
cantidad de vacunas con PA recombinante (rPA, recombinant
PA) nuevas. Se ha demostrado que dichas vacunas novedosas se
toleran bien y tienen alta inmunogenicidad (véase descripción
en Tratamiento).
Tratamiento
En seres humanos, muchos antibióticos son eficaces para tratar
el carbunco pero deben iniciarse cuanto antes. Para este último,
se recomienda ciprofloxacina; otros fármacos con actividad
incluyen penicilina G, desoxiciclina, eritromicina y vancomi-
cina. En el contexto de la exposición potencial a B. anthracis
como un arma de guerra biológica, la profilaxia con ciprofloxa-
cina o doxiciclina debe administrarse durante 60 días y tres
dosis de AVA.
La FDA aprobó el raxibacumab, un anticuerpo mono-
clonal recombinante de ser humano, a finales de 2012 para
tratamiento y profilaxia contra el carbunco pulmonar. El
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![CAPÍTULO 11 Bacilos grampositivos formadores de esporas: Bacillus y Clostridium 183
que generan botulismo, tétanos, gangrena gaseosa y colitis
seudomembranosa.
Morfología e identificación
A. Microorganismos típicos
Por lo general, las esporas de los clostridios son más amplias
que el diámetro de los bacilos a partir de los cuales se forman.
En las diversas especies, la espora tiene una ubicación central,
subterminal o terminal. La mayor parte de los clostridios es
móvil y posee flagelos perítricos. En la figura 11-2, se muestran
clostridios con esporas terminales.
B. Cultivo
Los clostridios son anaerobios y proliferan en un ambiente
anaerobio; muy pocas especies son aerotolerantes y crecen en
el aire ambiental. En el capítulo 21, se describen las caracterís-
ticas del cultivo anaerobio. En general, los clostridios crecen
mejor en medios enriquecidos con sangre u otras sustancias
utilizadas para cultivar anaerobios.
C. Formas de colonias
Algunos clostridios producen grandes colonias en relieve (p. ej.,
C. perfringens); otros generan colonias más pequeñas (p. ej., C.
tetani). Ciertos clostridios forman colonias que se diseminan
en la superficie de agar (Clostridium septicum). Muchos clos-
tridios producen una zona de hemólisis β en agar sangre. C.
perfringens da origen a una zona doble característica de la
hemólisis β alrededor de las colonias.
D. Características de crecimiento
Los clostridios pueden fermentar diversos carbohidratos (saca-
rolíticos) y muchos pueden digerir proteínas (proteolíticos);
algunas especies tienen ambas propiedades. Tales caracterís-
ticas metabólicas se utilizan para dividirlos en grupos. Unos
tornan ácida la leche, otros la digieren y un tercer grupo le pro-
voca la llamada “fermentación turbulenta” al romper grumos
con gas (p. ej., C. perfringens). Diferentes especies producen
varias enzimas. Clostridium genera más toxinas que cualquier
otro grupo de bacterias (véase más adelante).
CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Este microorganismo, que causa el botulismo, tiene una dis-
tribución mundial. Habita en la tierra y, a veces, en las heces
fecales de algunos animales.
Las variedades de C. botulinum se distinguen por el tipo
antigénico de la toxina que producen. Las esporas de este
microorganismo son muy resistentes al calor y soportan hasta
100 °C durante varias horas. Su termorresistencia disminuye
con un pH ácido o una concentración alta de sal.
Toxinas
Durante la proliferación de C. botulinum y en la autólisis de la
bacteria, se liberan toxinas hacia el ambiente. Se conocen siete
variedades antigénicas de la toxina (serotipos A-G). Las princi-
pales causas de enfermedad en el ser humano son los tipos A, B,
E y F. Las variedades A y B se han vinculado con gran diversi-
dad de alimentos y, el tipo E, principalmente con los productos
de la pesca. El tipo C es el botulismo de las aves; el tipo D causa
botulismo en mamíferos. La variedad G no es patógena. Las
toxinas botulínicas tienen tres dominios. Dos de ellos facilitan
la unión y el ingreso de la toxina a la célula nerviosa. El tercer
dominio es la toxina constituida por una proteína de 150 kDa
que se fractura en una cadena pesada (H, 100 kDa) y una cadena
ligera (L, 50 kDa), unidas por un enlace disulfuro. La toxina
botulínica se absorbe del intestino, entra en la circulación san-
guínea y se une a receptores de las membranas presinápticas
de las neuronas motoras del sistema nervioso periférico y los
pares craneales. No cruza la barrera hematoencefálica ni afecta
el sistema nervioso central. La proteólisis (por la cadena L de
la toxina botulínica) de las proteínas destinatarias de SNARE
(proteína de unión del factor sensible a la N-etilmaleimida
soluble), en las neuronas, inhibe la liberación de acetilcolina en
la sinapsis, lo cual resulta en ausencia de contracción muscu-
lar y en parálisis. Las proteínas de SNARE son sinaptobrevinas
(también conocidas como proteínas de membrana asociadas a
vesícula [VAMP, vesicle-associated membrane protein]), pro-
teína de unión a NSF soluble 25 (SNAP, soluble NSF attachment
protein 25) y sintaxina. Las toxinas de C. botulinum tipos A, C
y E fracturan a la SNAP 25 de 25 000 kDa. La de tipo C también
rompe la sintaxina. Las toxinas tipos B, D, F y G fracturan sólo
a la sinaptobrevina. Las toxinas de C. botulinum se encuentran
entre las sustancias más toxicas conocidas: la dosis letal para
un ser humano es quizá de alrededor de 1 a 2 μg/kg. Las toxi-
nas se destruyen con calor aplicado durante 20 min a 100 °C.
Se ha demostrado que cepas raras de Clostridium butyricum y
Clostridium baratii producen neurotoxina botulínica y causan
botulismo en personas. Las cepas productoras de toxinas A,
B o F se asocian con botulismo de la infancia. Rossetto et al.
FIGURA 112 Tinción de Gram de Clostridium. Se observan
algunos bacilos grampositivos. Muchos de ellos forman cadenas.
Algunos tienen esporas que no se tiñen o adquieren forma ovalada y
son transparentes (flechas).
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![194 SECCIÓN III Bacteriología
Anatomía patológica
La toxina de la difteria se absorbe hacia las mucosas y produce
destrucción del epitelio y una respuesta inflamatoria superfi-
cial. El epitelio necrótico queda embebido en la fibrina exuda-
tiva y los eritrocitos y leucocitos, de manera que se forma una
“seudomembrana” grisácea, por lo general sobre amígdalas,
faringe o laringe. Cualquier tentativa de eliminar la seudo-
membrana expone y desgarra los capilares y por lo tanto pro-
duce hemorragia. Los ganglios linfáticos del cuello aumentan
de tamaño y algunas veces se produce edema acentuado en
todo el cuello con distorsión de las vías respiratorias, a menudo
llamado “cuello proconsular”. Los bacilos de la difteria en la
membrana continúan produciendo toxina en forma activa. Ésta
se absorbe y el resultado es una lesión tóxica a distancia, prin-
cipalmente degeneración parenquimatosa, infiltración grasa y
necrosis en el músculo cardiaco (miocarditis), hígado, riñones
(necrosis tubular) y glándulas suprarrenales, acompañada en
ocasiones de hemorragia macroscópica. La toxina además pro-
voca lesión de los nervios (desmielinización), cuyo resultado
es a menudo parálisis del paladar blando, músculos oculares
o extremidades.
La difteria cutánea o de heridas es más frecuente en los
trópicos, aunque también se han descrito algunos casos en
climas templados entre alcohólicos, indigentes y otros gru-
pos empobrecidos. Se forma una membrana sobre una herida
infectada que no logra cicatrizar. Sin embargo, la absorción de
toxina suele ser leve y los efectos sistémicos insignificantes. La
pequeña cantidad de toxina que se absorbe durante la infec-
ción cutánea favorece el desarrollo de anticuerpos antitoxina.
La “virulencia” de los bacilos diftéricos se debe a su capacidad
para establecer la infección, su proliferación rápida y luego su
pronta elaboración de toxina que se absorbe de manera eficaz.
C. diphtheriae no tiene que ser toxígeno para establecer una
infección localizada (p. ej., en la nasofaringe o la piel) pero
las cepas antitoxígenas no producen efectos tóxicos localiza-
dos o sistémicos. C. diphtheriae no invade activamente tejidos
profundos y prácticamente nunca entra en la circulación san-
guínea. Sin embargo, es notable que en el transcurso de los
últimos dos decenios han aumentado los informes sobre infec-
ciones invasivas como la endocarditis y septicemia debida a C.
diphtheriae no toxígena.
Manifestaciones clínicas
Cuando la inflamación diftérica empieza en el aparato res-
piratorio, casi siempre se acompaña de dolor de garganta y
febrícula. La postración y la disnea se presentan poco después
por la obstrucción causada por la membrana. Esta obstruc-
ción puede incluso ocasionar asfixia si no se trata con rapidez
mediante intubación o traqueostomía. Las irregularidades del
ritmo cardiaco indican lesión del corazón. Más tarde, puede
haber dificultades visuales, de lenguaje, de la deglución o del
movimiento de los brazos o las piernas. Todas estas manifesta-
ciones tienden a desaparecer en forma espontánea.
En general, la variedad gravis tiende a producir una enfer-
medad más grave que la variedad mitis, pero todos los tipos
pueden producir enfermedad similar.
Pruebas diagnósticas de laboratorio
Son útiles para confirmar la impresión clínica y tienen impor-
tancia epidemiológica. Nota: El tratamiento específico nunca
debe demorarse por los resultados de laboratorio si el cuadro
clínico es muy sugestivo de difteria. Los médicos deben noti-
ficar al laboratorio clínico antes de obtener o remitir muestras
para cultivo.
Antes de la administración de fármacos antimicrobianos
deben obtenerse frotis de dacrón de la nariz, la faringe o de
otras lesiones sospechosas. El frotis debe obtenerse por debajo
de cualquier membrana visible. El frotis luego debe colocarse
en medios de transporte semisólidos como Amies. Los frotis
teñidos con azul de metileno alcalino o con tinción de Gram
muestran bacilos con forma de microesferas con una dis-
posición característica.
Las muestras deben ser inoculadas en una placa de agar
con sangre (para descartar la posibilidad de estreptococo
hemolítico), y un medio selectivo como placa de telurita (p. ej.,
agar con sangre y cistina-telurita [CTBA, cystine-tellurite blood
agar] o un medio modificado de Tinsdale) e incubado a 37 °C
en CO2
al 5%. Las placas se examinan de 18 a 24 h. En 36 a
48 h, las colonias en medio de telurita son lo suficientemente
definidas para el reconocimiento de C. diphtheriae. En el agar
de cistina con telurita, las colonias son negras con un halo café.
Una cepa presuntiva de C. diphtheriae debe someterse a
pruebas de toxigenicidad. Tales pruebas se realizan sólo en la-
boratorios de salud pública de referencia. Existen varios méto-
dos, a saber:
1. El método de Elek modificado descrito por la Unidad de
Referencia de Difteria de la OMS.
Un disco de papel de filtro que contiene antitoxina
(10 UI/disco) se coloca en una placa de agar. Los cultivos
en los que se debe comprobar la toxigenicidad se inocu-
lan (cuando menos se eligen 10 colonias) de 7 a 9 mm del
disco. Después de 48 h de incubación, la antitoxina que se
difunde desde el disco de papel ha precipitado la toxina
que se difunde desde los cultivos toxígenos y ha produ-
cido bandas de precipitina entre el disco y el crecimiento
bacteriano.
2. Se han descrito los métodos con base en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reac-
tion) para la detección del gen de la toxina diftérica (tox).
Los análisis de PCR para tox también se pueden utilizar
directamente en los especímenes de los pacientes antes que
se disponga de los resultados de cultivo. Un cultivo positivo
confirma un análisis de PCR positivo. Un cultivo negati-
vo después de la antibioticoterapia junto con un análisis de
PCR positivo indica que el paciente probablemente tiene
difteria.
3. Se pueden emplear enzimoinmunoanálisis de adsorción
(ELISA, enzyme–linked immunosorbent assay) para detec-
tar toxina diftérica de cepas de C. diphtheriae clínicas.
4. Un análisis de tira inmunocromográfica permite detectar
toxinas de la difteria en cuestión de horas. Este análisis es
muy sensible.
Los últimos dos estudios no se llevan a cabo en todos los
lugares.
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![204 SECCIÓN III Bacteriología
1. La producción de lactamasa β es frecuente, está sujeta a
control por plásmidos y hace que los microorganismos
sean resistentes a muchas penicilinas (penicilina G, ampi-
cilina, ticarcilina, piperacilina y fármacos afines). Los
plásmidos son transmitidos mediante transducción y tal
vez también mediante conjugación.
2. La resistencia a la nafcilina (y a la meticilina y la oxaci-
lina) es independiente de la producción de lactamasa β.
La resistencia a la nafcilina es codificada y regulada por
una serie de genes que se encuentran en una región del
cromosoma denominada cromosomas en casete estafilo-
cócicos mec (SCCmec, staphylococcal cassette chromosome
mec). De manera específica, el gen mecA y el recién des-
crito gen mecC en este locus codifican una proteína fija-
dora de penicilina (PBP2a, penicillin binding protein) de
baja afinidad que es la encargada de la resistencia. Hay 12
tipos diferentes de SCCmec. Los tipo I, II, III, VI y VIII
se relacionan con infecciones intrahospitalarias y pue-
den contener genes que codifican la resistencia también a
otros antimicrobianos. SCCmec tipo IV se ha encontrado
principalmente en S. aureus extrahospitalario resistente
a meticilina (CA-MRSA, community-acquired methici-
llin-resistant S. aureus) y tiende a ser menos resistente, más
contagioso y ha producido brotes en la última década en
Estados Unidos y algunos países de Europa. Los tipos IX
y X se relacionan con animales (MRSA asociado a ganado
[livestock-associated MRSA, LA-MRSA]; de ellos el IX con-
tiene mecC. Los demás tipos se limitan a diversas regiones
geográficas del mundo.
3. En Estados Unidos, S. aureus y S. lugdunensis se conside-
ran sensibles a la vancomicina cuando la concentración
inhibidora mínima (MIC) es de 2 μg/mL o menos; de sen-
sibilidad intermedia cuando la MIC es de 4 a 8 μg/mL; y
resistentes cuando la MIC es de 16 μg/mL o más. Las cepas
de S. aureus con sensiblidad intermedia a la vancomicina
se han aislado en Japón, Estados Unidos y varios otros
países. A menudo se conocen como S. aureus con resis-
tencia intermedia a vancomicina (VISA, vancomycin-in-
termediate S. aureus). Por lo general se han aislado de
pacientes con infecciones complejas que han recibido tra-
tamiento prolongado con vancomicina. A menudo el trata-
miento con vancomicina ha sido ineficaz. El mecanismo
de la resistencia se relaciona con un incremento en la sín-
tesis de pared celular y alteraciones de la misma y no se
debe a los genes van que se encuentran en los enteroco-
cos. Las cepas de S. aureus de sensibilidad intermedia a
la vancomicina por lo general son resistentes a nafcilina,
pero generalmente son sensibles a las oxazolidinonas y a
quinupristina/dalfopristina.
4. Desde 2002, se aislaron varias cepas de S. aureus resistente
a vancomicina (VRSA, vancomycin-resistant S. aureus)
en pacientes estadounidenses. Las cepas contenían el gen
de la resistencia a vancomicina vanA de los enterococos
(capítulo 14) y el gen de resistencia a nafcilina mecA (véase
antes). Las dos cepas iniciales de VRSA eran sensibles a los
otros antibióticos. La resistencia de S. aureus a vancomi-
cina es un problema importante en todo el mundo.
5. La resistencia mediada por plásmido a tetraciclinas, eri-
tromicina, aminoglucósidos y otros fármacos es frecuente
en los estafilococos.
6. La “tolerancia” implica que los estafilococos son inhibi-
dos por un fármaco pero no destruidos por el mismo; es
decir, hay una gran diferencia entre las concentraciones
mínimas inhibidoras y las concentraciones mínimas leta-
les de un antimicrobiano. Los pacientes con endocarditis
causada por un S. aureus tolerante pueden tener una evo-
lución clínica prolongada en comparación con los indi-
viduos que tienen endocarditis causada por un S. aureus
FIGURA 131 Tinción de Gram de Staphylococcus aureus que
muestra cocos grampositivos dispuestos en pares, tétradas y racimos.
Amplificación original ×1000. (Cortesía de L. Ching.)
FIGURA 132 Colonias de Staphylococcus aureus en una placa de
agar sangre después de la incubación durante 24 h. Las colonias de
color gris amarillo tienen 3 a 4 mm de diámetro en la placa de 10 cm.
Las colonias están rodeadas por zonas claras de hemólisis de casi 1 cm
de diámetro. (Cortesía de H. Reyes.)
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![213
14
Estreptococos, enterococos
y géneros relacionados
C A P Í T U L O
Los estreptococos, enterococos y microorganismos relaciona-
dos son bacterias esféricas que forman los característicos pares
o cadenas cuando crecen. Están ampliamente distribuidos en la
naturaleza. Algunos son miembros de las microbiotas normales
del ser humano, en tanto que otros ocasionan graves enfermeda-
des atribuibles a los efectos directos de la infección causada por
ellos, o en otros casos, a la respuesta inmunitaria contra ellos.
Los estreptococos elaboran sustancias extracelulares y enzimas.
Los estreptococos constituyen un gran grupo heterogéneo
de bacterias y no basta un solo sistema de clasificación para
abarcarlos. Sin embargo, conocer su taxonomía es esencial
para comprender su importancia en medicina.
CLASIFICACIÓN DE LOS ESTREPTOCOCOS
La clasificación de los estreptococos en grandes categorías se
ha basado en una serie de observaciones acumuladas durante
muchos años: 1) morfología de las colonias y reacciones hemo-
líticas en agar sangre; 2) especificidad serológica de la sustancia
de la pared celular específica de grupo (antígenos de Lancefield)
y otros antígenos parietales o capsulares; 3) reacciones bioquí-
micas y resistencia a factores físicos y químicos y 4) caracte-
rísticas ecológicas. En fecha reciente, la genética molecular
reemplazó métodos fenotípicos en la asignación taxonómica de
tales microorganismos. En el cuadro 14-1 se muestra resumida
la clasificación de estreptococos de importancia médica.
A. Hemólisis
Muchos estreptococos pueden producir hemólisis de los eri-
trocitos in vitro en grados variables. La destrucción completa
de los eritrocitos con el aclaramiento de la sangre alrededor
del crecimiento bacteriano se denomina hemólisis β. La lisis
incompleta de los eritrocitos con reducción de hemoglobina y
la formación de pigmento verde se llama hemólisis α. Otros
estreptococos no son hemolíticos (a veces se les denomina
hemólisis γ [gamma]).
En el cuadro 14-1 se muestran los patrones de hemólisis
de los estreptococos que tienen importancia médica para el ser
humano. Se utiliza la clasificación de los patrones hemolíticos
principalmente con los estreptococos y no con otras bacte-
rias que producen enfermedad y que suelen producir diversas
hemolisinas.
B. Sustancia específica de grupo
(clasificación de Lancefield)
Este hidrato de carbono está contenido en la pared celular de
muchos estreptococos y constituye la base del agrupamiento
serológico en los grupos de Lancefield A a H y K a U. La
especificidad serológica del hidrato de carbono específico
de grupo está determinada por un aminoglúcido. En caso de
estreptococos del grupo A, ésta es la ramnosa-N-acetilglucosa-
mina; en el caso del grupo B, es un polisacárido de ramnosa-
glucosamina; para el grupo C, es la ramnosa-N-acetilgalac-
tosamina; para el grupo D, es el ácido teicoico de glicerol que
contiene d-alanina y glucosa; y para el grupo F, es una gluco-
piranosil-N-acetilgalactosamina.
Se preparan extractos de antígeno específico para el agru-
pamiento de los estreptococos por diversos métodos: extrac-
ción del cultivo centrifugado tratado con ácido clorhídrico
caliente, ácido nitroso o formamida; mediante lisis enzimá-
tica de células estreptocócicas (p. ej., con pepsina o tripsina); o
mediante autoclave de suspensiones celulares. Estos extractos
contienen el carbohidrato de la sustancia específica de grupo
que produce antisueros específicos para reacciones de la pre-
cipitina; ello permite clasificar a los estreptococos en grupos
A a H y K a U. La tipificación por lo regular se hace sólo en los
grupos A, B, C, F y G (cuadro 14-1), que causan enfermedad en
seres humanos, y para los cuales se cuenta con reactivos que
permiten tipificarlos por medio de reacciones sencillas de aglu-
tinación o colorimétricas.
C. Polisacáridos capsulares
La especificidad antigénica de los polisacáridos capsulares per-
mite clasificar S. pneumoniae en más de 90 tipos y tipificar los
estreptococos del grupo B (S. agalactiae).
D. Reacciones bioquímicas
Las pruebas bioquímicas comprenden reacciones de fermen-
tación de carbohidratos, pruebas para determinar la presencia
de enzimas y pruebas de susceptibilidad o resistencia a deter-
minados compuestos químicos. Las pruebas bioquímicas sir-
ven muy a menudo para clasificar estreptococos después del
desarrollo de la colonia y de observar las características hemo-
líticas. Se utilizan las pruebas bioquímicas para especies que
por lo general no reaccionan con las preparaciones de anti-
cuerpos que suelen usarse para las sustancias específicas, de los
grupos A, B, C, F y G. Por ejemplo, los estreptococos viridans
son α hemolíticos o no hemolíticos y no reaccionan con los
anticuerpos que suelen utilizarse para la clasificación de Lan-
cefield. Para determinar las especies de estreptococos viridans
se necesita una serie de pruebas bioquímicas. Véase el cuadro
14-1. Sin embargo, las reacciones bioquímicas son laboriosas
y generan resultados poco confiables, por lo que los laborato-
rios que practican técnicas moleculares, como la secuenciación
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Microbiologia Medica.pdf
- 2. a LANGE medicalbook Jawetz, Melnick, & Adelberg Microbiología médica 27a. edición MÉXICO • AUCKLAND • BOGOTÁ • BUENOS AIRES • GUATEMALA • LONDRES MADRID • MILÁN • MONTREAL • NUEVA DELHI • NUEVA YORK • SAN FRANCISCO SAN JUAN • SANTIAGO • SAO PAULO • SIDNEY • SINGAPUR • ST. LOUIS • TORONTO Karen C. Carroll, MD Professor of Pathology The Johns Hopkins University School of Medicine Director, Division Medical Microbiology The Johns Medical Institutions Baltimore, Maryland Jeffery A. Hobden, PhD Associate Professor Department of Microbiology, Immunology and Parasitology LSU Health Sciences Center—New Orleans New Orleans, Louisiana Steve Miller, MD, PhD Department of Laboratory Medicine University of California San Francisco, California Stephen A. Morse, PhD Associate Director for Environmental Microbiology Division of Foodborne, Waterborne, and Environmental Diseases National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases Atlanta, Georgia Traducción: José Rafael Blengio Pinto Gabriel González Loyola Héctor Barrera Villavicencio Timothy A. Mietzner, PhD Associate Professor of Microbiology Lake Erie College of Osteopathic Medicine at Seton Hill Greensburg, Pennsylvania Barbara Detrick, PhD Professor of Pathology The Johns Hopkins University School of Medicine Director, Clinical Immunology Laboratories The Johns Hopkins Medical Institutions Baltimore, Maryland Thomas G. Mitchell, PhD Department of Molecular Genetics and Microbiology Duke University Medical Center Durham, North Carolina James H. McKerrow, MD, PhD University of California San Diego, California Judy A. Sakanari, PhD Adjunct Professor Center for Parasitic Diseases Department of Pharmaceutical Chemistry University of California San Francisco, California M_Caroll_4R.indd i M_Caroll_4R.indd i 15/04/16 15/04/16
- 3. Program & PortfolioManager Professional: Javier de León Fraga Development editor: Norma Leticia García Carbajal Supervisor de producción: Juan Manjarrez de la Vega NOTA La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se requerirán cambios de la terapéutica. El(los) autor(es) y los editores se han esforzado para que los cuadros de dosificación medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la fecha de publicación. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparación de la obra garantizan que la información contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha información se obtengan. Convendría recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habrá que consultar la hoja informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la información de esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones para su administración. Esto es de particular importancia con respecto a fármacos nuevos o de uso no frecuente. También deberá consultarse a los laboratorios para recabar infor- mación sobre los valores normales. MICROBIOLOGÍA MÉDICA. Todos los derechos reservados. Esta publicación no puede ser reproducida, ni parcial, ni totalmente, ni registrada en / o transmitida por, un sistema de recuperación de información, en ninguna forma ni formato, por ningún medio, sea mecánico, fotocopiado, electrónico, magnético, electroóptico, o cualquier otro, sin el permiso previo y por escrito de la editorial. DERECHOS RESERVADOS © 2016, 2014, 2011 respecto a la tercera edición por McGRAW-HILL/INTERAMERICANA EDITORES, S.A. DE C.V. Edificio Punta Santa Fe Prolongación Paseo de la Reforma 1015 Torre A Piso 16, Colonia Desarrollo Santa Fe, Delegación Álvaro Obregón C.P. 01376, México, D. F. Miembro de la Cámara Nacional de la Industria Editorial Mexicana, Reg. Núm. 736 ISBN: 978-607-15-1370-0 ISBN: 978-607-15-1135-5 (edición anterior) CTP 04/16 Translated from the twenty-seven English edition of: Jawetz, Melnick, & Adelberg´s Medical Microbiology Copyright © 2016 by McGraw-Hill Education. Previous editions copyright © 2013, 2010, 2004 by McGraw-Hill Companies, Inc.; copyright © 2001, 1995, 1991, 1989 by Appleton & Lange. All Rights Reserved ISBN: 9780-0-71-82498-9 1234567890 2345789016 Impreso en México Printed in Mexico Todos los derechos reservados. Esta publicación no puede ser reproducida, ni parcial, ni totalmente, ni registrada en/o transmitida por, un sistema de recuperación de información, en ninguna forma ni formato, por ningún medio, sea mecánico, fotocopiado, electrónico, magnético, electroóptico, o cualquier otro, sin el permiso previo y por escrito de la editorial M_Caroll_4R.indd ii M_Caroll_4R.indd ii 15/04/16 15/04/16
- 4. Contenido iii Contenido Prefacio xii SE C C I Ó N I FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA 1 Stephen A. Morse, PhD yTimothy A. Meitzner, PhD 1. La ciencia de la microbiología 1 Introducción 1 Principios biológicos ilustrados por la microbiología 1 Virus 2 Priones 3 Procariotas 4 Protistas 7 Resumen del capítulo 9 Preguntas de revisión 9 2. Estructura celular 11 Métodos ópticos 11 Estructura de células eucariotas 13 Estructura de las células procariotas 15 Tinción 38 Cambios morfológicos durante la proliferación 39 Resumen del capítulo 39 Preguntas de revisión 40 3. Clasificación de las bacterias 43 Taxonomía: el vocabulario de la microbiología médica 43 Criterios para clasificar las bacterias 43 Sistemas de clasificación 46 Descripción de las principales categorías y grupos de bacterias 48 Métodos que no requieren cultivo para identificar microorganismos patógenos 52 Objetivos 53 Preguntas de revisión 53 4. Crecimiento, supervivencia y muerte de microorganismos 55 Supervivencia de microorganismos en un ambiente natural 55 Significado de crecimiento 55 Crecimiento exponencial 56 Curva de crecimiento en cultivos discontinuos 57 Mantenimiento de células en la fase exponencial 58 Crecimiento en biopelículas 58 Definición y cuantificación de muerte 59 Control ambiental del crecimiento microbiano 59 Estrategias para controlar las bacterias en el ambiente 59 Mecanismos de acción generales de los biocidas 60 Acciones específicas de biocidas selectos 63 Relación entre la concentración de biocida y el tiempo de exposición en la eliminación de microbios 64 Resumen del capítulo 65 Preguntas de revisión 66 5. Cultivo de microorganismos 69 Necesidades para el crecimiento 69 Fuentes de energía metabólica 69 Nutrición 70 Factores ambientales que afectan el crecimiento 71 Métodos de cultivo 74 Resumen del capítulo 78 Preguntas de revisión 78 6. Metabolismo microbiano 81 Participación del metabolismo en la biosíntesis y crecimiento 81 Metabolitos focales y su interconversión 81 Vías de asimilación 84 Vías biosintéticas 92 Patrones microbianos del metabolismo para la producción de energía 94 Regulación de las vías metabólicas 101 Resumen del capítulo 103 Preguntas de revisión 103 7. Genética microbiana 105 Ácidos nucleicos y su organización en genomas eucariótico, procariótico y viral 105 Replicación 110 iii M_Caroll_4R.indd iii M_Caroll_4R.indd iii 15/04/16 15/04/16
- 5. iv Contenido Transferencia deDNA 111 Mutación y reordenación genética 114 Expresión génica 115 Ingeniería genética 117 Identificación del DNA clonado 120 Mutagénesis dirigida al sitio 123 Análisis con DNA clonado: sondas de hibridación 124 Manipulación del DNA clonado 124 Objetivos 125 Preguntas de revisión 125 S E C C I Ó N II INMUNOLOGÍA 127 Barbara Detrick, PhD 8. Inmunología 127 Generalidades 127 Inmunidad innata 127 Inmunidad adaptativa 130 Complemento 141 Citosinas 143 Hipersensibilidad 145 Deficiencias de la respuesta inmunitaria 146 Exámenes de laboratorio para enfermedades inmunitarias (pruebas diagnósticas) 147 Resumen del capítulo 149 Preguntas de revisión 150 S E C C I Ó N III BACTERIOLOGÍA 153 Karen C. Carroll, MD y Jeffery A. Hobden, PhD 9. Patogenia de la infección bacteriana 153 Identificación de las bacterias que causan enfermedades 154 Transmisión de la infección 155 Proceso infeccioso 155 Genómica y patogenicidad bacteriana 156 Regulación de los factores de virulencia bacteriana 157 Factores de virulencia bacteriana 158 Resumen del capítulo 165 Preguntas de revisión 165 10. Microbiota normal del cuerpo humano 169 Proyecto del microbioma humano 169 Importancia de la microbiota natural 169 Microbiota normal de la piel 171 Microbiota normal de la boca y vías respiratorias altas 171 Microbiota normal de la uretra 176 Microbiota normal de la vagina 176 Microbiota normal de la conjuntiva 176 Resumen del capítulo 177 Preguntas de revisión 177 11. Bacilos grampositivos formadores de esporas: Bacillus y Clostridium 179 Bacillus 179 Bacillus anthracis 179 Bacillus cereus 182 Clostridium 182 Clostridium botulinum 183 Clostridium tetani 185 Clostridios que causan infecciones invasoras 186 Clostridium difficile y enfermedades diarreicas 187 Preguntas de revisión 188 12. Bacilos grampositivos aerobios no esporulantes: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix, Nocardia y patógenos relacionados 191 Corynebacterium diphtheriae 192 Otras bacterias corineformes 195 Listeria monocytogenes 196 Erysipelothrix rhusiopathiae 198 Actinomycetes aerobios complejos 198 Nocardiosis 199 Actinomicetoma 200 Preguntas de revisión 200 13. Estafilococos 203 Resumen del capítulo 210 Preguntas de revisión 210 14. Estreptococos, enterococos y géneros relacionados 213 Clasificación de los estreptococos 213 Estreptococos de interés especial en medicina 215 Streptococcus pyogenes 215 Streptococcus agalactiae 220 Grupos C y G 221 Estreptococos del grupo D 221 Grupo de Streptococcus anginosus 221 Estreptococos de los grupos E, F, G, H y K-U 221 Estreptococos viridans 222 Estreptococos nutricionalmente variables 222 Peptostreptococcus y géneros afines 222 Streptococcus pneumoniae 223 Enterococos 226 Otros cocos grampositivos catalasa negativos 228 Preguntas de revisión 229 M_Caroll_4R.indd iv M_Caroll_4R.indd iv 15/04/16 15/04/16
- 6. Contenido v 15. Bacilosgramnegativos entéricos (Enterobacteriaceae) 231 Clasificación 231 Enfermedades causadas por Enterobacteriaceae diferentes a Salmonella y Shigella 234 Shigelas 237 El grupo Salmonella 239 Resumen del capítulo 242 Preguntas de revisión 243 16. Pseudomonas y Acinetobacter 245 Grupo de las pseudomonas 245 Pseudomonas aeruginosa 245 Burkholderia pseudomallei 248 Complejo Burkholderia cepacia 248 Stenotrophomonas maltophilia 249 Acinetobacter 249 Resumen del capítulo 249 Preguntas de revisión 249 17. Vibrio, Campylobacter y Helicobacter 253 Vibriones 253 Vibrio cholerae 253 Vibrio parahaemolyticus y vibrio vulnificus 256 Campylobacter 256 Campylobacter jejuni 256 Helicobacter pylori 258 Preguntas de revisión 259 18. Haemophilus, Bordetella, Brucella y Francisella 263 Bacterias del género Haemophilus 263 Haemophilus influenzae 263 Haemophilus aegyptius 265 Aggregatibacter aphrophilus 265 Haemophilus ducreyi 266 Otras bacterias del género Haemophilus 266 Bordetella 266 Bordetella pertussis 266 Bordetella parapertussis 268 Bordetella bronchiseptica 268 Las Brucelas 269 Francisella tularensis y tularemia 271 Preguntas de revisión 273 19. Yersinia y Pasteurella 275 Yersinia pestis y peste 275 Yersinia enterocolitica 277 Pasteurella multocida 278 Preguntas de revisión 278 20. Neisserias 281 Neisseria gonorrhoeae 281 Neisseria meningitidis 287 Otros gonococos 289 Resumen del capítulo 289 Preguntas de revisión 289 21. Infecciones causadas por bacterias anaerobias 293 Fisiología y condiciones de crecimiento para los anaerobios 293 Bacterias anaerobias detectadas en infecciones de seres humanos 294 Bacterias que causan vaginosis 295 Gardnerella vaginalis 295 Patogenia de las infecciones anaerobias 296 La naturaleza polimicrobiana de las infecciones por anaerobios 297 Diagnóstico de infecciones por anaerobios 298 Tratamiento de las infecciones por anaerobios 298 Resumen del capítulo 298 Preguntas de revisión 298 22. Legionelas, Bartonelas y bacterias patógenas poco comunes 301 Legionella pneumophila y otras Legionelas 301 Bartonella 304 Streptobacillus moniliformis 306 Enfermedad de Whipple 307 Preguntas de revisión 307 23. Micobacterias 309 Mycobacterium tuberculosis 309 Otras micobacterias 318 Mycobacterium leprae 319 Preguntas de revisión 320 24. Espiroquetas y otros microorganismos espirilares 323 Treponema pallidum y sífilis 323 Borrelia 327 Especies de borrelia y borreliosis 327 Borrelia burgdorferi y enfermedad de Lyme 328 Leptospira y leptospirosis 331 Preguntas de revisión 332 25. Micoplasmas y bacterias con pared defectuosa 335 Micoplasmas 335 Mycoplasma pneumoniae y neumonías atípicas 337 Mycoplasma hominis 338 Ureaplasma urealyticum 338 Mycoplasma genitalium 338 Resumen de capítulo 339 Preguntas de revisión 339 26. Rickettsia y géneros relacionados 341 Generalidades 341 Rickettsia y orientia 341 Ehrlichia y Anaplasma 345 Coxiella burnetii 346 Preguntas de revisión 348 M_Caroll_4R.indd v M_Caroll_4R.indd v 15/04/16 15/04/16
- 7. vi Contenido 27. Clamidias351 Infecciones oculares, genitales y respiratorias por Chlamydia trachomatis 354 Tracoma 354 Infecciones genitales por Chlamydia trachomatis y conjuntivitis de inclusión 355 Chlamydia trachomatis y neumonía neonatal 356 Linfogranuloma venéreo 357 Chlamydophila pneumoniae e infecciones respiratorias 358 Chlamydia psittaci y psitacosis 359 Resumen de capítulo 360 Preguntas de revisión 360 28. Farmacoterapia antimicrobiana 363 Mecanismos de acción de los antimicrobianos 363 Toxicidad selectiva 363 Inhibición de la síntesis de la pared celular 363 Inhibición/alteración de la función de la membrana celular 365 Inhibición de la síntesis de proteínas 366 Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos 367 Resistencia a los antibióticos 368 Farmacorresistencia 368 Resistencia cruzada 369 Limitación de la farmacorresistencia 369 Consecuencias clínicas de la farmacorresistencia 369 Actividad antimicrobiana in vitro 371 Factores que modifican la actividad antimicrobiana 371 Medición de la actividad antimicrobiana 371 Actividad antimicrobiana in vivo 372 Relaciones entre fármaco y microorganismo patógeno 372 Relaciones entre hospedador y microorganismo patógeno 373 Aplicación clínica de los antibióticos 373 Selección de antibióticos 373 Riesgos del uso indiscriminado 374 Antibióticos utilizados en combinación 374 Quimioprofilaxia antimicrobiana 375 Antibióticos que se administran por vía sistémica 377 Penicilinas 377 Cefalosporinas 384 Otros β lactámicos 385 Tetraciclinas 386 Glicilciclinas 386 Cloranfenicol 387 Macrólidos 387 Clindamicina y lincomicina 388 Glucopéptidos, lipopéptidos y lipoglucopéptidos 388 Estreptograminas 389 Oxazolidinonas 389 Bacitracina 389 Polimixinas 390 Aminoglucósidos 390 Quinolonas 391 Sulfonamidas y trimetoprim 392 Otros fármacos con aplicaciones especializadas 393 Fármacos utilizados principalmente para el tratamiento de las infecciones micobacterianas 394 Preguntas de revisión 395 S E C C I Ó N IV VIROLOGÍA 397 Steve Miller, MD, PhD 29. Propiedades generales de los virus 397 Términos y definiciones en virología 397 Orígenes evolutivos de los virus 398 Clasificación de los virus 398 Principios de la estructura viral 404 Composición química de los virus 405 Cultivo y análisis virales 407 Purificación e identificación de virus 408 Seguridad en el laboratorio 409 Reacción a agentes físicos y químicos 409 Replicación del virus: generalidades 410 Genética de los virus animales 414 Historia natural (ecología) y modos de transmisión de los virus 416 Resumen del capítulo 418 Preguntas de revisión 418 30. Patogenia y control de enfermedades virales 421 Principios de enfermedad viral 421 Patogenia de enfermedades virales 421 Prevención y tratamiento de las infecciones virales 433 Resumen del capítulo 438 Preguntas de revisión 438 31. Parvovirus 441 Propiedades de los parvovirus 441 Infecciones por parvovirus en seres humanos 441 Resumen del capítulo 445 Preguntas de revisión 445 M_Caroll_4R.indd vi M_Caroll_4R.indd vi 15/04/16 15/04/16
- 8. Contenido vii 32. Adenovirus447 Propiedades 447 Infecciones por adenovirus en seres humanos 451 Resumen del capítulo 454 Preguntas de revisión 454 33. Herpesvirus 457 Propiedades de los herpesvirus 457 Infecciones por herpesvirus en seres humanos 460 Virus del herpes simple 460 Virus de varicela-zóster 466 Citomegalovirus 470 Virus de Epstein-Barr 475 Herpesvirus humano 6 477 Herpesvirus humano 7 478 Herpesvirus humano 8 478 Virus B 478 Resumen del capítulo 479 Preguntas de revisión 480 34. Poxvirus 483 Propiedades de los poxvirus 483 Infecciones por poxvirus en seres humanos: enfermedad vacuna vaccinia y varicela 486 Infecciones por viruela de los simios 490 Infecciones por enfermedad vacuna 490 Infecciones por viruela de búfalos 490 Infecciones por virus de ectima contagioso 491 Molusco contagioso 492 Tumores símicos por virus tanapox y yaba e infecciones por poxvirus 493 Resumen del capítulo 493 Preguntas de revisión 493 35. Virus de la hepatitis 495 Propiedades de los virus de la hepatitis 495 Infecciones por el virus de la hepatitis en seres humanos 500 Resumen del capítulo 512 Preguntas de revisión 512 36. Picornavirus (grupos de enterovirus y rinovirus) 515 Propiedades de los picornavirus 515 Grupo de Enterovirus 516 Poliovirus 516 Coxsackievirus 522 Otros Enterovirus 524 Enterovirus en el medio ambiente 525 Grupo de los rinovirus 526 Grupo Parechovirus 527 Fiebre aftosa (aftovirus del ganado) 528 Resumen del capítulo 528 Preguntas de revisión 528 37. Reovirus, rotavirus y calicivirus 531 Reovirus y rotavirus 531 Rotavirus 532 Reovirus 536 Orbivirus y coltivirus 536 Calicivirus 536 Astroviridae 539 Resumen del capítulo 539 Preguntas de revisión 539 38. Enfermedades virales transmitidas por artrópodos y roedores 541 Infecciones por arbovirus humanos 541 Encefalitis por togavirus y flavivirus 543 Fiebre amarilla 550 Dengue 552 Encefalitis por Bunyavirus 554 Fiebre por la mosca de la arena 554 Fiebre del Valle de Rift 554 Virus de la fiebre grave con síndrome de trombocitopenia 555 Virus de Heartland 555 Virus de la fiebre por garrapata de colorado 555 Fiebres hemorrágicas transmitidas por roedores 555 Enfermedades por bunyavirus 555 Enfermedades por arenavirus 557 Enfermedades por filovirus 559 Resumen del capítulo 561 Preguntas de revisión 562 39. Ortomixovirus (virus de la influenza) 565 Propiedades de los ortomixovirus 565 Infecciones por el virus de la gripe en seres humanos 571 Resumen del capítulo del capítulo 576 Preguntas de revisión 576 40. Paramixovirus y virus de la rubéola 579 Propiedades de los paramixovirus 579 Infecciones por el virus de parainfluenza 583 Infecciones por el virus sincicial respiratorio 586 Infecciones por metaneumovirus humano 588 Infecciones por virus de la parotiditis 589 Infección por el virus del sarampión (rubéola) 591 Infecciones por virus Hendra y virus Nipah 595 Infecciones por el virus de la rubéola (sarampión alemán) 595 Rubéola posnatal 595 Síndrome de rubéola congénita 597 Resumen del capítulo 598 Preguntas de revisión 598 M_Caroll_4R.indd vii M_Caroll_4R.indd vii 15/04/16 15/04/16
- 9. viii Contenido 41. Coronavirus601 Propiedades 601 Infecciones por coronavirus en seres humanos 602 Resumen del capítulo 605 Preguntas de revisión 605 42. Rabia, infecciones por virus lentos y enfermedades priónicas 607 Rabia 607 Enfermedad de Borna 613 Infecciones por virus lentos y enfermedades priónicas 613 Resumen del capítulo 616 Preguntas de repaso 616 43. Virus que causan cáncer en el ser humano 619 Características generales de la carcinogénesis viral 619 Mecanismos moleculares de la carcinogénesis 620 Interacciones de los virus oncógenos con sus hospedadores 621 Virus oncógenos de RNA 622 Virus de la hepatitis B 622 Virus de la hepatitis C 622 Retrovirus 622 Virus de DNA oncógenos 628 Poliomavirus 629 Papilomavirus 631 Adenovirus 634 Herpesvirus 634 Poxvirus 635 Método para comprobar que un virus causa cáncer en seres humanos 635 Resumen del capítulo 635 Preguntas de revisión 635 44. Sida y Lentivirus 639 Propiedades de los lentivirus 639 Infecciones por VIH en seres humanos 643 Resumen del capítulo 654 Preguntas de revisión 654 S E C C I Ó N V MICOLOGÍA 657 Thomas G. Mitchell, PhD 45. Micología médica 657 Propiedades generales, virulencia y clasificación de hongos patógenos 658 Diagnóstico de laboratorio de las micosis 662 Micosis superficiales 665 Micosis cutáneas 665 Conceptos básicos: micosis superficiales y cutáneas 669 Micosis subcutáneas 669 Esporotricosis 670 Cromoblastomicosis 671 Feohifomicosis 673 Micetoma 673 Conceptos básicos: micosis subcutáneas 674 Micosis endémicas 674 Coccidioidomicosis 675 Histoplasmosis 678 Blastomicosis 681 Paracoccidioidomicosis 682 Conceptos clave: micosis endémicas 683 Micosis por oportunistas 683 Candidosis 684 Criptococosis 687 Aspergilosis 690 Mucormicosis 691 Neumonía por Pneumocystis 691 Peniciliosis 692 Otras micosis por oportunistas 693 Conceptos básicos: micosis por oportunistas 693 Profilaxia antimicótica 693 Hipersensibilidad a hongos 694 Micotoxinas 694 Farmacoterapia antimicótica 694 Antimicóticos tópicos 700 Conceptos básicos: tratamiento antimicótico 700 Preguntas de revisión 700 S E C C I Ó N VI PARASITOLOGÍA 705 Judy A. Sakanari, PhD y James H. McKerrow, MD, PhD 46. Parasitología médica 705 Clasificación de los parásitos 705 Infecciones intestinales por protozoos 709 Giardia lamblia (flagelado intestinal) 709 Entamoeba histolytica (amebas de intestino y tejidos) 710 Otras amebas intestinales 712 Criptosporidium (esporozoos intestinales) 712 Ciclospora (esporozoos intestinales) 713 Infecciones de transmision sexual por protozoos 713 Trichomonas vaginalis (flagelado de vías genitourinarias) 713 M_Caroll_4R.indd viii M_Caroll_4R.indd viii 15/04/16 15/04/16
- 10. Contenido ix Clonorchis sinensis(duela hepática china), fasciola hepatica (duela hepática de las ovejas) y paragonimus westermani (duela del pulmón)- trematodos de tejidos) 734 Schistosoma mansoni, schistosoma japonicum, y schistosoma haematobium (duelas de la sangre) 735 Infecciones por cestodos hísticos (causadas por las fases larvarias) 736 Taenia solium-cisticercosis/neurocisticercosis 736 Echinococcus granulosus (quiste hidatídico) 736 Preguntas de revisión 737 S E C C I Ó N VII DIAGNÓSTICO MÉDICO MICROBIOLÓGICO Y CORRELACIÓN CLÍNICA 741 Karen C. Carroll, MD y Steve Miller, MD, PhD 47. Principios de diagnóstico médico microbiológico 741 Comunicación entre el médico y el laboratorio 741 Diagnóstico de infecciones por bacterias y hongos 742 Importancia de la flora bacteriana y micótica normales 754 Medios auxiliares de laboratorio en la selección del tratamiento antimicrobiano 754 Diagnóstico de infección según el sitio anatómico 755 Infecciones por anaerobios 761 Diagnóstico de infecciones por Clamidias 762 Diagnóstico de infecciones virales 763 Preguntas de revisión 770 48. Casos y correlaciones clínicas 773 Sistema nervioso central 773 Aparato respiratorio 777 Corazón 782 Abdomen 783 Vías urinarias 785 Huesos y tejidos blandos 790 Enfermedades de transmisión sexual 792 Infecciones por Mycobacterium tuberculosis 795 Complejo de Mycobacterium avium 798 Infecciones en receptores de trasplante 799 Infecciones emergentes 806 Índice 809 Infecciones de sangre y tejidos por protozoos 714 Hemoflagelados 714 Trypanosoma brucei rhodesiense y trypanosoma brucei gambiense (hemoflagelados) 714 Trypanosoma cruzi (hemoflagelados) 715 Especies de leishmania (hemoflagelados) 716 Entamoeba histolytica (ameba hística) consúltese la sección de infecciones intestinales por protozoos 717 Naegleria fowleri, Acanthamoeba castellanii y Balamuthia mandrillaris (amebas de vida libre) 717 Especies de Plasmodium (esporozoos de la sangre) 718 Babesia microti (esporozoos de la sangre) 722 Toxoplasma gondii (esporozoos tisulares) 722 Microsporidios 723 Infecciones intestinales por helmintos 723 Enterobius vermicularis (oxiuro-nematodo intestinal) 724 Trichuris trichiura (tricocéfalo-nematodo intestinal) 724 Ascaris lumbricoides (verme redondo de humanos- nematodo intestinal) 728 Ancylostoma duodenale y Necator americanus (anquilostomas de humanos-nematodo intestinal) 728 Strongyloides stercoralis (estrongiloidosis humana- nematodo intestinal e hística) 729 Trichinella spiralis (nematodo intestinal e hístico) 730 Fasciolopsis buski (duela intestinal gigante- trematodo intestinal) 730 Taenia saginata (tenia de la res-cestodo intestinal) y taenia solium (tenia del cerdo-cestodo intestinal e hística) 731 Diphyllobothrium latum (tenia ancha de peces- cestodo intestinal) 731 Hymenolepis nana (tenia enana-cestodo intestinal) 732 Dipylidium caninum (tenia de perros-cestodo intestinal) 732 Helmintosis de sangre y tejidos 732 Wuchereria bancrofti y brugia malayi (filariosis linfática-nematodos hísticos) 732 Onchocerca volvulus (ceguera de los ríos-nematodo tisular) 733 Dracunculus medinensis (gusano de guinea- nematodo hístico) 734 Larva migratoria (infecciones zoonóticas por larvas de nematodos) 734 M_Caroll_4R.indd ix M_Caroll_4R.indd ix 15/04/16 15/04/16
- 11. Comprensión de losaspectos clínicos relevantes de la microbiología con Microbiología médica de Jawetz, Melnick & Adelberg, vigésima séptima edición Las correlaciones clínicas y de casos guían al lector en la aplicación del material a situaciones del mundo real • Presenta información concisa y actualizada sobre las funciones que los microorganismos desempeñan en la salud y las enfermedades humanas • Relaciona principios fundamentales con el diagnóstico y tratamiento de infecciones microbianas • Refleja la enorme expansión del conocimiento médico por medio de los mecanismos moleculares, avances en la comprensión de la patogenia microbiana, además de nuevos tratamientos farmacológicos • Incluye descripciones concisas de cada microorganismo, junto con perspectivas esenciales sobre la patogenia, pruebas diagnósticas de laboratorio, manifestaciones clínicas, tratamientos, así como epidemiología • Todo un capítulo dedicado al estudio de casos que se enfocan en el diagnóstico diferencial y tratamiento de las infecciones microbianas • Introducción a los conceptos básicos de microbiología a través de la bacteriología, virología, micología y parasitología • El capítulo de inmunología está totalmente revisado y actualizado 773 48 Casos y correlaciones clínicas C A P Í T U L O Eltratamientodelasenfermedadesinfecciosasexigelacompren- sión de las manifestaciones clínicas iniciales y el conocimiento de las características microbiológicas. El cuadro de presentación de muchas infecciones incluye innumerables signos y síntomas focales y generales, y los casos típicos sugieren fuertemente el diagnóstico, aunque la enfermedad pudo haber sido causada por microorganismos diferentes. El arte de la medicina se funda en la elaboración del diagnóstico clínico que más tarde será con- firmado por datos de laboratorio. El capítulo presente incluye 23 casos y comentarios breves del diagnóstico diferencial y el tratamiento de las infecciones. Conviene que el lector consulte los primeros capítulos de este texto en busca de datos definitorios de los microorganis- mos; también el capítulo 47, para recabar información sobre las pruebas microbiológicas diagnósticas y revise obras de medi- cina e infectología para obtener información más completa de las entidades clínicas. SISTEMA NERVIOSO CENTRAL papiledema, lo cual denota que durante largo tiempo no había presentado hipertensión intracraneal. Los demás datos de la exploración física fueron normales. Datos de laboratorio Minutos después de su llegada, se tomó una muestra de san- gre para practicar cultivos y otras pruebas de laboratorio, y se colocó un catéter intravenoso. En menos de 30 min del ingreso al servicio de urgencias se practicó punción lumbar. La presión de abertura fue de 350 mm de líquido cefalorraquídeo (LCR) (elevada). El líquido estaba turbio. Se llenaron varios tubos de LCR para cultivo, recuento celular y pruebas químicas. Un tubo fue llevado inmediatamente a laboratorio para practicar tinción de Gram. Dicha técnica indicó la presencia de innumerables células polimorfonucleares (PMN, polymorphonuclear cells) con diplococos gramnegativos intracelulares que sugerían Neisseria meningitidis (capítulo 20). Los datos de la química sanguínea fueron normales, al igual que el valor de hematocrito. El recuento de leucocitos fue de 25000 células/μl (muy elevado) y 88% eran formas de PMN, y el número absoluto de tales células era de 22000/μl (muy elevado), 6% de linfocitos y 6% de monocitos. En el LCR se detectaron 5000 PMN/μl (cifra normal, 0 a 5 linfocitos/μl). La concentra- ción de proteínas en LCR fue de 100 mg/100 ml (elevada) y el de glucosa, 15 mg/100 ml (disminución o hipoglucorraquia), datos compatibles con meningitis bacteriana. En los cultivos de san- gre y líquido cefalorraquídeo se detectó la proliferación de N. meningitidis del serogrupo B. Tratamiento Se inició la administración de cefotaxima por vía intravenosa dentro de los primeros 35 a 40 min del ingreso de la paciente; también se le administró dexametasona. El paciente respondió con rapidez y se trató con el antibiótico durante siete días. Se recuperó sin secuelas palpables. Se planearon estudios neuro- lógicos y pruebas de audiometría adicionales para el futuro. Se administró rifampicina como profiláctico a los demás niños que acudían a la guardería. Comentarios Las manifestaciones clínicas de la meningitis bacteriana varían según la edad de los pacientes. En los niños de mayor edad y en los adultos, los signos y síntomas iniciales suelen incluir fiebre, cefalea, vómito, fotofobia, alteración del estado mental que varía Una niña de tres años es llevada por sus padres al servi- cio de urgencias por presentar fiebre y falta de apetito en las últimas 24 h y dificultad para estar despierta, en las últimas 2 h. Los antecedentes de su desarrollo han sido normales desde su nacimiento; acudía a una guardería y mostró algunos episodios de supuestas infecciones virales similares a las de otros niños de la guardería. Sus vacuna- ciones estaban al corriente. CASO 1: MENINGITIS Manifestaciones clínicas La temperatura de la paciente era de 39.5ºC, su pulso, de 130 lpm lpm y frecuencia respiratoria de 24/min. Su presión arterial era de 110/60 mm Hg. La exploración física mostró a una niña con desarrollo, nutrición, talla y peso normales, aunque somnolienta. Al inten- tar la flexión pasiva del cuello, sus piernas también se flexiona- ron (signo de Brudzinski positivo que sugiere irritación de las meninges). El estudio oftalmoscópico no indicó la presencia de M_Caroll_4R.indd x M_Caroll_4R.indd x 15/04/16 15/04/16
- 12. • Más de650 preguntas de repaso tipo USMLE • Más de 300 cuadros e ilustraciones complementarias • Veintitrés casos de estudio que agudizan las habilidades de los estudiantes en la aplicación del diagnóstico diferencial y tratamiento • Lista de fácil comprensión sobre los microorganismos médicos más importantes • Alcance de conocimiento que refleja las últimas técnicas en las tecnologías de laboratorio y diagnóstico • Imágenes y micrografías a todo color • Resúmenes al final de cada capítulo • Revisiones de capítulo Imágenes a todo color que vuelven realidad los conceptos estudiados Diagramas que resumen lo expresado en el texto Estudio completo de los conceptos esenciales, como la virología Éstas son algunas de las razones por las cuales la Microbiología médica de Jawetz, Melnick & Adelberg es esencial para la preparación de los exámenes de certificación USMLE: 296 SECCIÓN III Bacteriología FIGURA 211 Especies del género Actinomyces. A: Colonia de especies de Actinomyces después de 72 h de cultivo en agar con infusión de cerebro y corazón, que por lo general produce colonias de casi 2 mm de diámetro; a menudo se les denomina colonias “de dientes molares”. (Cortesía de CDC Public Health Image Library, L. Georg.) B: Gránulo de Actinomyces en tejido con tinción de Brown y Breen. Aumento original × 400. Los filamentos de los bacilos ramificados son visibles en la periferia del gránulo. Estos gránulos suelen denominarse “gránulos de azufre” debido a su color amarillo burdo no teñido. (Cortesía de CDC Public Health Image Library.) C: Actinomyces naeslundii en un absceso cerebral teñido con tinción con metilamina argéntica. Son visibles los bacilos ramificados. Aumento original × 1000. (Cortesía de CDC Public Health Image Library, L. Georg.) A B C de gota o microesfera, y a veces formas cocoides o esféricas. Propionibacterium acnes, a menudo considerado un microor- ganismo patógeno oportunista, produce la enfermedad del acné vulgar y se relaciona con diversos trastornos inflamato- rios. Este microorganismo causa acné cuando produce lipasas que desdoblan ácidos grasos libres fuera de los lípidos de la piel. Estos ácidos grasos pueden producir inflamación del tejido que contribuye a la formación del acné. Además, P. acnes suele ser una causa de infecciones posoperatorias de heridas quirúrgi- cas, sobre todo las que implican la inserción de dispositivos, por ejemplo, infecciones de prótesis articulares, en particular del hombro, infecciones de derivaciones del sistema nervioso central, osteomielitis, endocarditis y endoftalmitis. Puesto que es parte de la microflora cutánea habitual, P. acnes a veces con- tamina los cultivos de sangre o líquido cefalorraquídeo que se obtienen al penetrar la piel. Por lo tanto, es importante (pero a menudo difícil) distinguir un cultivo contaminado de uno que es positivo y que indica infección. 3. Clostridium. Los clostridios son bacilos grampositivos, formadores de esporas (capítulo 11). B. Cocos grampositivos El grupo de los cocos grampositivos anaerobios ha experi- mentado una expansión taxonómica muy importante. Muchas especies de Peptostreptococcus fueron reasignadas a nuevos géneros como Anaerococcus, Finegoldia y Peptoniphilus. Las especies que contienen estos géneros, al igual que Peptococ- cus niger, son miembros importantes de la microflora habitual de la piel, la cavidad bucal, las vías respiratorias altas, el tubo digestivo y el aparato genitourinario de la mujer. Los miem- bros de este grupo son microorganismos patógenos oportunis- tas y muy a menudo se detectan en infecciones mixtas, sobre todo de muestras que no se obtienen en forma meticulosa. Sin embargo, estos microorganismos se han relacionado con infec- ciones graves como abscesos cerebrales, infecciones pleuro- pulmonares, fascitis necrosante y otras infecciones profundas de la piel y los tejidos blandos, infecciones intraabdominales e infecciones del aparato genital femenino. PATOGENIA DE LAS INFECCIONES ANAEROBIAS Las infecciones causadas por anaerobios suelen deberse a com- binaciones de bacterias que funcionan en patogenicidad sinér- gica. Aunque los estudios sobre la patogenia de las infecciones anaerobias a menudo se han centrado en una sola especie, es importante reconocer que las infecciones por anaerobios muy a menudo se deben a varias especies de estos últimos que actúan en conjunto para producir infección. B. fragilis es un microorganismo patógeno muy impor- tante entre los anaerobios que forman parte de la microflora habitual. La patogenia de la infección por anaerobios se ha estudiado en forma muy amplia con B. fragilis utilizando un modelo de rata de infección intraabdominal, que en muchos aspectos se parece a la enfermedad de los seres humanos. Se produce una secuencia característica después que se coloca contenido del colon (que incluye B. fragilis y un anaerobio Membrane Membrane – – – – Se sintetizan derivados UDP de NAM y NAG (no se muestra). El complejo NAM-pentapéptido se transfiere al fosfato de bactoprenol. Se unen por medio de enlaces de pirofosfato. El UDP transfiere NAG al complejo bactoprenol-NAM-pentapéptido. Si se necesita la interposición de pentaglicina, se crea con moléculas especiales de glicil-tRNA, pero no con ribosomas. La formación de puentes ocurre en la membrana. Adición secuencial de aminoácidos a UDP-NAM para formar el complejo NAM-pentapéptido. Se utiliza ATP para favorecer la reacción, pero no participan el RNA y los ribosomas en la formación de enlaces peptídicos que unen los aminoácidos. Los enlaces cruzados entre las cadenas de peptidoglucano se forman por transpeptidación (no se muestran). El transportador bactoprenol se desplaza a través de la membrana. A medida que lo hace, pierde un fosfato y se convierte en fosfato de bactoprenol. Ahora está preparado para iniciar un nuevo ciclo. Los transportadores de bactoprenol transportan las unidades repetidas del complejo NAG-NAM pentapéptido a través de la membrana. El complejo NAG-NAM pentapéptido se une al extremo en crecimiento de la cadena de peptidoglucano, lo que aumenta la longitud de la cadena en repeticiones de una unidad. Periplasma Membrana Bactoprenol Bactoprenol Bactoprenol Citoplasma L-Ala L-Ala D-Glu D-Ala D-Ala UDP NAM L-Lys (DAP) NAM UDP NAG Lípido I Pentapéptido NAM NAG Pentapéptido Bactoprenol NAM Lípido II Pentapéptido Bactoprenol UDP D-Ala UDP NAM Pentapéptido NAG Cicloserina Peptidoglucano Peptidoglucano NAM NAG Pentapéptido Pi A Bacitracina Vancomicina P P P P P P P P P 7 2 1 3 3 4 5 6 4 2 8 7 5 6 UMP B D Ala L Ala D Ala Ala L D Glu Ala DAP D D Ala D Glu D DAP H2N Ala D NAG L Ala NAM ••• ••• ••• D NAG ••• NAM L Ala Glu Ala D DAP D Glu D Ala DAP Penicilinas L L D L Ala Ala NAM NAG ••• ••• ••• ••• NAG NAM NAG ••• NAG ••• NAM NAM ••• ••• ••• ••• NAG NAM L ••• NAM ••• NAG Ala D D GluNH2 GluNH2 Ala Lys D D Ala Lys (Gly)5 D Ala Ala L D L Ala GluNH2 -GluNH2 D Ala Lys D D Ala Lys (Gly)5 Ala L L Transpeptidación de Escherichia coli Transpeptidación de Staphylococcus aureus H2N FIGURA 620 A: Síntesis de peptidoglucano. Los pentapéptidos contienen L-lisina en el peptidoglucano de Staphylococcus aureus y ácido diaminopimélico (DAP) en Escherichia coli. También se muestra la inhibición con bacitracina, cicloserina y vancomicina. Los números corresponden a seis de las ocho etapas revisadas en el texto. Se ilustra la etapa ocho en B. NAM corresponde a ácido N-acetilmurámico y NAG a N-acetilglucosamina; UDP, difosfato de uridina. B: Transpeptidación. Reacciones de transpeptidación en la formación de peptidoglucanos de Escherichia coli y S. aureus. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. ed, McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) 95 400 SECCIÓN IV Virología DNA virus Virus del RNA dsDNA ssDNA dsDNA (RT) dsRNA ssRNA (–) ssRNA (+) ssRNA (RT) Asfarviridae Poxviridae Herpesviridae Polyomaviridae Papillomaviridae Adenoviridae Bunyaviridae Retroviridae Arenaviridae Bornaviridae Paramyxoviridae Coronaviridae Arteriviridae Togaviridae Flaviviridae Orthomyxoviridae Rhabdoviridae Filoviridae Caliciviridae Hepeviridae Astroviridae Picornaviridae Hepadnaviridae Reoviridae Picobirnaviridae Iridoviridae Parvoviridae Circoviridae 100 nm FIGURA 292 Formas y tamaños relativos de las familias de virus de animales que infectan vertebrados. En algunos diagramas, se representan ciertas estructuras internas de las partículas. Sólo se incluyen aquellas familias que son patógenas para los seres humanos y se enumeran en el cuadro 29-1 y se describen en el texto. (Con autorización de van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, et al. [editors]: Virus taxonomy: Classification and nomenclature of viruses. Seventh report of the International Commmittee of Viruses. Academic Press, 2000). M_Caroll_4R.indd xi M_Caroll_4R.indd xi 15/04/16 15/04/16
- 13. Prefacio xii La vigésima séptimaedición de Microbiología médica de Jawetz, Melnick & Adelberg se mantiene fiel a los objetivos de la primera edición publicada en 1954, que tenían como meta proporcionar una presentación breve, precisa y actualizada de aquellos aspec- tos de la microbiología médica que son de particular importan- cia a los campos de infecciones clínicas y la quimioterapia. Todos los capítulos se han revisado ampliamente, en con- sonancia con la tremenda expansión del conocimiento médico debido a los mecanismos moleculares, los avances en la com- prensión de la patogenia microbiana y el descubrimiento de nuevos agentes patógenos. El capítulo 47, Principios de diagnós- tico médico microbiológico, y el capítulo 48, Casos y correlaciones clínicas, se han actualizado para reflejar el gran interés de los últimos años sobre los nuevos diagnósticos, así como de nuevos tratamientos contra las enfermedades infecciosas. En esta edición colaboran Steve Miller, MD, PhD, y Jeffery Hobden, PhD. El Dr. Miller es el director médico del San Fran- cisco Clinical Microbiology Laboratory de la Universidad de California, además de ser profesor asociado de medicina en el laboratorio clínico de la UCSF; el Dr. Miller aporta una amplia experiencia en virología. Por otra parte, el Dr. Hobden es profe- sor asociado en el departamento de Microbiología, Inmunolo- gía y Parasitología de la Louisiana State University Health Scien- ces Center, Nueva Orleans, Louisiana; su interés se centra en los patógenos bacterianos, en particular Pseudomonas aeruginosa. Damos la bienvenida a la participación de ambos. Los autores esperamos que los cambios en esta edición sean de gran ayuda para los estudiantes de microbiología. M_Caroll_4R.indd xii M_Caroll_4R.indd xii 15/04/16 15/04/16
- 14. 1 1 La ciencia de lamicrobiología C A P Í T U L O INTRODUCCIÓN La microbiología es el estudio de los microorganismos, un grupo grande y diverso de organismos microscópicos que vive en forma de células aisladas o en grupos de ellas; también comprende a los virus, que son organismos microscópicos, pero que carecen de estructuras celulares. Los microorganis- mos tienen un enorme impacto en la vida y en la composición física y química de nuestro planeta. Los microorganismos se encargan de llevar a cabo ciclos de elementos químicos indispensables para la vida, tales como los ciclos del carbono, nitrógeno, azufre, hidrógeno y oxígeno; los microorganismos realizan más fotosíntesis que las plantas. Además, los océanos contienen 100 millones más bacterias (13 × 1028 ) que las estre- llas que contiene el universo conocido. La frecuencia de infec- ciones virales en los océanos es de aproximadamente 1 × 1023 infecciones por segundo, y estas infecciones eliminan de 20 a 40% de las células bacterianas diariamente. Se calcula que en la tierra existen 5 × 1030 células microbianas; excluyendo a la celulosa, éstas constituyen el 90% de la biomasa de toda la bios- fera. Los seres humanos también tienen una relación cercana con los microorganismos; más del 90% de las células de nues- tros cuerpos corresponde a microbios. Las bacterias del intes- tino del ser humano promedio pesan alrededor de 1 kg y un adulto excretará su propio peso en bacterias fecales cada año. El número de genes contenidos dentro de la flora intestinal es 150 veces mayor que el contenido en el genoma e, incluso en nuestro propio genoma, 8% del DNA proviene de los vestigios de genomas virales. PRINCIPIOS BIOLÓGICOS ILUSTRADOS POR LA MICROBIOLOGÍA En ninguna otra parte es más evidente la diversidad biológica que en los microorganismos, seres que no pueden observarse a simple vista sin ayuda de un microscopio. En cuanto a su forma y función, ya sea una propiedad bioquímica o un mecanismo genético, el análisis de los microorganismos conduce a los lí- mites de la comprensión biológica. Por lo tanto, la necesidad de originalidad (una prueba del mérito de una hipótesis cientí- fica) puede satisfacerse por completo en la microbiología. Una hipótesis útil debe ofrecer una base para hacer una generaliza- ción y la diversidad microbiana proporciona el terreno donde siempre se da este desafío. La predicción, que es la consecuencia práctica de la cien- cia, es un producto creado por una mezcla de técnica y teo- ría. La bioquímica, biología molecular y genética ofrecen los recursos necesarios para el análisis de los microorganismos. A su vez, la microbiología amplía el horizonte de estas discipli- nas científicas. Quizá un biólogo describiría este intercambio como mutualismo, esto es, algo que beneficia a todos los par- ticipantes. Un ejemplo de mutualismo microbiano es el de los líquenes. Los líquenes constan de un hongo y un compañero fototrópico, ya sea un alga (eucariota) o una cianobacteria (procariota) (figura 1-1). El componente fototrópico es el pro- ductor principal, en tanto que el hongo proporciona sujeción y protección de los elementos. En biología, el mutualismo se denomina simbiosis, que es una relación continua de distin- tos organismos. Cuando el intercambio opera principalmente en beneficio de una de las partes, la relación se describe como parasitismo, en la que el hospedador proporciona el beneficio principal al parásito. Para el aislamiento y clasificación de un parásito (p. ej., una bacteria o virus patógenos) a menudo es necesario simular en el laboratorio el ambiente de proliferación que ofrecen las células hospedadoras. Este requisito en ocasio- nes representa una dificultad importante para el investigador. Los términos mutualismo, simbiosis y parasitismo se rela- cionan con la ciencia de la ecología, y los principios de la bio- logía ambiental se encuentran implícitos en la microbiología. Los microorganismos son productos de la evolución, que es la consecuencia biológica de la selección natural que actúa en SECCIÓN I FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA apter 01_Carroll_4R.indd 1 apter 01_Carroll_4R.indd 1 14/04/16 14/04/16
- 15. 2 SECCIÓN IFundamentos de microbiología una gran variedad de microorganismos distintos en términos genéticos. Vale la pena tener en mente la complejidad de la historia natural antes de generalizar sobre los microorganis- mos, que forman el subgrupo más heterogéneo de las criaturas vivientes. Una división biológica importante separa a los eucariotas, microorganismos que contienen núcleo rodeado de una mem- brana, de las procariotas, en los que el DNA no está separado físicamente del citoplasma. Como se describirá más adelante y en el capítulo 2, se pueden hacer más diferenciaciones entre las células eucariotas y procariotas. Por ejemplo, las primeras se distinguen por su tamaño relativamente grande y la presencia de organelos especializados, rodeados de membranas como las mitocondrias. Como se describe con detalle más adelante, las células eucariotas (o Eukarya, en términos filogenéticos) compar- ten su estructura celular característica e historia filogenética. Algunos grupos de microorganismos eucarióticos son algas, protozoarios, hongos y mohos. VIRUS Las propiedades exclusivas de los virus los colocan en un sitio aparte de los demás seres vivos. Los virus carecen de muchos de los atributos de las células, como la capacidad de multipli- carse. Sólo cuando infectan una célula adquieren la caracterís- tica esencial de un sistema viviente: la reproducción. Se sabe que los virus infectan cualquier célula, incluidas las células microbianas. En fecha reciente, se descubrió que los virus lla- mados virófagos infectan a otros virus. Las interacciones entre hospedador y virus tienden a ser muy específicas y la variedad biológica de los virus es un reflejo de la diversidad de células hospedadoras potenciales. La mayor diversidad de virus se expresa en su amplia variedad de estrategias de replicación y supervivencia. Las partículas virales por lo general son pequeñas (p. ej., el adenovirus mide 90 nm) y constan de una molécula de ácido nucleico, ya sea DNA o RNA, contenida en una capa proteínica o cápside viral (que algunas veces también se encuentra con- tenida en una envoltura de lípidos, proteínas y carbohidratos). Las proteínas, a menudo glucoproteínas, de la cápside deter- minan la especificidad de la interacción del virus con su célula hospedadora. La cápside protege al ácido nucleico y facilita la fijación y penetración del virus en la célula hospedadora. En el interior de la célula, el ácido nucleico viral redirige la maqui- naria enzimática del hospedador hacia funciones que tienen que ver con la replicación viral. En algunos casos, la informa- ción genética del virus se incorpora en forma de DNA en el cromosoma del hospedador. En otros, la información genética del virus sirve como base para la producción celular y libera- ción de copias del virus. Este proceso exige la replicación del ácido nucleico viral y la producción de proteínas virales espe- cíficas. La maduración consiste en armar subunidades recién sintetizadas de ácido nucleico y proteínas hasta formar par- tículas virales maduras, que luego son liberadas en el ambiente extracelular. Algunos virus muy pequeños necesitan la ayuda de otro virus en la célula hospedadora para su replicación. El elemento delta, también conocido como virus de la hepatitis D, es demasiado pequeño como para codificar incluso una sola proteína de la cápside y necesita ayuda del virus de la hepati- tis B para su transmisión. Se sabe que los virus infectan una gran variedad de hospedadores tanto vegetales como animales, así como protistas, hongos y bacterias. Sin embargo, la mayor FIGURA 11 Diagrama de un liquen, que consiste en células fototrofas, ya sea un alga o una cianobacteria, entrelazadas con hifas de un hongo con el que establece simbiosis (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT (editores): Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 293). Corteza Capa de algas Corteza Hifas Alga Hongo apter 01_Carroll_4R.indd 2 apter 01_Carroll_4R.indd 2 14/04/16 14/04/16
- 16. CAPÍTULO 1 Laciencia de la microbiología 3 parte de los virus puede infectar tipos específicos de células de una sola especie de hospedador. Algunos virus son grandes y complejos. Por ejemplo, el Mimivirus, un virus DNA que infecta a Acanthamoeba, una ameba de vida libre, tiene un diámetro de 400 a 500 nm y un genoma que codifica 979 proteínas, incluidas las primeras cua- tro aminoacil tRNA sintetasas que se encontraron fuera de los organismos celulares y enzimas para la biosíntesis de polisa- cáridos. En fecha reciente se descubrió un virus marino incluso más grande (Megavirus); su genoma (1259197-bp) codifica 1120 supuestas proteínas y es más grande que algunas bacte- rias (cuadro 7-1). Por su gran tamaño, estos virus son similares a bacterias si se observan en preparaciones de tinciones por microscopia de luz; sin embargo, no experimentan división celular ni contienen ribosomas. Algunas enfermedades transmisibles de las plantas son causadas por viroides, moléculas pequeñas de RNA monocate- nario y circular con enlaces covalentes estrechos que existen en forma de estructuras similares a bastones con numerosos pares de bases. Su tamaño varía de 246 a 375 nucleótidos de longitud. La forma extracelular del viroide es RNA desnudo; no hay nin- guna clase de cápside. La molécula de RNA no contiene genes que codifican proteínas y, por lo tanto, el viroide depende por completo de las funciones del hospedador para su replicación. El RNA del viroide se multiplica por medio de la RNA polime- rasa dependiente de DNA de la planta hospedadora; la función de esta enzima quizá contribuye a la patogenia del viroide. Se ha demostrado que los RNA de los viroides contienen secuencias de bases repetidas invertidas en sus extremos 3′ y 5′, característica de los transposones (capítulo 7) y de los retrovi- rus. Por eso, es probable que hayan evolucionado de transpo- sones o retrovirus por la eliminación de secuencias internas. En el capítulo 29 se describen las propiedades generales de los virus animales patógenos para el ser humano. Los virus bacterianos se describen en el capítulo 7. PRIONES Varios descubrimientos destacados en los últimos 30 años permitieron la clasificación tanto molecular como genética del microorganismo transmisible que causa la encefalopatía espongiforme ovina, enfermedad degenerativa del sistema nervioso central de las ovejas. En los estudios ha sido posible identificar la proteína asociada con esta enfermedad en prepa- raciones obtenidas de cerebro de ovejas con esta encefalopatía y, además, se logró reproducir los síntomas de la enfermedad en ovejas sanas (figura 1-2). Los esfuerzos por identificar otros componentes, como ácidos nucleicos, no han tenido éxito. Con el fin de diferenciarlo de los virus y viroides, se introdujo el término prion para subrayar su naturaleza proteínica e infec- ciosa. La forma celular de la proteína priónica (PrPc ) es codifi- cada por el DNA cromosómico del hospedador. La PrPc es una sialoglucoproteína con un peso molecular de 33000 a 35000 daltons y un alto contenido de una estructura secundaria α-he- licoidal que es sensible a las proteasas y soluble en detergente. La PrPc se expresa en la superficie de las neuronas a través del anclaje de glucosil fosfatidilinositol en encéfalos tanto infecta- dos como no infectados. La proteína prion sufre un cambio de FIGURA 12 Prion. Priones aislados del cerebro de un hámster infectado con el agente de la encefalopatía espongiforme ovina. Esta enfermedad neurodegenerativa es causada por un prion. (Reimpresa con autorización de Stanley B. Prusiner.) 50 µm configuración que la transforma de su forma normal o celular PrPc a una configuración patógena, PrPSc (figura 1-3). Cuando un individuo tiene PrPSc (debido a la conversión espontánea de la configuración o a infección), ésta puede reclutar PrPc y con- vertirla en la variedad patógena. Por eso, para replicarse, los priones utilizan el sustrato PrPc presente en el hospedador. Hay otras enfermedades importantes causadas por priones (cuadro 1-1 y capítulo 42). El kuru, la enfermedad de Creutz- feldt-Jakob (CJD, Creutzfeldt-Jakob disease), la enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker y el insomnio familiar letal afectan a los seres humanos. La encefalopatía espongiforme ovina, que se cree que es resultado de la ingestión de alimento para ganado y harina de huesos preparados con residuos de animales del matadero, ha causado la muerte de más de 184000 cabezas de ganado en Gran Bretaña desde que se descubrió en 1985. Una nueva variedad de CJD (vCJD) en seres humanos, se ha vinculado con la ingestión de carne de res infectada por priones en el Reino Unido y Francia. Una característica común de todas estas enfermedades es la conversión de una sialoglu- coproteína codificada por el hospedador en una forma resis- tente a la proteasa como consecuencia de la infección. Las enfermedades por priones en los seres humanos son singulares porque se manifiestan en forma de enfermedades esporádicas, genéticas e infecciosas. El estudio de la biología de los priones constituye una nueva e importante área de investi- gación biomédica, de lo cual falta mucho por aprender. En el cuadro 1-2 aparecen las características distintivas de los integrantes no vivientes del mundo microbiano. apter 01_Carroll_4R.indd 3 apter 01_Carroll_4R.indd 3 14/04/16 14/04/16
- 17. 4 SECCIÓN IFundamentos de microbiología FIGURA 13 Mecanismo propuesto por medio del cual se replican los priones. Las proteínas normales y anormales del prion difieren en su estructura terciaria. (Reimpresa con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MR (editores): Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 342). PP PP PP original NP Neurona Proteínas anormales del prion NP convertida NP convertidas NP Primer paso. La proteína priónica anormal interactúa con la proteína priónica normal. Está presente tanto la proteína priónica normal (NP) como anormal (PP) Paso 2. La proteína priónica normal se convierte en una proteína priónica anormal. Pasos 3 y 4. Las proteínas anormales del prion siguen actuando de manera recíproca con las proteínas normales del prión hasta que convierten a todas las proteínas normales en proteínas anormales PROCARIOTAS Las características principales que distinguen a las procariotas son su tamaño relativamente pequeño, casi siempre del orden de 1 μm de diámetro y la ausencia de una membrana nuclear. El DNA de casi todas las bacterias es circular con una longi- tud aproximada de 1 mm, que constituye el cromosoma bacte- riano. La mayor parte de las células procariotas tiene un solo cromosoma. El DNA cromosómico se debe doblar más de 1000 veces para acomodarse dentro de la membrana celular procariótica. Hay muchos datos que sugieren que quizá estos dobleces se realizan en forma ordenada, con lo que acercan ciertas regiones del DNA. La región especializada de la célula que contiene al DNA se denomina nucleoide y se puede obser- var con un microscopio electrónico o un microscopio de luz después de someter a la célula a un tratamiento especial para hacerlo visible. Por lo tanto, sería un error concluir que la dife- renciación subcelular, delimitada en forma clara por membra- nas en las eucariotas, no existe en las procariotas. De hecho, las procariotas en algunos casos forman estructuras subcelulares unidas a membranas con funciones especializadas, como los cromatóforos de las bacterias fotosintéticas (capítulo 2). Diversidad procariótica El tamaño pequeño del cromosoma procariótico limita la can- tidad de información genética que puede contener. La informa- ción más reciente basada en las secuencias del genoma indica que el número de genes dentro de una célula procariota varía de 468 en Mycoplasma genitalium a 7825 en Streptomyces coelicolor y que muchos de estos genes tienen que dedicarse a funciones esenciales, como generación de energía, síntesis de macromoléculas y replicación celular. Las procariotas poseen relativamente pocos genes que permiten la adaptación fisioló- gica del microorganismo a su ambiente. La variedad de ambien- tes procarióticos potenciales es increíblemente amplia, por lo que las procariotas comprenden una categoría heterogénea de microorganismos especializados, cada uno adaptado a un entorno circunscrito bastante reducido. Se puede apreciar la variedad de ambientes procarióticos si sepiensaenlasestrategiasutilizadasparagenerarenergíameta- bólica. La principal fuente de energía para la vida es la luz solar. Algunas procariotas, como las bacterias púrpuras, convierten la energía lumínica en energía metabólica sin producción de oxígeno. Otras, como las bacterias verde-azules (cianobacte- rias) producen oxígeno que proporciona energía a través de la respiración en ausencia de luz. Los microorganismos aerobios dependen de la respiración en presencia de oxígeno para obte- ner energía. Algunos microorganismos anaerobios utilizan aceptores de electrones distintos del oxígeno en la respiración. Muchos anaerobios llevan a cabo fermentaciones, de donde obtienen la energía mediante la reorientación metabólica de los sustratos químicos para el crecimiento. La gran variedad quí- mica de sustratos potenciales para el crecimiento tanto aerobio como anaerobio se refleja en la diversidad de los procariotas que se han adaptado a su aprovechamiento. Comunidades procarióticas Una estrategia útil de supervivencia para los microorganismos especializados es pertenecer a consorcios, organizaciones en las que las características fisiológicas de los diferentes organis- mos contribuyen a la supervivencia del grupo en su conjunto. Si los microorganismos dentro de una comunidad interrela- cionada desde el punto de vista físico se derivan directamente de una sola célula, la comunidad es un clon que puede con- tener hasta 108 células. La biología de esta comunidad difiere mucho de la de una sola célula. Por ejemplo, el gran número de células prácticamente asegura que en el clon existe cuando menos una célula que posee una variante de cualquier gen en el cromosoma. Por lo tanto, la variabilidad genética (la fuente del proceso evolutivo llamado selección natural) se encuentra apter 01_Carroll_4R.indd 4 apter 01_Carroll_4R.indd 4 14/04/16 14/04/16
- 18. CAPÍTULO 1 Laciencia de la microbiología 5 CUADRO 12 Características distintivas de los virus, viroides y priones Virus Viroides Priones Microorganismos intracelulares obligados Microorganismos intracelulares obligados Forma anormal de una proteína celular Constan de DNA o RNA rodeado por una cápside proteínica Constan sólo de RNA; no tienen cápside proteínica Constan sólo de proteínas; sin DNA ni RNA Reimpreso con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT (editores): Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 13. CUADRO 11 Principales enfermedades en seres humanos y animales causadas por priones Tipo Nombre Causa Enfermedades por priones en seres humanos Adquiridas Variante de enfermedad de Creutzfeldt-Jakoba Asociada con la ingestión o inoculación de material infectado por priones Kuru Enfermedad iatrógena de Creutzfeldt-Jakobb Esporádicas Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Se desconoce el origen de la infección Familiares Gerstmann-Sträussler-Scheinker Asociadas con mutaciones específicas dentro del gen que codifica PrP Insomnio familiar letal Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Enfermedades por priones en animales Ganado vacuno Encefalopatía espongiforme bovina Contacto con carne y alimento de harina de hueso contaminados con priones Ovejas Encefalopatía espongiforme ovina Ingestión de material contaminado con encefalopatía espongiforme ovina Venados, alces Enfermedad por consunción crónica Ingestión de material contaminado con priones Visón Encefalopatía transmisible del visón Se desconoce la fuente de la infección Gatos Encefalopatía espongiforme felinaa Exposición a carne y alimento de harina de hueso contaminado con priones PrP, proteína priónica. a Vinculado con el contacto con materiales contaminados por encefalopatía espongiforme bovina. b Vinculado con materiales biológicos contaminados por priones como injerto de duramadre, trasplante de córnea, hormona del crecimiento humana derivada de cadáver o instrumentos quirúrgicos contaminados por priones. Reimpreso con autorización de American Society for Microbiology. Priola SA: How animal prions cause disease in humans. Microbe 2008;3(12):568. asegurada en el interior de un clon. También es probable que el alto número de células dentro de los clones ofrezca protección fisiológica cuando menos a algunos integrantes del grupo. Por ejemplo, los polisacáridos extracelulares confieren protección contra algunos elementos potencialmente letales, como los antibióticos o iones de metales pesados. La gran cantidad de polisacáridos producidos por el gran número de células den- tro de un clon permite que las células que están en el interior sobrevivan al contacto con un elemento letal a una concentra- ción que aniquilaría a células individuales. Muchas bacterias utilizan un mecanismo de comunicación intercelular llamado quórum sensing o sensor de quórum que regula la transcripción de los genes que participan en diversos procesos fisiológicos, como bioluminiscencia, transferencia de plásmidos conjugativos y producción de los factores determi- nantes de virulencia. La percepción del quórum depende de la producción de una o más moléculas de señalización difusibles (p. ej., lactona acetilada de hemosiderina [AHL], denominadas autoinductores o feromonas que permiten que las bacterias vigilen su propia densidad poblacional (figura 1-4). Las acti- vidades de cooperación que conducen a la formación de una bioplaca son controladas por la percepción del quórum. Es un ejemplo de conducta multicelular en procariotas. Una característica que distingue a las procariotas es su capacidad de intercambio de pequeños paquetes de informa- ción genética. Esta información es llevada en los plásmidos, elementos genéticos pequeños y especializados que se pueden multiplicar en el interior de cuando menos una línea celular procariótica. En algunos casos, los plásmidos se transfieren de una célula a otra y, por lo tanto, llevan consigo grupos de información genética especializada a través de una población. Algunos plásmidos exhiben un espectro amplio de hospe- dadores que les permite transmitir grupos de genes a distin- tos microorganismos. Algunos que despiertan preocupación particular son los plásmidos de resistencia farmacológica, que inducen resistencia bacteriana al tratamiento con antimi- crobianos. La estrategia de supervivencia de una sola línea celu- lar procariótica conduce a una variedad de interacciones con otros microorganismos. Éstas comprenden relaciones simbió- ticas que llevan a complejos intercambios nutricionales entre los microorganismos dentro del intestino humano. Estos in- tercambios benefician tanto a los microorganismos como a sus hospedadores humanos. Algunas veces las interacciones pa- rasitarias son nocivas para el hospedador. La simbiosis o el parasitismo avanzado provocan la pérdida de ciertas funciones apter 01_Carroll_4R.indd 5 apter 01_Carroll_4R.indd 5 14/04/16 14/04/16
- 19. 6 SECCIÓN IFundamentos de microbiología que no permiten el crecimiento del simbionte o parásito inde- pendientemente de su hospedador. Por ejemplo, los micoplasmas son parásitos procariotas, que han perdido la capacidad de sintetizar una pared celular. La adaptación de estos microorganismos a su ambiente para- sitario ha tenido como resultado la incorporación de una can- tidad importante de colesterol en sus membranas celulares. El colesterol, que no se observa en otras procariotas, es asimi- lado del ambiente metabólico del hospedador. La pérdida de la función también se ejemplifica con los parásitos intracelulares obligados, las clamidias y las rickettsias. Estas bacterias son muy pequeñas (0.2 a 0.5 μm de diámetro) y dependen de una célula hospedadora que les suministra metabolitos esenciales y coenzimas. Esta pérdida de la función se refleja por la pre- sencia de un cromosoma más pequeño con muy pocos genes (cuadro 7-1). Los mejores ejemplos de simbiontes bacterianos son los cloroplastos y las mitocondrias, que son los organelos especia- lizados en la producción de energía de las eucariotas. Nume- rosos datos indican que los antecesores de estos organelos eran endosimbiontes, es decir, procariotas que establecieron simbiosis dentro de la membrana celular de un hospedador eucariótico ancestral. La presencia de múltiples copias de los organelos quizá contribuyó al tamaño relativamente grande de las células eucarióticas y a su potencial de especialización, rasgo que finalmente se ha reflejado en la evolución de los microorganismos multicelulares diferenciados. Clasificación de las procariotas Para comprender cualquier grupo de microorganismos, es necesario hacer una clasificación. Un buen sistema de cla- sificación permite al científico elegir las características con las que se puede catalogar con rapidez y exactitud cualquier microorganismo nuevo. La categorización permite pronosticar muchos rasgos adicionales que comparten otros integrantes de la misma categoría. En el ámbito hospitalario, la clasificación correcta de un microorganismo patógeno ofrece la vía más directa para eliminarlo. Asimismo, la clasificación permite comprender mejor las relaciones entre diferentes microorganis- mos y esta información tiene un gran valor práctico. Por ejem- plo, un microorganismo patógeno se podrá eliminar por un FIGURA 14 Percepción del quórum. (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT (editores): Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 181). Célula bacteriana Cuando hay pocas células, la concentración de la molécula de señalización lactona acetilada de hemosiderina (AHL) es baja. Cuando hay muchas células, la concentración de AHL es alta. Las concentraciones altas de AHL inducen la expresión de genes específicos. Molécula de señalización tiempo relativamente largo si su hábitat es ocupado por una variedad no patógena. En el capítulo 3 se describen los principios de la clasifica- ción procariótica. Para empezar, es importante reconocer que cualquier característica procariótica puede servir como criterio potencial de clasificación. Sin embargo, no todos los criterios son tan efectivos para agrupar microorganismos. Por ejemplo, que contenga DNA constituye un criterio inútil para distinguir los microorganismos puesto que todas las células lo contienen. La presencia de un plásmido con un espectro amplio de hospe- dadores no es un criterio útil porque estos plásmidos existen en distintos hospedadores y no es necesario que existan todo el tiempo. Los criterios útiles pueden ser estructurales, fisiológi- cos, bioquímicos o genéticos. Las esporas, estructuras celula- res especializadas que permiten la supervivencia en ambientes extremos, son criterios estructurales útiles para la clasificación porque solo subgrupos bien clasificados de bacterias forman esporas. Algunos grupos de bacterias se pueden subdividir con base en su potencial para fermentar ciertos carbohidratos. Estos criterios son poco efectivos cuando se aplican a otros grupos bacterianos que carecen de potencial de fermentación. Existe una prueba bioquímica, la tinción de Gram, que cons- tituye un criterio efectivo de clasificación porque la respuesta a la tinción refleja diferencias fundamentales y complejas en la superficie celular bacteriana que dividen a la mayor parte de las bacterias en dos grupos principales. Los criterios genéticos cada vez se utilizan más en la clasi- ficación bacteriana y muchos de estos adelantos han sido posi- bles gracias al desarrollo de tecnologías basadas en DNA. En la actualidad es posible diseñar sondas de DNA o realizar análisis de amplificación del DNA (p. ej., reacción en cadena de la poli- merasa [PCR, polymerase chain reaction]) que identifican con rapidez microorganismos que poseen regiones genéticas espe- cíficas con un linaje común. Al comparar las secuencias del DNA de algunos genes se pudieron conocer las relaciones filo- genéticas entre las procariotas. Es posible encontrar los linajes celulares ancestrales y agrupar a los microorganismos con base en sus afinidades evolutivas. Estas investigaciones condujeron a conclusiones sorprendentes. Por ejemplo, la comparación de las secuencias del citocromo c sugiere que todos los organismos eucariotas, incluidos los seres humanos, se originaron a partir de uno de tres grupos de bacterias fotosintéticas púrpuras. Esta apter 01_Carroll_4R.indd 6 apter 01_Carroll_4R.indd 6 14/04/16 14/04/16
- 20. CAPÍTULO 1 Laciencia de la microbiología 7 conclusión explica en parte el origen evolutivo de las eucario- tas, pero no tiene en cuenta por completo la opinión generali- zada de que la célula eucariótica se derivó de la fusión evolutiva de distintas líneas celulares procarióticas. Bacterias y arqueobacterias: subdivisiones principales dentro de las procariotas Un logro importante en la filogenia molecular ha sido demos- trar que las procariotas pertenecen a uno de dos grupos prin- cipales. La mayor parte de las investigaciones se ha orientado hacia un grupo, las bacterias. El otro grupo, las arqueobac- terias, ha recibido menos atención hasta hace poco, en parte a causa de que muchos de sus representantes son difíciles de estudiar en el laboratorio. Por ejemplo, algunas arqueobacte- rias mueren al contacto con el oxígeno y otras crecen a una tem- peratura que excede la del agua en ebullición. Antes de contar con datos moleculares, los principales subgrupos de arqueo- bacterias parecían diferentes. Las metanógenas llevan a cabo una respiración anaerobia que genera metano; las halófilas necesitan una concentración muy alta de sal para crecer; y las termoacidófilas necesitan una temperatura alta y gran acidez. Ahora se sabe que estas procariotas comparten rasgos bioquí- micos como la pared celular o los componentes de la membrana que las colocan en un grupo completamente aparte del de los demás microorganismos vivos. Un rasgo intrigante que com- parten las arqueobacterias y eucariotas es la presencia de intro- nes en el interior de los genes. No se ha establecido la función de los intrones (segmentos de DNA que interrumpen al DNA codificante dentro de los genes). Lo que se sabe es que los intro- nes representan una característica fundamental que comparte el DNA de las arqueobacterias y eucariotas. Este rasgo común ha originado la hipótesis de que, al igual que las mitocondrias y cloroplastos parecen ser derivados evolutivos de las bacterias, el núcleo eucariótico se originó a partir de una arqueobacteria antecesora. PROTISTAS El “núcleo verdadero” de las eucariotas (del griego karyon, “núcleo”) constituye sólo una de sus características distintivas. Los organelos adheridos a la membrana, los microtúbulos y los microfilamentos de las eucariotas forman una estructura intracelular compleja distinta a la observada en las procariotas. Los elementos para la movilidad de las células eucarióticas son flagelos o cilios (estructuras complejas formadas por múltiples filamentos que difieren de los flagelos de las procariotas). La expresión génica en las eucariotas se lleva a cabo a través de una serie de eventos que logran la integración fisiológica del núcleo con el retículo endoplásmico, estructura que carece de contraparte en las procariotas. Las eucariotas forman un grupo aparte por la organización de su DNA celular en forma de cro- mosomas separados por un aparato mitótico distinto durante la división celular. En general, la transferencia genética entre las eucariotas depende de la fusión de los gametos haploides para formar una célula diploide que contiene un conjunto completo de genes derivados de cada gameto. El ciclo de vida de muchas eucariotas se lleva a cabo casi por completo en estado diploide, cualidad de la que carecen las procariotas. La fusión de los gametos para formar su progenie reproductiva constituye una función altamente específica y establece la base de la especie eucariótica. Este término se puede aplicar solo en forma meta- fórica para las procariotas, que intercambian fragmentos de DNA a través de recombinación. Los grupos taxonómicos de las eucariotasamenudosebasanenunaseriedepropiedadesmor- fológicas compartidas y es importante señalar que muchos de los factores taxonómicos tienen que ver con la reproducción. Casi todas las especies eucarióticas exitosas son aquellas en las que las células afines, miembros de la misma especie, se pueden recombinar para formar descendencia viable. Las estructuras que contribuyen de manera directa o indirecta al proceso de la reproducción tienden a ser muy avanzadas y están amplia- mente conservadas, con modificaciones mínimas entre las especies afines. Las eucariotas microbianas (protistas) son miembros de cuatro grupos principales: algas, protozoarios, hongos y mohos. Es importante señalar que estos grupos no son necesa- riamente filogenéticos: algunos microorganismos afines se han clasificado por separado porque aún no se encuentran similitu- des bioquímicas y genéticas de fondo. Algas El término alga se utiliza desde hace tiempo para referirse a los microorganismos que producen O2 como producto de la foto- síntesis. Un subgrupo importante de estos microorganismos, las bacterias verde-azules o cianobacterias, son procariotas y ya no se llaman algas. Esta clasificación se reserva de manera exclusiva para los microorganismos eucariotas fotosintéticos. Todas las algas contienen clorofila en la membrana fotosinté- tica de su cloroplasto intracelular. Muchas especies de algas son unicelulares. Otras algas forman estructuras multicelula- res muy grandes. Los sargazos de algas cafés miden en ocasio- nes varios cientos de metros de longitud. Otras algas producen toxinas que son venenosas para el ser humano y otros anima- les. Los dinoflagelados, algas unicelulares, generan las mareas rojas en el océano (figura 1-5). La marea roja producida por el dinoflagelado de la especie Gonyaulax es importante por- que este microorganismo produce neurotoxinas como saxito- xina y gonyautoxinas, que se acumulan en los mariscos (p. ej., almejas, mejillones, callo de hacha y ostiones) que se alimentan con este microorganismo. El consumo de estos mariscos pro- duce intoxicación paralítica por mariscos que puede causar la muerte. Protozoarios Los protozoarios son organismos protistas unicelulares no fotosintéticos. Los protozoarios más primitivos son flagelados y se asemejan en muchos aspectos a algunos representantes de las algas. Es probable que los antecesores de estos proto- zoarios fueran algas que se tornaron heterótrofas; las necesi- dades alimentarias de estos microorganismos se satisfacen con compuestos orgánicos. La adaptación a un modo de vida hete- rótrofo en ocasiones se acompañó de pérdida de los cloroplas- tos y, por eso, las algas dieron origen a los protozoarios afines. apter 01_Carroll_4R.indd 7 apter 01_Carroll_4R.indd 7 14/04/16 14/04/16
- 21. 8 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Se han observado eventos similares en el laboratorio como resultado de una mutación o de una adaptación fisiológica. Al parecer, de los protozoarios flagelados surgieron las variedades ameboides y ciliadas; se sabe que algunas formas intermedias tienen flagelos durante una fase de su ciclo vital y seudópodos (característicos de la ameba) en otra fase. Un cuarto grupo de protozoarios, los esporozoarios, son parási- tos estrictos que casi siempre son inmóviles; la mayor parte se reproduce de manera sexual y asexual en generaciones alternas FIGURA 15 Microfotografía electrónica de un dinoflagelado Gymnodinium (4000×). (Reimpresa con autorización de David M. Phillips/Visuals Unlimited.) por medio de esporas. En el capítulo 46 se describen los proto- zoarios parásitos del ser humano. Hongos Los hongos son protistas no fotosintéticos que crecen en forma de conjuntos de filamentos ramificados y entrelazados (“hifas”) conocidos como micelios. El micelio micótico con- tiguo más grande que se conoce cubrió un área de 9.7 km2 en una región situada en la zona este de Óregon. A pesar de que las hifas poseen paredes cruzadas, éstas tienen perforaciones que permiten el paso libre del núcleo y citoplasma. Por lo tanto, el microorganismo completo es un cenocito (aglomeración mul- tinucleada de citoplasma continuo) confinado dentro de una serie de tubos ramificados. Estos tubos, elaborados con poli- sacáridos como quitina, son homólogos con las paredes celu- lares. Los hongos que poseen micelios se denominan mohos; algunos tipos de hongos denominados levaduras no forman micelios, pero se reconocen con facilidad como hongos por la naturaleza de su reproducción sexual y la presencia de formas de transición. Es probable que los hongos representen una rama evo- lutiva de los protozoarios; no tienen relación con los actino- micetos, que son bacterias con micelios a las que se parecen superficialmente. Las subdivisiones principales (phyla) de los hongos son: Chytridiomycota, Zygomycota (zigomicetos), Ascomycota (ascomicetos), Basidiomycota (basidiomicetos) y los “deuteromicetos” (u hongos imperfectos). La evolución de los ascomicetos a partir de los ficomicetos se observa en un grupo de transición, cuyos integrantes for- man un cigoto que después se transforma en ascos. Se cree que los basidiomicetos provienen, a su vez, de los ascomicetos. La clasificación de los hongos y su importancia médica se descri- ben en el capítulo 45. FIGURA 16 Mohos de fango. A: Ciclo de vida de un moho de fango acelular. B: Cuerpo fructífero de un moho de fango celular. (Reimpresa con autorización de Carolina Biological Supply/Phototake, Inc.) Esporas Germinación Mixamebas Sincicio Cuerpo fructífero A B Los cuerpos fructíferos liberan esporas apter 01_Carroll_4R.indd 8 apter 01_Carroll_4R.indd 8 14/04/16 14/04/16
- 22. CAPÍTULO 1 Laciencia de la microbiología 9 Mohos de fango Estos microorganismos se caracterizan por la presencia, durante una fase de su ciclo vital, de una masa multinucleada ameboide de citoplasma llamada sincicio. Este último de un moho de fango es análogo al micelio de un hongo verdadero. Ambos son cenocíticos. Mientras que en este último la circu- lación citoplásmica se confina a la red de tubos quitinosos, en el primero el citoplasma circula en cualquier dirección. Esta circulación provoca que el sincicio emigre en dirección de su fuente alimentaria, a menudo bacterias. En respuesta a una señal química, por ejemplo, 3′,5′-AMP cíclico (capítulo 7), el sin- cicio, que alcanza un tamaño macroscópico, se diferencia para formar un cuerpo con pedúnculo que produce células móviles individuales. Estas células, flageladas o ameboides, empiezan un nuevo ciclo de vida del moho de fango (figura 1-6). El ciclo a menudo empieza por la fusión sexual de células aisladas. El ciclo vital de los mohos de fango ilustra un tema central de este capítulo: la interdependencia de las formas vivientes. El crecimiento de los hongos de fango depende de los nutrientes que proporcionan las bacterias o, en algunos casos, las células vegetales. La reproducción de los mohos de fango a través de sincicios depende del reconocimiento intercelular y la fusión de las células de la misma especie. Para comprender bien las características de un microorganismo es indispensable cono- cer los demás microorganismos con los que ha evolucionado y apreciar la variedad de respuestas fisiológicas que contribuyen a su supervivencia. RESUMEN DEL CAPÍTULO • Los microorganismos son un grupo grande y diverso de organismos que existen como células aisladas o agrupa- ciones; también incluyen los virus, que son microscópicos, pero carecen de características celulares. • Un virus consta de una molécula de ácido nucleico, ya sea DNA o RNA, contenida en una capa proteínica o cápside, algunas veces encerrada en una envoltura compuesta de lípidos, proteínas y carbohidratos. • Un prion es una proteína infecciosa que puede causar enfermedades neurológicas crónicas. • Las procariotas consisten en bacterias y arqueobacterias. • Las procariotas son organismos haploides. • Las eucariotas microbianas, o protistas, pertenecen a cuatro grupos principales: algas, protozoarios, hongos y mohos. • Las eucariotas tienen núcleos verdaderos y son diploides. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. ¿Cuál de los siguientes términos caracteriza la interacción entre el virus del herpes simple y un virus de origen humano? (A) Parasitismo (B) Simbiosis (C) Endosimbiosis (D) Endoparasitismo (E) Consorcio 2. ¿Cuál de los siguientes carece de ácido nucleico? (A) Bacterias (B) Virus (C) Viroides (D) Priones (E) Protozoarios 3. ¿Cuál de los siguientes es un procariota? (A) Bacterias (B) Algas (C) Protozoarios (D) Hongos (E) Mohos de fango 4. ¿Cuál de los siguientes agentes contiene simultáneamente DNA y RNA? (A) Bacterias (B) Virus (C) Viroides (D) Priones (E) Sincicio 5. ¿Cuál de los siguientes no se puede infectar por virus? (A) Bacterias (B) Protozoarios (C) Células humanas (D) Virus (E) Ninguno de los anteriores 6. Los virus, las bacterias y los protistas se caracterizan de manera exclusiva por sus respectivos tamaños. ¿Verdadero o falso? (A) Verdadero (B) Falso 7. La percepción del quórum en las procariotas comprende: (A) Comunicación entre células (B) Producción de moléculas como lactona acetilada de hemo- siderina (AHL) (C) Un ejemplo de conducta multicelular (D) La regulación de los genes que participan en diversos proce- sos fisiológicos (E) Todas las anteriores 8. Una mujer de 16 años de edad acudió con su médico familiar y refirió secreción vaginal anormal y prurito. La paciente negó haber tenido actividad sexual y en fecha reciente concluyó un tratamiento para acné con doxiciclina. El examen de un frotis de secreción vaginal con tinción de Gram reveló la presencia de células grampositivas ovales con un diámetro de 4 a 8 μm. ¿Cuál de los siguientes microorganismos es la causa de su vaginitis? (A) Bacterias (B) Virus (C) Protozoarios (D) Hongos (E) Priones 9. Un hombre de 65 años de edad manifiesta demencia progresiva en el transcurso de varios meses acompañada de ataxia y somno- lencia. El patrón del electroencefalograma muestra paroxismos con voltajes altos y ondas lentas que sugieren enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. ¿Cuál de los siguientes microorganismos es la causa de esta enfermedad?: (A) Bacteria (B) Virus (C) Viroide (D) Prion (E) Sincicio apter 01_Carroll_4R.indd 9 apter 01_Carroll_4R.indd 9 14/04/16 14/04/16
- 23. 10 SECCIÓN IFundamentos de microbiología 10. Unos 20 min después de consumir una almeja cruda, un varón de 35 años de edad manifiesta parestesias en boca y extremidades, cefalea y ataxia. Estos síntomas son resultado de una neurotoxina producida por un alga llamada: (A) Ameba (B) Algas verde-azules (C) Dinoflagelados (D) Algas marinas (E) Ninguno de las anteriores Respuestas 1. A 2. D 3. A 4. A 9. D 10. C 5. E 6. B 7. E 8. D Belay ED: Transmissible spongiform encephalopathies in humans. Annu Rev Microbiol 1999;53:283. Colby DW, Prusiner SB: De novo generation of prion strains. Nature Rev Microbiol 2011;9:771. Diener TO: Viroids and the nature of viroid diseases. Arch Virol 1999;15(Suppl):203. Fournier PE, Raoult D: Prospects for the future using genomics and proteomics in clinical microbiology. Annu Rev Microbiol 2011;65:169. Katz LA: Origin and diversification of eukaryotes. Annu Rev Micro- biol 2012;63:411. Lederberg J (editor): Encyclopedia of Microbiology, 4 vols. Academic Press, 1992. Olsen GJ, Woese CR: The winds of (evolutionary) change: Breathing new life into microbiology. J Bacteriol 1994;176:1. Priola SA: How animal prions cause disease in humans. Microbe 2008;3:568. Prusiner SB: Biology and genetics of prion diseases. Annu Rev Microbiol 1994;48:655. Schloss PD, Handlesman J: Status of the microbial census. Microbiol Mol Biol Rev 2004;68:686. Sleigh MA: Protozoa and Other Protists. Chapman & Hall, 1990. Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ: Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:6578. BIBLIOGRAFÍA Abrescia NGA, Bamford DH, Grimes JM, Stuart DL: Structure uni- fies the viral universe. Annu Rev Biochem 2012;81:795. Arslan D, Legendre M, Seltzer V, et al., Distant Mimivirus relative with a larger genome highlights the fundamental features of Megaviridae. Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108:17486. apter 01_Carroll_4R.indd 10 apter 01_Carroll_4R.indd 10 14/04/16 14/04/16
- 24. 11 2 Estructura celular C AP Í T U L O Este capítulo revisa la estructura y función básica de los com- ponentes que constituyen a las células eucariotas y procario- tas. El capítulo inicia con el análisis del microscopio. Desde el punto de vista histórico, el microscopio reveló por primera vez la presencia de bacterias y más tarde, los secretos de la estruc- tura celular. Hoy en día es aún una herramienta poderosa en el estudio de la biología celular. MÉTODOS ÓPTICOS El microscopio de luz El poder de resolución del microscopio de luz bajo condiciones ideales es de casi la mitad de la longitud de onda de la luz uti- lizada. (El poder de resolución es la distancia que debe sepa- rar dos puntos de fuentes de luz para que puedan observarse como dos imágenes distintas.) Con la longitud de onda de la luz amarilla con 0.4 μm, los diámetros separados más peque- ños son de casi 0.2 μm (p. ej., casi la tercera parte del ancho de una célula procariota típica). La utilidad del microscopio radica en que la magnificación hace visibles las partículas más pequeñas alcanzables en el poder de resolución. A continua- ción se revisan varios tipos de microscopios de luz, los cuales se utilizan a menudo en microbiología. A. Microscopio de campo brillante El microscopio de campo brillante es el utilizado más a menudo en los cursos de microbiología y consiste en dos series de len- tes (objetivo y ocular) que actúan en conjunto para la resolu- ción de la imagen. Estos microscopios por lo general emplean una lente objetivo con 100 aumentos y una lente ocular con 10 aumentos, con lo que la magnificación de la muestra es de hasta 1000 veces. Las partículas con diámetros de 0.2 μm se incrementan de tamaño a casi 0.2 mm, por lo que se hacen cla- ramente visibles. La magnificación adicional no brinda mayor resolución de detalle y puede reducir el área de visibilidad (campo). Con el microscopio, las muestras se tornan visibles por las diferencias en el contraste entre ellas y el entorno. Muchas bacterias son difíciles de observar bien por la falta de contraste con el medio circundante. Pueden utilizarse colorantes para teñir las células o sus organelos e incrementar el contraste, de forma que sean visibles con mayor facilidad en la microscopia de campo brillante. B. Microscopio de contraste de fases El microscopio de contraste de fases se desarrolló para mejo- rar las diferencias de contraste entre las células y el medio cir- cundante, con lo que se hace posible observar células vivas sin tinción; con los microscopios de campo brillante deben utili- zarse preparaciones de microorganismos muertos y teñidos. La microscopia de contraste de fases toma ventaja del hecho de que la luz pasa a través de objetos transparentes, como las célu- las, y se fusiona en diferentes fases dependiendo de las propie- dades de los materiales a través de los cuales pasa. Este efecto se amplifica por medio de un anillo especial en la lente objetivo del microscopio de contraste de fases, lo que da origen a la for- mación de una imagen oscura en un entorno luminoso. C. Microscopio de campo oscuro El microscopio de campo oscuro es el microscopio de luz en el cual el sistema de iluminación se ha modificado para alcanzar la muestra desde un solo lado. Esto se logra a través del uso de un condensador especial que bloquea la luz directa y la refleja a través de un espejo ubicado a un costado del condensador en un ángulo oblicuo. Esto crea un “campo oscuro” que contrasta contra el borde luminoso de la muestra y da origen a que los rayos oblicuos se reflejen desde el borde de la muestra hacia el objetivo del microscopio. La resolución de la microscopia de campo oscuro es bastante alta. Así, esta técnica ha sido de par- ticular utilidad para la observación de microorganismos como Treponema pallidum, una espiroqueta con un diámetro inferior a 0.2 μm y que por lo tanto no puede observarse con micros- copia de contraste de fases o de campo brillante (figura 2-1A). D. Microscopio de fluorescencia El microscopio de fluorescencia se utiliza para visualizar muestras con efecto de fluorescencia, que tiene la capacidad de absorber luz de longitud de onda corta (ultravioleta) y emitir luz con mayor longitud de onda (luz visible). Algunos microor- ganismos presentan fluorescencia natural por la presencia de sustancias fluorescentes, como la clorofila. Aquellos que no presentan fluorescencia natural pueden teñirse con un grupo de colorantes fluorescentes denominados fluorocromos. La microscopia de fluorescencia se utiliza ampliamente para el diagnóstico microbiológico. Por ejemplo, el fluorocromo aura- mina O adquiere un color amarillo brillante cuando se expone a la luz ultravioleta y es captado en gran medida por Myco- bacterium tuberculosis, la bacteria que causa la tuberculosis. Cuando el colorante se aplica a una muestra que se sospecha apter 02_Carroll_4R.indd 11 apter 02_Carroll_4R.indd 11 14/04/16 14/04/16
- 25. 12 SECCIÓN IFundamentos de microbiología contiene M. tuberculosis y se expone a la luz ultravioleta, la bacteria puede detectarse por la aparición de microorganismos de color amarillo brillante contra un campo oscuro. El uso principal de la microscopia de fluorescencia es la téc- nica diagnóstica denominada técnica de anticuerpos fluores- centes (FA, fluorescent-antibody) o inmunofluorescencia. En esta técnica, anticuerpos específicos (p. ej., anticuerpos contra Legionella pneumophila) se marcan por medios químicos con fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceína (FITC, fluorescein isothiocyanate). Tales anticuerpos fluorescentes se añaden a la preparación que contiene la muestra. Si la muestra contiene L. pneumophila, los anticuerpos fluorescentes se unen a los antígenos en la superficie de la bacteria, dando origen a fluo- rescencia cuando haya exposición a luz ultravioleta (figura 2-1B). E. Microscopio diferencial de contraste de interferencia Los microscopios diferenciales de contraste de interferencia (DIC, differential interference contrast microscope) usan un polarizador para producir luz polarizada, la cual se hace pasar a través de un prisma que genera dos haces distintos; éstos pasan a través de la muestra y entran al objetivo donde se combinan en un solo haz. Por las ligeras diferencias en el índice de refrac- ción de las sustancias a través de las cuales pasa cada haz, los haces combinados no están por completo alineados, sino que crean un efecto de interferencia, el cual intensifica diferen- cias útiles en la estructura celular. Estructuras como esporas, vacuolas y gránulos adquieren un aspecto tridimensional. La microscopia DIC es en particular útil para observar células no teñidas, por su capacidad para producir imágenes que revelan estructuras celulares internas que son menos aparentes con las técnicas de campo brillante. Microscopio electrónico El gran poder de resolución de la microscopia electrónica per- mite a los científicos observar estructuras detalladas de células procariotas y eucariotas. La resolución superior de la microscopia electrónica se debe al hecho de que los electrones tienen una lon- gitud de onda mucho más corta que los fotones de la luz blanca. Hay dos tipos de microscopios electrónicos para uso gene- ral: el microscopio electrónico de transmisión (TEM, trans- mission electron microscope), que tiene muchas características en común con el microscopio de luz y el microscopio electró- nico de barrido (SEM, scanning electron microscope). El TEM fue el primero en ser desarrollado y utiliza un haz de electrones proyectados desde una fuente de electrones y se dirige a partir de un condensador electromagnético hacia una muestra del- gada. Conforme los electrones golpean la muestra, son disper- sados en forma diferencial por los distintos números atómicos y masa atómica en la muestra; algunos electrones pasan a través de la muestra y son recopilados y dirigidos por una lente obje- tivo electromagnética, que presenta una imagen de la muestra a un sistema de proyección de lentes para su ampliación adicio- nal. Se visualiza la imagen al permitir que se afecte la pantalla, la cual presenta fluorescencia cuando chocan los electrones. La imagen puede registrarse en película fotográfica. El TEM per- mite observar partículas con separación de 0.001 μm. Los virus con diámetros de 0.01 a 0.2 μm pueden observarse con facilidad. A 10 μm B C FIGURA 21 A: Examen positivo en campo oscuro. Los treponemas se identifican por su forma característica en sacacorchos y por los movimientos hacia adelante y hacia atrás con rotación sobre su eje longitudinal. (Reproducida con autorización de Charles Stratton/Visuals Unlimited). B: Microfotografía con fluorescencia. Bacteria con forma de bastón realzada con un marcador fluorescente. (© Evans Roberts.) C: Microscopia de barrido electrónico de bacterias de Staphylococcus aureus (32000×). (Reproducida con autorización de David M. Phillips/Photo Researchers, Inc.) apter 02_Carroll_4R.indd 12 apter 02_Carroll_4R.indd 12 14/04/16 14/04/16
- 26. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 13 El SEM por lo común tiene menor poder de resolución que el TEM; sin embargo, es de particular utilidad para propor- cionar imágenes tridimensionales de la superficie de objetos microscópicos. Los electrones se dirigen por medio de lentes a un punto muy fino. La interacción de los electrones con la muestra da origen a la liberación de diferentes formas de radia- ción (p. ej., electrones secundarios) de la superficie del mate- rial, la cual se capta por medio de un detector apropiado, se amplifica y más tarde se presenta como imágenes en una pan- talla de televisión (figura 2-1C). Una técnica importante en la microscopia electrónica es el uso de “sombreado”. Esto consiste en el depósito de una capa delgada de metal pesado (como platino) sobre la muestra al colocarlo en el trayecto del haz de iones metálicos en el vacío. El haz se dirige en un ángulo agudo respecto a la muestra, de forma que adquiere una “sombra” en la forma de un área no cubierta en el otro lado. Cuando un haz de electrones pasa a través de la preparación cubierta en el microscopio electrónico y se crea una imagen positiva a partir de una imagen “negativa” se logra un efecto tridimensional (figura 2-21). Otra técnica importante en la microscopia electrónica incluye el uso de cortes ultradelgados de material incrustado, un método de congelamiento-secado de muestras que evita la distorsión causada por los procedimientos convencionales desecados, y con el uso de tinciones negativas con un mate- rial denso para los electrones, como el ácido fosfotungsténico o sales de uranilo (figura 42-1). Sin estas sales de metales pesa- dos, no se lograría suficiente contraste para detectar los deta- lles de una muestra. Microscopio láser confocal El microscopio láser confocal (CSLM, confocal scanning laser microscope) asocia una fuente luminosa láser con un micros- copio de luz. En la microscopia láser confocal un haz láser se dirige a un espejo que a su vez dirige el haz a través del dispo- sitivo de imagen. A continuación el haz láser se dirige a través de un orificio que se ajusta con precisión al plano del foco del haz para dar una capa vertical en la muestra. Al iluminar con precisión sólo un plano de la muestra, la intensidad de la ilumi- nación disminuye con rapidez por arriba y por abajo del plano del foco y aleja la luz de otros planos diferentes al focal. Así, con muestras relativamente gruesas, pueden observarse varias capas al ajustar el plano del foco del haz láser. Las células a menudo se tiñen con colorantes fluorescentes para hacerlas más visibles. Otro método consiste en generar imágenes con color falso al ajustar el microscopio en forma tal que se obtengan diferentes capas con diferentes colores. Los microscopios láser confocales están equipados con programas informáticos para crear imágenes digitales para su procesa- miento subsiguiente. Así, las imágenes obtenidas de las dife- rentes capas pueden almacenarse y superponerse por medios digitales para reconstruir una imagen tridimensional de la totalidad de la muestra. Microscopio de sonda de barrido Los microscopios de sonda de barrido son una nueva clase de microscopios que miden características de la superficie al des- plazar una sonda sobre la superficie del objeto. La microscopia de efecto túnel y la microscopia de fuerza atómica son ejem- plos de esta nueva clase de microscopios, que permiten a los científicos observar átomos o moléculas en la superficie de la muestra estudiada. Por ejemplo, pueden estudiarse las interac- ciones entre las proteínas de la bacteria Escherichia coli con el empleo de un microscopio de fuerza atómica. ESTRUCTURA DE CÉLULAS EUCARIOTAS Núcleo El núcleo contiene el genoma de la célula. Está limitado por una membrana formada por un par de unidades de membrana separadas por un espacio de grosor variable. La membra- na interna por lo común es un saco simple, pero la membrana más externa se presenta en varios sitios como una continua- ción del retículo endoplásmico (ER, endoplasmic reticulum). La membrana nuclear muestra permeabilidad selectiva por la presencia de poros, que consisten en varias proteínas complejas cuya función es importar sustancias y extraer sustancias del núcleo. Los cromosomas de las células eucariotas contienen macromoléculas de DNA lineal expuestas en una doble hélice. Sólo son visibles con la microscopia de luz cuando la célula se encuentra en división y el DNA se encuentra en una forma muy condensada; en otros momentos los cromosomas no se encuentran condensados y tienen el aspecto que se muestra en la figura 2-3. Las macromoléculas de DNA de las células euca- riotas se asocian con proteínas básicas denominadas histonas que se unen al DNA por medio de interacciones iónicas. Una estructura a menudo visible en el núcleo es el nu- cléolo, un área rica en RNA que es el sitio de síntesis del RNA ribosómico (figura 2-3). Las proteínas ribosómicas sintetizadas en el citoplasma se transportan hacia el nucléolo y se combi- nan con RNA ribosómico para formar subunidades grandes y pequeñas de ribosoma eucariota. Más tarde éstas son llevadas al citoplasma donde se asocian para formar ribosomas intactos que participan en la síntesis de proteínas. Estructuras citoplásmicas El citoplasma de las células eucariotas se caracteriza por la pre- sencia de un ER, vacuolas, plástidos que se reproducen por sí FIGURA 22 Microscopio de fuerza atómica. Micrografía de un fragmento de DNA. Las zonas brillantes en forma de pico corresponden a enzimas unidas al DNA (Torunn Berg, Photo Researchers, Inc). apter 02_Carroll_4R.indd 13 apter 02_Carroll_4R.indd 13 14/04/16 14/04/16
- 27. 14 SECCIÓN IFundamentos de microbiología mismos y un citoesqueleto complejo, compuesto por microtú- bulos, microfilamentos y filamentos intermedios. El retículo endoplásmico es una red de conductos limita- dos por membranas que tienen continuidad con la membrana del núcleo. Se identifican dos tipos de ER: rugoso, al cual se unen ribosomas 80S y liso, sin dichos ribosomas (figura 2-3). El ER rugoso es el principal productor de glucoproteínas y tam- bién produce nuevo material de membrana que se transporta a través de la célula; el ER liso participa en la síntesis de lípidos y en algunos aspectos del metabolismo de los carbohidratos. El aparato de Golgi consiste en un conjunto de membranas que funcionan en combinación con el ER para modificar y orga- nizar productos químicos del retículo endoplásmico que más tarde serán secretados y aquellos que participan en la produc- ción de otras estructuras de la membrana celular. Losplástidosincluyenmitocondriasycloroplastos.Varias pruebas sugieren que las mitocondrias y cloroplastos son des- cendientes de microorganismos procariotas antiguos y que se originaron del englobamiento de células procariotas por célu- las de mayor tamaño (endosimbiosis). Las mitocondrias tienen el tamaño de una célula procariota y su membrana, que carece de esteroles, es mucho menos rígida que la membrana citoplás- mica de las células eucariotas, las cuales contienen esteroles. FIGURA 23 Células eucariotas. A: Representación esquemática de una célula animal. B: Representación esquemática de una célula vegetal. C: micrografía de una célula animal que muestra varias estructuras unidas a la membrana, incluidas mitocondrias y núcleo [figura 2-3 (A) y (B)]. Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT: Microbiology: a Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009. Figura 2-3 (C) reproducida con autorización de Thomas Fritsche, MD, PhD). Las mitocondrias contienen dos grupos de membranas. La membrana más externa es permeable y cuenta con numero- sos conductos diminutos que permiten el paso de iones y mo- léculas pequeñas (p. ej., trifosfato de adenosina [ATP, adeno- sine triphosphate]). La invaginación de la membrana externa forma un sistema de membranas plegadas internas denomi- nadas crestas. Las crestas son los sitios donde se encuentran las enzimas que participan en la respiración y producción de ATP. También contienen proteínas de transporte específico que regulan el paso de metabolitos hacia el interior y el exte- rior de la matriz mitocondrial. Dicha matriz contiene varias enzimas, en particular aquellas que participan en el ciclo del ácido cítrico. Los cloroplastos son organelos celulares fotosin- téticos capaces de convertir la energía de la luz solar a energía química por medio de la fotosíntesis. La clorofila y todos los demás componentes necesarios para la fotosíntesis se ubican en una serie de discos aplanados de la membrana denomina- dos tilacoides. El tamaño, forma y número de cloroplastos por célula varía notablemente; a diferencia de las mitocondrias, los cloroplastos por lo general son mucho más grandes que las células procariotas. Las mitocondrias y cloroplastos contienen su propio DNA, el cual se encuentra en forma circular cerrada por medio de enlaces covalentes y codifica algunas proteínas Membrana celular Mitocondria Núcleo Membrana nuclear 1 μm A B C Complejo de Golgi Citoesqueleto Filamentos de actina Microtúbulos Filamentos intermedios Retículo endoplásmico liso Envoltura nuclear Nucléolo Núcleo Citoplasma Pared celular de la célula adyacente Cloroplasto (abierto para mostrar los tilacoides) Peroxisoma Vacuola central Lisosoma Ribosomas Mitocondrias Retículo endoplásmico rugoso Membrana plasmática Pared celular Complejo de Golgi Citoesqueleto Filamentos de actina Microtúbulo Filamento intermedio Retículo endoplásmico liso Cubierta nuclear Nucléolo Núcleo Citoplasma Membrana plasmática Peroxisoma Lisosoma Ribosoma Mitocondrias Retículo endoplásmico rugoso Centríolo apter 02_Carroll_4R.indd 14 apter 02_Carroll_4R.indd 14 14/04/16 14/04/16
- 28. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 15 (no todas) y participa en la transferencia de RNA. Las mitocon- drias y cloroplastos también contienen ribosomas 70S, al igual que las procariotas. Algunos microorganismos eucariotas (p. ej., Trichomo- nas vaginalis) carecen de mitocondrias y en su lugar contienen organelos respiratorios rodeados por una membrana, deno- minados hidrogenosomas. Estos últimos también parecen haberse originado por endosimbiosis y en algunos se ha identi- ficado que contienen DNA y ribosomas. Los hidrogenosomas, pese a que son similares en tamaño con las mitocondrias, care- cen de crestas y de las enzimas del ciclo del ácido tricarboxí- lico. El hidrogenosoma capta al piruvato, H2 , CO2 y acetato y produce ATP. Los lisosomas son sacos rodeados por membrana que contienen varias enzimas digestivas que las células utilizan para desdoblar macromoléculas como proteínas, grasas y polisacáridos. Los lisosomas permiten que estas enzimas no se encuentren en contacto con el citoplasma, donde pueden destruir macromoléculas celulares de importancia si no son contenidas en forma apropiada. Después de la hidrólisis de macromoléculas en los lisosomas, los monómeros resultantes pasan del lisosoma hacia el citoplasma donde actúan como nutrientes. El peroxisoma es una estructura rodeada por membrana cuya función consiste en producir H2 O2 por la reducción de O2 a partir de varios hidrógenos donadores. El H2 O2 producido en el peroxisoma más tarde se degrada a H2 O y O2 por acción de la enzima catalasa. El citoesqueleto es una estructura tridimensional que ocu- pa el citoplasma. Los tres tipos principales de fibras que com- prenden el citoesqueleto son microfilamentos, filamentos in- termedios y microtúbulos. Los microfilamentos tienen casi 3 a 6 nm de diámetro y son los polímeros compuestos por subunidades de la proteína actina. Estas fibras forman anda- mios a través de los cuales se define y mantiene la forma de la célula. Los microfilamentos pueden desplazarse por los movi- mientos celulares, lo que incluye deslizamiento, contracción y citocinesis. Los microtúbulos son tubos cilíndricos, de 20 a 25 nm de diámetro y están compuestos por subunidades de la proteína tubulina. Los microtúbulos colaboran con los microfilamentos para mantener la estructura celular, formar las fibras fusifor- mes que separan los cromosomas durante la mitosis y también participar de manera importante en la motilidad celular. Los filamentos intermedios tienen casi 10 nm de diámetro y pro- porcionan fuerza tensil a la célula. Capas superficiales El citoplasma está rodeado por una membrana plasmática compuesta por proteínas y fosfolípidos, similar a la membrana de las células procariotas, ilustrada más adelante (figura 2-11). La mayor parte de las células animales no tienen otras capas superficiales; no obstante, las células vegetales tienen una pared celular externa compuesta por celulosa (figura 2-3b). Muchos microorganismos eucariotas también tienen una pared celu- lar externa, que puede ser compuesta por polisacáridos como celulosa o quitina o pueden ser inorgánicos, por ejemplo, la pared de sílice de las diatomeas. Organelos que participan en la motilidad Muchos microorganismos eucariotas tienen organelos denomi- nados flagelos (p. ej., T. vaginalis) o cilios (p. ej., Paramecium) que permiten el movimiento similar a una onda que desplaza las células sobre el agua. Los flagelos eucariotas surgen de las regiones polares de la célula y los cilios, que son más cortos que los flagelos, rodean a las células (figura 2-4). Los flagelos y los cilios de las células eucariotas tienen la misma estructura básica y composición bioquímica. Ambos consisten en grupos de microtúbulos, cilindros proteínicos huecos compuestos por una proteína llamada tubulina y que está rodeada por una membrana. La disposición de los microtúbulos se conoce como “sistema 9 + 2” porque está formado de nueve pares periféri- cos de microtúbulos rodeados por dos microtúbulos centrales (figura 2-5). ESTRUCTURA DE LAS CÉLULAS PROCARIOTAS La célula procariota es más simple que la eucariota en todos los aspectos, con una excepción: la envoltura celular es más compleja. Nucleoide Las células procariotas no tienen un núcleo verdadero; alma- cenan su DNA en una estructura conocida como nucleoide. El DNA de carga negativa es neutralizado, al menos en parte, por poliaminas pequeñas y por iones de magnesio, pero las proteí- nas similares a histonas existen en bacterias y tal vez desempe- ñan una función similar a la de las histonas en la cromatina de las células eucariotas. Las micrografías electrónicas de células procariotas típi- cas revelan la presencia de membrana nuclear y de un aparato mitótico. La excepción a esta regla son los plantomicetos, un grupo de bacterias acuáticas que tienen un nucleoide rodeado por una cubierta nuclear formada por dos membranas. La dife- renciación entre las células procariotas y eucariotas es que las 20 μm FIGURA 24 Paramecio que se desplaza con la ayuda de cilios en la superficie celular. (© Manfred Kage). apter 02_Carroll_4R.indd 15 apter 02_Carroll_4R.indd 15 14/04/16 14/04/16
- 29. 16 SECCIÓN IFundamentos de microbiología primeras no cuentan con un aparato similar al huso mitótico. La región nuclear (figura 2-6) está llena de fibrillas de DNA. El nucleoide de la mayor parte de las células bacterianas consiste en una molécula circular única y continua, que varía en tamaño de 0.58 a casi 10 millones de pares de bases. Sin embargo, unas cuantas bacterias han demostrado poseer dos, tres o incluso cuatro cromosomas diferentes. Por ejemplo, Vibrio cholerae y Brucella melitensis tienen dos cromosomas distintos. Hay dos excepciones a esta regla de material genético circular porque algunas células procariotas (Borrelia burgdorferi y Streptomy- ces coelicolor) han mostrado poseer cromosomas lineales. En las bacterias, el número de nucleoides y por lo tanto el número de cromosomas, depende de las condiciones de B A Cabeza del rayo Brazo externo de dineína Brazo interno de dineína Rayo Vínculo de nexina Vaína central Subtúbulo B Subtúbulo A Microtúbulo central Microtúbulo doble FIGURA 25 Estructura de cilios y flagelos. A: Micrografía electrónica de un corte transversal de un cilio. Obsérvense los dos microtúbulos centrales rodeados por nueve dobletes de microtúbulos (160000×). (Reproducida de KG Murti/Visuals Unlimited) B: Diagrama de la estructura de cilios y flagelos. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [eds]: Prescott, Harley, and Klein’s Microbiology, 7a. ed. Nueva York: McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Will Companies, Inc.) FIGURA 26 Nucleoide. A: Microfotografía electrónica de transmisión resaltada con color de una Escherichia coli con su DNA en rojo. (© CNRI/ SPL/Photo Researchers, Inc.) B: Cromosoma liberado de una célula de E. coli que fue lisada con delicadeza. Obsérvese qué tan comprimido debe encontrarse el DNA dentro de la bacteria. (© Dr. Gopal Murti/SPL/Photo Researchers). proliferación. Las bacterias con rápido crecimiento tienen nucleoides más grandes por célula que las de crecimiento lento; sin embargo, cuando se presentan múltiples copias, todas son similares (es decir, las células procariotas son haploides). Estructuras citoplásmicas Las células procariotas carecen de plástidos autónomos, como las mitocondrias y cloroplastos; las enzimas de transporte de electrones se localizan en la membrana citoplásmica. Los pig- mentos fotosintéticos (carotenoides, bacterioclorofila) de bac- terias fotosintéticas se encuentran contenidos en sistemas de membranas intracitoplásmicas de varias morfologías. Las ve- 0.5 μm A B Fibras de DNA Célula rota Membrana apter 02_Carroll_4R.indd 16 apter 02_Carroll_4R.indd 16 14/04/16 14/04/16
- 30. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 17 sículas de membrana (cromatóforos) son tipos de membrana observadas a menudo. Algunas bacterias fotosintéticas tienen estructuras especializadas rodeadas por membrana denomi- nadas clorosomas. En algunas cianobacterias (antes conoci- das como algas azul-verdosas) las membranas fotosintéticas a menudo forman estructuras de múltiples capas conocidas como tilacoides (figura 2-7). Los principales pigmentos accesorios uti- lizados para recolectar luz son las ficobilinas que se encuentran en la superficie externa de las membranas de los tilacoides. Las bacterias a menudo almacenan materiales de reserva en forma de gránulos insolubles, que tienen el aspecto de cuerpos refringentes en el citoplasma cuando se observan en un microscopio de contraste de fases. También se denominan cuerpos de inclusión y casi siempre participan en el almacena- miento de energía o como reservorio de bloques estructurales. La mayor parte de las inclusiones celulares están limitadas por una membrana delgada formada por lípidos, que sirve para separar los cuerpos de inclusión del citoplasma mismo. Uno de los cuerpos de inclusión más comunes consiste en ácido poli-β hidroxibutírico (PHB, poly-β-hydroxybutyric acid), un compuesto similar a un lípido que tiene cadenas de ácido β-hidroxibutírico conectadas a través de enlaces éster. El PBH se produce cuando la fuente de nitrógeno, sulfuro y fósforo se encuentra limitada y hay exceso de carbón en el medio (figura 2-8A). Otro producto de almacenamiento formado por las células procariotas cuando hay carbón en cantidades excesi- vas es el glucógeno, un polímero de la glucosa. El glucógeno y PHB se utilizan como fuentes de carbono cuando se reinicia la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos. Diversos procariotas Membrana plasmática Pared celular Ficobilisomas Tilacoides Ribosoma 70S 1μm Carboxisoma FIGURA 27 Corte delgado de Synechocystis durante la división celular. Se observan varias estructuras (reproducida de Stanier RY: The position of cyanobacteria in the world of phototrophs. Carlsberg Res Commun 42:7798, 1977. Con autorización de Springer + Business Media). son capaces de oxidar compuestos de sulfuro reducidos como ácido sulfhídrico y tiosulfato, produciendo gránulos intrace- lulares de azufre elemental (figura 2-8B). Conforme las fuen- tes de azufre reducido se ven limitadas, se oxidan los gránulos de azufre, por lo común a sulfato y los gránulos desaparecen con lentitud. Muchas bacterias acumulan grandes reservas de fosfato inorgánico en la forma de gránulos de polifosfato. Tales gránulos podrán degradarse y utilizarse como fuentes de fosfato para la producción de ácidos nucleicos y síntesis de fosfolípidos para mantener el crecimiento. En ocasiones, éstos se denominan gránulos de volutina o gránulos metacromá- ticos, porque se tiñen de rojo con un colorante azul. Estas son características de las corinebacterias (capítulo 13). Ciertos grupos de bacterias autótrofas que fijan dióxido de carbono producen bloques de construcción bioquímica que contienen cuerpos poliédricos rodeados por una cubierta pro- teínica (carboxisomas) y contienen una enzima fundamental para la fijación de CO2 , la carboxilasa de ribulosa bifosfato (figura 2-7). Los magnetosomas son partículas cristalinas intracelulares del mineral de hierro magnetita (Fe3 O4 ) que permiten que ciertas bacterias acuáticas muestren magneto- taxis (migración u orientación de la célula respecto al campo magnético de la Tierra). Los magnetosomas están rodeados por membranas que contienen fosfolípidos, proteínas y glu- coproteínas. Las vesículas de gas se observan, casi de manera exclusiva en microorganismos de hábitat acuáticos, donde pro- porcionan flotabilidad. Las membranas de las vesículas de gas tienen proteínas con un grosor de 2 nm, son impermeables al agua y a los solutos pero permeables a los gases; así, las vesícu- las de gas existen como estructuras llenas de gas rodeadas por elementos del citoplasma (figura 2-9). Las bacterias contienen proteínas similares a la actina y proteínas del citoesqueleto diferentes a la actina de las célu- las eucariotas, como proteínas adicionales que participan en la formación del citoesqueleto (figura 2-10). Los homólogos de la actina (p. ej., MreB, Mbl) realizan varias funciones, y colabo- ran a establecer la forma de la célula, segregar cromosomas y localizar proteínas en la célula. Los homólogos diferentes a la actina (p. ej., FtsZ) y proteínas singulares del citoesqueleto bac- teriano (p. ej., SecY, MinD) participan en determinar la forma celular en la regulación de la división celular y segregación de cromosomas. Envoltura celular Las células procariotas están rodeadas por una envoltura com- pleja en capas que difiere en composición entre los principa- les grupos. Tales estructuras protegen al microorganismo de entornos ambientales hostiles, como osmolaridad extrema, químicos nocivos e incluso antibióticos. Membrana celular A. Estructura La membrana celular bacteriana, también denominada mem- brana citoplásmica, es visible en la micrografía electrónica de cortes delgados (figura 2-15). Es una “unidad de membrana” típica compuesta por fosfolípidos y hasta 200 diferentes tipos de proteínas. Las proteínas constituyen casi 70% de la masa de apter 02_Carroll_4R.indd 17 apter 02_Carroll_4R.indd 17 14/04/16 14/04/16
- 31. 18 SECCIÓN IFundamentos de microbiología FIGURA 28 Cuerpos de inclusión en bacterias. A: Micrografía electrónica de Bacillus megaterium (30500×) que muestra un cuerpo de inclusión de ácido poli-β-hidroxibutírico, PHB; pared celular, CW; nucleoide, N; membrana plasmática, PM; “mesosoma”, M; y ribosomas, R. (Reproducida con autorización de Ralph A. Slepecky/Visuals Unlimited.) B: Cromatium vinosum, una bacteria reductora de sulfato con gránulos intracelulares de azufre en microscopia de campo brillante (2000×). (Reproducida con autorización de John Holt (ed.): The Shorter Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8a. ed, John Holt, editor, 1977. Copyright Bergey’s Manual Trust.) la membrana, una proporción considerablemente más elevada en comparación con las membranas de las células de mamífe- ros. En la figura 2-11 se ilustra un modelo de organización de la membrana. La membrana de las células procariotas se dife- rencia de aquella de las células eucariotas por la ausencia de esteroles y la única excepción son los micoplasmas que incor- poran esteroles, como el colesterol, en sus membranas cuando se cultiva en medios que contienen esteroles. Las membranas celulares de las arqueobacterias difie- ren de las bacterias (capítulo 1). Las membranas celulares de algunas arqueobacterias contienen un lípido singular, los iso- prenoides en lugar de ácidos grasos, unidos al glicerol por un enlace éter en lugar de un enlace éster. Algunos de estos lípidos no contienen grupos fosfato y por lo tanto no son fosfolípidos. En otras especies las membranas celulares están constituidas por una monocapa de lípidos formada por lípidos grandes (casi el doble de la longitud de los fosfolípidos) con éteres de glicerol en ambos extremos (tetraéteres de diglicerol). Las moléculas se orientan a sí mismas por la presencia de grupos de glice- rol polares en la superficie y cadenas de compuestos hidrocar- bonos no polares en su interior. Estos lípidos poco comunes contribuyen a la capacidad de múltiples arqueobacterias de proliferar en condiciones ambientales, por ejemplo en presen- cia de grandes concentraciones de sal, pH bajo o temperaturas muy elevadas. B. Función Las principales funciones de la membrana citoplásmica son: 1) permeabilidad selectiva y transporte de solutos; 2) trans- porte de electrones y fosforilación oxidativa en especies aero- bias; 3) excreción de exoenzimas hidrolíticas; 4) transporte de CW M N PHB PM R A B apter 02_Carroll_4R.indd 18 apter 02_Carroll_4R.indd 18 14/04/16 14/04/16
- 32. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 19 A B FIGURA 29 Corte transversal de una célula en división de una cianobacteria del género Microcystis que muestra agrupamiento hexagonal de vesículas cilíndricas de gas (31500×). (Micrografía de HS Pankratz. Reproducida con autorización de Walsby AE: Gas vesicles. Microbiol Rev 1994;58:94.) FIGURA 210 Citoesqueleto de una célula procariota. Se observa la proteína citoesquelética similar a MreB (MbI) de Bacillus subtilis. La proteína MbI se fusionó con una proteína fluorescente verde y las células vivas se analizaron en un microscopio de fluorescencia. A: Las flechas señalan los cables helicoidales del citoesqueleto que se extienden en la longitud de las células. B: Se muestran tres células de la ilustración A con mayor aumento. (Cortesía de Rut Carballido-López y Jeff Errington.) enzimas y moléculas que participan en la biosíntesis de DNA, polímeros de la pared celular y lípidos de la membrana, y 5) portar receptores y otras proteínas quimiotácticas y otros sis- temas sensoriales de transducción. Al menos 50% de la membrana citoplásmica debe encon- trarse en estado semilíquido a fin de que ocurra la proliferación celular. Con temperaturas bajas, esto se logra al incrementar en gran medida la síntesis e incorporación de ácidos grasos no saturados en los fosfolípidos de la membrana celular. 1. Permeabilidad de transporte. La membrana citoplás- mica forma una barrera hidrófoba impermeable a la mayor parte de las moléculas hidrofílicas. Sin embargo, existen va- rios mecanismos (sistemas de transporte) que permiten que la célula transporte nutrientes hacia el interior de la misma y productos de desecho hacia el exterior. Estos sistemas de trans- porte trabajan contra gradiente de concentración con el fin de incrementar la concentración de nutrientes en el interior de la célula, una función que requiere alguna forma de energía. Hay tres mecanismos de transporte generales que participan en el transporte de membrana: transporte pasivo, transporte activo y translocación de grupo. a. Transporte pasivo. Este mecanismo depende de la difusión, no utiliza la energía y funciona sólo cuando el soluto se encuen- tra en concentraciones más elevadas fuera de la célula. La difu- sión simple explica la entrada de muy pocos nutrientes, lo que incluye el oxígeno disuelto, dióxido de carbono y el agua misma; no proporciona velocidad ni selectividad. La difusión facilita- da no utiliza energía, de forma que el soluto nunca alcanza una concentración interna mayor que la que existe fuera de la célula. Sin embargo, esta difusión es selectiva. Los conductos de proteí- nasformanconductosselectivosquefacilitanelpasodemoléculas específicas. La difusión facilitada es común en microorganis- mos eucariotas (p. ej., levaduras) pero es poco común en células procariotas. El glicerol es uno de los pocos compuestos que pe- netran en las células procariotas por difusión facilitada. b. Transporte activo. Muchos nutrientes se concentran más de 1000 veces como consecuencia del transporte activo. Hay dos tipos de mecanismos de transporte activo, lo que depende de la fuente de energía utilizada: transporte acoplado con iones y transporte con casete unido a ATP (ABC). 1) Transporte acoplado con iones. Estos sistemas desplazan una molécula a través de la membrana celular siguiendo un gra- diente iónico previamente establecido, como una fuerza de movimiento por sodio o de movimiento por protones. Hay tres tipos básicos: transporte simple (uniport), cotransporte uni- direccional (symport) y cotransporte bidireccional (antiport) (figura 2-12). El transporte acoplado con iones es en particular común en microorganismos aerobios, que tienen mayor facili- dad para generar una fuerza de desplazamiento de iones que los microorganismos anaerobios. Los transportadores simples cata- lizan el transporte de un sustrato sin importar el ion acoplado. Los cotransportadores unidireccionales catalizan el transporte simultáneo de dos sustratos en la misma dirección por un solo transportador; por ejemplo, un gradiente de H+ puede permitir el cotransporte unidireccional de iones de carga opuesta (p. ej., glicina) o de moléculas de carga neutra (p. ej., galactosa). Los cotransportadores bidireccionales catalizan el transporte simul- táneo de dos compuestos de carga similar en direcciones opues- tas por un transportador común (p. ej., H+ :Na+ ). Casi 40% de los sustratos transportados por E. coli utilizan este mecanismo. apter 02_Carroll_4R.indd 19 apter 02_Carroll_4R.indd 19 14/04/16 14/04/16
- 33. 20 SECCIÓN IFundamentos de microbiología 2) Transporte ABC. Este mecanismo emplea ATP directamente para el transporte de solutos hacia el interior de la célula. En bacterias gramnegativas el transporte de varios nutrientes se facilita por proteínas transportadoras (de unión) específicas que se ubican en el espacio periplasmático; en células grampo- sitivas las proteínas de unión se encuentran fijas a la superficie externa de la membrana celular. Estas proteínas funcionan al transferir el sustrato de unión a un complejo proteínico unido a la membrana. Se desencadena la hidrólisis de ATP y se utiliza la energía para abrir los poros de la membrana y permitir el movimiento unidireccional de los sustratos hacia el interior de la célula. Casi 40% de los sustratos transportados por E. coli utilizan este mecanismo. c. Translocación de grupo. Además del transporte verdadero, en el cual un soluto se desplaza a través de la membrana sin cambio en su estructura, las bacterias utilizan un proceso denominado translocación del grupo (metabolismo vectorial) para llevar a cabo la captación neta de ciertos carbohidratos (p. ej., glucosa y manosa) el sustrato sufre fosforilación durante el proceso de transporte. En un sentido estricto, la transloca- ción de grupo no es un transporte activo porque no participa un gradiente de concentración. Dicho proceso permite que las bacterias utilicen sus fuentes energéticas de manera eficiente al acoplar el transporte con el metabolismo. En este proceso, una proteína transportadora de membrana sufre fosforilación en el citoplasma a expensas del fosfoenolpiruvato; la proteína trans- portadora fosforilada se une al azúcar libre en la cara exterior de la membrana, es transportada hacia el citoplasma y liberada en forma de carbohidrato unido a un fosfato. Tales sistemas de transporte de carbohidratos se denominan sistemas de fosfotransferasas. Los sistemas de fosfotransferasas también participan en el movimiento hacia las fuentes de carbono (qui- miotaxia) y en la regulación de otras vías metabólicas (repre- sión catabólica). Proteína integral Glucolípidos Oligosacáridos Hélice α hidrófoba Hopanoides Fosfolípidos Proteína periférica FIGURA 211 Estructura de la membrana plasmática bacteriana. Este diagrama del modelo de mosaico líquido de la estructura de la membrana bacteriana muestra proteínas integrales (verdes y rojas) flotando en una bicapa lipídica. Las proteínas periféricas (en color amarillo) tienen una asociación laxa con la superficie de la membrana interna. Las esferas pequeñas representan extremos hidrofílicos de fosfolípidos de la membrana y colas onduladas, que corresponden a las cadenas hidrófobas de ácidos grasos. Pueden encontrarse otros lípidos de membrana como los hopanoides (en color morado). Para mayor claridad, los fosfolípidos se muestran en un tamaño proporcionalmente mayor del que se encuentra en la membrana real. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ (eds): Prescott, Harley, and Klein’s Microbiology, 7a. ed. Nueva York, McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Will Companies, Inc.) d. Procesos especiales de transporte. El hierro (Fe) es un nutriente esencial para la proliferación de la mayor parte de las bacterias. En condiciones anaerobias este elemento por lo general se encuentra en estado de oxidación +2 y en estado soluble. Sin embargo, en condiciones anaerobias dicho metal por lo común se encuentra en estado de oxidación +3 y es inso- luble. Los compartimentos internos de los animales práctica- mente no contienen hierro libre, pues se encuentra secuestrado en complejos como las proteínas transferrina y lactoferrina. Algunas bacterias resuelven este problema al secretar sideró- foros, compuestos que causan la quelación de hierro y favore- cen su transporte a complejos solubles. Uno de los principales grupos de sideróforos consiste en derivados del ácido hidroxá- mico (−CONH2 OH), los cuales producen la quelación intensa de Fe3+ . El complejo hierro-hidroxamato es transportado acti- vamente hacia el interior de la célula por la acción cooperativa de un grupo de proteínas que abarcan la membrana externa, el periplasma y la membrana interna. El hierro se libera y el hidroxamato puede salir de la célula y utilizarse de nuevo para el transporte de hierro. Algunas bacterias patógenas utilizan mecanismos fun- damentalmente diferentes que incluyen receptores específicos que se unen a la transferrina y lactoferrina del hospedador (al igual que a otras proteínas del hospedador que contienen hie- rro). El hierro se retira y transporta hacia el interior de la célula por un proceso dependiente de energía. 2. Transporte de electrones y fosforilación oxida- tiva. Los citocromos y otras enzimas y componentes de la cadena respiratoria incluyen ciertas deshidrogenasas que se ubican en la membrana celular. La membrana celular bacte- riana es un análogo funcional a la membrana mitocondrial, una relación que muchos biólogos han considerado como la base para la teoría de que las mitocondrias evolucionaron a partir de bacterias simbióticas. En el capítulo 6 se revisa el apter 02_Carroll_4R.indd 20 apter 02_Carroll_4R.indd 20 14/04/16 14/04/16
- 34. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 21 Transporte simple A B C Exterior de la célula Interior de la célula Transporte en paralelo Cotransporte bidireccional H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ FIGURA 212 Tres tipos de transportadores: A: Transportadores simples, B: Transportadores en paralelo y C: Cotransporte bidireccional. Los transportadores simples catalizan el transporte de una sola sustancia en forma independiente de otras; los transportadores en paralelo catalizan el cotransporte pero sustancias diferentes (por lo común un soluto y un ion con carga positiva, H+ ) en la misma dirección y los transportadores antiparalelos catalizan el transporte de intercambio de dos solutos similares en direcciones opuestas. Una proteína de transporte simple puede catalizar sólo uno de estos procesos, dos de estos procesos o incluso los tres procesos, dependiendo de las condiciones. Los transportadores simples, en paralelo y antiparalelo parecen tener similitudes estructurales y evolución relacionada y por lo tanto funcionan por mecanismos similares. (Reproducida con autorización de Saier MH Jr: Peter Mitchell and his chemiosmotic theories. ASM News 1997;63:13.) mecanismo por el cual la generación de ATP se acopla con el transporte de electrones. 3. Excreción de exoenzimas hidrolíticas y patogenia de las proteínas. Todos los organismos que dependen de polímeros orgánicos macromoleculares como fuente energé- tica (p. ej., proteínas, polisacáridos, lípidos) excretan enzimas hidrolíticas que desdoblan los polímeros hasta subunidades lo suficientemente pequeñas para penetrar la membrana celular. Los animales superiores secretan tales enzimas en la luz del tubo digestivo; las bacterias (tanto grampositivas como gram- negativas) las secretan directamente al medio externo o en el espacio periplasmático entre la capa de peptidoglucano y la membrana externa de la pared celular en el caso de las bacterias gramnegativas (véase la sección Pared celular, adelante). En las bacterias grampositivas, las proteínas se secretan directamente, en tanto que las proteínas secretadas por las bac- terias gramnegativas deben atravesar también la membrana externa. Se han descrito seis vías de secreción de proteínas en las bacterias: sistemas de secreción tipos I, II, III, IV, V y VI. En la figura 2-13 se muestra un esquema de los sistemas tipos I a V. Los sistemas de secreción tipos I y IV se han descrito para bac- terias grampositivas y gramnegativas, en tanto que los siste- mas de tipos II, III, V y VI se han encontrado sólo en bacterias gramnegativas. Las proteínas secretadas por las vías tipo I y tipo III atraviesan la membrana interna (IM, inner membrane) y la membrana externa (OM, outer membrane) en un paso, pero las proteínas secretadas por las vías tipo II y tipo V, atraviesan la IM y la OM en pasos separados. Las proteínas secretadas por las vías de tipo II y V se sintetizan en ribosomas citoplásmicos como preproteínas que contienen una secuencia principal adi- cional o una secuencia de señales de 15 a 40 aminoácidos (más a menudo casi 30 aminoácidos) en el extremo amino terminal y requieren un sistema secundario para el transporte a través de la IM. En la E. coli, la vía secundaria comprende varias pro- teínas IM (SecD hasta SecF, SecY), una ATPasa asociada con la membrana celular (SecA) que proporciona energía para su exportación, una proteína chaperona (SecB) que se une a las preproteínas y una peptidasa de señal periplasmática. Des- pués de la translocación, la secuencia principal sufre desdo- blamiento por la peptidasa de señal unida a la membrana y se libera la proteína madura hacia el espacio periplasmático. Por el contrario, las proteínas secretadas por los sistemas de tipos I y III no tienen una secuencia principal y se exportan intactas. En las bacterias gramnegativas y grampositivas, otro sis- tema de translocación de la membrana plasmática conocida como vía tat, puede desplazar proteínas a través de la mem- brana plasmática. En las bacterias gramnegativas dichas pro- teínas son suministradas al sistema tipo II (figura 2-13). La vía tat es diferente al sistema sec porque transporta proteínas ya plegadas. Aunque las proteínas secretadas por los sistemas tipos II y V son similares en cuanto al mecanismo por el cual cruzan la membrana interna, existen diferencias en la forma en que atraviesan la OM. Las proteínas secretadas por el sistema tipo II se transportan a través de la OM por un complejo multipro- teínico (figura 2-13). Esta es la principal vía para la secreción de las enzimas de degradación extracelular por parte de las bacte- rias gramnegativas. La elastasa, fosfolipasa C y exotoxina A son secretadas por este sistema en la bacteria Pseudomonas aeru- ginosa. Sin embargo, las proteínas secretadas por los sistemas tipo V se autotransportan a través de la membrana externa en virtud de una secuencia carboxilo terminal, que es eliminada por medios enzimáticos hasta la liberación de la proteína desde lamembranaexterna.Algunasproteínasextracelulares(p.ej.,la proteasa IgA de Neisseria gonorrhoeae y la citotoxina que forma vacuolas de Helicobacter pylori) son secretadas a través de este sistema. apter 02_Carroll_4R.indd 21 apter 02_Carroll_4R.indd 21 14/04/16 14/04/16
- 35. 22 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Las vías de secreción de tipos I y III son independientes de sec y por lo tanto no incluyen el procesamiento del extremo aminoterminal de las proteínas secretadas. La secreción de pro- teínas por estas vías ocurre en forma de un proceso continuo sin la presencia de un intermediario citoplásmico. La secreción de tipo I se ejemplifica con la hemolisina α de E. coli y la ade- nilil-ciclasa de la Bordetella pertussis. La secreción de tipo I requiere de tres proteínas secretoras: un casete de unión a ATP en la membrana interna (transportador ABC), que proporciona energía para la secreción de proteínas; una proteína de mem- brana externa y una proteína de difusión de membrana, que se encuentra fija a la membrana interna y abarca la totalidad del espacio periplasmático (figura 2-13). En lugar del péptido de señalización, la información se ubica en los 60 aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la proteína secretada. La vía de secreción de tipo III es un sistema dependiente del contacto, que se activa por el contacto con una célula del hospedador y a continuación se inyecta una proteína tóxica directamentealacélulahospedadora.Elaparatodesecreciónde tipo III está compuesto por casi 20 proteínas, la mayor parte de las cuales se ubican al nivel de la membrana interna. La mayor parte de estos componentes de la IM son homólogos al aparato de biosíntesis flagelar de las bacterias grampositivas y gramnegativas. Al igual que la secreción de tipo I, las proteínas secretadas por la vía de tipo III no son objeto de procesamiento en el extremo amino terminal durante su secreción. La vía de tipo IV secreta toxinas polipeptídicas (dirigidas contra células eucariotas) o complejos de proteína-DNA ya sea entre dos células bacterianas o entre una célula bacteriana y una célula eucariota. Un ejemplo de la secreción de tipo IV Proteína Citoplasma Espacio periplásmico YscJ Yop Chaperona Chaperona Tat PulS SecD EFGY Sec ATP ATP ATP ADP + Pi ATP ADP + Pi ATP ADP + Pi ATP ADP + Pi ADP + Pi Membrana plasmática TolC Exterior de la célula Tipo I Tipo III Tipo II Tipo V Tipo IV Membrana exterior FIGURA 213 Sistemas de secreción de proteínas de bacterias gramnegativas. Se muestran cinco sistemas de secreción de las bacterias gramnegativas. Las vías dependientes de Sec y Tat suministran proteínas del citoplasma al espacio periplásmico. Los sistemas de tipos II, V y en ocasiones el IV completan el proceso de secreción por una vía dependiente de Sec. El sistema Tat parece suministrar proteínas sólo a la vía de tipo II. Los sistemas de tipos I y III evitan las vías dependientes de Sec y Tat, desplazando proteínas directamente del citoplasma a través de la membrana externa y hacia el espacio extracelular. El sistema de tipo IV puede trabajar ya sea con una vía dependiente de Sec o puede trabajar sola para transportar proteínas al espacio extracelular. Las proteínas translocadas por la vía dependiente de Sec y la vía de tipo III son suministradas a estos sistemas por proteínas chaperonas. ADP, adenosin difosfato; ATP, adenosin trifosfato; EFGY; PulS; SecD, TolC; Yop. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [eds]: Prescott, Harley, and Klein’s Microbiology, 7a. ed. Nueva York: McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Will Companies, Inc.) apter 02_Carroll_4R.indd 22 apter 02_Carroll_4R.indd 22 14/04/16 14/04/16
- 36. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 23 es el suministro del complejo de proteína-DNA por la bacte- ria Agrobacterium tumefaciens en una célula vegetal. Además, B. pertussis y H. pylori poseen sistemas de secreción tipo IV que median la secreción de la toxina de la tos ferina y el fac- tor inductor de interleucina-8, respectivamente. La secreción de tipo VI independiente de sec fue descrita en fechas recien- tes en P. aeruginosa, donde contribuye a la patogenicidad en pacientes con fibrosis quística. Este sistema de secreción está compuesto por 15 a 20 proteínas cuya función bioquímica no se comprende por completo. Sin embargo, estudios recientes sugieren que algunas de tales proteínas comparten homología con proteínas de la cola de bacteriófagos. Las características de los sistemas de secreción de proteí- nas de bacterias se resumen en el cuadro 9-5. 4. Funciones de biosíntesis. La membrana celular es el sitio de los lípidos transportadores sobre los cuales se ensam- blan las subunidades de la pared celular (véase la revisión de la síntesis de las sustancias que forman la pared celular en el capítulo 6) así como de la biosíntesis de las enzimas de la pared celular. Las enzimas para la síntesis de fosfolípidos también se ubican en la membrana celular. 5. Sistemas quimiotácticos. Las sustancias con capaci- dad de atracción y repulsión se unen a receptores específicos en la membrana bacteriana (véase la sección Flagelos, adelante). Hay al menos 20 quimiorreceptores diferentes en la membrana de E. coli, algunos de los cuales también actúan como el primer paso en el proceso de transporte. Pared celular La presión osmótica interna de la mayor parte de las bacterias varía de 5 a 20 atm como consecuencia de la concentración de solutos por medio del transporte activo. En la mayor parte de los entornos, esta presión sería suficiente para hacer esta- llar la célula si no se contara con la presencia de una pared celu- lar con fuerza tensil elevada (figura 2-14). La pared celular bac- teriana debe su resistencia a una capa compuesta de diversas FIGURA 214 La pared celular rígida determina la forma de la bacteria. Aunque se ha separado la célula, la pared celular conserva su forma original (cortesía de Dale C. Birdsale). sustancias conocidas como mureína, mucopéptidos o pepti- doglucanos (todos son sinónimos). La estructura de los pep- tidoglucanos se revisa adelante. La mayor parte de las bacterias se clasifican como gram- positivas o gramnegativas con base en su respuesta al proce- dimiento de tinción de Gram. El procedimiento recibió su nombre por el histólogo, Hans Christian Gram, quien desarro- lló este procedimiento de tinción diferencial en un intento para teñir las bacterias en tejidos infectados. La tinción de Gram depende de la capacidad de ciertas bacterias (grampositivas) para retener un complejo de cristales de color violeta (un colo- rante de color violáceo) además de yodo después de un breve lavado con alcohol o acetona. Las bacterias gramnegativas no retienen el complejo de colorante-yodo y se vuelven translúci- das, pero pueden volverse a teñir con safranina (un colorante de color rojo). Así, las bacterias grampositivas adquieren un aspecto violáceo bajo el microscopio, en tanto que las bac- terias gramnegativas se ven de color rojo. La diferenciación entre estos dos grupos refleja diferencias fundamentales en sus envolturas celulares (cuadro 2-1). CUADRO 21 Comparación de las características de las bacterias grampositivas y gramnegativas Peptidoglucano y ácido teicoico Membrana citoplásmica Peptidoglucano Membrana externa Membrana citoplásmica Periplasma Grampositivas Gramnegativas Color de la célula después de la tinción de Gram Violeta Rojizo-rosado Género representativo Bacillus, Staphylococus, Streptococcus Escherichia, Neisseria, Pseudomonas Componentes y estructuras distintivas Peptidoglucano Capa gruesa Capa delgada Ácido teicoico Presente Ausente Membrana externa Ausente Presente Lipopolisacáridos (endotoxinas) Ausente Presente Proteínas porinas Ausentes (innecesarias porque carecen de membrana externa) Presentes; permiten el paso de moléculas a través de la membrana externa Periplasma Ausente Presente Características generales Sensibilidad a penicilina Generalmente más susceptibles (con notables excepciones) Por lo general poco susceptibles (con notables excepciones) Sensibilidad a las lisozimas Sí No apter 02_Carroll_4R.indd 23 apter 02_Carroll_4R.indd 23 14/04/16 14/04/16
- 37. 24 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Cadena tetrapeptídica (aminoácidos) N-acetilmurámico (NAM) N-acetilglucosamina (NAG) NAM NAG NAM NAG NAG NAM NAG HC CH3 OH Puente interno de péptido (células grampositivas) cadena de glucano Cadena de glucano O O O O H H H OH H H H H CH3 NH CH2OH CH2OH O O NAM Peptidoglucano C O C O CH3 NH C O Cadenas tetrapeptídicas H Cadena tetrapeptídica (aminoácidos) A B Puente interno de péptido Cadena tetrapeptídica (aminoácidos) Cadena principal del azúcar NAM NAG Además de brindar protección osmótica, la pared celular desempeña una función esencial en la división celular, también sirve como preparador para su propia biosíntesis. Varias capas de la pared son sitios de determinantes antigénicos mayores de la superficie celular y uno de sus componentes (los lipopoli- sacáridos de las paredes celulares de bacterias gramnegati- vas) son causantes de la actividad endotóxica inespecífica de las bacterias gramnegativas. En términos generales, la pared celular no muestra permeabilidad selectiva; sin embargo, una capa de la pared gramnegativa (la membrana externa) evita el paso de moléculas relativamente grandes (véase más adelante). La biosíntesis de la pared celular y los antibióticos que interfieren en el proceso se revisan en el capítulo 6. A. Capa de peptidoglucanos El peptidoglucano es un polímero complejo que consiste, con fines de descripción, de tres partes: una estructura básica, compuesta de moléculas alternadas de N-acetilglucosamina y de ácido N-acetilmurámico unidas por enlaces beta 1→4 y un grupo idéntico de enlaces peptídicos cruzados (figura 2-15). La estructura básica es la misma en todas las especies bacteria- nas; las cadenas tetrapeptídicas laterales y los enlaces peptídi- cos varían de una especie a otra. En muchas paredes celulares de bacterias gramnegativas, los enlaces cruzados consisten de unión peptídica directa entre el grupo amino de una cadena lateral del ácido diaminopimélico (DAP) y el grupo carboxilo terminal de la cadena secundaria lateral de d-alanina. Las cadenas laterales tetrapeptídicas de todas las especies tienen ciertas características importantes en común. La mayor parte tiene l-alanina en la posición 1 (unida al ácido N-acetil- murámico), d-glutamato o la sustitución de d-glutamato en la posición 2 y d-alanina en la posición 4. La posición 3 es la más variable: la mayor parte de las bacterias gramnegativas tienen ácido diaminopimélico u otro aminoácido en dicha posición. El ácido diaminopimélico es un elemento singular en las paredes celulares bacterianas; nunca se encuentra en las pare- des celulares de las arqueobacterias o de células eucariotas; es el precursor inmediato de la glicina en la biosíntesis bacteriana FIGURA 215 Componentes y estructuras del peptidoglucano. A: Estructura química de la N-acetilglucosamina (NAG) y de ácido N-acetilmurámico (NAM); las estructuras anulares de las dos moléculas corresponden a glucosa. Las cadenas de glucanos están compuestas de subunidades alternantes de NAG y NAM unidas con enlaces covalentes. Las cadenas adyacentes de glucanos tienen enlaces cruzados a través de sus cadenas tetrapeptídicas para crear peptidoglucano. B: Cadenas de glucano interconectadas que forman una molécula tridimensional muy grande de peptidoglucano. Los enlaces β1→ 4 en el esqueleto molecular son desdoblados por acción de las lisosomas (reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT: Microbiology: A Human Perspective, 6a. Ed. McGraw-Hill; 2009). apter 02_Carroll_4R.indd 24 apter 02_Carroll_4R.indd 24 14/04/16 14/04/16
- 38. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 25 de dicho aminoácido (figura 6-19). Los mutantes bacterianos que son bloqueados antes de la síntesis de ácido diaminopi- mélico por lo común proliferan de forma normal cuando se encuentra dicho ácido en su entorno; cuando se administra L-glicina sola se destruyen, porque continúan proliferando pero son específicamente incapaces de sintetizar nuevo pepti- doglucano para su pared celular. El hecho de que las cadenas de peptidoglucanos tengan enlaces cruzados significa que cada capa de peptidoglucanos tiene una sola molécula gigante. En una bacteria grampositiva hay hasta 40 hojas de peptidoglucanos, lo que constituye hasta 50% del material de la pared celular; en las bacterias gramne- gativas parece haber sólo una o dos hojas, lo que constituye 5 a 10% del material de la pared. La bacteria adquiere su forma, que es característica para cada especie en particular, por la estructura de su pared celular. B. Componentes especiales de las paredes celulares de bacterias grampositivas La mayor parte de las paredes celulares de las bacterias gram- positivas contienen cantidades considerables de ácidos tei- coico y teicurónico, los cuales pueden constituir hasta 50% del peso seco de la pared y 10% del peso seco de la totalidad de la célula. Además, algunas paredes de bacterias grampositivas pueden contener moléculas de polisacáridos. 1. Ácidos teicoico y teicurónico. El término ácido tei- coico abarca la totalidad de la pared celular, membrana o polí- meros capsulares que contienen glicerofosfato o residuos de O O CH2 CH2 CH2 CH2 O O R C H O R C H A O O– O– P O O P O O O– O P Espacio periplásmico Peptidoglucano Membrana plasmática Ácido lipoteicoico Ácido teicoico B FIGURA 216 A: Estructura del ácido teicoico. Segmento de ácido teicoico constituido por fosfato, glicerol y una cadena lateral, R. R puede representar a D-alanina, glucosa u otras moléculas. B: Ácidos teicoico y lipoteicoico de una envoltura de una bacteria grampositiva. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [eds]: Prescott, Harley, and Klein’s Microbiology, 7a. ed. Nueva York: McGraw-Hill; 2008.) ribitol fosfato. Estos polialcoholes están conectados por enla- ces fosfodiéster y por lo común se encuentran unidos con otros carbohidratos y con d-alanina (figura 2-16A). Como tie- nen carga negativa, el ácido teicoico es en parte la causa de la carga negativa de la superficie celular en su conjunto. Hay dos tipos de ácidos teicoico: ácido teicoico de la pared (WTA, wall teichoic acid) que tiene unión covalente con los peptidogluca- nos y ácido teicoico de la membrana que tiene unión covalente con glucolípidos de la membrana. Como estos últimos tienen asociación estrecha con los lípidos, también se han denomi- nado ácidos lipoteicoicos (LTA, lipoteichoic acids). En con- junto con los peptidoglucanos, WTA y LTA constituyen una red polianiónica o matriz que proporciona funciones relacio- nadas con la elasticidad, porosidad, fuerza tensil y propiedades electrostáticas de la envoltura. No todas las bacterias grampo- sitivas tienen LTA y WTA convencionales, pero aquellas que carecen de tales polímeros por lo común son similares desde el punto de vista funcional. La mayor parte de los ácidos teicoicos contienen grandes cantidades de d-alanina, por lo común unida a la posición 2 o 3 del glicerol o a la posición 3 o 4 del ribitol. En algunos áci- dos teicoicos más complejos la d-alanina se une a uno de los residuos de azúcar. Además de la d-alanina, otros sustitutos pueden unirse a los grupos hidroxilo libres del glicerol y ribitol (por ejemplo, glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina, N-ace- tilgalactosamina o succinato). Una especie dada puede tener más de un tipo de azúcar sustituto además de la d-alanina; en tales casos, no se sabe si los diferentes carbohidratos se presen- tan en la misma molécula o en moléculas separadas de ácido apter 02_Carroll_4R.indd 25 apter 02_Carroll_4R.indd 25 14/04/16 14/04/16
- 39. 26 SECCIÓN IFundamentos de microbiología teicoico. La composición del ácido teicoico formado por una especie bacteriana dada puede variar con la composición del medio en el cual es cultivada. Los ácidos teicoicos constituyen la principal superficie de los antígenos de aquellas especies de bacterias grampositi- vas que los poseen y su accesibilidad para los anticuerpos se ha tomado como evidencia de que se encuentran en la super- ficie externa del peptidoglucano. Sin embargo, su actividad a menudo se incrementa por la digestión parcial de este último; así, gran parte del ácido teicoico puede encontrarse entre la membrana citoplásmica y la capa del peptidoglucano, tal vez extendiéndose a través de los poros formados en esta última (figura 2-16B). En el neumococo (Streptococcus pneumoniae) los ácidos teicoicos portan antígenos determinantes llamados antígeno Forssman. En el Streptococcus pyogenes, LTA se asocia con la proteína M que protruye desde la membrana celular a través de la capa de peptidoglucanos. Las largas moléculas de proteína M junto con LTA forman microfibrillas que facilitan la unión de S. pyogenes a las células animales (véase capítulo 14). Los ácidos teicurónicos son polímeros similares, pero repiten unidades, lo que incluye carbohidratos ácidos (como Lípido A Peptidoglucano MDO Fosfolípidos Proteínas Antígeno O repetido GlcNAc Glucosa Galactosa Heptosa KDO Región central externa Región central interna Porina Citoplasma Lipopoli- sacáridos Membrana externa Lipoproteína Espacio periplasmático Membrana interna N-acetilmanosurónico o ácido d-glucosurónico) en lugar de ácido fosfórico. Se sintetizan en lugar de los ácidos teicoicos cuando hay limitación en la disponibilidad de fosfato. 2. Polisacáridos. La hidrólisis de paredes celulares de bac- terias grampositivas de ciertas especies ha permitido la ob- tención de carbohidratos neutros como manosa, arabinosa, ramnosa y glucosamina, además de azúcares ácidos como el ácido glucurónico y ácido manurónico. Se ha propuesto que dichos carbohidratos existen como subunidades de polisa- cáridos en la pared celular; sin embargo, el descubrimiento de que los ácidos teicoico y teicurónico pueden contener diversos carbohidratos hace incierto el origen de tales azúcares (figura 2-6A). C. Componentes especiales de las paredes celulares de bacterias gramnegativas Las paredes celulares de bacterias gramnegativas contienen tres componentes que se encuentran fuera de la capa de pepti- doglucanos: lipoproteínas, membrana externa y lipopolisacári- dos (figura 2-17). FIGURA 217 Representación molecular de la envoltura de una bacteria gramnegativa. Los óvalos y rectángulos representan residuos de carbohidratos; los círculos ilustran el extremo polar de los grupos de los glicerofosfolípidos (fosfatidiletanolamina y fosfatidilglicerol). Las regiones centrales que se muestran corresponden a Escherichia coli K-12, una cepa que en condiciones normales no contiene un antígeno O repetido a menos que se transforme con un plásmido apropiado. MDO, oligosacáridos derivados de la membrana. (Reproducida con autorización de Raetz CRH: Bacterial endotoxins: Extraordinary lipids that activate eucaryotic signal transduction. J Bacteriol 1993;175:5745.) apter 02_Carroll_4R.indd 26 apter 02_Carroll_4R.indd 26 14/04/16 14/04/16
- 40. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 27 1. Membrana externa. La membrana externa es diferente desde el punto de vista químico de todas las demás membra- nas biológicas. Es una estructura con bicapa cuya hoja interna tiene una composición similar a la de la membrana celular, en tanto que la hoja externa contiene un constituyente diferente, lipopolisacáridos (LPS, lipopolysaccharide) (véase adelante). Como consecuencia, las hojas de esta membrana son asimétri- cas y las propiedades de esta bicapa difieren considerablemente de las que se observan en las membranas biológicas simétricas, como en las membranas celulares. La capacidad de la membrana externa para que excluya moléculas hidrófobas es una característica poco común entre las membranas biológicas y sirve para proteger a la célula (en el caso de bacterias entéricas)de sustanciasnocivas,comolas sales bilia- res. Por su naturaleza lipídica, es de esperarse que la membrana externa excluya también a moléculas hidrofílicas. Sin embargo, dicha membrana posee conductos especiales, formados por pro- teínas denominadas porinas, que permiten la difusión pasiva de compuestos hidrofílicos de bajo peso molecular como azúcares, aminoácidos y ciertos iones. Las moléculas grandes de antibió- ticos penetran la membrana externa con relativa lentitud, lo que explica la resistencia relativamente elevada a los antibióticos de las bacterias gramnegativas. La permeabilidad de la membrana externa varía ampliamente de un género bacteriano a otro; por ejemplo, P. aeruginosa es extremadamente resistente a los fár- macos antibacterianos y tiene una membrana externa que es 100 veces menos permeable que la de E. coli. Las proteínas principales de la membrana externa reci- ben su nombre con base en los genes que las codifican, y se han clasificado en varias categorías funcionales con base en los mutantes que carecen de las mismas y con base en experi- mentos en los cuales se han reconstituido proteínas purifica- das en membranas artificiales. Las porinas, ejemplificadas por OmpC, D y F y por PhoE de E. coli y de Salmonella typhimu- rium son proteínas triméricas que penetran ambas capas de la membrana externa (figura 2-18). Éstas forman poros relativa- mente inespecíficos que permiten la libre difusión de solutos hidrofílicos pequeños a través de la membrana. Las porinas de diferentes géneros bacterianos tienen diferentes límites de exclusión, que van desde pesos moleculares de casi 600 en E. coli y S. typhimurium a más de 3000 en P. aeruginosa. Los miembros de un segundo grupo de proteínas de la membrana externa, que se comportan como porinas en muchas formas, se ejemplifican con LamB y Tsx. La primera es una porina inducible que también actúa como receptor para el bacteriófago lambda y que participa en la mayor parte de la difusión transmembrana de maltosa y maltodextrinas; Tsx, el receptor para el bacteriófago T6 participa en la difusión trans- membrana de nucleósidos y de algunos aminoácidos. LamB permite el paso de otros solutos; sin embargo, su relativa espe- cificidad puede reflejar debilidad en las interacciones de solu- tos con sitios específicos de configuración en el conducto. La proteína OmpA es una proteína abundante en la mem- brana externa. Participa en la fijación de la membrana externa a la capa de peptidoglucanos y también se encuentra en el pelo sexual receptor de la conjugación bacteriana mediada por F (capítulo 7). La membrana externa también contiene un grupo de proteínas menos abundantes que participan en el transporte de moléculas específicas, como vitamina B12 y complejos de C N A B FIGURA 218 A: Plegamiento general de un monómero de porina (porina OmpF de Escherichia coli). El gran hueco en la estructura cilíndrica β se forma por la disposición antiparalela de tiras 16 β. Las tiras se conectan por asas cortas o patrones regulares en el borde periplásmico (porción inferior de la figura) y grandes asas irregulares en el exterior de la célula (porción superior de la figura). El asa interna conecta las tiras β 5 y 6 y se extiende hacia el interior del cilindro, lo que se resalta en color oscuro. Se marcaron las cadenas terminales. La superficie más cercana al observador participa en las subunidades de contacto. B. Representación esquemática del trímero OmpF. Se observa desde el espacio extracelular sobre su eje de simetría trirradiado. (Reproducida con autorización de Schirmer T: General and specific porins from bacterial outer membranes. J Struct Biol 1998;121:101.) apter 02_Carroll_4R.indd 27 apter 02_Carroll_4R.indd 27 14/04/16 14/04/16
- 41. 28 SECCIÓN IFundamentos de microbiología hierro-sideróforo. Muestran gran afinidad por sus sustratos y probablemente actúen como sistemas de transporte en forma de acarreadores clásicos de la membrana citoplásmica. Para el funcionamiento correcto de estas proteínas se requiere energía acoplada a través de una proteína denominada TonB. Las pro- teínas menores adicionales incluyen un número limitado de enzimas, entre ellas las fosfolipasas y proteasas. En la figura 2-17 se muestra la topología de las principa- les proteínas de la membrana externa, basada en estudios de enlaces cruzados y análisis de relaciones funcionales. La mem- brana externa se conecta a la capa de peptidoglucanos y a la membrana citoplásmica. La conexión con la capa de peptido- glucanos está mediada principalmente por lipoproteínas de la membrana externa (véase adelante). Casi una tercera parte de las moléculas de lipoproteínas tienen enlace covalente con los peptidoglucanos y ayudan a mantener las estructuras juntas. Una asociación no covalente de algunas de las porinas en la capa del peptidoglucano desempeña una función menor en conectar las membranas externas con esta estructura. Las pro- teínas de la membrana externa se sintetizan en los ribosomas unidos a la superficie citoplásmica de la membrana celular; sin embargo, aún se desconoce la forma en que se transfieren a la membrana externa, una hipótesis sugiere que la transferencia Glc NAG Gal Gal Glc Hep Hep P P P P P Etanolamina KDO KDO KDO Etanolamina Polisacárido central Lípido A Ácido graso Man Abe Rha Gal Man Abe Rha Gal n Lado O de la cadena A B GlcN GlcN ocurre en zonas de adhesión entre las membranas citoplásmica y externa, lo que puede observarse en la microscopia electró- nica. Por desgracia, se ha demostrado que es difícil obtener evi- dencias firmes de la adhesión a tales áreas. 2. Lipopolisacáridos (LPS). Los LPS de las paredes celu- lares de bacterias gramnegativas consisten en un glucolípido complejo, denominado lípido A, el cual está unido a un polisa- cárido constituido por una porción central y series terminales de unidades repetidas (figura 2-19A). El lípido A se encuentra embebido en la hoja externa de la membrana a la cual se unen los LPS. Estos últimos se sintetizan en la membrana citoplás- mica y se transportan a su posición exterior final. La presencia de LPS es necesaria para la función de muchas proteínas de la membrana externa. El lípido A consiste en unidades de disacárido de glucosa- mina fosforilada a la cual se unen varios ácidos grasos de cadena larga (figura 2-19). El ácido β-hidroximirístico es un ácido graso de 14 carbonos que siempre está presente y es característico de este lípido; los otros ácidos grasos, junto con sus grupos sustitu- tos de fosfatos, varían de acuerdo al género bacteriano. En la figura 2-19A y B se muestra la región central del polisacárido; éste es similar en la mayor parte de los géneros de FIGURA 219 Estructura de los lipopolisacáridos. A: Lipopolisacárido de Salmonella. Este esquema ligeramente simplificado ilustra una forma de lipopolisacárido (Abe, abecuosa; Gal, galactosa; GlcN, glucosamina; Hep, heptulosa; KDO, 2-ceto-3 desoxioctonato; Man, manosa; NAG, N-acetilglucosamina; P, fosfato; Rha, L-ramnosa). El lípido A se encuentra sepultado en la membrana externa. B: Modelo molecular de lipopolisacárido de Escherichia coli. El lípido A y los polisacáridos centrales tienen una disposición recta; el lado O de la cadena se encuentra doblado en ángulo en este modelo. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [eds]: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. edition, McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Will Companies, Inc.) apter 02_Carroll_4R.indd 28 apter 02_Carroll_4R.indd 28 14/04/16 14/04/16
- 42. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 29 bacterias gramnegativas que tienen LPS e incluyen dos azúcares característicos, el ácido cetodesoxioctanoico (KDO, ketodeox- yoctanoic acid) y una heptosa. Sin embargo, cada género bacte- riano contiene una unidad de repetición singular y en la figura 2-19A se muestra la que se encuentra en bacterias del género Salmonella. Las unidades de repetición por lo común son disa- cáridos, tetrasacáridos o pentasacáridos lineales o ramificados. Las unidades de repetición se conocen como antígeno O. Las cadenas de carbohidratos hidrofílicos del antígeno O cubren la superficie bacteriana y excluyen los compuestos hidrófobos. Las moléculas de LPS con carga negativa forman enlaces no covalentes por medio de cationes divalentes (p. ej., Ca2+ y Mg2+ ); esto estabiliza la membrana y proporciona una barrera para las moléculas hidrófobas. El retiro de los cationes diva- lentes con sustancias quelantes o por el desplazamiento con antibióticos policatiónicos, como las polimixinas y aminoglu- cósidos, hacen permeable la membrana externa a las moléculas hidrófobas grandes. Los LPS que son extremadamente tóxicos para los ani- males se denominan endotoxinas de bacterias gramnegativas porque se encuentran firmemente unidas a la superficie celular y se liberan sólo cuando las células sufren lisis. Cuando los LPS se desdoblan en polisacáridos y lípido A, toda la toxicidad se relaciona con este último. El antígeno O es muy inmunógeno en animales vertebrados. Se confiere especificidad antigénica por el antígeno O porque éste es muy variable entre las espe- cies e incluso en cepas de una misma especie. El número de posibles tipos antigénicos es muy grande: solamente de Salmo- nella se han identificado más de 1000. No todas las bacterias gramnegativas tienen LPS en la membrana externa compuesta por números variables de unidades repetidas de oligosacáridos (figura 2-19); los glucolípidos de la membrana externa de las bacterias que colonizan las superficies mucosas (p. ej., Neis- seria meningitidis, N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae y Haemophilus ducreyi) poseen glucanos relativamente cortos, ramificados. Estos glucolípidos más pequeños se han com- parado con las estructuras truncadas de LPS de “tipo R”, que carecen de antígeno O y que son producidos por mutantes de bacterias entéricas como E. coli. Sin embargo, sus estructuras semejan más estrechamente aquellas de los glucoesfingolípidos de las membranas celulares de mamíferos y que se denomi- nan de manera más apropiada como lipooligosacáridos (LOS, lipooligosaccharides). Tales moléculas muestran diversidad antigénica y estructural incluso en una sola cepa. Los lipoo- ligosacáridos son un factor importante de virulencia. Se han identificado epítopos en todos los LOS que simulan estructuras del hospedador y que pueden permitir que estos microorganis- mos eviten la respuesta inmunitaria del hospedador. Algunos LOS (p. ej., los de N. gonorrhoeae, N. meningitidis y H. ducreyi) poseen residuos de N-acetillactosamina (Galβ-1→4-GlcNAc) que son similares desde el punto inmunoquímico a los precur- sores del antígeno i de los eritrocitos humanos. En presencia de una enzima bacteriana denominada sialiltransferasa y sustrato bacteriano o del hospedador (ácido monofosfo-N-acetilneura- mínico-citidina; CMP-NANA) los residuos de N-acetillactosa- mina se encuentran sialilados. Este proceso ocurre in vivo y proporciona a los microorganismos en el entorno ventajas de simulación molecular con los antígenos del hospedador y hay un ocultamiento biológico a través del ácido siálico presente. 3. Lipoproteínas. Las moléculas poco comunes de lipo- proteínas unen la membrana externa con las capas de peptido- glucanos (figura 2-17). Las lipoproteínas contienen 57 residuos de aminoácidos y constituyen repeticiones de secuencias de 15 aminoácidos; presentan enlaces peptídicos con residuos de DAP de las cadenas laterales de tetrapéptidos de peptidoglu- canos. El componente lipídico consiste de tioéter de diglicérido unido a un residuo de cisteína terminal que forma un enlace no covalente con la membrana externa. Las lipoproteínas son la proteína más abundante desde el punto de vista numérico en las células gramnegativas (casi 700000 moléculas por célula). Su función (que se infiere por la conducta de células mutan- tes que carecen de ellas) es estabilizar la membrana externa y fijarla a la capa de peptidoglucano. 4. Espacio periplásmico. El espacio entre las membranas interna y externa, conocido como espacio periplásmico con- tiene la capa de peptidoglucano y una solución de proteínas que se comporta como un gel. El espacio periplásmico repre- senta casi 20 a 40% del volumen celular, lo que de ninguna manera es insignificante. Las proteínas periplásmicas incluyen proteínas fijadoras de sustratos específicos (p. ej., aminoácidos, azúcares, vitaminas y iones), enzimas hidrolíticas (p. ej., fosfa- tasa alcalina y 5′-nucleotidasa) que se desdoblan en sustratos no transportables hacia otros transportables además de incluir enzimas destoxificadoras (p. ej., lactamasa β y fosforilasa de aminoglucósidos) que inactivan ciertos antibióticos. El espacio periplásmico también contiene altas concentraciones de polí- meros muy ramificados de d-glucosa con ocho a 10 residuos de longitud que han sustituido en varios sitios con fosfato de glicerol y residuos de fosfatidiletanolamina; algunos contienen ésteres de O-succinilo. Tales compuestos denominados oligo- sacáridos derivados de la membrana parecen participar en la regulación osmótica, porque las células que crecen en medios con baja osmolaridad incrementan su síntesis de estos com- puestos en 16 veces. D. Pared celular de bacterias acidorresistentes Algunas bacterias, entre las que sobresale el bacilo tuberculoso (M. tuberculosis) y bacterias relacionadas poseen paredes celu- lares que contienen grandes cantidades de ceras, que consisten de hidrocarbonos ramificados complejos (con longitudes de 70 a 90 carbonos) conocidos como ácidos micólicos. La pared celular está compuesta de peptidoglucanos y una bicapa lipí- dica asimétrica externa; la hoja interna contiene ácidos micóli- cos unidos a arabinoglucanos y la hoja externa contiene otros lípidos extraíbles. Es una bicapa lipídica muy ordenada, en la cual las proteínas se encuentran embebidas formando poros llenos de agua a través de los cuales pasan con lentitud ciertos fármacos y nutrientes. Algunos compuestos también pueden penetrar los dominios lipídicos de la pared celular, aunque con gran lentitud. La estructura hidrófoba confiere a estas bacterias resistencia a muchos compuestos químicos como detergentes y ácidos fuertes. Si se introduce un colorante en estas células por un proceso de calentamiento breve o el trata- miento con detergentes, no puede eliminarse con la aplicación de ácido clorhídrico diluido, como ocurre con otras bacterias. Dichos microorganismos se denominan acidorresistentes. La apter 02_Carroll_4R.indd 29 apter 02_Carroll_4R.indd 29 14/04/16 14/04/16
- 43. 30 SECCIÓN IFundamentos de microbiología permeabilidad de la pared celular a las moléculas hidrofílicas es de 100 a 1000 veces inferior que para E. coli, lo que puede explicar la tasa de crecimiento lenta de las micobacterias. E. Pared celular de las arqueobacterias Las arqueobacterias no poseen paredes celulares como las bac- terias. Algunas poseen una capa S simple (véase adelante) a menudo constituida por glucoproteínas. Algunas arqueobac- terias tienen pared celular rígida compuesta de polisacáridos o de un peptidoglucano conocido como seudomureína. Esta última difiere de los peptidoglucanos de las bacterias porque tiene aminoácidos levógiros (L− ) en lugar de aminoácidos dex- trógiros (D− ) y unidades de disacáridos con enlaces α-1→3 en vez de β-1→4. Las arqueobacterias que tienen una pared celu- lar de seudomureína son grampositivas. F. Capas superficiales cristalinas Muchas bacterias, tanto grampositivas, gramnegativas y arqueobacterias, poseen una capa bidimensional de subuni- dades cristalinas con disposición en entramado formada por proteínas o glucoproteínas (capa S) como los componentes más externos de la envoltura celular. En bacterias grampositivas y gramnegativas esta estructura en ocasiones tiene el grosor de varias moléculas. En algunas arqueobacterias sólo existe una capa externa a la membrana celular. Las capas S por lo general están compuestas por una mo- lécula proteínica de un solo tipo, en ocasiones con carbohidra- tos unidos a ésta. Las moléculas aisladas son capaces de ensam- blarse a sí mismas, es decir forman hojas similares o idénticas a las que presentan las células. Las proteínas de la capa S son resistentes a las enzimas proteolíticas y a los agentes desnatu- ralizadores de proteínas. La función de la capa S es incierta pero probablemente sea protectora. En algunos casos se ha demostrado que protege a la célula de las enzimas que degra- dan la pared celular, de la invasión por Bdellovibrio bacterio- vorous (una bacteria depredadora) y de bacteriófagos. También participan en la conservación de la forma celular en algunas especies de arqueobacterias y pueden participar en la adhesión celular a las superficies epidérmicas del hospedador. G. Enzimas que atacan la pared celular El enlace β1→4 de la estructura básica de los peptidogluca- nos sufre hidrólisis por acción de la enzima lisozima (figura 2-15), que se encuentra en las secreciones animales (lágrimas, saliva, secreciones nasales), así como en la clara del huevo. En bacterias grampositivas tratadas con lisozimas en medios de lisis con baja concentración osmótica, si la fuerza osmótica del medio de cultivo se incrementa para equilibrarla con la pre- sión osmótica interna de la célula, se liberan cuerpos esféricos conocidos como protoplastos. La membrana externa de las paredes celulares de bacterias gramnegativas evita el acceso de las lisozimas a menos que haya alteración por agentes como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un compuesto que causa quelación de cationes divalentes; en medios de cultivo protegidos desde el punto de vista osmótico, las células trata- das con EDTA-lisozimas dan origen a esferoplastos que aún poseen residuos de complejos de pared celular gramnegativa, lo que incluye la membrana externa. Las bacterias por sí mismas poseen varias autolisinas, enzimas hidrolíticas que desdoblan a los peptidoglucanos, lo que incluye muramidasas, glucosaminidasas, en repetidas asas y carboxipeptidasas. Tales enzimas catalizan el recambio o desdoblamiento de peptidoglucanos en bacterias; además, se presume que participan en el crecimiento de la pared celular y en el recambio y separación celulares, pero su actividad es más aparente durante la disolución de células muertas (autólisis). Las enzimas que degradan la pared celular bacteriana tam- bién se encuentran en células que digieren la totalidad de la bac- teria, por ejemplo protozoarios y células fagocíticas de animales superiores. H. Crecimiento de la pared celular Para la división celular es necesaria la síntesis de la pared celular; sin embargo, la incorporación de nuevo material de la pared celular varía con la forma de la bacteria. Las bacterias en forma de bacilos (p. ej., E. coli, Bacillus subtilis) tienen dos modos de síntesis de la pared celular; se introducen nuevos peptidoglucanos con un patrón helicoidal, lo que da origen a la formación de un tabique de división. Los cocos como S. aureus no parecen sufrir un modo de elongación para la síntesis de la pared celular. En su lugar se insertan nuevas moléculas de pep- tidoglucano en el sitio de división. Una tercera forma de cre- cimiento de la pared celular se ejemplifica con S. pneumoniae, que no es un verdadero coco, porque su forma no es completa- mente redonda, sino que tiene un aspecto ligeramente ovalado. S. pneumoniae sintetiza nueva pared celular al nivel del tabi- que, pero también en la región denominada anillos ecuatoria- les (figura 2-20). I. Protoplastos, esferoplastos y formas L La eliminación de la pared bacteriana puede lograrse con hidrólisis con lisozimas o al bloquear la síntesis de peptido- glucano con un antibiótico como penicilinas. En los medios de cultivo con protección osmótica, tales tratamientos liberan protoplastos en las células bacterianas grampositivas y esfe- roplastos de las gramnegativas (los esferoplastos retienen la membrana externa y peptidoglucano retenido). Si tales células son capaces de crecer y dividirse, se deno- minan formas L; éstas son difíciles de cultivar, por lo común requieren un medio de cultivo sólido con agar, además de encontrarse en un medio con la concentración osmótica ade- cuada. Las formas L se producen con mayor facilidad con la administración de penicilina que con lisozimas, lo que sugiere la necesidad de peptidoglucanos residuales. Algunas formas L pueden cambiar a su forma basilar normal al eliminar el estímulo inductor. Así, son capaces de reiniciar la síntesis normal de la pared celular. Otras son esta- bles y nunca presentan reversión. El factor que determina su capacidad para la reversión puede, de nuevo, ser la presencia de peptidoglucano residual, el cual en condiciones normales actúa como cebador para su propia biosíntesis. Algunos géneros bacterianos producen formas L de manera espontánea. La formación espontánea o inducida por antibióticos de formas L en el hospedador puede producir infecciones crónicas, en la cual los microorganismos persisten- tes son secuestrados en regiones protegidas del cuerpo. Como las infecciones por formas L son relativamente resistentes al apter 02_Carroll_4R.indd 30 apter 02_Carroll_4R.indd 30 14/04/16 14/04/16
- 44. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 31 A B Bacilus subtilis o Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus FIGURA 220 Incorporación de una nueva pared celular en bacterias de forma diferente. Las bacterias con forma de bacilo, como Bacillus subtilis o Escherichia coli tienen dos modos de síntesis de la pared celular: se introduce nuevo peptidoglucano en forma helicoidal (A), lo que da origen a la elongación de la pared lateral y se introduce en un anillo que se cierra alrededor del sitio de la futura división, lo que da origen a la formación del tabique de división (B). Los Streptococcus pneumoniae tienen forma oval y se elongan al insertar nuevo material en la pared celular de forma que se originan anillos ecuatoriales (A), que corresponden con la proliferación de la pared celular que rodea a la célula. El anillo inicial se duplica y los dos anillos resultantes se separan en forma progresiva, marcando el sitio de división futura de las células hijas. El tabique de división se sintetiza en la porción media de la célula (B). Las células redondas, como Staphylococcus aureus, no parecen tener un modo de elongación de la síntesis de la pared celular. En este caso se introduce nuevo peptidoglucano sólo en el tabique de división (B). (Reproducida con autorización de Scheffers DJ y Pinho MG: Microbiol Mol Biol Rev 2005;69:585.) tratamiento con antibióticos, constituyen problemas especia- les en la quimioterapia. Su reversión a la forma basilar puede producir recaídas de infecciones evidentes. J. Micoplasmas Los micoplasmas son bacterias que carecen de pared y que no contienen peptidoglucano (figura 25-1). Hay también arqueo- bacterias carentes de pared, pero se les ha estudiado menos. El análisis genómico coloca los micoplasmas cerca de las bac- terias grampositivas, a partir de las cuales se derivaron. Los micoplasmas carecen de un sitio de acción para los fármacos antimicrobianos que inhiben la síntesis de la pared celular (p. ej., penicilinas y cefalosporinas) y por lo tanto son resisten- tes a tales fármacos. Algunos micoplasmas causantes de neu- monía, como Mycoplasma pneumoniae, contienen esteroles en su membrana. La diferencia entre las formas L y los mico- plasmas es que es posible la síntesis de mureína, por lo que las formas L pueden adquirir nuevamente su forma original de bacterias, lo que nunca ocurre con los micoplasmas. Cápsula y glucocáliz Muchas bacterias sintetizan grandes cantidades de polímeros extracelulares cuando crecen en sus ambientes naturales. Con una excepción conocida (cápsulas de ácido poli-d-glutámico de Bacillus anthracis y Bacillus licheniformis), el material extra- celular es un polisacárido (cuadro 2-2). Los términos cápsula y capa mucilaginosa con frecuencia se utilizan para descri- bir capas de polisacáridos; también se utiliza el término más incluyente, glucocáliz que se define como el material que se encuentra fuera de la célula y que contiene polisacáridos. Una capa condensada, bien definida que rodea en forma estrecha a la célula y que excluye partículas, como la tinta china, se conoce como cápsula (figura 2-21). Si el glucocáliz tiene una asociación laxa con la célula y no excluye partículas, se le deno- mina capa mucilaginosa. Los polímeros extracelulares son sin- tetizados en la superficie de la célula bacteriana. Por ejemplo, Streptococcus mutans utiliza dos enzimas (glucosiltransferasa y fructosiltransferasa) para la síntesis de dextranos de cadena larga (poli-d-glucosa) y levanos (poli-d-fructosa) a partir de sacarosa. Estos polímeros se denominan homopolímeros. Los polímeros que contienen más de un tipo de monosacáridos se denominan heteropolímeros. La cápsula contribuye a la capacidad de invasión de la bac- teria patógena; las células encapsuladas están protegidas de la fagocitosis a menos que estén cubiertas con anticuerpos anti- capsulares. El glucocáliz participa en la adhesión bacteriana a las superficies en su entorno, lo que incluye células hospe- dadoras vegetales y animales. Por ejemplo, S. mutans posee la capacidad para adherirse estrechamente al esmalte de los dientes por medio de su glucocáliz. Las células bacterianas de la misma o de diferentes especies permanecen atrapadas en el glucocáliz, donde forman una capa conocida como placa den- tal; los productos ácidos excretados por estas bacterias causan caries dental (capítulo 10). La participación esencial del glu- cocáliz en este proceso y su formación a partir de sacarosa explican la correlación de la caries dental con el consumo de sacarosa en seres humanos. Como las capas de polisacáridos externas se unen a una cantidad significativa de agua, la capa de glucocáliz puede participar en la resistencia a la desecación. Flagelos A. Estructura Los flagelos bacterianos son apéndices fusiformes compuestos en su totalidad por proteína, con un diámetro de 12 a 30 nm. Son órganos de locomoción para las estructuras que los poseen. apter 02_Carroll_4R.indd 31 apter 02_Carroll_4R.indd 31 14/04/16 14/04/16
- 45. 32 SECCIÓN IFundamentos de microbiología CUADRO 22 Composición química del polímero extracelular en bacterias selectas Microorganismo Polímero Subunidades químicas Bacillus anthracis Polipéptido Ácido D-glutámico Enterobacter aerogenes Polisacáridos complejos Glucosa, fucosa, ácido glucurónico Haemophilus influenzae Serogrupo b Ribosa, ribitol, fosfato Neisseria meningitides Homopolímeros y heteropolímeros, p. ej. , Serogrupo A Parcialmente O-acetilado N-acetilmanosaminofosfato Serogrupo B Ácido N-acetilmuramínico (ácido siálico) Serogrupo C Ácido siálico acetilado Serogrupo 135 Galactosa, ácido siálico Pseudomonas aeruginosa Alginato Ácido D-manurónico, ácido L- glucurónico Streptococcus pneumoniae Polisacáridos complejos (varios tipos), p. ej. , (neumococo) Tipo II Ramnosa, glucosa, ácido glucurónico Tipo III Glucosa, ácido glucurónico Tipo VI Galactosa, glucosa, ramnosa Tipo XIV Galactosa, glucosa, N-acetilglucosamina Tipo XVIII Ramnosa, glucosa Streptococcus pyogenes (grupo A) Ácido hialurónico N-acetilglucosamina, ácido glucurónico Streptococcus salivarius Levano Fructosa FIGURA 221 Cápsulas bacterianas. A: Tinción de la cápsula de Bacillus anthracis con la técnica de M’Faydean, cultivados a 35°C en sangre de caballo sin sibilina. B: Demostración de la presencia de cápsula en B. anthracis por tinción negativa con tinta china. Este método es útil para mejorar la visualización de bacterias encapsuladas en muestras clínicas como sangre, medios de hemocultivo o líquido cefalorraquídeo. (CDC, cortesía de Larry Stauffer, Oregon State Public Health Laboratory.) Se conocen tres tipos de disposición: monótrico (flagelo polar único), lofótrico (múltiples flagelos polares) y perítrico (flage- los distribuidos sobre la totalidad de la célula). En la figura 2-22 se ilustran los tres tipos. Un flagelo bacteriano está constituido por varios miles de moléculas de subunidades proteínicas denominadas flage- lina. En unos cuantos microorganismos (p. ej., caulobacter) los flagelos están compuestos por dos tipos de flagelina, pero en la mayor parte de los casos sólo se encuentra un tipo. El flagelo se forma por la agregación de subunidades a una estructura de forma helicoidal. Si los flagelos se eliminan por agitación mecánica de una suspensión de bacterias, con rapidez se for- man nuevos flagelos por la síntesis, agregación y extrusión de subunidades de flagelina; la motilidad se restablece en 3 a 6 min. A B apter 02_Carroll_4R.indd 32 apter 02_Carroll_4R.indd 32 14/04/16 14/04/16
- 46. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 33 La flagelina de diferentes géneros bacterianos probablemente difiera de otra en cuanto a su estructura primaria. Son muy antigénicas (antígeno H) y algunas de las respuestas inmunita- rias a la infección se dirigen contra estas proteínas. Los flagelos se unen al cuerpo celular bacteriano por una estructura compleja formada por un gancho y un cuerpo basal. El gancho es una estructura curvada corta que parece actuar como articulación universal entre el motor en la estructura basal y el flagelo. Los cuerpos basales cuentan con un grupo de anillos, un par en las bacterias grampositivas y dos pares en las bacterias gramnegativas. En la figura 2-23 se muestra un dia- grama interpretativo de la estructura de los gramnegativos; los anillos con las letras L y P se encuentran ausentes en las células grampositivas. La complejidad del flagelo bacteriano se hace evidente por estudios genéticos, los cuales muestran que más de 40 productos génicos participan en el ensamble y función de tales estructuras. Los flagelos se elaboran en forma escalonada (figura 2-23). En primer lugar se ensambla el cuerpo basal y se inserta en la envoltura celular. A continuación se añade el gancho y por último el filamento se ensambla en forma progresiva por la adi- ción de subunidades de flagelina a su punta de tamaño cada vez mayor. Las subunidades de flagelina son expulsadas a través de un conducto central hueco en el flagelo y cuando alcanzan la punta, se condensan con las moléculas predecesoras, lo que permite que el filamento se haga más largo. B. Motilidad Los flagelos bacterianos son rotores helicoidales semirrígidos que imparten movimiento de rotación a la célula. Esta rotación funciona por el flujo de protones dentro de la misma, siguiendo el gradiente de concentración producido por una bomba de protones primaria (véase revisión anterior); en ausencia de una fuente de energía metabólica, puede funcionar por la fuerza de desplazamiento de protones generada por ionóforos. Las bac- terias que viven en entornos alcalinos (alcalófilas) utilizan la energía del gradiente del sodio (en lugar del gradiente de proto- nes) para hacer funcionar el motor flagelar (figura 2-24). Todos los componentes del motor flagelar se ubican en la envoltura celular. Los flagelos unidos a una envoltura celular aislada y sellada rotan normalmente cuando el medio contiene un sustrato apropiado para la respiración o cuando se establece un gradiente de protones por medios artificiales. Cuando una bacteria perítrica se desplaza, los flagelos se asocian para formar un mechón posterior que favorece el des- plazamiento de la célula en línea recta mediante la rotación en sentido contrario a las manecillas del reloj. En intervalos los fla- gelos invierten su dirección de rotación y sufren una disociación transitoria, ocasionando que la célula dé volteretas hasta que de nuevo se restablece el desplazamiento, con dirección aleatoria. Esta conducta hace posible la propiedad de la quimiotaxia; una célula que se desplaza de la fuente de un compuesto químico atrayente sufre una voltereta y se reorienta más a menudo de lo que ocurriría si se desplazara hacia la sustancia que causa la atracción, lo que da origen a un desplazamiento neto de la célula hacia el sitio de origen de la sustancia atrayente. La presencia de un atrayente químico (como un carbohidrato o aminoácido) es percibido por receptores específicos ubicados en la membrana celular (en muchos casos el mismo receptor también participa en el transporte de membrana de dicha molécula). Las células bacterianas son demasiado pequeñas para detectar la existencia de un gradiente químico espacial (es decir, un gradiente entre dos polos); los experimentos muestran que detecta gradientes temporales, esto es, concentraciones que disminuyen con el FIGURA 222 Flagelos bacterianos. A: Vibrio metchnikovii, una bacteria monotrica (7 500×). (Reproducida con autorización de van Iterson W: Biochim Biophys Acta 1947;1:527). B: Micrografía electrónica de Spirillum serpens, que muestra flagelos lofótricos (9 000×). (Reproducida con autorización de van Iterson W: Biochim Biophys Acta 1947;1:527). C: Micrografía electrónica de Proteus vulgaris, que muestra flagelos perítricos (9 000×). Obsérvense los gránulos basales. (Reproducida con autorización de Houwink A, van Iterson W: Electron microscopical observation on bacterial cytology; a study of flagellation. Biochim Biophys Acta 1950;5:10.) A B C apter 02_Carroll_4R.indd 33 apter 02_Carroll_4R.indd 33 14/04/16 14/04/16
- 47. 34 SECCIÓN IFundamentos de microbiología FIGURA 223 A: Estructura general del flagelo de una bacteria gramnegativa, como Escherichia coli o Salmonella typhimurium. El gancho filamentoso en el complejo corporal basal se ha aislado y se describe ampliamente. La ubicación del aparato de exportación no se muestra. B: Un diagrama del flagelo muestra la subestructura y proteínas a partir de las cuales se construye. La proteína FliF es responsable de la característica del anillo M, del anillo S y de la disposición en collar de las subestructuras que se muestran, que en conjunto se denominan anillo MS. Se desconoce la ubicación de FliE respecto al anillo MS y con la barra (y el orden de las proteínas FlgB, FlgC y FlgF en la barra proximal). (Tomada de Macnab RM: Genetics and biogenesis of bacterial flagella. Annu Rev Genet 1992;26:131. Reproducida con autorización de Annual Review of Genetics, Volume 26, © 1992 by Annual Reviews.) FIGURA 224 Componentes estructurales en el cuerpo basal del flagelo, lo que permite que la porción interna de la estructura, las barras y el cuerpo basal así como el complejo de gancho-filamento unidos presenten rotación. Los anillos externos permanecen estáticos en contacto con la membrana celular interna y externa y la pared celular (mureína), fijando el complejo del flagelo a la envoltura bacteriana. La rotación es estimulada por el flujo de protones a través del espacio periplásmico, fuera de la membrana celular, hacia el citoplasma en respuesta a un campo eléctrico y gradiente de protones a través de la membrana, que en conjunto constituyen la fuerza motriz de protones. Un apagador determina la dirección de la rotación, lo que a su vez determina si la bacteria se desplaza en sentido anterógrado (por rotación en sentido contrario a las manecillas del reloj) o presenta movimiento irregular (por rotación en el sentido de las manecillas del reloj de los flagelos). (Reproducida con autorización de Saier MH Jr: Peter Mitchell and his chemiosmotic theories. ASM News 1997;63:13.) Filamento Gancho Gancho (FlgE) 20 nm 10 μm A B Cubierta del filamento (FliD) Filamento (FliC) Unión de gancho-filamento (FlgK FlgL) Impulsor Cuerpo basal Apagador Aparato de exportación Motor Motor (MotA, MotB) Membrana externa Espacio periplásmico Membrana celular Apagador (FliG, FliM, FliN) Aparato de exportación (FlhA, FliH, Flil)? Anillo L (FlgH) Anillo P (Flgl) Camisa Porción distal de la barra (Flgl) Anillo MS (FliF) Porción proximal de la barra (FliE, FlgB, FlgC, FlgF) Placa de montaje Barra de la transmisión H + + + + + – – – – Cuerpo basal Apagador Membrana externa Mureína Espacio periplásmico Membrana celular Gancho Filamento + + + – – Fuerza motriz con protones Motor H+ H+ H+ H+ H+ apter 02_Carroll_4R.indd 34 apter 02_Carroll_4R.indd 34 14/04/16 14/04/16
- 48. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 35 paso del tiempo durante el cual la célula se aleja de la fuente de atracción y que se incrementa con el tiempo durante el cual la célula se desplaza hacia dicha fuente. Algunos compuestos actúan como repelentes en lugar de atrayentes. Un mecanismo por el cual las células responden a las sustancias atrayentes y repelentes implica la metilación mediada por cGMP y la desmetilación de proteínas específicas en la membrana. Las sustancias atrayentes causan una inhibi- ción transitoria de la desmetilación de estas proteínas, en tanto que los repelentes estimulan su desmetilación. El mecanismo por el cual un cambio en la conducta celu- lar ocurre en respuesta a un cambio en el entorno se denomina transducción sensorial; dicho fenómeno es causante de la qui- miotaxia y de la aerotaxis (movimiento hacia la concentración óptima de oxígeno), fototaxis (movimiento de las bacterias foto- sintéticas hacia las fuentes luminosas) y taxis aceptora de elec- trones(movimientodelasbacteriasrespiratoriashaciaaceptores electrónicos alternativos, como nitrato y fumarato). En estas respuestas, al igual que la quimiotaxia, el desplazamiento neto depende de la regulación de la respuesta a las volteretas. Pilosidades (fimbrias) Muchas bacterias gramnegativas poseen apéndices superfi- ciales rígidos denominados pilosidades (“pelos L”) o fimbrias (“flecos L”). Son más cortos y más finos que los flagelos y al igual que éstos, se componen por subunidades proteínicas estruc- turales denominadas pilinas. Algunas pilosidades contienen un tipo único de pilina en tanto que otras tienen más de una. Las proteínas menores denominadas adhesinas se ubican en la punta de las pilosidades y participan en sus propiedades de unión. Pueden distinguirse dos clases: pilosidades ordinarias, que participan en la adhesión de bacterias sintéticas y pató- genas con las células del hospedador y pilosidades sexuales, que participará en el mecanismo de unión de células donadas y receptoras para la conjugación bacteriana (capítulo 7). En la figura 2-25 se ilustran las pilosidades en las cuales la pilosidad sexual ha sido cubierta por una partícula fagocítica para la cual cuentan con receptores específicos. FIGURA 225 Pilosidades. Pilosidades en una célula de Escherichia coli. Las pilosidades cortas (fimbrias) gobiernan la adhesión; la pilosidad sexual participa en la transferencia de DNA. (Cortesía del doctor Charles Brinton, Jr.) La motilidad a través de pilosidades es completamente diferente del movimiento flagelar. Las moléculas de pilina muestran disposición helicoidal para formar un cilindro recto que no rota y que carece de un cuerpo basal completo. Su punta se adhiere fuertemente a superficies distantes a la célula. Más tarde, las pilosidades sufren despolimerización desde el extremo interno y de esta forma sufren retracción al interior de la célula. El resultado es que la bacteria se mueve en la dirección en que se adhiere la punta. Este tipo de movimiento superficial se denomina fasciculaciones y se observa a menudo en bacte- rias con pilosidades. A diferencia de los flagelos, las pilosidades crecen desde el interior de la célula hacia el exterior. La virulencia de ciertas bacterias patógenas depende de la producción de toxinas y también de “antígenos de coloniza- ción”, los cuales son pilosidades ordinarias que proporcionan a las células propiedades de adhesión. En cepas de E. coli ente- ropatógena, las enterotoxinas y los antígenos de colonización (pilosidades) tienen determinación genética a través de plásmi- dos transmisibles, como se menciona en el capítulo 7. En los estreptococos que son un grupo de cocos gram- positivos, las fimbrias son el sitio principal para la ubicación del antígeno de superficie, la proteína M. El ácido lipoteicoico relacionado con estas fimbrias es causante de la adhesión de los estreptococos del grupo A a las células epiteliales del hos- pedador. Las pilosidades de diferentes bacterias son distintas desde el punto de vista antigénico y desencadenan la formación de anticuerpos por el hospedador. Los anticuerpos contra las pilo- sidades de una especie bacteriana no evitan la unión de otra especie. Algunas bacterias (capítulo 21), como N. gonorrhoeae son capaces de producir pilosidades con diferentes tipos anti- génicos (variación antigénica) y por lo tanto pueden adherirse a las células aun en presencia de anticuerpos contra su veloci- dad original. Al igual que las cápsulas, las pilosidades inhiben la capacidad fagocítica de los leucocitos. Endosporas Miembros de varios géneros bacterianos son capaces de formar endosporas (figura 2-26). Las dos más comunes son bacilos grampositivos: los anaerobios obligados del género Bacillus y los anaerobios obligados del género Clostridium. Otras bacte- rias que se sabe forman endosporas son Thermoactinomyces, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Sporotomaculum, Sporomusa y Sporohalobacter. Dichos microorganismos sufren un ciclo de diferenciación en respuesta a condiciones ambientales: el proceso, denominado esporulación, es desencadenado por el casi agotamiento de varios nutrientes (carbono, nitrógeno o fósforo). Cada célula forma una espora interna única que es liberada cuando la célula madre sufre autólisis. La espora es una célula en reposo, muy resistente a la desecación, al calor y a los compuestos químicos; cuando se encuentra en condi- ciones nutricionales favorables y se activa (véase adelante) la espora germina para producir una célula vegetativa. A. Esporulación El proceso de esporulación inicia cuando las condiciones nutri- cionales se tornan poco favorables, hay casi agotamiento de las fuentes de nitrógeno o de carbono (o ambas), lo que constituye 1 μm Otras pilosi- dades Pilosidad sexual Flagelo apter 02_Carroll_4R.indd 35 apter 02_Carroll_4R.indd 35 14/04/16 14/04/16
- 49. 36 SECCIÓN IFundamentos de microbiología los factores más significativos. La esporulación ocurre masiva- mente en cultivos que han terminado su crecimiento exponen- cial como consecuencia del casi agotamiento de los nutrientes. La esporulación implica la producción de muchas estruc- turas, enzimas y metabolitos nuevos junto con la desaparición de varios componentes de la célula vegetativa. Estos cambios representan un verdadero proceso de diferenciación; se acti- va una serie de genes cuyos productos determinan la forma- ción y composición final de la espora. Tales cambios implican alteraciones en la especificidad transcripcional de la poli- merasa de RNA, que depende de la asociación de la proteína central de polimerasa con una u otra proteína promotora espe- cífica denominada factor sigma. Durante el crecimiento vege- tativo, predomina un factor sigma designado como σA . Más tarde, durante la esporulación se forman otros cinco factores sigma que causan la expresión de varios genes de la espora a diferentes tiempos en ubicaciones específicas. La secuencia de eventos en la esporulación es sumamente compleja: la diferenciación de una célula vegetativa de B. sub- tilis en una endospora tarda casi 7 h en condiciones de labo- ratorio. Distintos eventos clínicos y morfológicos ocurren en etapas secuenciales del proceso. Se han identificado siete etapas diferentes. Desde el punto de vista morfológico, la esporulación inicia con la formación de un filamento axil (figura 2-27). El proceso continúa con el plegamiento de la membrana de forma que se produce una doble membrana cuyas superficies corresponden a la superficie de síntesis de la pared celular de la envoltura celular. Los puntos de crecimiento se desplazan de manera progresiva hacia el polo de la célula de forma que pueda englo- bar la espora en formación. Las dos membranas de la espora inician la síntesis activa de capas especiales que formarán la envoltura celular: la pared de la espora y la corteza que se encuentran fuera de las mem- branas en aposición. En el nuevo citoplasma aislado muchas enzimas de la célula vegetativa sufren degradación y son sus- tituidas por un grupo de constituyentes singulares para la espora. B. Propiedades de las endosporas 1. Región central. La región central es el protoplasto de la espora. Contiene un núcleo completo (cromosomas), todos los componentes del aparato de síntesis de proteínas y el sistema productor de energía que depende de la glucólisis. Se carece de citocromos incluso en especies aerobias y por lo tanto las esporas dependen de una vía de transporte de electrones acortada que incluye flavoproteínas. Varias enzimas de células vegetativas se incrementan en cantidad (p. ej., alanina racemasa) y se forman varias enzimas singulares (p. ej., sintetasa de ácido dipicolí- nico). Las esporas no contienen nucleótidos de piridinas redu- cidos o ATP. La energía para la germinación se almacena en forma de 3-fosfoglicerato en lugar de almacenarse como ATP. La resistencia al calor de las esporas se debe en parte a su estado de deshidratación y a la presencia de grandes cantidades de dipicolinato cálcico en la región central (5 a 15% del peso seco de la espora) que se forma a partir de un intermediario de la vía biosintética de glicina (figura 6-19). En alguna forma que aún no se comprende por completo, estas propiedades causan la estabilización de las enzimas de la espora, la mayor parte de las cuales muestran labilidad normal al calor cuando se aís- lan en forma soluble. 2. Pared de la espora. La capa más interna que rodea la membrana interna de la espora se denomina pared de la espora. Contiene peptidoglucano normal y se convierte en la pared celular de la célula vegetativa en germinación. 3. Corteza. Es la capa más gruesa de la envoltura de la espora. Contiene un tipo inusual de peptidoglucano, con muchos menos enlaces cruzados de los que se encuentran en FIGURA 226 Células en esporulación del género bacilos. A: Bacilos no identificados provenientes del suelo. B: Bacillus cereus. C: Bacillus megaterium. (Reproducida con autorización de Robinow CF, Structure. En Gunsalus IC, Stanier RY [eds]. The Bacteria: A Treatise on Structure and Function. Vol 1. Academic Press, 1960.) A B C apter 02_Carroll_4R.indd 36 apter 02_Carroll_4R.indd 36 14/04/16 14/04/16
- 50. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 37 el peptidoglucano de la pared celular. El peptidoglucano de la corteza es extremadamente sensible a las lisozimas y su autóli- sis participa en la germinación de la espora. 4. Cubierta. La cubierta se compone de proteínas simila- res a la queratina que contienen muchos enlaces disulfuro intramoleculares. La impermeabilidad de esta capa confiere a las esporas su relativa resistencia a los agentes químicos antibacterianos. 5. Exosporio. El exosporio está compuesto por proteínas, lípidos y carbohidratos. Consiste de una capa basal paracris- talina y una región externa con aspecto piloso. La función del exosporio es poco clara. Las esporas de algunos microorganis- mos del género Bacillus (p. ej., B. anthracis y B. cereus) poseen un exosporio, en tanto que microorganismos de otros géne- ros (p. ej., B. atrophaeus) poseen esporas que carecen de esta estructura. C. Germinación El proceso de germinación ocurre en tres etapas: activación, inicio y retoño. 1. Activación. La mayor parte de las endosporas no pueden germinar de inmediato después de su formación. Pueden ger- minar después de que han permanecido en reposo por varios FIGURA 227 Etapas de la formación de endosporas. (Reproducida con autorización de Merrick MJ: Streptomyces. En: Parish JH [ed]. Developmental Biology of Procaryotes. Univ California Press, 1979.) Pared celular Corteza Pared celular germinativa Cubierta de la espora Espora Espora madre DNA Formación del filamento axial Englobamiento de la preespora Depósito de la cubierta Maduración Destrucción de la célula madre Síntesis de la corteza Formación del tabique de la preespora 0 1 2 3 4 5 6 7 apter 02_Carroll_4R.indd 37 apter 02_Carroll_4R.indd 37 14/04/16 14/04/16
- 51. 38 SECCIÓN IFundamentos de microbiología días o cuando se activan por primera vez en un medio rico en nutrientes por uno u otro agente que daña la cubierta de la espora. Entre los agentes que pueden activar a una espora en reposo se encuentran el calor, abrasión, acidez y compuestos que contienen grupos sulfhidrilo libres. 2. Inicio. Después de activada, una espora iniciará la ger- minación si las condiciones ambientales son favorables. En diferentes especies han evolucionado receptores que recono- cen diferentes efectores como sistema de señalización en un entorno rico en nutrientes: así la etapa de inicio es desencade- nada por l-alanina en una especie y por adenosina en otra. La unión del efector activa una autolisina que degrada con rapidez la corteza de peptidoglucano. Se capta agua, se libera el dipi- colinato cálcico y diversos constituyentes de la espora sufren degradación por enzimas hidrolíticas. 3. Proliferación. La degradación de la corteza y de las capas externas da origen al surgimiento de una nueva célula vegetativa que consiste de protoplastos de espora con su pared circundante. Se continúa con un periodo de biosíntesis activa que concluye con la división celular, y se conoce como etapa de proliferación; para que se lleve a cabo ésta es necesario el suministro de todos los nutrientes esenciales para el crecimiento celular. TINCIÓN Los colorantes sufren combinación química con el proto- plasma de la bacteria; si la célula no está muerta, el proceso de tinción la destruye; por lo tanto, tal proceso es drástico y puede producir artefactos. Los colorantes utilizados a menudo son sales. Los coloran- tes básicos consisten de cationes teñidos con un anión incoloro (p. ej., cloruro– de azul de metileno+ ); ocurre lo contrario con los colorantes ácidos (p. ej., eosinato– de sodio+ ). Las células bacterianas son ricas en ácidos nucleicos y portan cargas ne- gativas en los grupos fosfato. Ésta se combina con las cargas positivas de los colorantes básicos. Los colorantes ácidos no tiñen a las células bacterianas y por lo tanto pueden utilizarse para teñir el material de fondo a fin de proporcionar un con- traste de color (véase la sección Tinción negativa). Los colorantes básicos tiñen las células bacterianas de manera uniforme a menos que en primer lugar se destruya el RNA citoplásmico. Sin embargo, pueden utilizarse técnicas de tinción especial para diferenciar los flagelos, cápsulas, paredes celulares, membranas celulares, gránulos, nucleoides y esporas. Tinción de Gram Una característica taxonómica importante de las bacterias es su respuesta a la tinción de Gram. Las propiedades de tin- ción de Gram parecen ser fundamentales, porque la reacción de Gram se correlaciona con muchas otras propiedades mor- fológicas en formas con relación filogenética (capítulo 3). Un microorganismo que en potencia es positivo para la tinción de Gram puede parecerlo sólo bajo condiciones ambientales par- ticulares y en un cultivo joven. Los procedimientos de tinción de Gram (capítulo 47) ini- cianconlaaplicacióndeuncolorantebásico,violetadegenciana. A continuación se aplica una solución de yodo; todas las bac- terias se tiñen de color azul en este punto del procedimiento. Luego la célula se trata con alcohol. Las células gramposi- tivas que conservan el complejo de violeta de genciana-yodo adquieren un color azul y las células gramnegativas se deco- loran por completo con la adición de alcohol. Como último paso se aplica otro colorante (como rojo de safranina) de forma que las células gramnegativas decoloradas adquieran un color contrastante; las células grampositivas adquieren un color vio- láceo (cuadro 2-1). La base de la reacción diferencial a la tinción de Gram es la estructura de la pared celular, como se comentó antes en este capítulo. Tinción acidorresistente Las bacterias acidorresistentes son aquellas que conservan la carbolfucsina (tiroxina básica disuelta en una mezcla de agua-alcohol-fenol) incluso cuando se decolora con ácido clorhídrico en alcohol. Un frotis de células sobre una lami- nilla se cubre con carbolfucsina y se calienta en baño María. A continuación se lleva a cabo la decoloración con la mezcla de ácido-alcohol y por último se aplica una tinción de contraste (azul o verde) (capítulo 47). Las bacterias acidorresistentes (micobacterias y algunos actinomicetos relacionados) adquie- ren un color rojizo en tanto que otras células adquieren el color del segundo colorante. Tinción negativa Este procedimiento consiste en la atención del entorno con un colorante ácido, dejando a las células incoloras. El colorante negro de nigrosina (tinta china) se utiliza a menudo. Dicho método se emplea para aquellas células o estructuras difíciles de teñir en forma directa (figura 2-21B). Tinción de los flagelos Los flagelos son demasiado delgados (12 a 30 nm de diámetro) para que sean visibles en el microscopio de luz. Sin embargo, su presencia y distribución pueden demostrarse al tratar las células con una suspensión coloidal inestable de sales de ácido tánico, lo que causa la precipitación intensa sobre las paredes celulares y flagelos. De esta manera, el diámetro aparente de éstos se incrementa a un tamaño tal que las tinciones subsi- guientes con fucsina básica hacen visibles a los flagelos en la microscopia de luz. En la figura 2-28 se muestran células teñi- das con este método. En las bacterias perítricas los flagelos forman haces durante el movimiento y tales haces pueden tener un grosor tal que sea posible observarlos en células vivas en la microscopia de campo oscuro o de contraste de fases. Tinción de la cápsula La presencia de la cápsula por lo común se demuestra por pro- cedimientos de tinción negativa o modificaciones de tales pro- cedimientos (figura 2-21). Uno de estos métodos de “tinción de la cápsula” (método de Welch) implica el tratamiento con solución de violeta de genciana caliente seguido de un lavado con solución de sulfato de cobre. Este último se utiliza para apter 02_Carroll_4R.indd 38 apter 02_Carroll_4R.indd 38 14/04/16 14/04/16
- 52. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 39 eliminar el exceso de colorante porque las técnicas convencio- nales de lavado con agua causarían la disolución de la cápsula. Las sales de cobre también proporcionan color al fondo, con el resultado de que la célula y el fondo adquieren un color azul oscuro y la cápsula tiene un color azul mucho más pálido. Tinción de nucleótidos Los nucleótidos se pueden teñir con la tinción de Feulgen, un método específico para el DNA. Tinción de esporas Las esporas se observan de la manera más simple como cuer- pos refringentes intracelulares (figura 2-26) en suspensiones celulares no teñidas o como áreas incoloras en células teñidas por métodos convencionales. La pared de la espora es relati- vamente impermeable, pero puede lograrse que el colorante penetre la espora mediante el calentamiento de la preparación. La misma impermeabilidad que sirve para evitar la decolo- ración de la espora después de un tratamiento con alcohol es suficiente para decolorar células vegetales. Más tarde puede aplicarse un segundo colorante. Las esporas a menudo se tiñen con verde de malaquita o carbolfucsina (figura 2-29). CAMBIOS MORFOLÓGICOS DURANTE LA PROLIFERACIÓN División celular La mayor parte de las bacterias se dividen por fisión binaria en dos células hijas iguales. En un medio de cultivo de bacilos, como E. coli, las células sufren elongación y más tarde forman una partición que finalmente se separa en dos células hijas. La partición se conoce como tabique y es consecuencia del creci- miento hacia el interior de la membrana citoplásmica y la pared celular a partir de direcciones opuestas hasta que se separan dos células hijas. Los cromosomas se duplican en número antes de la división y se distribuyen en cantidades iguales a las dos células hijas. Las bacterias carecen de huso mitótico pero el tabique se forma de manera tal que separa los cromosomas de las dos células hijas, que previamente se formaron por replicación cro- mosómica. Esto se logra mediante la unión de los cromosomas a la membrana celular. Con base en un modelo, la finalización de un ciclo de replicación de DNA desencadena la síntesis activa de la membrana en los sitios de unión de los dos cromo- somas hijos. Los cromosomas se separan por el crecimiento del tabique hacia el interior, procedimiento en el cual cada célula hija permanece con una copia. Agrupamiento celular Si las células permanecen transitoriamente unidas durante la división, se originan ciertas agrupaciones características. Dependiendo del plano de división y el número de divisiones a través del cual las células permanecen unidas, pueden presen- tarse las siguientes formas durante la replicación de cocos: cade- nas (estreptococos), pares (diplococos), haces cúbicos (sarcinas) o placas planas. Los bacilos pueden formar pares o cadenas. Después de la fisión de algunas bacterias, ocurren movi- mientos característicos luego de la división. Por ejemplo, un “movimientodelatigazo”puedecolocarlascélulasenposiciones paralelas; las divisiones repetidas y los movimientos de latigazo que ocurren en forma repetida dan origen a una disposición en “palizada” que es característica de los bacilos diftéricos. RESUMEN DEL CAPÍTULO • La microscopia tiene una participación muy importante en nuestros conocimientos de la estructura celular. • Las células eucariotas se caracterizan por un núcleo rodeado por una membrana, un retículo endoplásmico, FIGURA 228 Tinción de los flagelos de bacterias del género Pseudomonas. (Reproducida con autorización de Leifson E: Staining, shape and arrangement of bacterial flagella. J Bacteriol 1951;62:377.) FIGURA 229 Tinción de una endospora. Las endosporas retienen el color verde primario, verde malaquita. La contratinción con safranina tiñe de rojo las demás células. (© Jack M. Bostrack/Visuals Unlimited). 10 µm apter 02_Carroll_4R.indd 39 apter 02_Carroll_4R.indd 39 14/04/16 14/04/16
- 53. 40 SECCIÓN IFundamentos de microbiología ribosomas 80S y plástidos (mitocondrias y cloroplastos). La membrana plasmática se caracteriza por la presencia de esteroles (colesterol). Las células procariotas carecen de un núcleo verdadero y son haploides. Su citoplasma contiene ribosomas 70S y no poseen mitocondrias ni cloroplastos. • Las funciones principales de la membrana celular de las células procariotas son: 1) la permeabilidad selectiva y el transporte de solutos; 2) el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, en las especies aeróbias; 3) la excre- ción de enzimas hidrolíticas y otras proteínas; 4) tener las enzimas y moléculas acarreadoras que funcionan en la bio- síntesis de DNA, polímeros de la pared celular y lípidos de la membrana; y 5) tener a los receptores y proteínas de la quimiotaxia y otros sistemas de transducción sensorial. • La mayor parte de las bacterias se clasifica como grampo- sitiva o gramnegativa, según su respuesta a la tinción de Gram. Las diferencias entre ambos grupos se reflejan en diferencias fundamentales de sus cubiertas celulares. • La pared celular de los grampositivos consta de una mem- brana plasmática y una capa gruesa de peptidoglucano; la pared celular de los gramnegativos consta de una mem- brana plasmática, una capa delgada de peptidoglucano y una membrana externa que contiene lipopolisacáridos (endotoxina). El espacio entre la membrana plasmática y la membrana externa se denomina espacio periplásmico • Muchas bacterias sintetizan grandes cantidades de polí- meros extracelulares. Cuando este polímero forma una capa condensada y bien definida que rodea a la célula y excluye a las partículas como la tinta china, se le denomina cápsula. Las cápsulas son factores importantes de virulen- cia y protegen a la célula de la fagocitosis. • Las estructuras de la superficie celular como pilosidades y flagelos, son importantes para su adhesión y motilidad, respectivamente. • La formación de endosporas es una característica de los géneros Bacillus y Clostridium y se desencadena por la desaparición de nutrientes en el ambiente. Las endospo- ras (esporas) son células en reposo, altamente resistentes a la desecación, el calor y las sustancias químicas; cuando regresan a un ambiente nutritivo favorable y se activan, la espora germina para producir una célula vegetativa. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. Un varón de 22 años de edad acude a consulta con una úlcera indolora de 1 cm de diámetro en la base del pene. Presenta lin- fadenopatía inguinal. El paciente informa que ha pagado por relaciones sexuales y drogas y tiene varias parejas sexuales. Una prueba de RPR fue positiva y se sospecha sífilis; sin embargo, la tinción de Gram de un frotis obtenido con hisopo de la úlcera muestra ausencia de bacterias. El Treponema pallidum es el agente causal de la sífilis pero no puede visualizarse en la micros- copia de luz porque (A) Es transparente (B) No puede teñirse con los colorantes ordinarios (C) Tiene un diámetro < 0.2 μm (D) La longitud de onda de la luz blanca es demasiado grande (E) El movimiento rápido del microorganismo evita su visua- lización 2. El cloranfenicol es un antibiótico que inhibe la síntesis de pro- teínas bacterianas. ¿Qué organelos de células eucariotas también se afectan? (A) Mitocondria (B) Aparato de Golgi (C) Microtúbulos (D) Retículo endoplásmico (E) Membrana nuclear 3. ¿Cuál de las siguientes estructuras no es parte de la envoltura de la célula bacteriana? (A) Peptidoglucano (B) Lipopolisacárido (C) Cápsula (D) Vacuola de gas (E) Capa S 4. Un grupo de adolescentes presentó náusea, vómito, dolor abdo- minal cólico intenso y diarrea después de comer hamburguesas mal cocidas en un restaurante local. Dos de los adolescentes fue- ron hospitalizados con síndrome hemolítico-urémico. Se aisló Escherichia coli O157:H7 de las heces de un paciente y también en una muestra de las hamburguesas mal cocidas. ¿A qué estructura bacteriana se hace referencia con el término H7? (A) Lipopolisacáridos (B) Cápsula (C) Flagelo (D) Fimbria (E) Capa S 5. ¿Cuál de los siguientes componentes está presente en bacterias grampositivas, pero no en gramnegativas? (A) Peptidoglucano (B) Lípido A (C) Cápsula (D) Flagelos (E) Pilosidades 6. Los estreptococos del grupo A son la causa bacteriana más común de faringitis en niños de edad escolar de cinco a 15 años. El com- ponente celular más importante que participa en la adhesión de esta bacteria a la fibronectina y que cubre la superficie epitelial de la nasofaringe es (A) Cápsula (B) Ácido lipoteicoico (C) Flagelos (D) Lipoproteínas (E) Antígeno O 7. En el otoño de 2001, varias cartas que contenían esporas de Bacillus anthracis fueron enviadas por correo a personas de los medios de comunicación y oficinas del senado estadounidense. Esto ocasionó 22 casos de carbunco con cinco defunciones. La resistencia al calor de esporas bacterianas, como las de Bacillus anthracis se deben en parte a su estado de deshidratación y en parte a la presencia de grandes cantidades de (A) Ácido diaminopimélico (B) Ácido d-glutámico (C) Dipicolinato de calcio (D) Proteínas que contienen grupos sulfhidrilo (E) Lípido A 8. ¿Cuál de los siguientes términos NO describen al cromosoma bacteriano? (A) Haploide (B) Diploide (C) Circular apter 02_Carroll_4R.indd 40 apter 02_Carroll_4R.indd 40 14/04/16 14/04/16
- 54. CAPÍTULO 2 Estructuracelular 41 (D) Nucleoide (E) Positivo con la tinción de Feulgen 9. El lisosoma parte el enlace β1→4 entre: (A) d-alanina y el puente de pentaglicina (B) Ácido N-acetilmurámico y d-alanina (C) Lípido A y KDO (D) Ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina (E) d-Alanina y d-alanina 10. ¿De cuáles de los componentes siguientes carecen las especies de Mycoplasma? (A) Ribosomas (B) Membrana plasmática (C) Tanto DNA como RNA (D) Lípidos (E) Peptigloglicano Economou A, Christie PJ, Fernandez RC, Palmer T, Plano GV, Pug- sley AP: Secretion by the numbers: protein traffic in prokaryotes. Mol Microbiol 2006;62:308. Hinnebusch J, Tilly K: Linear plasmids and chromosomes in bacte- ria. Mol Microbiol 1993;10:917. Henriques AO, Moran CP Jr: Structure, assembly, and function of the spore surface layers. Annu Rev Microbiol 2007;61:555. Hueck CJ: Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol Mol Biol Rev 1998;62:379. Leiman PG, et al.: Type VI secretion apparatus and phage tail-asso- ciated protein complexes share a common evolutionary origin. Proc Natl Acad Sci U S A 2009;106:4154. Liu J, Barry CE III, Besra GS, Nikaido H: Mycolic acid structure determines the fluidity of the mycobacterial cell wall. J Biol Chem 1996;271:29545. Messner P, et al: Biochemistry of S-layers. FEMS Microbiol Rev 1997;20:25-46. Naroninga N: Morphogenesis of Escherichia coli. Microbiol Mol Biol Rev 1998;62:110. Nikaido H: Molecular basis of bacterial outer membrane permeabil- ity revisited. Microbiol Mol Biol Rev 2003;67:593. Rachel R, et al.: Fine structure of S-layers. FEMS Microbiol Rev 1997;20:13. Sauvage E, Kerff F, Terrak M, Ayala JA, Charlier P: The penicillin- binding proteins: structure and role in peptidoglycan biosynthe- sis. FEMS Microbiol Rev 2008;32:234. Schaechter M, Ingraham JL, Neidhardt FC: Microbe. American Soci- ety for Microbiology, 2006. Scheffers DJ, Pinho MG: Bacterial cell wall synthesis: New insights from localization studies. Microbiol Mol Biol Rev 2005;69:585. Schirmer T: General and specific porins from bacterial outer mem- branes. J Struct Biol 1998;121:101. [PMID: 9615433] Scott JR, Barnett TC: Surface proteins of gram-positive bacteria and how they get there. Annu Rev Microbiol 2006;60:397. Silverman JM, Brunet YR, Cascales E, Mougous JD: Structure and regulation of the Type VI secretion system. Annu Rev Microbiol 2012;66:453. Sonenshein AL, Hoch JA, Losick R: Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives. American Society for Microbiology, 2002. Vaara M: Agents that increase the permeability of the outer mem- brane. Microbiol Rev 1992;56:395. Vollmer W, Blanot D, de Pedro MA: Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol Rev 2008;32:149. Walsby AE: Gas vesicles. Microbiol Rev 1994;58:94. Whittaker CJ, Klier CM, Kolenbrander PE: Mechanisms of adhesion by oral bacteria. Annu Rev Microbiol 1996;50:513. Respuestas 1. C 2. A 3. D 4. C 5. B 6. B 7. C 8. B 9. D 10. E BIBLIOGRAFÍA Balows A, et al. (editors): The Prokaryotes, A Handbook on the Biol- ogy of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applica- tions, 2a. ed, 4 vols. Springer, 1992. Barreteau H, Kovac A, Boniface A, Sova M, Gobec S, Blanot D: Cytoplasmic steps of peptidoglycan biosynthesis. FEMS Micro- biol Rev 2008;32:168. Barton LL: Structural and Functional Relationships in Prokaryotes. Springer, 2005. Bermudes D, Hinkle G, Margulis L: Do prokaryotes contain micro- tubules? Microbiol Rev 1994;58:387. Blair DF: How bacteria sense and swim. Annu Rev Microbiol 1995;49:489. Burrows LL: Twitching motility: Type IV pili in action. Annu Rev Microbiol 2012;66:492. Craig L, Pique ME, Tainer JA: Type IV pilus structure and bacterial pathogenicity. Nat Rev Microbiol 2004;2:363. Dautin N, Bernstein HD: Protein secretion in gram-negative bac- teria via the autotransporter pathway. Annu Rev Microbiol 2007;61:89. apter 02_Carroll_4R.indd 41 apter 02_Carroll_4R.indd 41 14/04/16 14/04/16
- 55. apter 02_Carroll_4R.indd 42 apter02_Carroll_4R.indd 42 14/04/16 14/04/16
- 56. 43 3 Clasificación de lasbacterias C A P Í T U L O TAXONOMÍA: EL VOCABULARIO DE LA MICROBIOLOGÍA MÉDICA Con sólo examinar la tabla de contenido de este libro, se apre- cia la diversidad de patógenos que causan enfermedades infec- ciosas. Se calcula que en la actualidad es posible identificar menos de 10% de los microorganismos patógenos que provo- can enfermedades por la dificultad de cultivarlos o analizarlos con sondas moleculares. No obstante, incluso la diversidad de estos microorganismos patógenos identificables es tal que es importante conocer las diferencias sutiles entre cada uno de ellos. La razón por la que es importante conocer estas diferen- cias mínimas es que cada microorganismo infeccioso se ha adaptado de manera específica a un modo particular de trans- misión, un mecanismo para infectar al hospedador humano (colonización) y un mecanismo para causar enfermedad (pato- logía). Por lo tanto, es indispensable contar con un vocabulario que permita comunicar las características particulares de los microorganismos infecciosos a los estudiantes, microbiólogos y al personal dedicado a la salud con la finalidad de evitar el caos que sobrevendría sin las limitaciones de organización pro- pias de la taxonomía bacteriana (del griego taxon = organi- zación; esto es, la clasificación de los microorganismos en un sistema ordenado que indica una relación natural). La identificación, clasificación y nomenclatura son tres áreas independientes, pero interrelacionadas, de la taxonomía bacteriana. Cada área es crucial para el objetivo final de estu- diar con exactitud las enfermedades infecciosas y comunicar- las con precisión a otras personas en este campo. La identificación es el uso práctico de un esquema de cla- sificación para 1) aislar y diferenciar microorganismos especí- ficos entre una mezcla de flora microbiana compleja; 2) verifi- car la autenticidad o propiedades especiales de un cultivo en un entorno clínico y 3) aislar al microorganismo causal de una enfermedad. Esto último puede conducir a la selección de tra- tamientos farmacológicos específicos para la erradicación, a la creación de vacunas que mitiguen su patología o a la aplicación de medidas de salud pública (p. ej., lavado de manos) para pre- venir que continúe la transmisión. Los esquemas de identificación no son esquemas de clasifi- cación, aunque haya algunas similitudes superficiales. Por ejem- plo, las publicaciones populares han informado que Escherichia coli causa síndrome hemolítico-urémico (HUS, hemolytic-ure- mic syndrome) en lactantes. Hay cientos de cepas diferentes que se clasifican como E. coli, pero sólo unas cuantas se asocian a HUS. Estas cepas pueden “identificarse” de muchas otras cepas de E. coli por su reactividad a anticuerpos con los antígenos O, H y K, como se describe en el capítulo 2 (p. ej., E. coli O157:H7). Sin embargo, se las clasifica de una manera más amplia como integrantes de la familia de las Enterobacteriaceae. En el contexto microbiológico, la clasificación es la cate- gorización de microorganismos en grupos taxonómicos. Se necesitan técnicas experimentales y de observación para la clasificación taxonómica. Esto se debe a que, desde siempre, las propiedades bioquímicas, fisiológicas, genéticas y mor- fológicas son indispensables para establecer una categoría taxonómica. Esta área de la microbiología es necesariamente dinámica a medida que los recursos tecnológicos continúen evolucionando (p. ej., nuevos métodos de microscopía, aná- lisis bioquímicos y biología de ácidos nucleicos con el uso de computadoras). El término nomenclatura se refiere a la denominación de un microorganismo por un grupo establecido de científicos y médicos. Sin duda, éste es el componente más importante de la taxonomía porque permite a los médicos comunicarse entre sí. De la misma manera como el vocabulario social evoluciona, también lo hace el vocabulario de la microbiología médica. Cualquier profesional relacionado con enfermedades infeccio- sas debe conocer la evolución de la taxonomía de los microor- ganismos infecciosos. En definitiva, las categorías taxonómicas forman la base de la organización de las bacterias. La taxonomía linneana es el sistema que mejor conocen los biólogos. Ésta utiliza las catego- rías taxonómicas formales como reino, tipo, clase, orden, fami- lia, género y especie. Las categorías inferiores son aprobadas por un consenso de expertos en la comunidad científica. De estas categorías, la familia, género y especie son las más utili- zadas (cuadro 3-1). CRITERIOS PARA CLASIFICAR LAS BACTERIAS Crecimiento en medios de cultivo Los criterios adecuados para fines de clasificación bacteriana incluyen muchas de las propiedades que se describieron en el capítulo anterior. Uno de ellos es la proliferación en diferentes tipos de medios de cultivo bacteriológico. El cultivo general de la mayor parte de las bacterias exige un medio con abundan- tes nutrientes. Estos medios por lo general contienen agar, una fuente de carbono, y un hidrolizado ácido o una fuente de mate- rial biológico sometida a degradación enzimática (p. ej., ca- seína). Debido a que la composición de estos últimos es indefi- nida, se denominan medios complejos. apter 03_Carroll_4R.indd 43 apter 03_Carroll_4R.indd 43 14/04/16 14/04/16
- 57. 44 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Las muestras clínicas provenientes de sitios que en condi- ciones normales no son estériles (p. ej., faringe o colon) contie- nen más de un tipo de microorganismo, incluidos patógenos potenciales y microbiota residente. Los medios de cultivo pue- den clasificarse en no selectivos o selectivos; estos últimos permiten distinguir entre las diversas bacterias presentes en una muestra clínica que contiene numerosos microorganismos diferentes. A. Medios no selectivos El agar sangre y el agar chocolate constituyen ejemplos de medios de cultivo complejos no selectivos que facilitan el creci- miento de muy diversas bacterias. El propósito de estos medios es cultivar tantas especies como sea posible y generar, de esta manera, numerosos tipos de colonias bacterianas. B. Medios selectivos En vista de la diversidad de microorganismos que habitan en algunos sitios (p. ej., la piel, el aparato respiratorio, el aparato digestivo, la vagina), se utilizan medios selectivos para elimi- nar (o reducir) el gran número de bacterias irrelevantes en estas muestras. El fundamento de los medios selectivos es la incorporación de una sustancia que inhibe de manera selectiva el crecimiento de las bacterias irrelevantes. Algunos ejemplos de estas sustancias son: • Azida de sodio: selecciona bacterias grampositivas entre las gramnegativas • Sales biliares (p. ej., desoxicolato sódico): selecciona bacterias intestinales gramnegativas e inhibe las bacte- rias gramnegativas de la mucosa y la mayor parte de las grampositivas • Colistina y ácido nalidíxico: inhiben el crecimiento de numerosas bacterias gramnegativas Ejemplos de medios selectivos son el agar MacConkey (que contiene bilis), que selecciona Enterobacteriaceae y el agar sangre CNA (que contiene colistina y ácido nalidíxico) que selecciona los estafilococos y estreptococos. C. Medios diferenciales Al cultivarse, algunas bacterias producen pigmentos carac- terísticos y otras se distinguen con base en la producción de enzimas extracelulares; la actividad de estas enzimas puede identificarse como zonas claras alrededor de las colonias cul- tivadas en presencia de sustratos insolubles (p. ej., zonas de hemólisis en un agar que contiene eritrocitos). Muchos de los miembros de Enterobacteriaceae se distin- guen por su potencial para metabolizar lactosa. Por ejemplo, las cepas patógenas de Salmonella y Shigella no fermentan lactosa y en el agar MacConkey forman colonias transparentes, en tanto que las integrantes de las Enterobacteriaceae que fermentan lactosa (p. ej., E. coli) forman colonias rojas o rosas. El número de medios diferenciales utilizados actualmente en los laboratorios clínicos rebasa el alcance de este capítulo. Microscopia Por tradición, la tinción de Gram, aunada a la visualización con microscopio de luz, es uno de los métodos que más infor- mación ofrece para clasificar las eubacterias. Esta técnica de tinción divide de manera general a las bacterias con base en las diferencias fundamentales en la estructura de sus paredes celulares (capítulo 2). Habitualmente, esto representa el primer paso en la identificación de bacterias (p. ej., ¿son grampositi- vas o gramnegativas?) que crecen en cultivo o incluso directa- mente de las muestras clínicas (p. ej., muestras de orina). Pruebas bioquímicas Algunos exámenes como la prueba de la oxidasa, en la que se utiliza un aceptor artificial de electrones, sirven para diferen- ciar a los microorganismos con base en la presencia o ausencia de una enzima de la cadena respiratoria, el citocromo C, cuya ausencia permite distinguir entre las Enterobacteriaceae y otros bacilos gramnegativos. Asimismo, la actividad de la catalasa sirve, por ejemplo, para diferenciar entre los cocos gramposi- tivos; las especies de estafilococos son catalasas positivas, en tanto que las especies de estreptococos son catalasas negativas. Cuando se demuestra que un microorganismo es catalasa posi- tivo (Staphylococcus spp.), la especie se subdivide por medio de una prueba de coagulasa en Staphylococcus aureus (coagulasa positiva) o Staphylococcus epidermidis (coagulasa negativa) como se demuestra en la figura 3-1. En conclusión, hay varios ejemplos de pruebas bioquími- cas que permiten establecer la presencia de funciones metabó- licas características y que sirven para agrupar las bacterias en Estreptococos catalasa negativos Estafilococos catalasa positivos Prueba de catalasa para cocos grampositivos Prueba de la coagulasa S. aureus positivo S. epidermitis negativo FIGURA 31 Algoritmo para diferenciar los cocos grampositivos. CUADRO 31 Categorías taxonómicas Categoría formal Ejemplo Reino Procariotas División Gracilicutes Clase Escotobacteria Orden Eubacteriales Familia Enterobacteriaceae Género Escherichia Especie coli Subtipo Escherichia coli O157:H7 apter 03_Carroll_4R.indd 44 apter 03_Carroll_4R.indd 44 14/04/16 14/04/16
- 58. CAPÍTULO 3 Clasificaciónde las bacterias 45 un taxón específico. En el cuadro 3-2 aparece una lista incom- pleta de las pruebas bioquímicas más frecuentes. Pruebas inmunológicas: serotipos, serogrupos y serovariedades La designación “sero” simplemente indica el uso de anticuer- pos (policlonales o monoclonales) que reaccionan con estruc- turas específicas de la superficie celular bacteriana, como los lipopolisacáridos (LPS), los flagelos o los antígenos capsulares. Los términos “serotipo”, “serogrupo” y “serovariedad”, para fines prácticos, son idénticos; todos ellos utilizan la especifi- cidad de estos anticuerpos para subdividir a las cepas de una especie bacteriana. En determinadas circunstancias (p. ej., epidemias), es importante distinguir entre cepas de una especie dada o iden- tificar una cepa en particular. Esto se conoce como subtipifi- cación, y para realizarla se examinan colonias bacterianas en busca de características que permitan la discriminación más allá del nivel de la especie. Clásicamente, la subtipificación se lleva a cabo por biotipificación, serotipificación, pruebas de CUADRO 32 Pruebas bioquímicas microbacterianas utilizadas con frecuencia para distinguir entre las bacterias 1. Desdoblamiento de carbohidratos. La posibilidad de hacer productos metabólicos ácidos por vía de la fermentación o de la oxidación de una variedad de carbohidratos (p. ej., glucosa, sacarosa y lactosa) se ha aplicado a la identificación de la mayor parte de los grupos de bacterias (p. ej., Escherichia fermentan lactosa, en tanto que la Salmonella spp. no lo hace). Tales pruebas son generales e imperfectas como mecanismo de definición, pero han demostrado ser útiles con fines taxonómicos. En fechas más recientes, la identificación por cromatografía de gases de ácidos grasos de cadena corta específicos producidos por fermentación de la glucosa ha demostrado ser de utilidad en la clasificación de muchas bacterias anaerobias. 2. Producción de catalasa. La enzima catalasa cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno a agua y oxígeno. Cuando una colonia se coloca en peróxido de hidrógeno, puede observarse la liberación de oxígeno en forma de burbujas. La prueba es particularmente útil para distinguir entre estafilococos (positiva) y estreptococos (negativa), pero también tiene aplicaciones taxonómicas para las bacterias gramnegativas. 3. Utilización de citrato. Un medio de agar que contiene citrato de sodio como única fuente de carbono puede servir para determinar la capacidad de utilizar el citrato. Bacterias como la Klebsiella pneumoniae que crecen en este medio se denominan citrato positivas. 4. Coagulasa. La enzima coagulasa actúa con el factor plasmático para convertir el fibrinógeno en un coágulo de fibrina. Sirve para diferenciar el Staphylococcus aureus de otros estafilococos menos patógenos. 5. Descarboxilasas y desaminasas. La descarboxilación o desaminación de los aminoácidos lisina, ornitina y arginina se detecta por el efecto de los productos amino sobre el pH de la mezcla de reacción o por la formación de productos coloreados. Las pruebas se utilizan principalmente con bacilos gramnegativos. 6. Sulfuro de hidrógeno. La capacidad de algunas bacterias de producir H2 S a partir de aminoácidos o de otros compuestos que contienen azufre es útil en la clasificación taxonómica. El color negruzco de las sales de azufre formadas con metales pesados como el hierro es el medio habitual de detección. La prueba permite diferenciar entre los bacilos gramnegativos. 7. Indol. La reacción al indol prueba la capacidad del microorganismo de producir indol, un benzopirrol derivado del triptófano. El indol se detecta por la formación de un color rojizo después de la adición de un reactivo de benzaldehído. La prueba puede realizarse en segundos si se utilizan colonias. Proteus vulgaris es positivo para indol. 8. Reducción de nitratos. Las bacterias pueden ocasionar reducción de nitratos por varios mecanismos. Esta capacidad se demuestra con la detección de nitratos o con la formación de gas nitrógeno en el proceso. Esta prueba se incluye en el examen general de orina habitual para detectar infecciones de vías urinarias. 9. Desdoblamiento de O-nitrofenil-β-D-galactosidasa (ONPG). Esta prueba se relaciona con la fermentación de lactosa. Los microorganismos que tienen la β-galactosidasa necesaria para la fermentación de lactosa, pero carecen de la permeasa indispensable para que la lactosa entre en la célula son positivos para ONPG y negativos para lactosa. 10. Producción de oxidasa. La prueba de oxidasa detecta el componente c del complejo de citocromo-oxidasa. Los reactivos que se utilizan cambian de transparente a coloreado cuando se convierten de la forma reducida al estado oxidado. La reacción de oxidasa se demuestra a menudo en pruebas de inmunotransferencia, que pueden realizarse con rapidez en colonias aisladas. Esta prueba permite distinguir entre los bacilos gramnegativos, Pseudomonas aeruginosa (oxidasas +) y E. coli (oxidasas −). 11. Producción de proteinasa. La actividad proteolítica se detecta por la proliferación de microorganismos en presencia de sustratos como gelatina o huevo coagulado. Las cepas productoras de proteasa, como P. aeruginosa y S. aureus, son positivas en este análisis. 12. Producción de ureasa. La ureasa hidroliza la urea y produce dos moléculas de amoniaco y una molécula de CO2 . Esta reacción puede detectarse por el incremento del pH del medio de cultivo causado por la producción de amoniaco. Las especies positivas para ureasa varían en la cantidad de enzima producida; las bacterias pueden designarse, entonces, como positivas, débilmente positivas o negativas. P. vulgaris puede diferenciarse de otros bacilos entéricos con este análisis. 13. Prueba de Voges-Proskauer. Esta prueba detecta acetilmetilcarbinol (acetoína), un producto intermedio en la vía de butenglicol de fermentación de la glucosa. Esta prueba distingue entre bacilos entéricos. (Reproducido con autorización de Ryan KJ, Ray CG (editors): Sherris Medical Microbiology, 5a. ed. McGraw-Hill, 2010. Copyright © The McGraw-Hill Companies. Modificado de TA Mietzner, 2014. susceptibilidad antimicrobiana y tipificación con bacteriófa- gos. Por ejemplo, se han identificado más de 130 serogrupos de Vibrio cholerae por sus diferencias antigénicas en el polisa- cárido O de sus lipopolisacáridos; sin embargo, sólo los sero- grupos O1 y O139 se asocian a cólera epidémica y pandémica. En estos serogrupos, sólo las cepas que producen una pilosidad particular corregulada por toxinas y las que producen toxina del cólera son virulentas y causan la enfermedad. Por el contrario, hay cepas de V. cholerae no toxinógenas que no se han asociado a cólera pandémica y que se han aislado de muestras ambienta- les, de alimentos y de pacientes con diarrea esporádica. La clonalidad respecto a colonias de microorganismos pro- venientes de un brote epidémico de un punto de origen de dise- minación es un concepto importante en la epidemiología de las enfermedades infecciosas. Los microorganismos causales relacionados con estos brotes epidémicos suelen ser de carácter clonal; en otras palabras, se originan de una sola célula y, por lo tanto, para fines prácticos, son idénticos en términos genéticos. Así, la subtipificación desempeña una función importante en la diferenciación entre estos microorganismos en particular. Los adelantos recientes en biotecnología han mejorado de manera apter 03_Carroll_4R.indd 45 apter 03_Carroll_4R.indd 45 14/04/16 14/04/16
- 59. 46 SECCIÓN IFundamentos de microbiología notable la posibilidad de subtipificar los microorganismos. La tecnología de hibridoma ha conducido al desarrollo de anti- cuerpos monoclonales contra antígenos de superficie celular, que se han utilizado para crear sistemas de subtipificación muy estandarizados basados en anticuerpos y que describen los serotipos bacterianos. Esta es una herramienta importante para definir la propagación epidemiológica de una infección bacteriana. Otros microorganismos no pueden identificarse como serotipos particulares. Por ejemplo, algunos patógenos (p. ej., Neisseria gonorrhoeae) se transmite como un inóculo com- puesto de cuasiespecies (lo que significa que existen varia- ciones antigénicas amplias entre las bacterias presentes en el inóculo). En estos casos, los grupos de hibridoma que recono- cen las variantes de los microorganismos originales sirven para clasificar las serovariantes. Diversidad genética El valor de un criterio taxonómico depende del grupo bioló- gico que se está comparando. Los rasgos que comparten todos o ninguno de los miembros de un grupo no se pueden utili- zar para diferenciar a cada uno de ellos, pero sí para definir al grupo (p. ej., todos los estafilococos producen la enzima catalasa). Los avances en la biología molecular permiten ahora investigar la relación de genes o genomas mediante la compa- ración de secuencias de diversas bacterias. Se debe notar que la inestabilidad genética hace que ciertos rasgos sean muy varia- bles dentro de un grupo biológico o incluso dentro de un grupo taxonómico. Por ejemplo, los genes que confieren resistencia antimicrobiana o los genes que codifican enzimas (utilización de lactosa), se transportan en plásmidos o bacteriófagos (capí- tulo 7), elementos genéticos extracromosomales que pueden ser transferidos entre bacterias distintas o que pueden ser inte- grados en un subgrupo de cepas bacterianas que son idénticas en los demás sentidos. Muchos microorganismos son difíciles de cultivar y en estos casos son útiles las técnicas que revelan su relación midiendo la hibridación entre ácidos nucleicos o analizando la secuencia del DNA. SISTEMAS DE CLASIFICACIÓN Claves dicotómicas Las claves dicotómicas organizan los rasgos bacterianos en una forma que permite la identificación lógica de los microorga- nismos. El sistema ideal debe contener el número mínimo de características necesarias para una clasificación correcta. Los grupos se dividen en subgrupos más pequeños con base en la presencia (+) o ausencia (–) de una característica diagnóstica. Continuar este proceso con distintas características guía al investigador hasta el subgrupo más pequeño que contenga al microorganismo analizado. Durante las primeras fases de este proceso, los microorganismos son asignados a subgrupos con base en características que no reflejan su relación genética. Por ejemplo, sería perfectamente razonable que una clave bac- teriana incluyera a un grupo como “bacterias que forman pig- mentos rojos cuando se propagan en un medio determinado”; no obstante, esto incluiría a algunas variantes sin relación alguna como Serratia marcescens (capítulo 15) y bacterias foto- sintéticas púrpuras (capítulo 6). Estos dos grupos heterogéneos ocupan sitios distintos y dependen de un metabolismo energé- tico totalmente diferente. Sin embargo, sería conveniente hacer una clasificación preliminar del grupo porque esto permitiría de inmediato que el investigador que tuviera que identificar un cultivo pigmentado de rojo redujera la variedad de posibilida- des a unos cuantos grupos. En la figura 3-1 se muestra un ejem- plo de clave dicotómica. Taxonomía numérica con mediciones bioquímicas de actividad La taxonomía numérica se popularizó durante la década de 1970. Estos esquemas de clasificación utilizan un gran número de características no ponderadas útiles desde el punto de vista taxonómico. Para estos análisis, se tiene que aislar una sola colonia bacteriana y utilizarse para inocular el formato de la prueba. Un ejemplo es el Analytical Profile Index (APITM ), que utiliza una taxonomía numérica para identificar una amplia variedad de microorganismos de importancia médica. El API consta de varias tiras de plástico, cada una de las cuales tiene 20 compartimentos pequeños que contienen las pruebas bio- químicas (figura 3-2). Los resultados de las pruebas con el API permiten identificar a casi todos los grupos de bacterias que se pueden cultivar y a más de 550 especies. Estos sistemas de iden- tificación cuentan con bases de datos extensas de reacciones bioquímicas microbianas. Los grupos numéricos que se deri- van de estas pruebas identifican distintas cepas bacterianas en diversos grados de similitud general (casi siempre > 80% en el nivel de la especie) con base en la frecuencia con la que com- parten rasgos. Además, la clasificación numérica proporciona un porcentaje de frecuencia con la que todas las cepas de cada grupo exhiben características positivas. La limitante de este método es que es un sistema estático. Como tal, no tiene en cuenta la evolución de las bacterias ni el descubrimiento siste- mático de bacterias patógenas nuevas. FIGURA 32 Prueba APITM que demuestra cómo pueden identificarse las bacterias por medio de pruebas bioquímicas. Cada compartimento contiene un medio deshidratado que puede ser inoculado a partir de un cultivo bacteriano. Después de la incubación, los cambios de color se califican por número para producir un número que coincida con una especie y género bacterianos. (Por cortesía de bioMerieux, Inc). apter 03_Carroll_4R.indd 46 apter 03_Carroll_4R.indd 46 14/04/16 14/04/16
- 60. CAPÍTULO 3 Clasificaciónde las bacterias 47 Taxonomía basada en ácidos nucleicos Desde 1975, los adelantos en el aislamiento, amplificación y secuenciación de ácidos nucleicos ha estimulado la evolución de los sistemas de subtipificación basados en ácidos nucleicos. Estos sistemas incluyen el análisis del perfil de plásmidos, aná- lisis de restricción de fragmentos de endonucleasa, análisis de secuencias repetitivas, ribotipificación y secuenciación genó- mica. Estos métodos se describen a continuación en forma individual. Análisis de plásmidos Los plásmidos son elementos genéticos extracromosómicos (capítulo 7). Éstos pueden aislarse de una bacteria aislada y separada por electroforesis en gel de agarosa para determinar su número y tamaño. El análisis de plásmidos ha mostrado ser de utilidad para analizar brotes epidémicos que se circunscri- ben a un tiempo y espacio (p. ej., un brote epidémico en un hospital), en particular cuando se combina con otros métodos de identificación. Análisis de endonucleasas de restricción El uso de enzimas de restricción para desdoblar DNA en frag- mentos separados es uno de los procedimientos más básicos en la biología molecular. Las endonucleasas de restricción reconocen secuencias cortas de DNA (secuencia de restric- ción) y desdoblan el DNA de doble cadena en el interior de esta secuencia o adyacente a la misma. Las secuencias de restricción varían de cuatro a más de 12 bases de longitud y ocurre a lo largo de todo el cromosoma bacteriano. Las enzimas de restric- ción que reconocen secuencias cortas (p. ej., cuatro pares de bases) ocurren más a menudo que aquellas que son específi- cas de secuencias más largas (p. ej., 12 pares de bases). Así, las enzimas que reconocen secuencias cortas de DNA producen más fragmentos que las enzimas que reconocen secuencias largas de DNA, las cuales se presentan con menos frecuencia. Varios métodos de subtipificación utilizan el DNA digerido por endonucleasas de restricción. Un método consiste en aislar DNA de plásmidos, que en general tiene el tamaño de varias kilobases, y digerir este ácido nucleico con una enzima de restricción. Después del desdoblamiento enzimático, los segmentos fragmentados de los plásmidos se separan con electroforesis en gel de agarosa. Como los plásmidos portan material genético que contribuye directamente a la enfermedad y a menudo se desplazan de un organismo a otro, la presencia de un fragmento común puede confirmar que una cepa bacteriana específica era idéntica a otras cepas relacionadas con un brote epidémico. Otro método consiste en el análisis de DNA genómico, que suele tener el tamaño de varias megabases. En este caso, se utilizan endonucleasas de restricción que realizan cortes en sitios de restricción poco frecuentes en el genoma bacteriano. La digestión del DNA con estas enzimas por lo general produce de cinco a 20 fragmentos con una longitud que va de 10 a 800 kilobases. La separación de estos fragmentos grandes de DNA se lleva a cabo con una técnica conocida como electroforesis en gel de campo pulsátil (PFGE), que requiere equipo especia- lizado. En teoría, todas las cepas bacterianas pueden tipificarse con este método. Su ventaja es que el perfil de restricción con- siste en un número finito de bandas bien definidas que repre- sentan la totalidad del cromosoma bacteriano en un patrón de fragmentos únicos de DNA. Análisis genómico El uso sistemático de secuenciación del genoma de DNA per- mite la comparación precisa de secuencias divergentes de DNA, lo que puede dar una medición de su grado de relación. Los genes para diferentes funciones, como aquellos que codifi- can los antígenos de superficie para escapar a vigilancia inmu- nitaria, divergen en distintos grados respecto a los genes “de mantenimiento”, como los que codifican los citocromos. Así, la secuencia de DNA permite diferenciar entre genes rápida- mente divergentes que pueden utilizarse para conocer la dis- tancia genética entre grupos bacterianos muy relacionados. Las diferencias de secuencia entre los genes de mantenimiento pueden utilizarse para medir el grado de relación entre grupos de bacterias muy divergentes. Las propiedades genéticas de las bacterias permiten inter- cambiar genes entre microorganismos diferentes. Además, la multiplicación de las bacterias es casi por completo vegetativa y sus mecanismos de intercambio genético rara vez compren- den la recombinación entre grandes porciones de sus genomas (capítulo 7). Por lo tanto, el concepto de una especie, que es la unidad fundamental de la filogenia eucariótica, tiene un signi- ficado completamente diferente cuando se aplica a las bacterias. Existe una diversidad genética considerable entre especies bacterianas. La identificación química de DNA genómico bac- teriano revela una amplia variedad de composiciones de bases de nucleótidos entre las diferentes especies bacterianas. Una medición de esto es el contenido de guanina + citosina (G + C). Si el contenido de G + C de dos especies bacterianas es similar, indica relación taxonómica. Análisis de secuencias repetitivas En la era genómica actual de la medicina molecular, se ha obte- nido la secuencia de miles de genomas microbianos. En esta era de recursos bioinformáticos se obtiene una abundancia de información sobre la secuencia de DNA a fin de identificar objetivos novedosos para la subtipificación de patógenos, por ejemplo las secuencias repetitivas que se han observado en las diferentes especies (capítulo 7). Estas secuencias repetitivas se han denominado DNA satélite y tienen unidades repetidas que varían de 10 a 100 pares de bases. A menudo se conocen como número variable de repeticiones en tándem (VNTR, varia- ble number tandem repeats). Los VNTR se han encontrado en regiones con expresión génica controlada y con marco de lectura abierta. Las unidades repetidas y el número de copias repetidas lado a lado definen cada locus de VNTR. El método de genotipificación que utiliza la reacción en cadena de poli- merasa (PCR, polymerase chain reaction), que se conoce como análisis VNTR de múltiples locus (MLVA) aprovecha los nive- les de diversidad generados por la variación del tamaño de las unidades repetidas y por el número de copias de un número de locus identificados. Se ha demostrado utilidad especial en la subtipificación de especies monomorfas como Bacillus anthra- cis, Yersinia pestis y Francisella tularensis. apter 03_Carroll_4R.indd 47 apter 03_Carroll_4R.indd 47 14/04/16 14/04/16
- 61. 48 SECCIÓN IFundamentos de microbiología RNA ribosómico Los ribosomas tienen una función fundamental en la sínte- sis de las proteínas para todos los organismos. Las secuencias genéticas que codifican tanto RNA ribosómico (rRNA) como proteínas (ambas son necesarias para formar un ribosoma funcional) se han conservado a lo largo de la evolución, sepa- rándose con más lentitud que otros genes cromosómicos. Al comparar la secuencia de nucleótidos del RNA ribosómico 16S de un espectro de fuentes procarióticas, se observaron relacio- nes evolutivas entre organismos muy divergentes, con lo que se descubrió un reino nuevo, las arqueobacterias. El árbol filoge- nético basado en la información del RNA ribosómico (rARN), que muestra la división de las bacterias, arqueobacterias y familias eucarióticas, se ilustra en la figura 3-3, en la que se observan los tres dominios principales de vida biológica como se conocen en la actualidad. Con base en este esquema, dos reinos, las eubacterias (bacterias verdaderas) y las arqueobac- terias difieren de la rama eucariótica. La técnica de inmunotransferencia de Southern reci- bió su nombre de su inventor, Edwin Mellor Southern, y se ha utilizado como método de subtipificación para identificar cepas relacionadas con brotes epidémicos. Para este análisis, las preparaciones de DNA de colonias bacterianas se someten a digestión por endonucleasas de restricción. Después de la electroforesis en gel de agarosa, los fragmentos de restricción separados se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o de nylon. Estos fragmentos de DNA de doble cadena se convierten en primer lugar a secuencias lineales de una cadena. Con el uso de fragmentos marcados de DNA como sonda, es posible iden- tificar los fragmentos de restricción que contienen secuencias (locus) que son homólogos a la sonda por complementación de los fragmentos unidos de una sola cadena (figura 3-4). El análisis de inmunotransferencia de Southern puede ser- vir para detectar polimorfismo de los genes de rRNA, que está Bacterias Arqueobacterias Eucariotas Espiroquetas Gram- positivos Proteobacterias Cianobacterias Planctomyces Bacterias filamentosas verdes Methanosarcina Methanobacterium Methanococcus Thermococcus celer Thermoproteus Bacteroides Cytophaga Thermotoga Aquifex Pyrodicticum Halófilas Mohos de fango Animales Hongos Plantas Ciliados Flagelados Tricomonas Microsporidia Diplomonadas Entamoeba FIGURA 33 Árbol filogenético con base en la información del rARN y que muestra la separación de las familias de bacterias, arqueobacterias y eucariotas. Los grupos de bacterias patógenas mejor conocidas se encuentran en color gris. El único grupo de bacterias patógenas que no se acumula en esta área sombreada es el grupo Bacteroides. presente en todas las bacterias. Como las secuencias ribosómi- cas están muy conservadas, pueden detectarse con una sonda común preparada con las fracciones 16S y 23S de rRNA de una eubacteria (figura 3-6). Muchos microorganismos tienen múltiples copias (cinco a siete) de estos genes, lo que ocasiona patrones con un número suficiente de bandas que ofrezca un buen poder de discriminación; sin embargo, la ribotipificación tiene utilidad limitada para algunos microorganismos, como micobacterias, que tienen una sola copia de estos genes. DESCRIPCIÓN DE LAS PRINCIPALES CATEGORÍAS Y GRUPOS DE BACTERIAS Manual de Bergey de bacteriología sistemática La obra definitiva sobre la organización taxonómica de las bac- terias es la última edición del Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Publicado por primera vez en 1923, este libro cla- sifica en términos taxonómicos, en la forma de clave, las bac- terias conocidas que han sido cultivadas o no, o bien descritas. Otro volumen, el Bergey’s Manual of Determinative Bacterio- logy, ayuda a identificar a las bacterias que han sido descritas y cultivadas. En el cuadro 3-3 se presentan las principales bac- terias que causan enfermedades infecciosas, según el Bergey’s Manual. Es probable que la información que cambia constan- temente acerca de las relaciones filogenéticas genere modifica- ciones ulteriores en la organización de los grupos bacterianos dentro del Bergey’s Manual, es por ello que sus nominaciones se deben considerar como trabajo en progreso. Como ya se describió en el capítulo 2, hay dos grupos de organismos procarióticos: eubacterias y arqueobacterias. Ambos son microorganismos unicelulares pequeños que se multiplican en forma asexual. El término eubacterias se refiere apter 03_Carroll_4R.indd 48 apter 03_Carroll_4R.indd 48 14/04/16 14/04/16
- 62. CAPÍTULO 3 Clasificaciónde las bacterias 49 a las bacterias clásicas, según lo ha considerado la ciencia a lo largo de la historia. Carecen de un núcleo verdadero, poseen lípidos característicos que forman sus membranas, tienen una pared celular de peptidoglucano y una maquinaria para la sín- tesis de proteínas y ácidos nucleicos que se puede inhibir en forma selectiva por medio de antimicrobianos. Por el contra- rio, las arqueobacterias no poseen una pared celular clásica de peptidoglucano y tienen muchas características (p. ej., maqui- naria para la síntesis de proteínas y multiplicación de ácidos nucleicos) que son similares a las de las células eucariotas. Eubacterias A. Eubacterias gramnegativas Este es un grupo heterogéneo de bacterias con una cubierta celular compleja (tipo gramnegativa) que consta de una mem- brana externa, un espacio periplásmico que contiene una capa delgada de peptidoglucano y una membrana citoplásmica. La forma de la célula (figura 3-5) puede ser esférica, ovalada, como bastón recto o curvo, helicoidal o filamentosa; algunas se encuentran recubiertas o encapsuladas. Se reproducen por FIGURA 34 Técnica de inmunotransferencia de Southern que muestra cómo es posible identificar loci específicos en fragmentos divididos de DNA por medio de una sonda de DNA marcado. En esencia, este procedimiento permite distinguir DNA en tres niveles: 1) en el nivel del reconocimiento de enzimas de restricción, 2) por el tamaño del fragmento de DNA y 3) por la hibridación de la sonda de DNA a un locus específico definido por una banda específica en una posición específica de la membrana. Enzimas de restricción Membrana de nailon Sonda de DNA marcado 4) Hibridación de la sonda de DNA marcado con DNA unido a una membrana de nailon 5) Detectar el fragmento marcado Película de detección Gel de agarosa 1) Digestión del DNA con enzimas de restricción 2) Separar los fragmentos por medio de electroforesis en gel de agarosa 3) Transferir los fragmentos separados a una membrana de nailon apter 03_Carroll_4R.indd 49 apter 03_Carroll_4R.indd 49 14/04/16 14/04/16
- 63. CUADRO 33 Categoríasy grupos principales de bacterias patógenas en seres humanos como parte de un esquema de identificación descrito en el Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9a. ed. Manual de Bergey de bacteriología sistemática I. Eubacterias gramnegativas con paredes celulares Grupo 1: Espiroquetas Grupo 2: Bacterias aerobias/microaerófilas, móviles helicoidales/vibroides gramnegativas Grupo 3: Bacterias curvas inmóviles (o rara vez móviles) Grupo 4: Bacilos y cocos gramnegativos aerobios/microaeófilos Grupo 5: Bacilos gramnegativos anaerobios facultativos Grupo 6: Bacilos gramnegativos, anaerobios, rectos, curvos y helicoidales Grupo 7: Bacterias desasimiladoras de sulfato o reductoras de azufre Grupo 8: Cocos gramnegativos anaerobios Grupo 9: Rickettsias y clamidias Grupo 10: Bacterias fotótrofas anoxigénicas Grupo 11: Bacterias fotótrofas oxigénicas Grupo 12: Bacterias aerobias quimiolitótrofas y microorganismos variados Grupo 13: Bacterias con apéndice o yemas Grupo 14: Bacterias envainadas Grupo 15: Bacterias deslizantes no fotosintéticas y no formadoras de grupos fructíferos Grupo 16: Bacterias deslizantes formadoras de grupos fructíferos: mixobacterias Treponema Borrelia Leptospira Campylobacter Helicobacter Spirillum Ninguna Alcaligenes Bordetella Brucella Francisella Legionella Moraxella Neisseria Pseudomonas Rochalimaea Bacteroides (algunas especies) Escherichia (y bacterias coliformes afines) Klebsiella Proteus Providencia Salmonella Shigella Yersinia Vibrio Haemophilus Pasteurella Bacteroides Fusobacterium Prevotella Ninguna Ninguno Rickettsia Coxiella Chlamydia Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Capnocytophaga Ninguna II. Bacterias grampositivas con pared celular Grupo 17: Cocos grampositivos Grupo 18: Bacilos y cocos grampositivos formadores de endosporas Grupo 19: Bacilos grampositivos regulares no formadores de esporas Grupo 20: Bacilos grampositivos irregulares no formadores de esporas Grupo 21: Micobacterias Grupo 22-29: Actinomicetos Enterococcus Peptostreptococcus Staphylococcus Streptococcus Bacillus Clostridium Erysipelothrix Listeria Actinomyces Corynebacterium Mobiluncus Mycobacterium Nocardia Streptomyces Rhodococcus III. Eubacterias sin pared celular: Micoplasmas o Mollicutes Grupo 30: Micoplasmas Mycoplasma Ureaplasma IV. Arqueobacterias Grupo 31: Metanógenos Grupo 32: Arqueorreductores de sulfato Grupo 33: Arqueobacterias excesivamente halófilas Grupo 34: Arqueobacterias sin pared celular Grupo 35: Metabolizadores excesivamente termófilos y metabolizadores de azufre excesivamente termófilos Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno Ninguno 50 apter 03_Carroll_4R.indd 50 apter 03_Carroll_4R.indd 50 14/04/16 14/04/16
- 64. CAPÍTULO 3 Clasificaciónde las bacterias 51 fisión binaria, pero algunos grupos se reproducen por gema- ción. Las mixobacterias forman cuerpos fructíferos y mixospo- ras. Aquellas bacterias que pueden moverse lo hacen por medio de flagelos o por deslizamiento. Los miembros de esta categoría pueden ser fotótrofos o no fotótrofos (capítulo 5) y compren- den especies aerobias, anaerobias, anaerobias facultativas y microaerófilas. B. Eubacterias grampositivas Estas bacterias tienen un perfil de pared celular tipo grampo- sitivo y las células por lo general, pero no siempre, son gram- positivas. La cubierta celular de los organismos grampositivos consta de una pared gruesa que establece la forma de la célula y una membrana citoplásmica. Estas células pueden ser encap- suladas y tener motilidad por medio de flagelos. Las células son esféricas, bacilares o filamentosas; los bastones y filamentos son ramificados o no ramificados y quizá muestren una rami- ficación verdadera. La reproducción se realiza generalmente por fisión binaria. Algunas bacterias de esta categoría produ- cen esporas (p. ej., Bacillus y Clostridium spp.) como formas latentes que son muy resistentes a la desinfección. Las eubac- terias grampositivas por lo general son heterótrofos quimio- sintéticos (capítulo 5) y comprenden especies aerobias, anae- robias y anaerobias facultativas. Los grupos dentro de esta categoría comprenden bacterias asporógenas simples y esporó- genas, así como a los actinomicetos complejos desde el punto de vista estructural y otros microorganismos relacionados. C. Eubacterias sin paredes celulares Estos son microorganismos que carecen de pared celular (a menudo llamados micoplasmas, que forman la clase Molli- cutes) y no sintetizan los precursores del peptidoglucano. Se encuentran encerrados por una membrana unitaria, la mem- brana plasmática (figura 3-6). Son similares a las formas L que son generadas por muchas especies de bacterias (principal- mente eubacterias grampositivas); sin embargo, a diferencia de las formas L, los micoplasmas no cambian a un estado con pared y no existen relaciones antigénicas entre los micoplas- mas y formas L eubacterianas. Seis géneros han sido designados como micoplasmas con base en su hábitat; sin embargo, sólo dos géneros contienen patógenos animales. Los micoplasmas son microorganismos altamente polimorfos cuyo tamaño varía desde vesicular hasta muy pequeño (0.2 μm); son considerados microorganismos filtrables (es decir que son muy pequeñas para ser retenidos por los filtros que atrapan la mayor parte de las bacterias). Se reproducen por gemación, fragmentación o fisión binaria, de manera aislada o en combinación. La mayor parte de las espe- cies necesita un medio complejo para crecer y tiende a formar FIGURA 35 Formas celulares observadas entre las eubacterias. A: Cocos. B: Bastones (bacilos). C: Espirales. (Contraste de fase, 1500×) (Reimpresa con autorización de Stanier RY, Doudoroff M, Adelberg EA: The Microbial World, 3a. ed. Derechos reservados © 1970. Con autorización de Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ. Impresas y reproducidas electrónicamente con autorización de Pearson Education, Inc. Nueva York, Nueva York.) A B C FIGURA 36 Microfotografía electrónica de las células de un miembro del grupo de los micoplasmas, el microorganismo causal de la bronconeumonía en la rata (1960×). (Reimpresa con autorización de Klieneberger-Nobel E, Cuckow FW: A study of organisms of the pleuropneumonia group by electron microscopy. J Gen Microbiol 1955;12:99.) apter 03_Carroll_4R.indd 51 apter 03_Carroll_4R.indd 51 14/04/16 14/04/16
- 65. 52 SECCIÓN IFundamentos de microbiología colonias características con forma de “huevo estrellado” en un medio sólido. Una característica única de los Mollicutes es que algunos géneros necesitan colesterol para crecer; el colesterol no esterificado es un constituyente único de las membranas tanto de las especies de micoplasmas que requieren o no este- roles siempre y cuando éste se encuentre en el medio. Arqueobacterias Estos microorganismos habitan principalmente los ambien- tes terrestres y acuáticos extremos (concentración alta de sal, temperaturas elevadas, ambiente anaerobio) y a menudo se les llama “extremófilas”; algunas son simbiontes en el tubo digestivo de los animales. Las arqueobacterias comprenden microorganismos aerobios, anaerobios y anaerobios faculta- tivos que son quimiolitótrofos, heterótrofos o heterótrofos facultativos. Algunas especies son mesófilas, mientras que otras son capaces de crecer a temperaturas superiores a 100°C. Estas arqueobacterias hipertermófilas están adaptadas para crecer y proliferar a temperaturas altas. Con algunas excepcio- nes, las enzimas aisladas a partir de estos microorganismos son más termoestables que sus contrapartes obtenidas de microor- ganismos mesófilos. Algunas de estas enzimas termoestables, como la DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq polime- rasa), son componentes importantes de los métodos de ampli- ficación del DNA como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). Las arqueobacterias se distinguen de las eubacterias, en parte, por la ausencia de una pared celular de peptidoglucano, poseen lípidos de isoprenoide diéter o diglicerol tetraéter y expresan secuencias características de RNA ribosómico. Asi- mismo, las arqueobacterias comparten algunas características moleculares con las eubacterias (cuadro 3-4). Las células tienen diversas formas incluidas las esféricas, espirales y como placa o bastón; también existen variedades unicelulares o multicelula- res en forma de filamentos o conglomerados. Su multiplicación es por fisión binaria, gemación, constricción, fragmentación o algún otro mecanismo desconocido. MÉTODOS QUE NO REQUIEREN CULTIVO PARA IDENTIFICAR MICROORGANISMOS PATÓGENOS Los intentos por calcular el número total de eubacterias, arqueobacterias y virus resultan infructuosos debido a las difi- cultades para su obtención y aislamiento a partir del ambiente. Como se indicó antes, los cálculos indican que el número de taxones microbianos no cultivados es mucho mayor que el de los microorganismos que se han cultivado. Los cálculos más recientes indican que el número de especies bacterianas en el mundo es de 107 a 109 . Hasta hace poco tiempo, para identificar microorganismos era necesario aislar cultivos puros y luego realizar una serie de pruebas fisiológicas y bioquímicas. Los médicos saben desde hace tiempo que muchas enfermedades son producidas por microorganismos viables que no se pueden cultivar. En la actualidad los científicos usan técnicas como la PCR y rRNA para identificar microorganismos patógenos in situ. La primera fase de este método comprende la extracción del DNA de una muestra, el uso de técnicas moleculares tra- dicionales para obtener una colección de clones, la extracción de información de las secuencias de rRNA y el análisis compa- rativo de las secuencias extraídas. De esta manera se obtiene información sobre la identidad o afinidad de las secuencias frente a las bases de datos existentes. En la segunda fase se debe comprobar que las secuencias provienen de células de la muestra original por medio de hibridación in situ con sondas específicas para ciertas secuencias. Este método se ha utilizado para identificar microorganismos patógenos. Por ejemplo, un microorganismo patógeno que no se había catalogado antes, ahora se identificó como la bacteria con forma de bastón vincu- lada con la enfermedad de Whipple ahora llamada Tropheryma whipplei. Esta técnica de rRNA también se ha utilizado para identificar al agente causante de la angiomatosis bacilar como Bartonella henselae y para demostrar que el patógeno opor- tunista Pneumocystis jiroveci forma parte de la familia de los hongos. Sin duda, ésta y otras técnicas permitirán identificar otros microorganismos patógenos en el futuro. CUADRO 34 Características principales que comparten las arqueobacterias y células eucarióticas y que no existen en las eubacterias Característica Eubacteria Arqueobacterias, eucariotas El factor-2 de elongación (EF-2) contiene al aminoácido diftamida y por lo tanto es ADP- ribosilable por la toxina de la difteria No Sí El metionil tRNA iniciador sin formilación No Sí Algunos genes de tRNA contienen intrones No Sí en eucariotas La síntesis de proteínas es inhibida por anisomicina, pero no por cloranfenicol No Sí Las polimerasas de RNA dependientes de DNA son enzimas con múltiples componentes que son insensibles a los antibióticos rifampicina y estreptomicina No Sí Las polimerasas de RNA dependientes de DNA son enzimas con múltiples componentes insensibles a los antibióticos rifampicina y estreptolidigina No Sí apter 03_Carroll_4R.indd 52 apter 03_Carroll_4R.indd 52 14/04/16 14/04/16
- 66. CAPÍTULO 3 Clasificaciónde las bacterias 53 OBJETIVOS 1. Comprender la importancia fundamental del vocabulario taxonómico para comunicar la ciencia de las enfermedades infecciosas. 2. Conocer las categorías taxonómicas. 3. Reconocer las características de proliferación, bioquímicas y genéticas que se utilizan para clasificar las bacterias. 4. Comprender las diferencias entre las eubacterias, arqueo- bacterias y eucariotas. 5. Familiarizarse con las distintas herramientas utilizadas en la taxonomía basada en ácidos nucleicos. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. Las eubacterias que carecen de paredes celulares y no sintetizan los precursores del peptidoglucano se denominan: (A) Bacterias gramnegativas (B) Virus (C) Micoplasmas (D) Serovariedad (E) Bacilos 2. Las arqueobacterias se distinguen de las eubacterias por su falta de: (A) DNA (B) RNA (C) Ribosomas (D) Peptidoglucano (E) Núcleo 3. Un paciente de 16 años de edad con fibrosis quística es hospita- lizado. El cultivo de su esputo arroja Burkholderia cepacia. Pos- teriormente, aparecen otros dos pacientes con bacteremia por B. cepacia y el microorganismo se cultiva en el esputo de otros cuatro pacientes. Durante este brote hospitalario de B. cepa- cia, se están realizando estudios de subtipificación en 50 mues- tras del ambiente y siete pacientes para identificar el origen del brote. ¿Cuál de las siguientes técnicas sería más útil para esta tarea? (A) Cultivo (B) Ribotipificación (C) Secuencia de rRNA 16S (D) Pruebas de sensibilidad antimicrobiana (E) Secuencia de ácidos nucleicos 4. En las muestras hísticas obtenidas de pacientes con una enferme- dad desconocida, se observa un microorganismo grampositivo que no se puede cultivar. ¿Cuál de las siguientes técnicas sería más útil para identificar al microorganismo? (A) Serología (B) Amplificación con PCR y secuencia de genes de rRNA (C) Electroforesis enzimática de múltiples loci (D) Electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (E) Electroforesis pulsada en gel de campo 5. La DNA polimerasa de Thermus aquaticus es un componente importante de los métodos de amplificación de DNA como la reacción en cadena de polimerasa. Este microorganismo crece a temperaturas mayores de 100°C. Los microorganismos que cre- cen a estas temperaturas se denominan: (A) Mesófilos (B) Psicrófilos (C) Halófilos (D) Termófilos (E) Quimiolitótrofos 6. UnabacteriaconungenomaquetieneuncontenidodeG+Cde45% alberga un plásmido que codifica un gen con contenido de G + C de 55%. ¿A qué conclusiones puede llegarse con esta información? (A) Este gen codifica una peptidiltransferasa de la pared celular (B) Este gen codifica un citocromo bacteriano crítico (C) Este gen codifica un RNA singular de transferencia (D) Este gen codifica un plásmido de polimerasa de DNA depen- diente de RNA (E) Este gen codifica un polisacárido capsular con diversidad antigénica Respuestas BIBLIOGRAFÍA Achtman M, Wagner M: Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat Rev Microbiol 2008;6:431. Brenner DJ, Krieg NR, Staley JT (editors): Part A. Introductory essays. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology: The Proteo- bacteria, vol 2. Springer, 2005. Brenner DJ, Krieg NR, Staley JT (editors): Part B. The gammaproteo- bacteria. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology: The Proteo- bacteria, vol 2. Springer, 2005. Brenner DJ, Krieg NR, Staley JT (editors): Part C. The alpha-, beta-, delta-, and epsilonproteobacteria. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology: The Proteobacteria, vol 3. Springer, 2005. Colwell RR, Grimes DJ (editors): Nonculturable Microorganisms in the Environment. ASM Press, 2000. Curtis TP, Sloan WT, Scannell JW: Estimating prokaryotic diversity and its limits. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:10494. Edman JC, et al.: Ribosomal RNA sequence shows Pneumocystis carinii to be a member of the fungi. Nature (London) 1988;334:519. Fernandez LA: Exploring prokaryotic diversity: There are other molecular worlds. Molec Microbiol 2005;55:5-15. Fredericks DN, Relman DA: Sequence-based identification of micro- bial pathogens: A reconsideration of Koch’s postulates. Clin Microbiol Rev 1996;9:18. Holt JG, et al. (editors): Bergey’s Manual of Determinative Bacteriol- ogy, 9a. ed. Williams & Wilkins, 1994. Medini D, et al.: Microbiology in the post-genomic era. Nat Rev Microbiol 2008;6:429. Mizrahi-Man O, Davenport ER, Gilad Y: Taxonomic classification of bacterial 16S rRNA genes using short sequencing reads: Evalua- tion of effective study designs. PLOS 2013;8:e532608 Persing DH, et al. (editors): Molecular Microbiology. Diagnostic Prin- ciples and Practice. ASM Press, 2004. Riley LW: Molecular Epidemiology of Infectious Diseases. Principles and Practices. ASM Press, 2004. Rosello-Mora R, Amann R: The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiol Rev 2001;25:39. Schloss PD, Handelsman J: Status of the microbial census. Microbiol Molec Biol Rev 2004;68:686. Stringer JR, et al.: A new name (Pneumocystis jiroveci) for Pneumo- cystis from humans. Emerg Infect Dis 2002;8:891. Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ: Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:6578. 1. C 2. D 3. E 4. B 5. D 6. E apter 03_Carroll_4R.indd 53 apter 03_Carroll_4R.indd 53 14/04/16 14/04/16
- 67. apter 03_Carroll_4R.indd 54 apter03_Carroll_4R.indd 54 14/04/16 14/04/16
- 68. 55 4 Crecimiento, supervivencia y muertede microorganismos C A P Í T U L O SUPERVIVENCIA DE MICROORGANISMOS EN UN AMBIENTE NATURAL La población de microorganismos en la biosfera se mantiene casi constante debido a que la muerte de éstos equilibra su cre- cimiento. La supervivencia de cualquier grupo microbiano en un nicho ambiental es influenciada por la exitosa competencia de nutrientes y por el mantenimiento de un acervo de todas las células vivas, a menudo compuesto de células humanas y un conjunto de microorganismos diferentes (conocidos como microbioma o microbiota). Es indispensable comprender la competencia por recursos nutritivos en un ambiente determi- nado para entender el crecimiento, la supervivencia y la muerte de especies bacterianas (un conjunto de conceptos conocidos como fisiología). Gran parte del conocimiento de la fisiología microbiana proviene del estudio de cultivos aislados que crecen en con- diciones óptimas (con exceso de nutrientes) en laboratorios. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos compite en ambientes naturales bajo condiciones de estrés nutricional. Además, una microbiota diferente puede ocupar un nicho microbiano ambiental libre en poco tiempo. Al final, las com- plejas interacciones que garantizan la sobrevivencia de un microbioma específico consisten en un balance entre la dispo- nibilidad de nutrientes y el rendimiento fisiológico. SIGNIFICADO DE CRECIMIENTO El crecimiento es el incremento ordenado de la suma de todos los componentes de un organismo. El aumento de tamaño que resulta cuando una célula absorbe agua o almacena lípi- dos o polisacáridos no es crecimiento real. La multiplicación de células es consecuencia de fisión binaria; ésta incrementa el número de las bacterias individuales que conforman una población, conocida como cultivo. Medición de concentraciones microbianas Las concentraciones microbianas pueden medirse en térmi- nos de la concentración de células (el número de células via- bles por unidad de volumen de cultivo) o de la concentración de biomasa (el peso seco de células por unidad de volumen de cultivo). Estos dos parámetros no siempre son equivalen- tes debido a que el promedio de peso seco de una célula varía en diferentes etapas de un cultivo. Tampoco tienen la misma relevancia: por ejemplo, en estudios de genética e inactivación de microbios, la concentración de células es el parámetro más relevante; en estudios de nutrición o bioquímica microbiana, la concentración de biomasa es la medida más importante. A. Recuento de células viables Por lo general, el recuento de células viables (cuadro 4-1) es la medida de la concentración de células. Para realizarlo, se obtiene 1 ml de una suspensión de bacterias y se realizan dilu- ciones seriales 1:10; después se cultivan alícuotas de 0.1 ml en un medio de agar. Cada bacteria invisible individual (o acumu- lación de bacterias) crecerá para formar una colonia visible que puede contarse (capítulo 5). Para propósitos estadísticos, las placas que contienen entre 30 y 300 colonias proporcionan los datos más precisos. El conteo de la placa × la dilución × 10 dará el número de unidades formadoras de colonias (CFU, colony forming units)/ml en la suspensión bacteriana no diluida. Con este método, las bacterias muertas en la suspensión no contri- buyen al recuento bacteriano final. B. Turbidez Para la mayoría de los propósitos, la turbidez de un cultivo (calculada por medios fotoeléctricos) puede relacionarse con el recuento de células viables utilizando una curva estándar. Como alternativa, en ocasiones es posible realizar un cálculo visual aproximado: por ejemplo, una suspensión poco turbia de Escherichia coli contiene cerca de 107 células/ml, mientras que una suspensión muy turbia incluye cerca de 108 células/ml. La correlación entre la turbidez y el recuento de células viables puede variar durante el crecimiento y la muerte de un cultivo; las células pueden perder viabilidad sin disminuir la turbidez del cultivo. C. Densidad de biomasa En principio, es posible medir la biomasa de forma directa determinando el peso seco de un cultivo microbiano después de que se ha lavado con agua destilada. En la práctica, este pro- cedimiento es complejo y requiere de una curva estándar que correlacione el peso seco con el recuento de células viables. De manera alternativa, la concentración de biomasa puede calcu- larse de manera indirecta al medir un componente celular apter 04_Carroll_4R.indd 55 apter 04_Carroll_4R.indd 55 14/04/16 14/04/16
- 69. 56 SECCIÓN IFundamentos de microbiología importante, como las proteínas, o al determinar el volumen ocupado por células establecidas fuera de la suspensión. CRECIMIENTO EXPONENCIAL Constante de la tasa de crecimiento Las tasa de crecimiento de células ilimitado por nutriente es: la tasa de crecimiento (medida en gramos de biomasa producidos por hora) es el producto del tiempo (t), la constante de la tasa de crecimiento (k) y la concentración de la biomasa B: = t kB dB d (1) El despeje de la ecuación 1 demuestra que la constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cual las células producen más células: = k t Bd dB (2) Una constante de la tasa de crecimiento de 4.3 h−1 , una de las más altas registradas, indica que cada gramo de células pro- duce 4.3 g de células por hora durante este periodo de incre- mento. Organismos que crecen con más lentitud pueden tener constantes de tasas de crecimiento tan bajas como 0.02 h−1 . Con este valor de k, cada gramo de células en el cultivo produce 0.02 g de células por hora. La integración de la ecuación 2 es igual a : = = − B B B B k t t ln 2.3 log ( ) 1 0 10 1 0 1 0 (3) El logaritmo natural del cociente entre B1 (la biomasa en el tiempo 1 [t1 ]) y B0 (la biomasa en el tiempo cero [t0 ]) es igual al producto de la constante de la tasa de crecimiento (k) y la diferencia de tiempo (t1 − t0 ). El crecimiento que obedece a la ecuación (3) se denomina exponencial debido a que la biomasa se incrementa de esta forma respecto al tiempo. Para obtener correlaciones lineales de crecimiento exponencial se debe gra- ficar el logaritmo de la concentración de biomasa (B) como una función del tiempo (t). Cálculo de la constante de la tasa de crecimiento y predicción de la magnitud de crecimiento Las bacterias se reproducen por fisión binaria; el tiempo promedio requerido para que la población, o la biomasa, se duplique se conoce como tiempo de generación o tiempo de duplicación (td ). Por lo general, el td se determina graficando la cantidad de crecimiento en una escala semilogarítmica como una función del tiempo; el tiempo necesario para duplicar la biomasa es el td (figura 4-1). La constante de la tasa de creci- miento puede deducirse a partir del tiempo de duplicación, sustituyendo el valor 2 por B1 /B0 y td por t1 − t0 en la ecuación 3, lo cual es igual a: = = kt k t ln2 ln2 d d (4) Un tiempo de duplicación rápido corresponde a una elevada constante de la tasa de crecimiento. Por ejemplo, un tiempo de duplicación de 10 min (0.17 h) corresponde a valor de k de 4.1 h−1 . Un tiempo de duplicación de 35 h (relativa- mente largo) indica una constante de la tasa de crecimiento de 0.02 h−1 . La constante de la tasa de crecimiento resultante puede utilizarse para calcular la cantidad de crecimiento que ocurrirá en un periodo específico o para prever el tiempo necesario para un crecimiento determinado. El crecimiento en un lapso específico se puede pronosticar con base en el siguiente despeje de la ecuación 3: = − B B k t t log ( ) 2.3 10 1 0 1 0 (5) FIGURA 41 Gráfica de biomasa contra tiempo de duplicación, que muestra el crecimiento exponencial lineal que ocurriría en un sistema cerrado. La biomasa (B) aumenta al doble con cada tiempo de duplicación (td ). td 2td 3td 4td Tiempo de duplicación (td) 1 2 4 Biomasa (B) 8 16 CUADRO 41 Ejemplo de un recuento de células viables Dilución Conteo en placaa Sin diluir Incontable 10−1 Incontable 10−2 510 10−3 72 10−4 6 10−5 1 a Cada recuento es el promedio de tres réplicas. apter 04_Carroll_4R.indd 56 apter 04_Carroll_4R.indd 56 14/04/16 14/04/16
- 70. CAPÍTULO 4 Crecimiento,supervivencia y muerte de microorganismos 57 Es posible determinar el crecimiento que ocurriría si un cultivo con una constante de la tasa de crecimiento de 4.1 h−1 creciera de manera exponencial durante 5 h: = × − B B log 4.1 h 5 h 2.3 10 1 0 1 (6) En este ejemplo, el incremento de la biomasa es 10−9 g; una sola bacteria con un peso seco de 2 × 10−13 g incrementaría a 2 × 10−4 g (0.2 mg) de biomasa, una cantidad que poblaría de forma densa un cultivo de 5 ml. Otras 5 h de crecimiento a esta tasa producirían 200 kg de peso seco de biomasa, o cerca de una tonelada de células. Esto ocurriría si los nutrientes fueran ilimitados, lo cual no sucede en la naturaleza. Otro despeje de la ecuación 3 permite calcular el tiempo necesario para que ocurra una cantidad específica de creci- miento. En la ecuación 7, que se muestra más adelante, N (la concentración de células) se sustituye por B (la concentración de biomasa) para poder calcular el tiempo necesario para un incremento específico del número de células. − = t t N N k 2.3log ( / ) 1 0 10 1 0 (7) Al utilizar la ecuación 7 es posible, por ejemplo, determi- nar el tiempo necesario para que una sola célula de crecimiento lento con una constante de la tasa de crecimiento de 0.02 h−1 forme una suspensión de células poco turbia con una concen- tración de 107 células por mililitro. − = × − t t 2.3 7 0.02 h 1 0 1 (8) El resultado de la ecuación 8 revela que serían necesarias cerca de 800 h (un poco más de un mes) para que ocurriera un crecimiento de dicha magnitud. La supervivencia de orga- nismos de desarrollo lento implica que la carrera por la sobre- vivencia biológica no siempre la ganan los organismos que se reproducen más rápido sino que prosperan las especies que compiten de forma exitosa por los nutrientes y evitan la ani- quilación por predadores y otros riesgos ambientales. CURVA DE CRECIMIENTO EN CULTIVOS DISCONTINUOS Si un volumen fijo de medio líquido se inocula con célu- las microbianas provenientes de un cultivo que ya ha crecido hasta la saturación, y se determina y grafica de forma perió- dica el número de células viables por mililitro, por lo general se obtiene una curva como la que se muestra en la figura 4-2. Las fases de la curva de crecimiento bacteriano que se mues- tran en dicha imagen reflejan los eventos que ocurren en una población de organismos, no en células individuales. Este tipo de cultivo se conoce como cultivo discontinuo. Una curva de crecimiento típica muestra cuatro fases (cuadro 4-2). El cul- tivo discontinuo es un sistema cerrado con recursos finitos, muy diferente al ambiente que se encuentra en un hospedador humano donde los nutrientes se metabolizan por las bacterias FIGURA 42 Gráfica del logaritmo de la concentración de células viables contra el tiempo, donde se observa una curva ideal de crecimiento bacteriano. En la figura se observan las fases de latencia, exponencial, estacionaria y de muerte, con las tasas aproximadas de incremento o disminución que representan lo que se esperaría observar después de inocular una sola colonia bacteriana en un sistema cerrado de cultivo discontinuo. y las células humanas. Sin embargo, comprender cómo ocurre el crecimiento en cultivos discontinuos es fundamental para el estudio de la genética y la fisiología de la replicación bacteriana, incluyendo las fases de latencia, exponencial, estacionaria y de muerte que comprende este proceso. Fase de latencia Durante la fase de latencia, las células (que carecen de metabo- litos y enzimas como resultado de las condiciones desfavora- bles que existieron al final de su cultivo previo) se adaptan a su nuevo ambiente. Las enzimas y sus intermediarios se forman y acumulan hasta que alcanzan concentraciones que permiten reiniciar el crecimiento. A menudo las células que se cultivan en un medio com- pletamente diferente al original son genéticamente incapaces de crecer. En dichos casos puede presentarse un periodo de latencia prolongado, que representa el lapso en el que algunas variantes del inóculo se multiplican lo suficiente para que sea aparente un incremento neto del número de células. Fase exponencial Durante la fase exponencial, las células se encuentran en un estadodeequilibrioycrecensegúnlasecuaciones5a7.Elnuevo material celular se sintetiza a una tasa constante, pero es catalí- tico por sí mismo y la masa incrementa de manera exponencial. Logaritmo de la concentración de células viables Tiempo Fase de muerte o declinación logarítmica Fase estacionaria Fase de crecimiento exponencial Fase de latencia CUADRO 42 Fases de la curva de crecimiento microbiano Fase Tasa de crecimiento De latencia Cero Exponencial Constante Estacionaria máxima Cero De declinación Negativa (muerte) apter 04_Carroll_4R.indd 57 apter 04_Carroll_4R.indd 57 14/04/16 14/04/16
- 71. 58 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Esto continúa hasta que se agotan uno o más nutrientes del medio o hasta que se acumulan productos metabólicos tóxi- cos que inhiben el crecimiento. Para los organismos aerobios, el nutriente limitante por lo general es el oxígeno. Cuando la concentración de células excede casi 1 × 107 /ml, la tasa de cre- cimiento disminuye a menos que se agregue oxígeno al medio mediante agitación o burbujeo de aire. Cuando la concentra- ción bacteriana alcanza 4 a 5 × 109 /ml, la tasa de difusión de oxígeno no puede satisfacer la demanda incluso en un medio ventilado, y el crecimiento se lentifica de forma progresiva. Fase estacionaria Al final, el agotamiento de nutrientes o la acumulación de pro- ductos tóxicos interrumpen por completo el crecimiento. Sin embargo, en la mayoría de los casos el recambio celular ocurre en la fase estacionaria. Hay una pérdida lenta de células que mueren, la cual se balancea por la formación de células nue- vas mediante crecimiento y división. Cuando esto ocurre, la cantidad total de células incrementa con lentitud, aunque el recuento viable permanece constante. Fase de muerte Después de cierto tiempo en la fase estacionaria, la viabilidad de las células comienza a disminuir a una tasa definida. Ésta varía con el tipo de organismo y con las condiciones del cul- tivo; la tasa de muerte incrementa hasta que alcanza un nivel equilibrado. Los aspectos matemáticos de la muerte en estado estable se discuten a continuación. En la mayoría de los casos la tasa de muerte celular es mucho más lenta que la de creci- miento exponencial. Con frecuencia, después de que la mayo- ría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye de forma drástica, de tal manera que un pequeño número de supervivientes puede persistir durante meses e incluso años. Esta persistencia puede en algunos casos reflejar el recambio celular, en el que unas cuantas células crecen a expensas de los nutrientes liberados de las células muertas que presentan lisis. Se cree que un fenómeno de los cultivos bacterianos cono- cido como estado viable pero no cultivable (VBNC, viable but not culturable) es el resultado de una respuesta genética que se activa en células sin nutrientes en fase estacionaria. Justo como algunas bacterias forman esporas como un mecanismo de supervivencia, otras son capaces de permanecer inactivas sin experimentar cambios morfológicos. Cuando hay condiciones apropiadas (p. ej., al pasar a través de un animal), los microbios en estado VNBC reanudan su crecimiento. MANTENIMIENTO DE CÉLULAS EN LA FASE EXPONENCIAL Quimiostato Las células pueden mantenerse en la fase exponencial si se transfieren varias veces a medios frescos idénticos mientras continúan creciendo de forma exponencial. A esto se le conoce como cultivo continuo; el dispositivo más utilizado para rea- lizar este tipo de cultivos es el quimiostato. Este aparato está formado por un recipiente de cultivo equipado con un sifón de decantación y un mecanismo para abastecer medio fresco a un ritmo regulado. El medio en el recipiente de cultivo es agitado por una corriente de aire estéril; cada gota de medio fresco que entra saca una gota de medio del reservorio. El medio se pre- para de tal manera que un nutriente limita el crecimiento. El recipiente se inocula y las células crecen hasta que se termina el nutriente limitante; entonces se permite que el medio fresco fluya al interior a un ritmo tal que permita que las células uti- licen el nutriente limitante tan rápido como es abastecido. En estas condiciones, la concentración de células permanece cons- tante y la tasa de crecimiento es directamente proporcional a la tasa del flujo de medio. El cultivo continuo es similar a las condiciones de los organismos que se encuentran en el mundo real (p. ej., el cuerpo humano), donde los nutrientes limitantes se reemplazan de forma constante. CRECIMIENTO EN BIOPELÍCULAS Ahora se sabe que muchas infecciones se producen por bac- terias que no crecen de manera individual (de forma planctó- nica) y que se desarrollan en comunidades complejas e íntimas. Por ejemplo, es habitual desbridar los dientes todos los días para eliminar la biopelícula bacteriana que se acumula durante el sueño. De manera similar, la formación de biopelículas está relacionada con la presencia de Streptococcus viridians en las válvulas cardiacas, con infecciones pulmonares por Pseudo- monas aeruginosa, con Staphylococcus aureus en catéteres o colonización de Legionella pneumophila en sistemas de agua de hospitales, por mencionar algunos ejemplos. El estudio de la formación de biopelículas bacterianas se ha convertido en un aspecto muy importante de la microbiología médica. Las biopelículas comienzan con una sola bacteria que se incuba en una superficie y que después experimenta fisión bina- ria para formar una íntima comunidad (capítulo 10). Eventual- mente esta entidad bacteriana se rodeará a sí misma con un glucocáliz para protegerse del ambiente y mantenerse intacta. Estos organismos producen moléculas pequeñas, como homo- serina-lactonas, que absorben bacterias adyacentes y que en términos funcionales sirven como un sistema de “telecomu- nicación” entre los integrantes de la colonia. Este sistema le indica a bacterias individuales que activen ciertos genes en un momento específico (percepción de quórum). Estas señales se conocen como sensores de quórum. Con base en lo anterior, es evidente que el crecimiento bacteriano en una biopelícula no es diferente a la evolución social de animales de orden superior. En términos conceptuales, la estrategia de la formación de una biopelícula es lógica. Promueve una mayor diversidad metabólica. Por ejemplo, las bacterias ubicadas en la periferia de la biopelícula pueden tener mayor acceso a oxígeno y otros nutrientes que los organismos del centro. Por otra parte, las células del interior están protegidas de las células inmunita- rias o de los antibióticos. Las bacterias que están íntimamente adheridas pueden transferirse genes de forma eficiente, lo cual genera versatilidad fenotípica en comparación con células planctónicas. Debido a todas estas variables es difícil calcular matemáticamente el crecimiento de una biopelícula, a diferen- cia del crecimiento en el cultivo discontinuo. Esta es un área importante de la microbiología médica que necesita conside- rarse en el amplio contexto de las enfermedades infecciosas. apter 04_Carroll_4R.indd 58 apter 04_Carroll_4R.indd 58 14/04/16 14/04/16
- 72. CAPÍTULO 4 Crecimiento,supervivencia y muerte de microorganismos 59 DEFINICIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE MUERTE Significado de muerte bacteriana Para una célula microbiana, morir significa perder de forma irreversible la capacidad de reproducción (crecimiento y divi- sión). Excepto por los organismos en estado VBMC , la prueba empírica de muerte consiste en realizar un cultivo de células en un medio sólido: se considera que una célula está muerta si no logra originar una colonia en un medio apropiado. Es obvio, entonces, que la confiabilidad de la prueba depende de la elec- ción del medio y de las condiciones. Por ejemplo, 99% de las células de un cultivo podría aparentar estar “muerto” por su incapacidad para formar colonias en un medio, sin embargo los mismos organismos podrían ser 100% viables si se sembra- ran en un medio distinto. Además, en ocasiones es imposible detectar pocas células viables en una muestra clínica grande si ésta se cultiva de forma directa, debido a que el fluido mismo del tejido es capaz de inhibir el crecimiento microbiano. En dichos casos es necesario diluir primero la muestra en un medio líquido, lo cual permite el crecimiento de células viables antes del cultivo. Las condiciones de incubación en la primera hora pos- terior al tratamiento también son cruciales para determinar la muerte. Por ejemplo, si se irradian bacterias con luz ultra- violeta y se colocan de inmediato en cualquier medio, podría parecer que 99.99% de las células ha sido aniquilado. Por otra parte, si primero se incuban dichos organismos en un medio adecuado durante 20 min, el cultivo puede indicar sólo la muerte de 10%. En otras palabras, la irradiación determina que una célula “morirá” si se coloca en una placa de inmediato, pero que vivirá si se le permite reparar el daño antes de ser inoculada. Una célula microbiana que no está dañada física- mente está “muerta” sólo en términos de las condiciones utili- zadas para valorar su viabilidad. Cuantificación de muerte bacteriana Cuando se trata con microorganismos, por lo general no se cuantifica la muerte de una sola célula sino la de una población entera. Este es un problema estadístico: bajo cualquier condi- ción que pueda provocar muerte celular, la probabilidad de que una célula muera es constante por unidad de tiempo. Por ejemplo, si se utiliza un método que provoca la muerte de 90% de las células en los primeros 10 min, la probabilidad de que cualquier célula muera en un intervalo de 10 min es 0.9. Por lo tanto, puede esperarse que 90% de las células supervivientes muera en cada intervalo sucesivo de 10 min, y es posible gene- rar una curva de muerte. El número de células que mueren en cada inervalo de tiempo es entonces una fracción del número de sobrevivientes, de tal manera que la muerte de una pobla- ción ocurre como un proceso exponencial según la siguiente fórmula general: = − S S e kt 0 (9) en que S0 es el número de supervivientes en el tiempo cero y S es el número de supervivientes en cualquier momento posterior t. Como en el caso del crecimiento exponencial, −k representa la tasa de muerte exponencial cuando la fracción ln (S/S0 ) se grafica contra el tiempo. La cinética de la muerte de bacterias también es una fun- ción del número de blancos que se requiere impactar con un antibiótico particular, para eliminar a un microbio planctó- nico específico. Por ejemplo, un solo “impacto” podría tener como objetivo el cromosoma haploide o la membrana celular de una bacteria. En contraste, una célula que contiene muchas copias del objetivo que se quiere inactivar exhibirá una curva de múltiples impactos. Este análisis se muestra de forma grá- fica en la figura 4-3. CONTROL AMBIENTAL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO La naturaleza robusta del crecimiento microbiano descontro- lado está, de forma clara, en conflicto con la vida humana. Las especies de orden superior tienen que controlar el crecimiento de las bacterias para poder coexistir con ellas. El hombre logra esto en un contexto biológico utilizando su sistema inmuni- tario y la limitación de nutrientes. También aplica métodos físicos para evitar la exposición a microorganismos. Términos como esterilización, desinfección, pasteurización y asepsia deben comprenderse de forma precisa para articularlos en un sentido apropiado. En el cuadro 4-3 se enlistan estos términos y sus definiciones. A continuación se describe un ejemplo acerca de la impor- tancia de la comprensión de estos términos. La esterilización es el proceso mediante el cual se eliminan todos los organis- mos, incluyendo las esporas, en una preparación determinada. Entender este concepto es muy importante cuando se habla de instrumentos quirúrgicos debido a que no se desea introdu- cir esporas en incisiones quirúrgicas. En contraste, “desinfec- tar” estos instrumentos puede eliminar las bacterias pero no las esporas. Por otra parte, la “limpieza” física de los instrumentos puede no remover todas las bacterias ni las esporas, sino que sólo disminuye la carga bacteriana biológica en el instrumento. La comprensión de los términos utilizados en el cuadro 4-3 es crucial para controlar el impacto ambiental de los microorga- nismos en el contexto de la salud humana. ESTRATEGIAS PARA CONTROLAR LAS BACTERIAS EN EL AMBIENTE En la microbiología médica a menudo se considera que el control de las bacterias con antibióticos es el tratamiento de referencia para tratar las infecciones humanas. Aunque esto es cierto, la medida principal consiste en evitar la exposición a agentes infecciosos. Por ejemplo, cada año ocurren cerca de 240000 muertes en el mundo por tétanos neonatal. Por otra parte, esta enfermedad es muy rara en países desarrollados. Un factor contribuyente significativo es la incapacidad de “esterili- zar” instrumentos (además de la inmunización corriente de la vacuna contra el tétanos) en muchos países del tercer mundo. Si se utilizaran medidas apropiadas en regiones poco desa- rrolladas, esta enfermedad podría eliminarse. Por lo tanto, es importante comprender los métodos de esterilización, desin- fección y pasteurización, entre otros. Se deben comprender los apter 04_Carroll_4R.indd 59 apter 04_Carroll_4R.indd 59 14/04/16 14/04/16
- 73. 60 SECCIÓN IFundamentos de microbiología mecanismos de acción de las técnicas para combatir infeccio- nes; de esta manera se podrían aplicar en situaciones apropia- das. El cuadro 4-4 presenta una lista no exhaustiva de biocidas que se utilizan de forma habitual. Es importante comprender los términos bacteriostático y bactericida como se definen en el cuadro 4-4. Los mecanismos generales mediante los cuales estos biocidas logran su actividad antimicrobiana se resumen en la siguiente sección. MECANISMOS DE ACCIÓN GENERALES DE LOS BIOCIDAS Disrupción de la pared celular o de la membrana plasmática La membrana celular actúa como una barrera selectiva que permite el paso a algunos solutos e impide el acceso a otros. Muchos compuestos se transportan de forma activa a través de la membrana y se concentran dentro de la célula. En la mem- brana también se alojan enzimas involucradas en la biosíntesis de los componentes de la envoltura celular. Las sustancias que se concentran en la superficie de la célula pueden alterar las propiedades físicas y químicas de su membrana, lo cual impide que el organismo funcione de forma normal, lo que provoca su muerte o inhibición. La pared celular actúa como un corsé (o una red para pes- car) que protege a la célula contra la lisis osmótica. Por lo tanto, agentes que destruyen la pared (p. ej., la lisozima, que rompe los enlaces entre los azúcares de los peptidoglucanos) o impi- den su síntesis normal (p. ej., la penicilina, que interrumpe los enlaces peptídicos) pueden inducir la lisis celular. Desnaturalización de las proteínas Las proteínas existen en un estado plegado tridimensional que se determina en primera instancia por interacciones intramo- leculares no covalentes, tales como puentes iónicos, hidrófobos y de hidrógeno o enlaces covalentes disulfuro. Esta conforma- ción se denomina estructura terciaria. Dicho estado se altera con facilidad por un número de agentes físicos (p. ej., el calor) o químicos (p. ej., el alcohol), los cuales provocan que las proteí- nas pierdan su función. La disrupción de la estructura terciaria de una proteína se llama desnaturalización proteínica. Disrupción de grupos sulfhidrilo libres Las enzimas que contienen cisteína tienen cadenas laterales que terminan en grupos sulfhidrilo. Además, coenzimas como la coenzima A y el dihidrolipoato contienen grupos sulfhidrilo libres. Dichas enzimas y coenzimas no pueden funcionar a menos que los grupos sulfhidrilo permanezcan libres y redu- cidos. En consecuencia, los agentes oxidantes interfieren con el metabolismo al formar enlaces disulfuro entre grupos sulfhi- drilo adyacentes: R —SH HS—R 2H R —S—S—R + − → Muchos metales, como los iones de mercurio, también interfieren al combinarse con los grupos sulfhidrilo. En las FIGURA 43 Curva de muerte de una suspensión con 106 microorganismos viables por mililitro. A: curva de un solo impacto. Esta gráfica es típica de la cinética de inactivación que se observa con muchos antimicrobianos. El hecho de que sea una línea recta desde el tiempo inicial (dosis nula) significa que un solo impacto del antimicrobiano es suficiente para matar a la célula (p. ej., sólo hay que dañar un blanco para inactivar al organismo). B: curva de impactos múltiples. Se observa cuando una célula contiene muchos blancos que inactivar. La línea recta se extrapola hasta 6.5, que corresponde a 4 × 106 células. El número de blancos es, en consecuencia, 4 × 106 o cuatro por célula. 10 0 1 2 3 Log 10 del número de células supervivientes/ml 4 5 6 B 7 20 30 Minutos 40 50 60 10 0 1 2 3 Log 10 del número de células supervivientes/ml 4 5 6 A 20 30 Minutos 40 50 60 apter 04_Carroll_4R.indd 60 apter 04_Carroll_4R.indd 60 14/04/16 14/04/16
- 74. CAPÍTULO 4 Crecimiento,supervivencia y muerte de microorganismos 61 Agente Fórmula Usos Alcoholes Etanol CH3 CHOH Antisepsia, desinfección y preservación Isopropanol CH3 CHOH CH3 Aldehídos Glutaraldehído O CCH2CH2CH2C H H O Desinfección, esterilización y preservación Formaldehído H C O H Biguanidas Clorhexidina N(HCN)2H(CH2)6N(HCN)2H NH NH Cl Cl Antisepsia, actividad contra la formación de placa, preservación y desinfección Bisfenoles Triclosán O Cl Cl OH Cl Antisepsia y actividad contra la formación de placa Hexaclorofeno OH Cl Cl Cl Cl Cl Cl OH CH2 Desodorizante y preservación Agentes liberadores de halógenos Compuestos clorados →OCI-, HOCl, Cl2 Desinfección y antisepsia Compuestos yodados →I2 Derivados de metales pesados Compuestos con plata Ag Preservación y antisepsia Compuestos con mercurio Hg Desinfección Ácidos orgánicos Ácido benzoico COOH Preservación Ácido propiónico CH3 CH2 COOH Sales de sodio o calcio que se utilizan para preservación Peroxígenos Peróxido de hidrógeno H2 O2 Desinfección y esterilización Ozono O3 Ácido peracético CH3 COOOH Fenoles y cresoles Fenol OH Desinfección y preservación Cresol OH CH3 CUADRO 43 Algunos biocidas comunes que se utilizan para antisepsia, desinfección, preservación y otros propósitos (continúa) apter 04_Carroll_4R.indd 61 apter 04_Carroll_4R.indd 61 14/04/16 14/04/16
- 75. 62 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Compuestos de amonio cuaternario R1 N R3 R2 R4 X– + Desinfección, antisepsia y preservación Agente Fórmula Usos Cetrimida H3C CH3 H3C C0H2n+1 N Br + – Desinfección, antisepsia y preservación Cloruro de benzalconio CH2 CH3 H3C C0H2n+1 N Cl + – Fase de vapor Óxido de etileno H2C CH2 O Esterilización y desinfección Formaldehído H H C O Peróxido de hidrógeno H2 O2 CUADRO 43 Algunos biocidas comunes que se utilizan para antisepsia, desinfección, preservación y otros propósitos (continuación) células hay enzimas portadoras de grupos sulfhidrilo y por lo tanto los agentes oxidantes y los metales pesados generan daño. Daño al DNA Un número de agentes físicos y químicos actúan dañando el ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid); entre éstos se encuentran las radiaciones ionizantes, la luz ultravio- leta y las sustancias químicas que reaccionan con el DNA. En la última categoría están los agentes alquilantes y otros com- puestos que reaccionan de manera covalente con las purinas y las pirimidinas para formar compuestos de DNA o enlaces cruzados entre las cadenas. La radiación puede dañar al DNA de muchas maneras; la luz ultravioleta, por ejemplo, induce entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes que permite la formación de dímeros pirimídicos, ya sea en una de las cadenas o entre ambas; las radiaciones ionizantes producen roturas en cadenas individuales o en moléculas bicatenarias. Las lesiones del DNA inducidas por radiaciones o por medios químicos matan a las células en primera instancia al interferir con la replicación del DNA. En el capítulo 7 se revisan los sistemas de reparación del DNA. Antagonismo químico El antagonismo químico ocurre cuando un agente inter- fiere en la reacción normal entre una enzima específica y su sustrato. El agonista actúa al combinarse con alguna parte de la holoenzima (la apoenzima [región proteínica de la holoen- zima], el activador mineral o la coenzima), con lo que se impide la adhesión del sustrato normal. En este caso el término sus- trato se utiliza en sentido general para incluir casos en los que el inhibidor se combina con la apoenzima, impidiendo de esta manera la adhesión a la coenzima. Un antagonista se combina con una enzima gracias a su afinidad química por un sitio esencial en la última. Las enzi- mas realizan su función catalítica por su afinidad a sus sustra- tos naturales; por lo tanto un compuesto que se asemeja a un sustrato en términos estructurales esenciales también puede tener afinidad por la enzima. Si esta afinidad es lo suficien- temente grande, el “análogo” desplazará al sustrato normal e impedirá que ocurra la reacción adecuada. Muchas holoenzimas incluyen un ion mineral que actúa como puente entre la enzima y la coenzima o entre la enzima y el sustrato. Los agentes químicos que se combinan con facili- dad con estos minerales impiden la adhesión de la coenzima o del sustrato (p. ej., el monóxido de carbono y el cianuro se com- binan con el átomo de hierro de las enzimas que contienen gru- pos hemo e impiden su función en el proceso de la respiración). Los antagonistas químicos pueden dividirse en: a) anta- gonistas de procesos generadores de energía y b) antagonistas de procesos biosintéticos. Los primeros incluyen venenos que afectan a enzimas respiratorias (monóxido de carbono y cia- nuro) y la fosforilación oxidativa (dinitrofenol). Los últimos apter 04_Carroll_4R.indd 62 apter 04_Carroll_4R.indd 62 14/04/16 14/04/16
- 76. CAPÍTULO 4 Crecimiento,supervivencia y muerte de microorganismos 63 comprenden a análogos de aminoácidos y de ácidos nucleicos. En algunas situaciones, el análogo sólo evita la incorporación del metabolito normal (p. ej., el 5-metiltriptófano impide la anexión de triptófano en las proteínas) y en otros casos el aná- logo remplaza al metabolito normal en la macromolécula y la inactiva. La incorporación de p-fluorofenilalanina en lugar de fenilalanina en las proteínas es un ejemplo del último tipo de antagonismo. ACCIONES ESPECÍFICAS DE BIOCIDAS SELECTOS En las siguientes secciones se describen importantes agentes físicos y químicos selectos. Métodos físicos A. Calor La aplicación de calor es el medio más simple para esterilizar materiales, dado que estos son resistentes. Una temperatura de 100 °C matará a todas las eubacterias (sin incluir sus esporas) en 2 a 3 min en cultivos de laboratorio; una temperatura de 121 °C durante 15 min matará las esporas. Por lo general, se utiliza vapor porque las bacterias mueren con mayor rapidez cuando se humedecen y debido a que el vapor distribuye el calor en todas las áreas del material a esterilizar. A nivel del mar, el vapor debe conservarse a una presión de 15 lb/pulgada cuadrada (psi, pounds per square inch) sobre la presión atmos- férica para obtener una temperatura de 121 °C; las autoclaves o las ollas de presión se utilizan con estos fines. En altitudes mayores, la presión necesitará ser mayor a 15 psi para alcanzar 121 °C. Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se utilizan hornos eléctricos que hacen circular aire caliente; puesto que el calor es menos efectivo en materiales secos, se acostumbra aplicar una temperatura de 160 a 170 °C durante 1 h o más. Bajo estas condiciones (p. ej., temperaturas excesi- vas aplicadas durante periodos largos), el calor desnaturaliza proteínas y ácidos nucleicos y rompe las membranas celulares. Este tratamiento, si se realiza de forma adecuada, es esporicida. B. Radiación La radiación ultravioleta (UV) con una longitud de onda cer- cana a 260 nm genera dímeros de timidina que impiden la replicación del DNA bacteriano. Por lo general es bactericida pero no esporicida. La radiación ionizante de 1 nm o menos (rayos X o gamma) provoca la formación de radicales libres que dañan proteínas, DNA y lípidos. Estos tratamientos son bactericidas y esporicidas. C. Agentes químicos En el cuadro 4-4 se muestran las estructuras químicas y las aplicaciones de los biocidas; las actividades selectivas de éstos se describen en las siguientes secciones. CUADRO 44 Términos comunes relacionados con el control microbiano Término Definición Esterilización Proceso que destruye o elimina de un objeto o ambiente todas las formas de vida microbiana, incluyendo esporas bacterianas muy resistentes Desinfección Proceso que elimina de un objeto o ambiente gran parte, o la totalidad, de los microorganismos patógenos (excepto esporas bacterianas) Pasteurización Método que consiste en aplicar calor, por lo general a productos lácteos, durante un periodo específico para matar o retrasar el desarrollo de bacterias patógenas Saneamiento Reducción de la presencia de patógenos a niveles inocuos en objetos inanimados para disminuir la probabilidad de infección cruzada Limpieza Remoción de suciedad (p. ej., material orgánico e inorgánico) de objetos y superficies, que se logra por lo general de forma manual o mecánica utilizando agua con detergentes o productos enzimáticos Biocida Agente químico o físico, por lo común de amplio espectro, que inactiva organismos Bactericida Término específico que se refiere a la propiedad mediante la cual un biocida es capaz de matar bacterias. La acción bactericida es irreversible, a diferencia del efecto bacteriostático (p. ej., los organismos que han muerto por exposición a un bactericida ya no pueden reproducirse incluso después de interrumpir el contacto con el agente). En ocasiones la sustancia provoca lisis (disolución) de las células; en otros casos las células permanecen intactas e incluso pueden seguir siendo metabólicamente activas (los términos fungicida, esporicida y viricida se refieren a la capacidad que tienen los biocidas para matar hongos, esporas y virus, respectivamente) Bacteriostático Término específico que se refiere a la propiedad mediante la cual un biocida es capaz de inhibir la multiplicación de las bacterias; al remover el agente, la reproducción reinicia. (Los términos fungistático y esporostático se refieren a los biocidas que inhiben el crecimiento de hongos y esporas, en dicho orden) Séptico Estado que se caracteriza por la presencia de microbios patógenos en tejidos vivos o en fluidos relacionados Aséptico Material libre de microorganismos o método para evitar el crecimiento de patógenos Antiséptico Agente que destruye o inhibe el crecimiento de microorganismos en tejidos vivos o fluidos biológicos Preservativo Sustancia que se agrega a productos alimenticios o a soluciones orgánicas para prevenir cambios químicos o la acción de bacterias Antibiótico Sustancia que interfiere con un paso particular del metabolismo celular; puede ser bactericida o bacteriostático apter 04_Carroll_4R.indd 63 apter 04_Carroll_4R.indd 63 14/04/16 14/04/16
- 77. 64 SECCIÓN IFundamentos de microbiología D. Alcoholes Estos agentes remueven de manera efectiva el agua de los siste- mas biológicos. Por lo tanto, en términos funcionales, actúan como “desecantes líquidos”. El alcohol etílico, el alcohol iso- propílico y el n-propanol tienen un espectro rápido y amplio de actividad antimicrobiana contra bacterias vegetativas, virus y hongos, pero no son esporicidas. Su actividad es óptima cuando se diluyen con agua hasta una concentración de 60 a 90%. Por lo general, esta estrategia terapéutica se considera bactericida pero no esporicida. E. Aldehídos Compuestos como el glutaraldehído o el formaldehído se uti- lizan para desinfectar y esterilizar instrumentos, endoscopios y herramientas quirúrgicas a baja temperatura. Por lo general, se aplican en forma de solución al 2% para lograr una actividad esporicida. Estos compuestos por lo común son bactericidas y esporicidas. F. Biguanidas La clorhexidina se utiliza de forma regular en productos para higiene oral y para el lavado de manos, como desinfectante y preservativo. Estos compuestos son bactericidas pero no espo- ricidas. En general las micobacterias son muy resistentes a estos compuestos, gracias a su envoltura celular cerosa única. G. Bisfenoles Los bisfenoles se utilizan en jabones antisépticos y enjuagues para manos. En general tienen actividad microbicida de amplio espectro pero su efecto es limitado contra Pseudomonas aeru- ginosa y mohos. El triclosán y el hexaclorofeno son bactericidas y esporostáticos (no esporicidas). H. Agentes liberadores de halógenos Los tipos más importantes de agentes liberadores de cloro son el hipoclorito de sodio, el dióxido de cloro y el dicloroisocia- nurato sódico, los cuales son moléculas oxidantes que impiden la actividad celular de las proteínas. El ácido hipocloroso es el compuesto activo responsable del efecto bactericida de estos compuestos. En concentraciones más altas, este grupo es espo- ricida. El yodo (I2 ) es un bactericida y esporicida de acción rápida. Los yodóforos (p. ej., la povidona yodada) son comple- jos de yodo y un agente portador o para disolución, que actúa como reservorio del I2 activo. I. Derivados de metales pesados La sulfadiazina de plata (Ag+ ) (una combinación de dos agentes bactericidas, Ag+ y sulfadiazina) tiene un espectro de actividad amplio. La unión a componentes celulares como el DNA es res- ponsable de sus propiedades inhibitorias. Estos compuestos no son esporicidas. J. Ácidos orgánicos Los ácidos orgánicos se usan como conservadores en las indus- trias farmacéutica y alimentaria. El ácido benzoico es fungis- tático, mientras que el ácido propiónico es bacteriostático y fungistático. Ninguno es esporicida. K. Peroxígenos El peróxido de hidrógeno (H2 O2 ) tiene una actividad de amplio espectro contra virus, bacterias, levaduras y esporas bacte- rianas. La actividad esporicida requiere de concentraciones mayores (de 10 a 30%) de H2 O2 y un tiempo de contacto más prolongado. L. Fenoles El fenol y los compuestos fenólicos tienen propiedades anti- sépticas, desinfectantes o preservativas. En general, no son esporicidas. M. Compuestos de amonio cuaternario Estos compuestos tienen dos regiones en sus estructuras mo- leculares, un grupo que repele el agua (hidrófobo) y otro que es afín a ésta (hidrófilo). Los detergentes catiónicos, como los compuestos de amonio cuaternario (QAC, quaternary ammo- nium compounds), son antisépticos y desinfectantes eficientes. Los QAC se utilizan para una gran variedad de propósitos clí- nicos (p. ej., para desinfectar la piel antes de una intervención quirúrgica) y para limpiar superficies duras. Son esporostáti- cos; inhiben el crecimiento de esporas pero no el proceso de germinación. Los QAC actúan sobre virus con envoltura, pero no afectan a los que carecen de ella. En general, estos compues- tos no son esporicidas. N. Esterilizadores con fase de vapor Los dispositivos médicos y los instrumentos quirúrgicos sensi- bles al calor pueden esterilizarse de manera efectiva empleando sistemas con fase de vapor que utilizan óxido de etileno, for- maldehído, peróxido de hidrógeno o ácido peracético. Éstos son esporicidas. RELACIÓN ENTRE LA CONCENTRACIÓN DE BIOCIDA Y EL TIEMPO DE EXPOSICIÓN EN LA ELIMINACIÓN DE MICROBIOS Cuando se utilizan los biocidas antes descritos para eliminar poblaciones microbianas, hay que considerar las variables de tiempo y concentración. A menudo se observa que la concen- tración de la sustancia utilizada está relacionada con el tiempo requerido para matar una fracción determinada de la pobla- ción, lo cual corresponde a la siguiente expresión: = C t K n (10) En esta ecuación, C es la concentración de biocida, t es el tiempo necesario para matar a una fracción determinada de las células y n y K son constantes. Con base en esta ecuación se concluye, por ejemplo, que si un desinfectante tiene un valor de n = 6 (como en el caso del fenol), duplicar la concentración del agente reducirá 64 veces el tiempo necesario para lograr la misma extensión de inac- tivación. El hecho de que la eficacia de un biocida varíe con la concentración a la sexta potencia sugiere que son necesarias apter 04_Carroll_4R.indd 64 apter 04_Carroll_4R.indd 64 14/04/16 14/04/16
- 78. CAPÍTULO 4 Crecimiento,supervivencia y muerte de microorganismos 65 seis moléculas del agente para inactivar a una célula, aunque no hay evidencia química directa que sustente esta conclusión. Para determinar el valor de n de cualquier biocida hay que realizar curvas de inactivación individuales para muchas con- centraciones. De esta manera se determina el tiempo requerido para inactivar una fracción fija de la población con cada con- centración. Por ejemplo, supóngase que C1 es la primera concentración y t1 es el tiempo necesario para inactivar a 99% de las células de una población. De manera similar, asúmase que C2 y t2 son la segunda concentración y el tiempo requerido para lograr el mismo efecto (respectivamente). Utilizando la ecuación 10, se observa que: = C t C t n n 1 1 2 2 (11) Si se despeja n se obtiene: = − − n t t C C log log log log 2 1 1 2 (12) Por lo tanto, n puede determinarse midiendo la pendiente de la línea que resulta cuando se grafica el logaritmo de t contra el logaritmo de C (figura 4-4). Si el valor de n se obtiene de esta manera, K puede determinarse sustituyendo los valores obser- vados para C t, y n en la ecuación 10. Reversión de la actividad de los biocidas Además de la cinética dependiente del tiempo y de la concen- tración, otro aspecto importante de la actividad biocida es la capacidad de revertir el efecto antimicrobiano. En el cuadro 4-5 se resumen los mecanismos que pueden revertir la actividad de 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 Pendiente = n 2.4 1.00 1.10 1.20 Log10 de la concentración (C) (en partes por 1000) Log 10 del tiempo (t) (en minutos) 1.30 los biocidas. Éstos incluyen la remoción del agente, competi- ción por el sustrato y la inactivación del biocida. La neutrali- zación de estas sustancias debe considerarse como parte de la estrategia de esterilización/desinfección. RESUMEN DEL CAPÍTULO Apreciar el crecimiento y la muerte de las bacterias es funda- mental para entender la interacción compleja que existe entre bacterias patógenas y sus hospedadores. Si un sistema inmu- nitario intacto y la limitación de nutrientes no restringen el crecimiento logarítmico de las bacterias, éstas vencerán con rapidez al hospedador en la lucha por el alimento. El control ambiental del crecimiento microbiano con biocidas limita la exposición a microorganismos potencialmente patógenos. Los métodos de esterilización, desinfección y pasteurización, entre otros, son fundamentales en el control de bacterias y en conse- cuencia para preservar la salud humana. Al final, comprender el crecimiento y la muerte microbianos es el primer paso hacia el control efectivo de las enfermedades infecciosas. VERIFICACIÓN DE CONCEPTOS 1. En los seres humanos, las bacterias se encuentran como biosistemas complejos conocidos como microbiota. 2. Para cuantificar células bacterianas se utilizan el recuento de células viables, la turbidez y la biomasa. 3. La biomasa y el tiempo de generación están relacionados de forma matemática. FIGURA 44 Relación entre la concentración de biocida (C) y el tiempo (t) necesario para matar una fracción determinada de una población de células. CUADRO 45 Ejemplos de mecanismos capaces de revertir la actividad de los biocidas Mecanismo Ejemplo Remoción del agente Cuando se separan células inhibidas de un agente bacteriostático mediante lavado o centrifugación, éstas se vuelven a multiplicar de manera normal. Competencia por los sustratos Cuando un antagonista químico de tipo análogo se une de forma reversible a una enzima, es posible desplazarlo agregando una concentración elevada del sustrato normal. A esto se le llama inhibición competitiva. La proporción entre la concentración del inhibidor y la concentración del sustrato que revierte la inhibición se denomina índice microbiano; por lo general es muy alto (100-10000), lo cual indica una afinidad mucho mayor de la enzima por el análogo que por su sustrato normal. Inactivación del agente A menudo es posible inactivar un agente agregando al medio una sustancia que se combine con él, impidiendo así su combinación con constituyentes celulares. Por ejemplo, los iones de mercurio se pueden inactivar agregando al medio compuestos con grupos sulfhidrilo, como el ácido tioglicólico. apter 04_Carroll_4R.indd 65 apter 04_Carroll_4R.indd 65 14/04/16 14/04/16
- 79. 66 SECCIÓN IFundamentos de microbiología 4. Inocular una sola colonia bacteriana en un volumen fijo de medio líquido se conoce como cultivo discontinuo. En este sistema, el crecimiento bacteriano exhibe cuatro fases (de latencia, exponencial, estacionaria y de muerte). 5. Algunas bacterias existen en un estado que se define como viable pero no cultivable. 6. El crecimiento en cultivo continuo o en forma de biope- lícula se asemeja más al crecimiento bacteriano dentro de un hospedador humano. 7. La esterilización, la desinfección y la pasteurización, así como otros términos (cuadro 4-3), son esenciales para comprender y comunicar la ciencia de la microbiología. 8. Es importante entender y conocer las estructuras gene- rales y los mecanismos de acción de los biocidas (cuadro 4-4). 9. Dependiendo de los mecanismos de acción, biocidas dife- rentes son bacteriostáticos, bactericidas o esporicidas. 10. La actividad biocida depende del tiempo y de la concentra- ción. Este efecto puede revertirse por remoción del agente, competencia por los sustratos e inactivación del biocida. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. Una mujer de 23 años de edad tiene 10 bacterias Escherichia coli inoculadas en la vejiga por tener relaciones sexuales. El tiempo de generación de este organismo es de 20 min. Después de un periodo de latencia de 20 min, las bacterias entran a la fase loga- rítmica de crecimiento. Después de 3 h de crecimiento logarít- mico, el número total de células es: (A) 2560 (B) 5012 (C) 90 (D) 1028 (E) 1000000 2. Una mujer de 73 años de edad está hospitalizada para tratamiento intravenoso de un absceso causado por Staphylococcus aureus. Después de ser tratada y dada de alta del hospital, es necesario desinfectar el cuarto. Mil células de S. aureus son expuestas al de- sinfectante. Después de 10 min, 90% de las células es eliminado. ¿Cuántos organismos continúan siendo viables después de 20 min? (A) 500 (B) 100 (C) 10 (D) 1 (E) 0 3. ¿La acción de cuál de los siguientes antibióticos o qué procesos pueden revertirse en bacterias que no forman esporas? (A) Un desinfectante (B) Un agente bactericida (C) Un agente bacteriostático (D) Esterilización en autoclave a 121 °C durante 15 min (E) Aplicación de calor seco a una temperatura de 160 a 170 °C durante 1 h 4. La tasa de crecimiento bacteriano durante la fase exponencial de crecimiento (A) Es igual a cero (B) Incrementa (C) Es constante (D) Disminuye (E) Es negativa 5. Un médico obtiene una muestra de esputo de un paciente con tuberculosis. La muestra contiene una célula viable de Mycobac- terium tuberculosis, un organismo con un tiempo de duplicación (lento) in vitro de 48 h que corresponde a una constante de la tasa de crecimiento in vitro (κ) de 0.04 h−1 . Calculando que la bio- masa de este único organismo es 2.3 × 10−13 g y asumiendo que esta célula entra de inmediato a la fase de crecimiento logarít- mico, ¿cuántas horas se necesitarán para que produzca 10−6 g de biomasa? (A) 4 h (B) 40 h (C) 400 h (D) 4000 h (E) 40000 h 6. Una muestra de leche pasteurizada de cabra se cultiva para identi- ficar la presencia de Brucella melitensis, un organismo que se sabe que infectó animales en una granja adyacente. Se declara que el consumo de esta leche es inocuo; sin embargo, algunas de las per- sonas que la ingirieron desarrollaron brucelosis. ¿Cuál de las siguientes opciones explica de manera más precisa la disparidad entre los resultados del cultivo y la enfermedad de los pacientes? (A) Las bacterias de la leche eran viables pero no cultivables (B) Pasteurización incompleta de la leche (C) Los organismos de la leche se encontraban en la fase de latencia cuando se hizo el examen (D) La leche tenía un nivel elevado de un antibiótico bactericida cuando se analizó (E) Hubo contaminación de la leche después de la prueba 7. Un médico misionero al trabajar en áreas rurales de India roció el ombligo de un recién nacido con una solución, con la estruc- tura química de la figura que se muestra abajo, para evitar una infección de tétanos. ¿A qué clase de agente químico pertenece esta estructura? R1 N R3 R2 R4 X– + (A) Alcohol (B) Aldehído (C) Bisfenol (D) Peroxígeno (E) Amonio cuaternario 8. Para esterilizar algunos instrumentos quirúrgicos ¿cuál de los siguientes agentes debería utilizarse? (A) Ácido benzoico (2%) (B) Alcohol isopropílico (2%) (C) Glutaraldehído (2%) (D) Peróxido de hidrógeno (2%) (E) Compuesto de amonio cuaternario (2%) 9. La tasa de crecimiento bacteriano durante la fase estacionaria máxima de crecimiento (A) Es igual a cero (B) Incrementa (C) Es constante (D) Disminuye (E) Es negativa apter 04_Carroll_4R.indd 66 apter 04_Carroll_4R.indd 66 14/04/16 14/04/16
- 80. CAPÍTULO 4 Crecimiento,supervivencia y muerte de microorganismos 67 10. Los agentes químicos pueden interferir con la reacción normal entre una enzima específica y su sustrato (antagonismo químico). ¿Cuál de las siguientes moléculas inhibe los procesos celulares generadores de energía? (A) 5-metiltriptófano (B) Cianuro (C) Peróxido de hidrógeno (D) Etanol (E) Lisozima 11. ¿Cuál de los siguientes organismos es el más resistente a la des- trucción por agentes químicos y calor? (A) Esporas de Aspergillus fumigatus (B) Mycobacterium tuberculosis (C) El virus del Ébola (D) Escherichia coli (E) Esporas de Bacillus anthracis Respuestas 1. A 2. C 3. C 4. C 5. C 6. A 7. E 8. C 9. A 10. B 11. E BIBLIOGRAFÍA Barcina I, Arana I: The viable but nonculturable phenotype: a cross- roads in the life-cycle of non-differentiating bacteria? Rev Envi- ron Sci Biotechnol 2009;8:245-255. Block SS (editor): Disinfection, Sterilization, and Preservation, 5a. ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Colwell RR, Grimes DJ (editors): Nonculturable Microorganisms in the Environment. American Society for Microbiology Press, 2000. Gerhardt P, et al. (editors): Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology, 1981. Hans-Curt F, Jost W: The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol 2010;8:623-633. McDonnell GE: Antisepsis, Disinfection, and Sterilization: Types, Action, and Resistance. American Society for Microbiology Press, 2007. McDonnell G, Russell AD: Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance. Clin Microbiol Rev 1999;12:147. Russell AD, Hugo WB, Ayliffe GAJ (editors): Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, 3a. ed. Blackwell Scientific Publications, 1999. Rutala WA, Weber DJ, Health Care Practices Advisory Committee: Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facili- ties, 2008. Centers for Disease Control and Prevention, 2008. http://www.cdc.gov/hicpac/Disinfection_Sterilization/acknowl- edg.html Siegels DA, Kolter R: Life after log. J Bacteriol 1992;174:345. apter 04_Carroll_4R.indd 67 apter 04_Carroll_4R.indd 67 14/04/16 14/04/16
- 81. apter 04_Carroll_4R.indd 68 apter04_Carroll_4R.indd 68 14/04/16 14/04/16
- 82. 69 5 Cultivo de microorganismos CA P Í T U L O El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno apropiado. Los microorganismos en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan los elementos presentes en su composición química. Los nutrien- tes deben proporcionar estos elementos en una forma que sea accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a través de sus membranas. Los factores que deben controlarse durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura, aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio. NECESIDADES PARA EL CRECIMIENTO La mayor parte del peso seco de los microorganismos es mate- ria orgánica que contiene elementos como carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre. Además, se necesitan iones inorgánicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcio y clo- ruro para facilitar los procesos enzimáticos y mantener los gra- dientes químicos a través de la membrana celular. En su mayor parte, la materia orgánica consiste en macro- moléculas formadas por enlaces anhidro entre los bloques de construcción. La síntesis de enlaces anhidro requiere energía química, que es proporcionada por dos enlaces fosfodiéster contenidos en el trifosfato de adenosina (ATP, adenosine tri- phosphate [capítulo 6]). La energía adicional necesaria para mantener la composición citoplásmica relativamente constante durante la proliferación se deriva de la fuerza motriz protó- nica, que consiste en energía potencial que puede derivarse del paso de protones a través de una membrana. En células euca- riotas, la membrana puede ser parte de las mitocondrias o de los cloroplastos. En células procariotas, la membrana corres- ponde a la membrana citoplásmica de la célula. La fuerza motriz protónica es un gradiente electroquímico con dos componentes: una diferencia en pH (concentración de iones de hidrógeno) y diferencia en la carga iónica. La carga en el exterior de la membrana bacteriana es más positiva que en el interior, y la diferencia en las cargas contribuye a la liberación de energía libre cuando un protón entra al cito- plasma desde fuera de la membrana. El proceso metabólico que genera la fuerza motriz protónica se revisa en el capítulo 6. La energía libre puede utilizarse para el desplazamiento de la célula, para mantener los gradientes iónicos o moleculares a través de la membrana, para sintetizar enlaces anhidro en el ATP o para diversos propósitos combinados. Asimismo, la célula puede utilizar una fuente de ATP con sus enlaces anhi- dro de energía para crear una fuerza motriz protónica que a su vez puede utilizarse para desplazar la célula y conservar los gradientes químicos. Para su desarrollo, un microorganismo requiere todos los elementos en su materia orgánica y cantidades adecuadas de iones para la producción de energía y reacciones catalíticas. Además, debe haber una fuente de energía para establecer la fuerza motriz protónica y permitir la síntesis de macromo- léculas. Los microorganismos varían de manera amplia en sus demandas nutricionales y sus fuentes de energía metabólica. FUENTES DE ENERGÍA METABÓLICA Los tres mecanismos principales para la generación de energía metabólica son fermentación, respiración y fotosíntesis. Para el desarrollo del microorganismo debe utilizarse al menos uno de estos mecanismos. Fermentación La formación de ATP en la fermentación no se acopla con la transferencia de electrones. La fermentación se caracteriza por la fosforilación del sustrato, un proceso enzimático en el cual los enlaces de pirofosfato se donan directamente al difosfato de adenosina (ADP, adenosine diphosphate) por un intermediario metabólico fosforilado. El intermediario fosforilado se forma por procesos metabólicos de sustrato susceptibles de fermenta- ción como la glucosa, lactosa o arginina. La fermentación no se acompaña de cambios en el estado general de oxidación-reduc- ción del sustrato fermentable y por lo tanto la composición ele- mentaldelosproductosdefermentacióndebeseridénticaalade los sustratos. Por ejemplo, la fermentación de una molécula de glucosa (C6 H12 O6 ) por la vía de Embden-Meyerhof (capítu- lo 6) produce una ganancia neta de dos enlaces de pirofosfato en el ATP y produce dos moléculas de ácido láctico (C3 H6 O3 ). Respiración La respiración es análoga a los procesos de acoplamiento dependientes de energía para descargar una batería. La reduc- ción química de un oxidante (aceptor de electrones) a través de una serie específica de transportadores de electrones en la membrana establece la fuerza motriz protónica a través de la membrana bacteriana. El reductor (donador de electrones) puede ser un compuesto orgánico o inorgánico (p. ej., el ácido láctico actúa como reductor en algunos microorganismos, en tanto que el gas hidrógeno es reductor para otros). A menudo se utiliza oxígeno gaseoso (O2 ) como oxidante, pero algunos apter 05_Carroll_4R.indd 69 apter 05_Carroll_4R.indd 69 14/04/16 14/04/16
- 83. 70 SECCIÓN IFundamentos de microbiología microorganismos pueden utilizar oxidantes alternativos como dióxido de carbono (CO2 ), sulfato (SO4 2− ) y nitrato (NO3 − ). Fotosíntesis La fotosíntesis es similar a la respiración en el sentido de que la reducción de un oxidante a través de una serie específica de transportadores de electrones establece una fuerza motriz pro- tónica. La diferencia en los dos procesos consiste en que en la fotosíntesis se crean el reductor y el oxidante por técnicas foto- químicas por medio de energía luminosa absorbida por los pig- mentos en la membrana; así, la fotosíntesis continúa en tanto exista una fuente de energía luminosa. Las plantas y algunas bacterias son capaces de invertir cantidades sustanciales de energía luminosa para hacer del agua un reductor para el dió- xido de carbono. El oxígeno participa en este proceso y se pro- duce materia orgánica. La respiración, la oxidación favorable desde el punto de vista energético de la materia orgánica por un aceptor de electrones como el oxígeno, puede proporcionar a los microorganismos con capacidad de fotosíntesis energía en ausencia de una fuente luminosa. NUTRICIÓN La nutrición en medios de cultivo debe contener todos los elementos necesarios para la síntesis biológica de un nuevo microorganismo. En los siguientes párrafos, se muestra una clasificación de los nutrientes con base en los elementos que proporcionan. Fuentes de carbono Como se mencionó antes, las plantas y algunas bacterias son capaces de utilizar energía de fotosíntesis para reducir el dió- xido de carbono a expensas del agua. Estos microorganismos pertenecen al grupo de microorganismos autótrofos, seres vivos que no necesitan nutrientes orgánicos para su desarrollo. Otros microorganismos autótrofos son los quimiolitótrofos, que utilizan sustratos inorgánicos como hidrógeno y tiosulfato como reductor y dióxido de carbono como fuente de carbono. Los microorganismos heterótrofos requieren carbono orgánico para su desarrollo; éste debe encontrarse en una forma que puedan asimilar. Por ejemplo, el naftaleno propor- ciona todo el carbón y energía necesarios para el desarrollo demicroorganismosheterótrofosrespiratorios,peromuypocos microorganismos poseen la vía metabólica necesaria para la asimilación de naftaleno. Por otra parte, la glucosa puede sustentar el desarrollo mediante procesos de respiración o fer- mentación en muchos microorganismos. Es importante que los sustratos de crecimiento se suministren a niveles apropia- dos para la cepa microbiana que se está cultivando: las con- centraciones que sostienen el desarrollo del microorganismo pueden inhibir el desarrollo de otro. El dióxido de carbono es necesario para varias reacciones biosintéticas. Muchos microorganismos respiratorios produ- cen más del dióxido de carbono necesario para satisfacer sus necesidades, en tanto que otros requieren fuentes de dióxido de carbono en su medio de cultivo. Fuentes de nitrógeno El nitrógeno es un constituyente importante de las proteí- nas, ácidos nucleicos y otros compuestos, y constituye casi 5% del peso seco de una bacteria típica. El nitrógeno inorgánico molecular (N2 ), es muy prevalente pues constituye casi 80% de la atmósfera terrestre. Es un compuesto muy estable, princi- palmente porque se requieren altas cantidades de energía de activación para romper su triple enlace entre ambos átomos de nitrógeno. Sin embargo, éste puede proporcionarse en diver- sas formas y los microorganismos varían en cuanto a su capaci- dad para asimilarlo (cuadro 5-1). El producto terminal de todas las vías para la asimilación de nitrógeno es la forma más redu- cida del elemento, el amoniaco (NH3 ). Cuando se cuenta con NH3 , se difunde hacia el interior de la mayor parte de las bac- terias a través de conductos transmembrana como gas disuelto NH3 + en lugar de formar ion amonio (NH4 + ). La capacidad de asimilar N2 en forma reducida como NH3 , proceso denominado fijación de nitrógeno, es una propiedad singular de las células procariotas y muy pocas bacterias son capaces de desdoblar el triple enlace entre ambos átomos de nitrógeno. Este proceso (capítulo 6) necesita grandes cantida- des de energía metabólica y se desactiva con facilidad por el oxígeno. La capacidad de fijación de nitrógeno se encuentra en bacterias muy divergentes que han evolucionado con estrate- gias bioquímicas bastante diferentes para proteger sus enzimas fijadoras de nitrógeno de la exposición con el oxígeno. La mayor parte de los microorganismos pueden utilizar NH3 como única fuente de nitrógeno; muchos microorganis- mos poseen la capacidad de producir NH3 a partir de aminas (R—NH2 ) o a partir de aminoácidos (RCHNH2 COOH), por lo común en el interior de la célula. La producción de NH3 por desaminación de aminoácidos se denomina amonificación. El amoniaco se introduce en la materia orgánica por vías bio- químicas que incluyen al glutamato y glutamina. Estas vías se revisan en el capítulo 6. Muchos microorganismos poseen la capacidad de asimilar nitrato (NO3 − ) y nitrito (NO2 − ) mediante la conversión de estos iones en NH3 . Tales procesos se conocen como reducción de nitratos por asimilación y reducción de nitritos por asimila- ción, de manera respectiva. Estas vías para la asimilación difie- ren de las vías utilizadas para catabolizar nitratos y nitritos. Las vías catabólicas utilizadas por microorganismos emplean estos iones como aceptores terminales de electrones en la respiración. Algunas bacterias autótrofas (p. ej., Nitrosomonas, Nitrobac- ter) son capaces de convertir NH3 a N2 gaseoso bajo condicio- nes anaerobias; este proceso se conoce como desnitrificación. CUADRO 51 Fuentes de nitrógeno en la nutrición microbiana Compuesto Valencia del nitrógeno NO3 − +5 NO2 − +3 N2 0 NH4 + −3 R-NH2 a −3 a R, radical orgánico. apter 05_Carroll_4R.indd 70 apter 05_Carroll_4R.indd 70 14/04/16 14/04/16
- 84. CAPÍTULO 5 Cultivode microorganismos 71 Continúa en evolución la comprensión del ciclo del nitrógeno. A mediados del decenio de 1990 se descubrió la reacción de oxi- dación anaerobia del ion amonio (anammox). La reacción + → + + − NH NO N 2H O 4 2 2 2 en la cual un nitrito oxida al amoniaco, es un proceso micro- biano que ocurre en aguas anóxicas en el océano y es la princi- pal vía por la cual regresa el nitrógeno hacia la atmósfera. Fuentes de azufre Al igual que el nitrógeno, el azufre es un componente de muchas sustancias orgánicas de las células. Forma parte de la estructura de varias coenzimas y se encuentra en las cadenas laterales de cisteinil y metionil de las proteínas. Las plantas o animales no pueden utilizar el azufre en su forma elemental. Sin embargo, algunas bacterias autótrofas pueden oxidarse a su forma de sulfato (SO4 2− ). La mayor parte de los microorganismos pue- den utilizar sulfato como fuente de azufre, al reducir el sulfato al nivel de ácido sulfhídrico (H2 S). Algunos microorganismos pueden asimilar H2 S de manera directa del medio de cultivo, pero este compuesto puede ser tóxico para muchos de ellos. Fuentes de fósforo El fosfato (PO4 3- ) es necesario como componente del ATP, ácidos nucleicos y coenzimas como NAD, NADP y flavinas. Además, muchos metabolitos, lípidos (fosfolípidos, lípido A), componentes de las paredes celulares (ácido teicoico), algunos polisacáridos capsulares y algunas proteínas sufren fosforila- ción. El fosfato siempre se asimila en forma de fosfato inorgá- nico libre (Pi ). Fuentes de minerales Se necesitan numerosos minerales para la función de las enzi- mas. El magnesio (Mg2+ ) y el ion ferroso (Fe2+ ) también se encuentran en derivados de porfirina: el magnesio en las mo- léculas de clorofila, el hierro como parte de las coenzimas de los citocromos y peroxidasas. Mg2+ y K+ son esenciales para la función e integridad de los ribosomas. El calcio es necesario como constituyente de las paredes celulares de bacterias gram- positivas, aunque es indispensable para las bacterias gramne- gativas. Muchos microorganismos marinos requieren Na+ para su desarrollo. Durante la elaboración de un medio para el cul- tivo de la mayor parte de los microorganismos, es necesario proporcionar fuentes de potasio, magnesio, calcio y hierro, por lo general en sus formas iónicas (K+ , Mg2+ , Ca2+ y Fe2+ ). Son necesarios muchos otros minerales (p. ej., Mn2+ , Mo2+ , Co2+ , Cu2+ y Zn2+ ); éstos con frecuencia pueden suministrarse en agua corriente o como contaminantes de otros ingredientes de los medios de cultivo. La captación de hierro, que forma hidróxidos insolubles a pH neutro, es facilitada en muchas bacterias y hongos por la producción de sideróforos, compuestos que tienen la capa- cidad de generar y favorecer su transporte en forma de com- plejo soluble. Esto incluye a los hidroxamatos (−CONH2 OH) conocidos como sideraminas y derivados de catecoles (p. ej., 2,3-dihidroxibenzoilserina). Los sideróforos determinados por plásmidos desempeñan una función importante en la capacidad de invasión de algunos patógenos bacterianos (capítulo 7). Los mecanismos de captación de hierro dependientes de sideróforos y de no sideróforos por las bacterias se revisan en el capítulo 9. Factores de crecimiento Un factor de crecimiento es un compuesto orgánico que debe contener la célula a fin de desarrollarse, pero que es incapaz de sintetizar. Muchos microorganismos que reciben los nutrien- tes mencionados antes son capaces de sintetizar todos los bloques para la construcción de macromoléculas (figura 5-1); estos nutrientes incluyen aminoácidos, purinas, pirimidinas y pentosas (precursores metabólicos de ácidos nucleicos); car- bohidratos adicionales (precursores de polisacáridos) y ácidos grasos y compuestos isoprenoides. Además, los microorganis- mos de vida libre deben ser capaces de sintetizar complejos vitamínicos que actúan como precursores de coenzimas. Cada uno de estos compuestos esenciales se sintetiza por una secuencia de reacciones enzimáticas; cada enzima se pro- duce bajo el control de un gen específico. Cuando un microor- ganismo sufre una mutación genética que da origen a la falla en una de estas funciones enzimáticas, la cadena se rompe y ya no se elabora el producto terminal. El microorganismo debe obte- ner el compuesto de su entorno: el compuesto se transforma en un factor de crecimiento para el microorganismo. Este tipo de mutación puede inducirse con facilidad en el laboratorio. Diferentes especies microbianas varían de forma amplia en cuanto a sus necesidades de factores de crecimiento. Los compuestos involucrados se encuentran y son esenciales en todos los microorganismos; las diferencias en cuanto a nece- sidades reflejan las distintas capacidades de síntesis. Algunas especies no requieren factores de crecimiento, en tanto que otras (p. ej., los lactobacilos) perdieron durante su evolución la capacidad de sintetizar hasta 30 a 40 compuestos esenciales y por tanto necesitan obtenerlos de su medio ambiente. FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO Un medio de cultivo adecuado debe contener todos los nutrien- tes necesarios para el microorganismo que se cultivará; tales factores incluyen pH, temperatura y aireación, que deben ser controlados con gran cuidado. Se utiliza un medio de cultivo líquido; al medio de cultivo puede añadirse agar o gel de sílice para que adquiera consistencia de gel para situaciones especia- les. El agar es un polisacárido extraído de algas marinas que es singular para el cultivo microbiano por su resistencia a la acción microbiana y porque se disuelve a 100 °C pero no forma placas de gel hasta que se encuentra por debajo de 45 °C; las células pueden suspenderse en el medio de cultivo a 45 °C; éste debe enfriarse con rapidez hasta que adquiera la consistencia de gel, sin lesionar a las células. Nutrientes En páginas previas, se describe cada tipo de nutriente, ade- más se presenta una lista de sustancias apropiadas. En general, apter 05_Carroll_4R.indd 71 apter 05_Carroll_4R.indd 71 14/04/16 14/04/16
- 85. 72 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Bloques de construcción Aminoácidos Mononucleótidos Monosacáridos Macromoléculas Porcentaje de peso seco en la célula típica Proteínas 50 20 10 Ácidos nucleicos Polisacáridos Lípidos 10 Aceptores D Acetato Precursores de isoprenoides Ácidos grasos D H2 H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O FIGURA 51 Síntesis de macromoléculas. La polimerización de los bloques de construcción en macromoléculas se logra en gran medida mediante la introducción de enlaces anhídrido. La formación de ácidos grasos a partir de acetato requiere varias etapas de reducción bioquímica utilizando donadores de hidrógeno orgánico (D • H2 ). debe suministrarse lo siguiente: 1) donadores y aceptores de hidrógeno: casi 2 g/L; 2) fuente de carbono: casi 1 g/L; 3) fuente de nitrógeno: casi 1 g/L; 4) minerales: azufre, fósforo, casi 50 mg/L de cada uno y oligoelementos, 0.1 a 1 mg/L de cada uno; y 5) factores de crecimiento: aminoácidos, purinas y pirimi- dinas, casi 50 mg/L de cada uno y vitaminas, 0.1 a 1 mg/L de cada uno. Para estudios del metabolismo microbiano, por lo general es necesario preparar un medio completamente sintético en el cual se conozcan las características y concentraciones exactas de cada uno de los ingredientes. Es mucho menos costoso y más simple utilizar materiales naturales como extractos de levaduras, proteínas ingeridas o sustancias similares. La mayor parte de los microbios de vida libre se desarrollan bien en extractos de levaduras; las formas parasitarias pueden necesi- tar sustancias especiales que se encuentran sólo en la sangre o en extractos de tejidos de animales. Sin embargo, hay micro- bios parasitarios (p. ej., Treponema pallidum) que no pueden cultivarse in vitro o que crecen en el interior de células eucario- tas (p. ej., Chlamydia trachomatis). Para muchos microorganismos, un compuesto simple (como un aminoácido) puede actuar como fuente de energía, de carbono y nitrógeno; otras requieren compuestos separa- dos para cada uno de estos elementos. Si los materiales natu- rales para medios no sintéticos tienen deficiencias de algún nutriente particular, deben complementarse. Concentración de iones hidrógeno (pH) La mayor parte de los microorganismos tienen un pH óptimo muy estrecho. El pH óptimo debe determinarse de manera empírica para cada especie. La mayor parte de los microorganis- mos (neutrolófilos) proliferan mejor en un pH de 6 a 8, aunque algunas formas (acidófilos) encuentran su cifra óptima con pH de 3; otros (alcalófilos) tienen un pH óptimo de hasta 10.5. Los microorganismos regulan su pH interno pese a la amplia gama de cifras de pH externo mediante el bombeo de protones hacia el interior o al exterior de la célula. Los microor- ganismos acidófilos mantienen su pH interno en casi 6.5 sobre un pH externo de 1 a 5; los microorganismos neutrolófilos mantienen un pH interno cercano a 7.5 con intervalos exter- nos de pH de 5.5 a 8.5; los microorganismos alcalófilos man- tienen un pH interno de casi 9.5 sobre intervalos externos de 9 a 11. El pH interno está regulado por un grupo de sistemas de transporte de protones en la membrana citoplásmica, lo que incluye una bomba de protones controlada por ATP y un intercambiador de Na+ /H+ . El sistema de intercambio de K+ /H+ parece contribuir a la regulación del pH interno en microorga- nismos neutrolófilos. Temperatura La temperatura óptima para el cultivo de las distintas especies microbianas varía (figura 5-2): los psicrófilos crecen mejor a temperaturas bajas (−5 a −15 °C) y por lo general se encuen- tran en ambientes de este tipo como las regiones del Ártico y la Antártida; para los psicrótrofos, la temperatura óptima es entre 20 y 30 °C, pero incluso crecen bien a temperaturas más bajas. Constituyen una causa importante de desperdicio ali- mentario. Los mesófilos crecen mejor entre 30 a 37 °C; la mayor parte de los termófilos crecen mejor entre 50 a 60 °C. Algunos microorganismos son hipertermófilos y pueden desarrollarse a temperatura de ebullición, la cual existe en sitios con alta pre- sión como en las profundidades del océano. La mayor parte de los microorganismos son mesófilos; 30 °C es la temperatura óptima para muchas formas de vida libre y la temperatura cor- poral del hospedador es óptima para simbiontes homeotermos. El extremo superior de las temperaturas toleradas por cualquier especie dada se correlaciona bien con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie, medidas en apter 05_Carroll_4R.indd 72 apter 05_Carroll_4R.indd 72 14/04/16 14/04/16
- 86. CAPÍTULO 5 Cultivode microorganismos 73 extractos celulares. Los microorganismos comparten con las plantas y animales la respuesta al golpe de calor, que consiste en la síntesis transitoria de un grupo de “proteínas de golpe de calor” cuando se exponen a incrementos súbitos en la tempe- ratura por arriba de la temperatura óptima de proliferación. Tales proteínas parecen ser inusualmente resistentes a la tem- peratura y estabilizan a proteínas celulares sensibles al incre- mento térmico. La relación de la tasa de proliferación con la temperatura para cualquier microorganismo dado se observa en el gráfico típico de Arrhenius (figura 5-3). Arrhenius demostró que el logaritmo de la velocidad de cualquier reacción química (log k) es una función lineal del recíproco de la temperatura (1/T); como el crecimiento celular es consecuencia de un grupo de reacciones químicas, cabría esperar que se observe esta rela- ción. En la figura 5-3 se muestra el caso de temperaturas por arriba de intervalos normales para una especie dada; el log k disminuye linealmente con 1/T. Sin embargo, por arriba y por abajo del intervalo normal, log k disminuye con rapidez, de forma que se definen las temperaturas máxima y mínima. Además de sus efectos sobre la tasa de proliferación, las temperaturas extremas matan a los microorganismos. La tem- peratura muy elevada se utiliza para esterilizar preparaciones (capítulo 4); el frío extremo también destruye microorganis- mos, aunque no puede utilizarse con seguridad con fines de esterilización. Las bacterias también muestran el fenómeno conocido como choque de enfriamiento; en éste, las células mueren con el enfriamiento rápido (a diferencia de lo que ocu- rre con el enfriamiento lento). Por ejemplo, el enfriamiento rápido de Escherichia coli de 37 a 5 °C puede destruir 90% de las células. Varios compuestos protegen a éstas del choque de calor o de congelamiento; a menudo se utilizan glicerol y dimetil sulfóxido. Aireación En el capítulo 6 se revisa la función del oxígeno como aceptor de hidrógeno. Muchos microorganismos son aerobios estric- tos, esto es, necesitan oxígeno como aceptor de hidrógeno; otros son anaerobios facultativos, es decir, tienen la capaci- dad de vivir en forma aerobia o anaerobia; otros son anaero- bios estrictos, pues necesitan una sustancia distinta al oxígeno como aceptor de hidrógeno y son sensibles a la inhibición de oxígeno; otros más son microaerófilos, que necesitan peque- ñas cantidades de oxígeno (2 a 10%) para la respiración aerobia (la concentración más elevada es inhibidora); otros son anae- robios aerotolerantes, pues son indiferentes al oxígeno. Éstos pueden crecer en su presencia pero no lo utilizan como aceptor de hidrógeno (figura 5-4). Los productos secundarios naturales del metabolismo aerobio son compuestos reactivos de peróxido de hidrógeno (H2 O2 ) y superóxido (O2 − ). En presencia de hierro, estas sus- tancias generan radicales hidroxilo (•OH) que pueden dañar cualquier macromolécula biológica: O H O O OH OH 2 2 2 Fe /Fe 2 2 3 2 + → + +• + − − Muchos microorganismos aerobios y anaerobios toleran- tes al aire se protegen de estos productos por la presencia de superóxido dismutasa, una enzima que cataliza la reacción 2O 2H O H O 2 2 2 2 + → + − + y por la presencia de una catalasa, una enzima que cataliza la reacción 2H O 2H O O 2 2 2 2 → + Índice de crecimiento Temperatura (°C) –10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Psicrófilos Psicrótrofos Mesófilos Termófilos Hipertermófilos FIGURA 52 Necesidades de temperatura para el crecimiento. Las células procariotas por lo general se dividen en cinco grupos con base en su temperatura óptima de crecimiento. Obsérvese que la temperatura óptima, que es el punto donde el crecimiento es mayor, es cercana al límite superior del espectro. (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT [eds]: Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 91. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) Mínimo Temperatura elevada Temperatura normal 1/T (K) Temperatura baja Óptimo Máximo Log k FIGURA 53 Forma general del gráfico de Arrhenius de la proliferación bacteriana. (Reproducida con autorización de Ingraham JL: Growth of psychrophilic bacteria. J Bacteriol 1958; 76(1):75-80.) apter 05_Carroll_4R.indd 73 apter 05_Carroll_4R.indd 73 14/04/16 14/04/16
- 87. 74 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Algunos microorganismos fermentados (p. ej., Lactobaci- llus plantarum) son tolerantes al aire pero no contienen catalasa o superóxido dismutasa. No hay reducción del oxígeno y por tanto no se producen H2 O2 y O2 − . Todos los anaerobios estrictos carecen de superóxido dismutasa y catalasa. Algunos microor- ganismos anaerobios (p. ej., Peptococcus anaerobius) tienen tolerancia considerable al oxígeno como consecuencia de su capacidad para producir cifras elevadas de la enzima (NADH oxidasa) que reduce oxígeno a agua con base en la reacción NADH H / O NAD H O 1 2 2 2 + + → + + + El peróxido de hidrógeno debe gran parte de su toxicidad al daño que causa al DNA. Los mutantes con reparación defi- ciente del DNA son excepcionalmente sensibles al peróxido de hidrógeno; el producto génico recA participa en la recombina- ción genética y en la reparación, y ha mostrado ser más impor- tante que la catalasa o la superóxido dismutasa para proteger células de E. coli contra la toxicidad por peróxido de hidrógeno. El proporcionar aire a los cultivos de bacterias aerobias es un problema técnico mayor. Por lo común se lleva a cabo un mezclado mecánico para introducir oxígeno al medio de cul- tivo o bien se fuerza el paso de aire a través del medio de cultivo por medio de presión. La difusión de oxígeno a menudo se vuelve un factor limitante en la proliferación de bacterias aerobias; cuando se alcanza una concentración de 4 a 5 × 109 / ml de células, la tasa de difusión de oxígeno limita la tasa de proliferación de las células en gran medida. Por otra parte, los anaerobios estrictos presentan el pro- blema de la eliminación del oxígeno. Se dispone de muchos métodos para lograr esto: pueden añadirse agentes reductores como el tioglicolato de sodio a los cultivos líquidos; los tubos de agar pueden sellarse con una capa de vaselina y parafina; las placas de cultivo deben colocarse en un contenedor al cual se le retira el oxígeno por medio de vacío o por agentes quími- cos, o bien el microorganismo puede manipularse en una caja cerrada en un medio anaerobio. Concentración iónica y presión osmótica En menor grado, deben controlarse factores como la presión osmótica y concentración de sales. Para la mayor parte de los microorganismos, las propiedades de los medios de cultivo Aerobio estricto Anaerobio estricto Microaerófilo Aerotolerante Anerobio facultativo Bacterias Bacterias Enzimas en las células para la destoxificación de O2 Catalasa: 2H2O2 2H2O + O2 Catalasa, superóxido dismutasa Ni catalasa ni superóxido dismutasa en la mayor parte Pequeñas cantidades de catalasa y superóxido dismutasa Superóxido dismutasa 2O2 – + 2H+ O2 + H2O2 Superóxido dismutasa: FIGURA 54 Requisitos de oxígeno (O2 ) de las células procariotas. (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT [editores]: Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 92. © The Mc Graw-Hill Companies, Inc.) ordinarios son satisfactorias; sin embargo, para formas mari- nas y microorganismos adaptados para crecer en soluciones hipertónicas de azúcar, por ejemplo, deben tomarse en con- sideración tales factores. Los microorganismos que requieren concentraciones elevadas de sales se denominan halófilos; aquellos que requieren presiones osmóticas elevadas se deno- minan osmófilos. La mayor parte de las bacterias son capaces de tolerar amplias variaciones de presión osmótica externa y de fuerza iónica, debido a su capacidad para regular la osmolaridad interna y la concentración iónica. La osmolalidad está regu- lada por transporte activo de iones de K+ hacia el interior de la célula; la concentración iónica interna se mantiene constante por excreción compensadora de putresceína, una poliamina orgánica con carga positiva. Como la putresceína transporta varias cargas positivas por molécula, una gran reducción en la concentración iónica se lleva a cabo con un pequeño costo en la concentración osmótica. MÉTODOS DE CULTIVO Deben considerarse dos problemas: elección del medio de cul- tivoapropiadoyaislamientodeunmicroorganismobacteriano. Medios de cultivo La técnica y medio de cultivo utilizados dependen de la natura- leza de la investigación. En términos generales, pueden encon- trarse tres situaciones: 1) tal vez sea necesario cultivar un grupo de células de una especie en particular que se encuentran a la mano; 2) puede ser necesario establecer el número y tipo de microorganismos presentes en un material dado; o 3) podría desearse el aislamiento de un tipo particular de microorga- nismo a partir de una fuente natural. A. Desarrollo celular de una especie dada Los microorganismos observados en el microscopio pueden proliferar en su ambiente natural y pueden ser extremadamente difíciles de hacer crecer en un medio de cultivo artificial puro. Ciertas formas parasitarias nunca han sido cultivadas fuera del hospedador. Sin embargo, en términos generales puede dise- ñarse un medio de cultivo apropiado para reproducir de forma apter 05_Carroll_4R.indd 74 apter 05_Carroll_4R.indd 74 14/04/16 14/04/16
- 88. CAPÍTULO 5 Cultivode microorganismos 75 cuidadosa las condiciones encontradas en el entorno natural del microorganismo. El pH, temperatura y aireación son fáciles de duplicar; los nutrientes presentes constituyen el mayor pro- blema. La contribución por el entorno en que se desarrolla el microorganismo es importante y difícil de analizar; un pará- sito podría necesitar un extracto de tejido del hospedador; una forma de vida libre podría necesitar una sustancia excretada por un microorganismo y con la cual se encuentra asociada. Podría ser necesaria una gran cantidad de experimentación para establecer las necesidades del microorganismo y el éxito depende de proporcionar una fuente apropiada de cada uno de los nutrientes mencionados al inicio de este capítulo. El cultivo de parásitos estrictos como clamidias se revisa en el capítulo 27. B. Estudio microbiológico de materiales naturales Un material dado puede contener muchos microambientes diferentes y cada uno proporciona un nicho para diferentes especies. El cultivo de una muestra de material bajo cierto grupo de condiciones permitirá que un grupo selecto de for- mas produzca colonias, pero podría ocasionar que se pasen por alto muchos otros tipos. Por tal razón, se acostumbra cultivar las muestras utilizando diversos medios de cultivo con diferen- tes condiciones de incubación, según sea posible en condicio- nes prácticas. No es irracional utilizar seis u ocho medios de cultivo y condiciones de cultivo diferentes si se van a identifi- car la mayor parte de las formas presentes. Cada tipo de microorganismo debe tener la posibilidad de proliferar, por ello se utilizan medios sólidos para evitar el aglomeramiento de colonias. Por otra parte, la competencia evitará que se formen algunos tipos de colonias. C. Aislamiento de un microorganismo en particular Una pequeña muestra de tierra, si se manipula de manera apropiada, permite el cultivo de diferentes tipos de microor- ganismos en cada microentorno presente. Para la tierra fértil (húmeda, aireada, rica en minerales y material orgánico) esto significa que pueden aislarse cientos o incluso miles de tipos bacterianos, lo cual se lleva a cabo al seleccionar el tipo deseado. Por ejemplo, 1 g de tierra se inocula en un frasco de medio de cultivo líquido que se elaboró con el fin de favorecer el creci- miento de un tipo de microorganismo, como bacterias aerobias fijadoras de nitrógeno (azobacterias). En este caso, el medio no contiene nitrógeno combinado y se incuba en un medio anae- robio. Si las azobacterias están presentes en la tierra, prolife- ran bien en este medio de cultivo; las formas incapaces de fijar nitrógeno crecerán sólo en la medida que la tierra tenga conta- minantes que fijen nitrógeno en el medio. Cuando el cultivo se ha desarrollado por completo, el porcentaje de azobacterias en la población total se habrá incrementado en gran medida; este método se denomina cultivo enriquecido. La transferencia de una muestra de este cultivo a un medio fresco dará origen a un enriquecimiento adicional de las azobacterias; después de varias transferencias seriadas el cultivo puede colocarse en un medio de cultivo sólido enriquecido, lo que permite el aisla- miento de colonias de azobacterias. El medio líquido se utiliza para permitir la competencia y por lo tanto la selección óptima, incluso cuando el tipo deseado es representado en la tierra por sólo una pequeña cantidad de células en la población de millones. Pueden obtenerse ventajas del “enriquecimiento natural”. Por ejemplo, al observar oxidan- tes de queroseno, se elige tierra contaminada con aceite, porque éste es un medio ya enriquecido para tales formas bacterianas. El enriquecimiento de cultivos es un procedimiento mediante el cual se prepara el medio de cultivo para duplicar el ambiente natural (“nicho”) del microorganismo deseado, por lo que se permite su selección (figura 5-5). Un principio impor- tante involucrado en tal selección es el siguiente: el microorga- nismo seleccionado será del tipo del cual se han satisfecho sus necesidades nutricionales. Por ejemplo, las azobacterias crecen en un medio de cultivo que contiene nitrógeno orgánico, pero sus necesidades mínimas consisten en la presencia de N2 ; por tanto, se elige un medio de cultivo que contenga N2 como la única fuente de nitrógeno. Si se añade nitrógeno orgánico al medio de cultivo, las condiciones ya no serán selectivas para azobacterias, sino más bien para las formas en las que el nitró- geno orgánico es una necesidad mínima. Cuando se busca un tipo específico de microorganismo que forma parte de una población mixta, se utilizan medios de cultivo selectivos o diferenciales. Los medios selectivos inhi- ben el crecimiento de microorganismos distintos del que se está buscando. Por ejemplo, el agar de Thayer-Martin se utiliza para aislar a Neisseria gonorrhoeae, causa de la gonorrea, de las muestras clínicas. Los medios diferenciales contienen sustan- cias que ciertas bacterias cambian de determinada manera. Por ejemplo, las colonias de E. coli tienen un color verdoso iridis- cente característico al cultivarse en agar que contiene eosina y azul de metileno (agar EMB). El agar EMB contiene altas con- centraciones de un carbohidrato que ocasiona que los microor- ganismos que fermentan azúcar formen colonias de color rojizo. Los medios de cultivo diferenciales se utilizan para pro- pósitos como la identificación de bacterias entéricas en agua o leche y la presencia de ciertos patógenos en muestras clínicas. En el cuadro 5-2 se presentan las características de los medios representativos que se utilizan para cultivar bacterias. Aislamiento de microorganismos en cultivos puros A fin de estudiar las propiedades de un microorganismo dado, es necesario manipularlo en cultivos puros sin otros tipos de microorganismos. Para llevar a cabo esto, debe aislarse una sola célula de todas las demás y cultivarse de forma tal que su progenie permanezca aislada. Se dispone de varios métodos. A. Cultivo en placa A diferencia de las células en medio líquido, las células en un medio de gel se encuentran inmobilizadas. Por lo tanto, si se colocan pocas células en un medio de gel, cada célula prolifera en una colonia aislada. El agente ideal para la formación de gel para la mayor parte de los medios de cultivo microbiológico es el agar, un polisacárido ácido extraído de ciertas algas rojas. Una suspensión al 1.5 a 2% en agua se disuelve a 100 °C, dando ori- gen a una solución clara que se gelifica a 45 °C. Una solución de agar estéril puede enfriarse a 50 °C; así, se añaden bacterias u otro microorganismo y más tarde la solución se enfría con rapi- dez por debajo de 45 °C para formar un gel. (Aunque la mayor apter 05_Carroll_4R.indd 75 apter 05_Carroll_4R.indd 75 14/04/16 14/04/16
- 89. 76 SECCIÓN IFundamentos de microbiología parte de las células microbianas se destruyen a 50 °C, el proceso de destrucción es lo suficientemente lento a esta temperatura para permitir que se lleve a cabo el procedimiento; figura 4-3). Una vez formado el gel, el agar no vuelve a tornarse líquido hasta que se calienta por arriba de 80 °C, de manera que cualquier temperatura es apropiada para la incubación de un medio de cultivo microbiano. En el método de vertido en placa se mezcla una suspensión de células con agar líquido a 50 °C y se vierte en una caja de Petri. Cuando el agar se torna sólido, las célu- las permanecen inmóviles en éste y proliferan dando origen a colonias. Si la suspensión celular está lo suficientemente diluida, las colonias se encontrarán bien separadas, de forma que cada una tiene una alta probabilidad de derivarse de una sola célula Traslado a la caja de Petri El medio contiene fuentes de nutriente selectas escogidas dado que pocas bacterias, diferentes del microorganismo en estudio, las pueden utilizar. Se agrega al medio la muestra que contiene una variedad amplia de microorganismos, incluida la especie en estudio. El microorganismo en estudio puede multiplicarse, pero no la mayor parte de los demás La muestra enriquecida es sembrada en la placa de Petri con medio de agar apropiado. Se obtiene un cultivo puro al seleccionar una colonia única del microorganismo de interés. FIGURA 55 Cultivo enriquecido. El medio y las condiciones de incubación favorecen el crecimiento de las especies escogidas sobre otras bacterias de la misma muestra. (Reproducido con autorización de Nester EW, Anderson DG. Roberts CE, Nester MT: Microbiology: A human perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 99 © The McGraw-Hill Companies, Inc.) CUADRO 52 Carácterísticas de los medios representativos utilizados para cultivar bacterias Medio Característica Agar de sangre Medio complejo de uso cotidiano en laboratorios clínicos. Es diferencial dado que las colonias de microorganismos hemolíticos están rodeadas por una zona de limpieza de los eritrocitos. No es selectivo. Agar de chocolate Medio complejo utilizado para cultivar bacterias de cultivo exigente, particularmente las encontradas en muestras clínicas. No es selectivo o diferencial. Sales de glucosa Medio definido químicamente. Se utiliza en experimentos de laboratorio para estudiar necesidades nutricionales de bacterias. No es selectivo o diferencial. Agar de MacConkey Medio complejo utilizado para aislar bacilos gramnegativos que habitan de manera típica en el intestino. Es selectivo debido a que las sales biliares y colorantes inhiben a microorganismos grampositivos y cocos gramnegativos. Es diferencial debido a que el indicador de pH se convierte en rojo rosado cuando el azúcar del medio, la lactosa, se fermenta. Agar de nutriente Medio complejo utilizado para trabajo de laboratorio cotidiano. Favorece el crecimiento de una variedad de bacterias de cultivo no difícil. No es selectivo ni diferencial. Thayer-Martin Medio complejo utilizado para aislar especies de Neisseria, que son de cultivo difícil. Es selectivo por contener antibióticos que inhiben a la mayor parte de microorganismos, excepto especies de Neisseria. No es diferencial. (Reproducido con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT: Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 96. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) (figura 5-6). Sin embargo, para tener la certeza es necesario tomar una colonia del tipo deseado, suspenderla en agua y repetir el procedimiento. La repetición de este procedimiento en varias ocasiones asegura que se obtenga un cultivo puro. Otro método consiste en crear estrías de la suspensión ori- ginal sobre una placa de agar con un asa de alambre (técnica de estriado en placa). Conforme se continúa con la creación de estrías, cada vez queda un menor número de células en el asa y por último el asa depositará una sola célula en el agar (figura 5-7). La placa se incuba y cualquier colonia bien aislada se retira; se vuelve a suspender en agua y se repite el procedi- miento en agar. Si la suspensión se vuelve a someter al método de estriado en placa (y no sólo una parte de la colonia), este apter 05_Carroll_4R.indd 76 apter 05_Carroll_4R.indd 76 14/04/16 14/04/16
- 90. CAPÍTULO 5 Cultivode microorganismos 77 Muestra original 9 ml de H2O (dilución 10–1 ) 9 ml de H2O (dilución 10–2 ) 9 ml de H2O (dilución 10–3 ) 9 ml de H2O (dilución 10–4 ) 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Mezcla con agar tibio, la cual se vierte FIGURA 56 Técnica de vertido en placa. La muestra original se diluye varias veces para reducir lo suficiente la población. Las muestras más diluidas se mezclan con agar tibio y se vierten en cajas de Petri. Las células aisladas proliferan en colonias y se utilizan para establecer cultivos puros. La superficie de las colonias es circular; por debajo de la superficie adquieren forma lenticular. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. ed., McGraw-Hill, 2008. The McGraw-Hill Companies, Inc.) Pasos en la formación de estrías en la placa Nota: este método sólo funciona si la herramienta para la extensión de la muestra (por lo común un asa de inoculación) se reesteriliza después de cada uno de los pasos del 1 a 4. 1 2 3 4 5 A B FIGURA 57 Técnica de estriado en placa. A: Patrón típico de estriación. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. ed., McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) B: Un ejemplo de la placa estriada. (Reproducida con autorización de Kathy Park Talaro.) método es tan fiable y mucho más rápido que el método de ver- tido en placa. En la técnica de extensión en placa, un pequeño volumen de suspensión microbiana diluida que contiene 30 a 300 células se transfiere hacia el centro de la placa de agar y se extiende en forma uniforme sobre la superficie con una varilla de cristal estéril, doblada. Las células dispersadas dan origen a colonias aisladas. El número de colonias debe ser similar al número de microorganismos viables en la muestra, por tanto la técnica de extensión en placa puede utilizarse para contar la población microbiana. B. Dilución Un método mucho menos fiable es el de la dilución hasta la extinción. Se realizan diluciones seriadas de la suspensión y las muestras de cada dilución se cultivan en placa. Si sólo unas cuantas muestras de una dilución en particular muestran apter 05_Carroll_4R.indd 77 apter 05_Carroll_4R.indd 77 14/04/16 14/04/16
- 91. 78 SECCIÓN IFundamentos de microbiología crecimiento, se supone, entonces, que algunas de las colonias iniciaron a partir de una sola célula. Este método no se utiliza a menos que sea imposible el cultivo en placa por alguna razón. Una característica indeseable de este método es que sólo puede utilizarse para aislar el tipo predominante de microorganismo en una población mixta. RESUMEN DEL CAPÍTULO • Un microorganismo necesita todos los elementos en su materia orgánica y el complemento total de iones nece- sarios para su actividad con el fin de crecer. Los nutrien- tes se clasifican según los elementos que proporcionan, incluidos una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de azufre, una fuente de fósforo y fuentes de minerales. • Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos que deben poseer una célula para crecer pero que no puede sintetizar. • También es fundamental una fuente de energía para establecer una fuerza protomotriz y permitir la síntesis macromolecular. Los tres principales mecanismos para generar energía metabólica son fermentación, respiración y fotosíntesis. • Ciertos factores ambientales como el pH, la temperatura y la aireación son importantes para el crecimiento. La mayor parte de los microorganismos patógenos para el ser humano son neutrolófilos (crecen mejor a un pH de 6 a 8) y mesófilos (crecen mejor de 30 a 37 °C). • La capacidad de los microorganismos para utilizar oxí- geno como aceptor de hidrógeno y para desactivar los productos intermedios nocivos del metabolismo aerobio, varían mucho entre los microorganismos. Se pueden divi- dir en aerobios estrictos, anaerobios facultativos, anaero- bios estrictos, microaerófilos y anaerobios aerotolerantes. • Es posible preparar medios microbiológicos para permitir el crecimiento de determinado tipo de microorganismo cuyo número es reducido (medio de cultivo enriquecido), identificar tipos específicos de microorganismos (medio de cultivo diferencial) o aislar a un microorganismo espe- cífico en una población mixta (medio de cultivo selectivo). PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. La mayor parte de los microorganismos patógenos para seres humanos se desarrollan mejor en el laboratorio cuando los culti- vos se incuban de: (A) 15 a 20 °C (B) 20 a 30 °C (C) 30 a 37 °C (D) 38 a 50 °C (E) 50 a 55 °C 2. El proceso por el cual un microorganismo produce ATP durante la fermentación de glucosa se caracteriza por: (A) Acoplamiento de la producción de ATP con la transferencia de electrones (B) Desnitrificación (C) Reducción de oxígeno (D) Fosforilación del sustrato (E) Respiración anaerobia 3. El efecto principal de la temperatura de 60 ºC sobre el crecimiento de un mesófilo como la Escherichia coli es para: (A) Destruir la pared celular (B) Desnaturalizar proteínas (C) Destruir ácidos nucleicos (D) Solubilizar la membrana citoplasmática (E) Causar formación de endosporas 4. La polimerización de bloques de construcción (p. ej., aminoá- cidos) en macromoléculas (p. ej., proteínas) se logra en gran medida por: (A) Deshidratación (B) Reducción (C) Oxidación (D) Asimilación (E) Hidrólisis 5. Una cepa de E. coli no requiere vitaminas cuando crece en un medio definido que contiene glucosa, sales minerales y cloruro de amonio. Esto se debe a que E. coli: (A) No utiliza vitaminas para su crecimiento (B) Obtiene vitaminas de su hospedador humano (C) Es un quimioheterótrofo (D) Puede sintetizar vitaminas a partir de compuestos simples proporcionados en el medio (E) El cloruro de amonio y las sales minerales contienen oligo- cantidades de vitaminas 6. ¿Cuál de los siguientes NO es un mecanismo de los microorga- nismos para generar energía metabólica? (A) Fermentación (B) Síntesis de proteínas (C) Respiración (D) Fotosíntesis (E) C y D 7. ¿Cuál de los siguientes términos describe mejor al microorga- nismo que crece a 20 °C? (A) Neutrolófilo (B) Psicrótrofo (C) Mesófilo (D) Osmófilo (E) Termófilo 8. La capacidad de asimilar N2 en forma reductiva a través de NH3 se denomina: (A) Amonificación (B) Anamox (C) Reducción asimilatoria de nitratos (D) Desaminación (E) Fijación de nitrógeno 9. ¿Cuál de los siguientes NO es asimilado por las células eucariotas? (A) Glucosa (B) Lactato (C) Sulfato (SO4 2− ) (D) Nitrógeno (N2 ) (E) Fosfato ((PO4 3− ) 10. Las bacterias que son patógenos intracelulares estrictos para el ser humano (p. ej., Chlamydia trachomatis) se consideran: (A) Autótrofos (B) Fotosintéticos (C) Quimiolitótrofos (D) Hipertermófilos (E) Heterótrofos apter 05_Carroll_4R.indd 78 apter 05_Carroll_4R.indd 78 14/04/16 14/04/16
- 92. CAPÍTULO 5 Cultivode microorganismos 79 Respuestas 1. C 2. D 3. B 4. A 5. D 6. B 7. B 8. E 9. D 10. E Maier RM, Pepper IL, Gerba CP: Environmental Microbiology. Aca- demic Press, 1992. Marzlut GA: Regulation of sulfur and nitrogen metabolism in fila- mentary fungi. Annu Rev Microbiol 1993;42:89. Pelczar MJ Jr, Chan ECS, Krieg NR: Microbiology: Concepts and Applications. McGraw-Hill, 1993. Schloss PD, Handelsman J: Status of the microbial census. Microbiol Molec Biol Rev 2004;68:686. Wood JM: Bacterial osmoregulation: A paradigm for the study of cellular homeostasis. Annu Rev Microbiol 2011;65:215. BIBLIOGRAFÍA Adams MW: Enzymes and proteins from organisms that grow near or above 100°C. Annu Rev Med 1993;47:627. Koch AL: Microbial physiology and ecology of slow growth. Micro- biol Molec Biol Rev 1997;61:305. apter 05_Carroll_4R.indd 79 apter 05_Carroll_4R.indd 79 14/04/16 14/04/16
- 93. apter 05_Carroll_4R.indd 80 apter05_Carroll_4R.indd 80 14/04/16 14/04/16
- 94. 81 6 Metabolismo microbiano C AP Í T U L O PARTICIPACIÓN DEL METABOLISMO EN LA BIOSÍNTESIS Y CRECIMIENTO El crecimiento microbiano requiere la polimerización de blo- ques bioquímicos de construcción para dar origen a proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos. Los bloques de cons- trucción tienen que encontrarse preformados en el medio de cultivo o tienen que sintetizarlo las células en crecimiento. Las demandas biosintéticas adicionales dependen de las necesida- des de coenzimas para que participen en la catálisis enzimá- tica. Las reacciones biosintéticas de polimerización necesitan la transferencia de enlaces anhídrido a partir del ATP. El creci- miento exige una fuente de energía metabólica para la síntesis de enlaces anhídrido y para la conservación de los gradientes transmembrana de iones y metabolitos. El metabolismo tiene dos componentes, catabolismo y anabolismo (figura 6-1). El catabolismo comprende procesos que albergan energía liberada por la degradación de compues- tos (p. ej., glucosa) y el aprovechamiento de esa energía para sintetizar ATP. Por el contrario, el anabolismo o biosíntesis, comprende procesos que utilizan la energía almacenada en el ATP para sintetizar y formar las subunidades, o bloques de construcción, de macromoléculas que componen la célula. La secuencia de bloques de construcción en una macromolécula depende de una de dos vías. En los ácidos nucleicos y proteí- nas es dirigida por una plantilla: el DNA actúa como plantilla para su propia síntesis y para la síntesis de diversos tipos de RNA; el RNA mensajero actúa como plantilla para la síntesis de proteínas. Por otra parte, para los carbohidratos y lípidos la disposición de los bloques de construcción depende en su tota- lidad de enzimas específicas. Una vez que se han producido las macromoléculas, se ensamblan para dar origen a estructuras supramoleculares de la célula, por ejemplo ribosomas, mem- branas, pared celular, flagelos y pilosidades. La tasa de síntesis de macromoléculas y la actividad de las vías metabólicas debe ser regulada de forma que la biosíntesis permanezca en equilibrio. Todos los componentes necesarios paralasíntesisdemacromoléculasdebenestarpresentesparaun crecimiento ordenado y debe ejercerse control de forma tal que los recursos de la célula no deben dar origen a productos que no contribuyan al crecimiento o supervivencia de la célula. El capítulo contiene una revisión del metabolismo micro- biano y su regulación. Los microorganismos representan extremos de la divergencia de la evolución y se encuentra una amplia variedad de vías metabólicas en este grupo. Por ejem- plo, cualquiera de más de media docena de vías metabólicas diferentes puede utilizarse para la asimilación de benzoato, un compuesto relativamente simple, y una vía simple para la asimilación de benzoato puede ser regulada por más de media docena de mecanismos de control. El objetivo de los autores es ilustrar los principios subyacentes a las vías metabólicas y su regulación. El principio fundamental que determina las vías metabólicas es el logro de unas cuantas reacciones bio- químicas relativamente organizadas en un orden específico. Muchas vías biosintéticas pueden deducirse si se examinan las estructuras químicas del material inicial, el producto termi- nal y quizá uno o dos intermediarios metabólicos. El princi- pio subyacente principal de la regulación metabólica es que las enzimas tienden a participar sólo cuando se demanda su acti- vidad catalítica. La actividad de una enzima puede cambiarse si se modifican las cantidades de la misma o la cantidad de sus- trato. En algunos casos, las actividades enzimáticas se alteran al unirse a efectores específicos, metabolitos que modulan la actividad enzimática. METABOLITOS FOCALES Y SU INTERCONVERSIÓN Interconversiones de glucosa 6-fosfato y carbohidratos Los orígenes biosintéticos de los bloques de construcción y coenzimas, proviene de unos cuantos precursores, llama- dos metabolitos focales. En las figuras 6-2 y 6-5 se ilustra la manera como los metabolitos focales respectivos, glucosa 6-fosfato (G6PD), fosfoenolpiruvato, oxaloacetato y α-cetoglu- tarato originan la mayor parte de los productos biosintéticos terminales. En la figura 6-2 se ilustra la forma en que la G6PD se convierte a diversos productos terminales por la vía de éste- res de fosfato o de carbohidratos con diferentes longitudes de cadena. Los carbohidratos poseen la fórmula empírica (CH2 O)n y el objetivo primario del metabolismo de los carbohidratos es modificar n, es decir, la longitud de la cadena de carbonos. El mecanismo por el cual la longitud de la cadena de fosfatos de carbohidrato se interconvierte se resume en la figura 6-6. En un caso se utilizan reacciones de oxidación para eliminar un carbono de la molécula de G6PD, lo que produce un derivado pentosa, la ribulosa 5-fosfato. Las reacciones de isomerasa y epimerasa transforman las formas bioquímicas más comunes de las pentosas: ribulosa 5-fosfato, ribosa 5-fosfato y xilulosa 5-fosfato. Las transcetolasas transfieren un fragmento de los apter 06_Carroll_4R.indd 81 apter 06_Carroll_4R.indd 81 14/04/16 14/04/16
- 95. 82 SECCIÓN IFundamentos de microbiología carbonos de una molécula donadora a una aceptora. Estas reacciones permiten que se produzcan pentosas o que éstas se formen de carbohidratos con diferentes longitudes de cadena. Como se muestra en la figura 6-6, 2 moléculas de pentosa 5-fosfato (n = 5) se interconvierten con triosa 3-fosfato (n = 3) y heptosa 7-fosfato (n = 7); la pentosa 5-fosfato (n = 5) y tetrosa 4-fosfato (n = 4) se interconvierten con triosa 3-fosfato (n = 3) y hexosa 6-fosfato (n = 6). La cadena hexosa (de seis carbonos) de la fructosa 6-fosfato puede convertirse a dos moléculas de triosa (tres carbonos) por la acción consecutiva de cinasas y aldolasas que actúan sobre la fructosa 6-fosfato. También, las aldolasas actúan en combina- ción con las fosfatasas que en conjunto pueden utilizarse para incrementar la longitud de las moléculas de carbohidratos: las moléculas de triosa-fosfato pueden dar origen a fructosa 6-fos- fato; una triosa-fosfato y tetrosa 4-fosfato pueden dar origen a heptosa 7-fosfato. La forma final de la interconversión en la longitud de la cadena del carbohidrato es la reacción de tran- saldolasa, en la cual ocurre la interconversión de heptosa 7-fos- fato y triosa 3-fosfato a tetrosa 4-fosfato y hexosa 6-fosfato. Lavíaalternativadelashexosasmonofosfatadas(figura6-7) ilustra la coordinación de diferentes reacciones que implican el Estructuras celulares (pared celular, membrana, ribosomas, estructuras de la superficie) Macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos) Subunidades (aminoácidos, nucleótidos) Fuente de energía (glucosa) Energía Energía Energía CATABOLISMO ANABOLISMO Nutrientes (fuente de nitrógeno, azufre, etc). Productos de desecho (ácidos, bióxido de carbono) Precursores FIGURA 61 Relación entre el catabolismo y anabolismo. El catabolismo comprende procesos que albergan energía liberada durante la desintegración de compuestos, utilizándola para sintetizar trifosfato de adenosina (ATP); además, proporciona los metabolitos precursores utilizados en la biosíntesis. El anabolismo, o biosíntesis, comprende procesos que utilizan ATP y metabolitos precursores para sintetizar y forma subunidades de macromoléculas que componen la célula. (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT [eds]: Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 127. © The Mc Graw-Hill Companies, Inc.) reordenamiento de carbohidratos para cumplir con un obje- tivo metabólico general. Las cianobacterias aprovechan este ciclo para reducir la molécula dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+ , nicotinamide adenine dinucleotide) en dinu- cleótido de nicotinamida y adenina reducido (NADH, redu- ced nicotinamide adenine dinucleotide), el cual funciona como reductor para procesos de respiración que ocurren durante la oscuridad. Numerosos microorganismos utilizan la vía alter- nativa de las hexosas monofosfatadas para reducir el dinucleó- tido de noctinamida y adenina fosfatado (NADP+ , nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) en dinucleótido de noctina- mida y adenina fosfatado reducido (NADPH, reduced nicotina- mide adenine dinucleotide phosphate), una molécula que se usa en reacciones de reducción biosintéticas. El primer paso en la vía de monofosfato de hexosa son reacciones de oxidación que acortan las moléculas de hexosa 6-fosfato (abreviado como C6 en la figura 6-7) a pentosa 5-fosfato (abreviado como C5 ). Las reacciones de reordenamiento de los carbohidratos convier- ten seis moléculas de C5 a cinco moléculas de C6 , de forma que puede continuar el ciclo de oxidación. Por supuesto, no todas las reacciones para la intercon- versión de carbohidratos con incremento de la longitud de las cadenas se llevan a cabo al mismo tiempo. La selección de gru- pos específicos de enzimas, que en esencia determinan la vía metabólica que se seguirá, depende de la fuente de carbono y de las demandas biosintéticas de las células. Por ejemplo, una célula que utiliza triosa-fosfato como fuente de carbohidratos utilizará una combinación de aldolasa-fosfatasa para dar ori- gen a fructosa 6-fosfato; no es de esperarse que la cinasa que actúa sobre la fructosa 6-fosfato en su interconversión a trio- sa-fosfato se active bajo tales circunstancias. Si las demandas de pentosa 5-fosfato son altas, como en el caso de la asimila- ción fotosintética de dióxido de carbono, las transcetolasas que pueden dar origen a pentosa 5-fosfato son muy activas. En suma, la G6PD puede considerarse como un metabolito focal porque actúa como precursor directo para la construc- ción de bloques metabólicos y como fuente de carbohidratos de longitud variable que se utilizan con fines biosintéticos. La G6PD misma puede generarse con otros carbohidratos fos- forilados por la selección de vías de entre un grupo de reac- ciones para la interconversión de longitudes de cadenas de carbohidratos. Las reacciones elegidas dependen del potencial genético de la célula, de la fuente primaria de carbono y de las demandas biosintéticas del microorganismo. Es necesaria la regulación metabólica para asegurar que las reacciones satis- fagan las necesidades del microorganismo. Formación y utilización de fosfoenolpiruvato Las moléculas de triosa-fosfato, formadas por la interconver- sión de fosfoésteres de carbohidrato, se interconvierten a fos- foenolpiruvato por una serie de reacciones que se muestran en la figura 6-8. La oxidación de gliceraldehído 3-fosfato por NAD+ se acompaña de la formación de enlaces anhídrido en uno de los carbonos de la molécula de 1,3-difosfoglicerato. Este anhídrido de fosfato se transfiere en una fosforilación de sustrato a difosfato de adenosina (ADP, adenosine diphos- phate), lo que da origen a enlaces ricos en energía en el ATP. apter 06_Carroll_4R.indd 82 apter 06_Carroll_4R.indd 82 14/04/16 14/04/16
- 96. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 83 Metabolito focal Polisacáridos Ácidos nucleicos Histidina Triptófano Fenilalanina Intermediarios Fosfatos de hexosa Tirosina Lípidos Glicina Cisteína Triptófano Productos terminales Fosfatos de pentosa Fosfatos de tetrosa Fosfatos de triosa 3-fosfoglicerato Corismato Glucosa 6-fosfato Serina FIGURA 62 Productos biosintéticos terminales formados de glucosa 6-fosfato. Los ésteres fosfato de carbohidrato de cadenas de longitud variable sirven como intermediarios en la vía biosintética. Metabolito focal Glicina Cisteína Triptófano Fenilalanina Tirosina Intermediarios Fosfatos de triosa 3-fosfoglicerato Corismato Piruvato Acetil-CoA Serina Polisacáridos Alanina Valina Isoleucina Lípidos Productos terminales Fosfoenolpiruvato FIGURA 63 Productos biosintéticos terminales formados de fosfoenolpiruvato. Otro enlace de fosfato rico en energía se forma por la deshi- dratación del 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato; a través de otra fosforilación de sustrato, el fosfoenolpiruvato puede donar enlaces ricos en energía al ADP, lo que da origen a la formación de ATP y piruvato. Así, pueden obtenerse dos enlaces ricos en energía en el ATP por medio de interconversión metabólica de triosa-fosfato a piruvato. Este es un proceso oxidativo y, en ausencia de un aceptor exógeno de electrones, el NADH gene- rado por la oxidación de gliceraldehído 3-fosfato debe oxidarse a NAD+ por medio de piruvato o por metabolitos derivados del piruvato. Los productos formados como consecuencia de este proceso varían y, como se describe más adelante en este apter 06_Carroll_4R.indd 83 apter 06_Carroll_4R.indd 83 14/04/16 14/04/16
- 97. 84 SECCIÓN IFundamentos de microbiología capítulo, pueden utilizarse en la identificación de bacterias de importancia clínica. La formación de fosfoenolpiruvato a partir de piruvato exige cantidades sustanciales de energía metabólica e invaria- blemente en el proceso se invierten dos enlaces anhídrido de ATP. Algunos microorganismos (p. ej., Escherichia coli) pro- ducen directamente la fosforilación del piruvato con ATP, lo que da origen a monofosfato de adenosina (AMP, adenosine monophosphate) y fosfato inorgánico (Pi , inorganic phosphate). Otros microorganismos utilizan dos pasos metabólicos: se invierte un enlace de pirofosfato de ATP en la carboxilación del piruvato a oxaloacetato y un segundo enlace de pirofosfato (a menudo donado por trifosfato de guanosina [GTP, guanosine triphosphate], en vez de ATP) para generar fosfoenolpiruvato a partir de oxaloacetato. Formación y utilización de oxaloacetato Como se describió antes, muchos microorganismos producen oxaloacetato por una carboxilación de piruvato dependiente de ATP. Otros microorganismos, como E. coli, que forman fosfo- enolpiruvato directamente de piruvato, sintetizan oxaloacetato por carboxilación de fosfoenolpiruvato. La succinil-CoA es necesaria como precursor biosintético para la síntesis de porfirinas y de otros compuestos esencia- les. Algunos microorganismos forman succinil-CoA por la reducción de oxaloacetato a través de malato y fumarato. Estas reacciones representan un flujo metabólico invertido que se observa en el ciclo del ácido tricarboxílico (figura 6-11). Metabolito focal Lisina Glutamina Glutamato Semialdehído glutámico Arginina Prolina Intermediarios Productos terminales Cetoglutarato α Metabolito focal Isoleucina Coenzimas Ácidos nucleicos Asparagina Treonina Metionina Pirimidinas Productos terminales Oxaloacetato Aspartato FIGURA 64 Productos biosintéticos terminales formados de oxaloacetato. Los productos terminales aspartato, treonina y las pirimidinas sirven de intermediarios en la síntesis de compuestos adicionales. FIGURA 65 Productos biosintéticos terminales formados de cetoglutarato α. Formación de cetoglutarato α a partir de piruvato Las conversiones de piruvato a cetoglutarato α necesitan una vía metabólica que diverge y luego converge (figura 6-9). En una vía, se forma oxaloacetato por carboxilación de piruvato o fosfoenolpiruvato. En la otra vía, se oxida el piruvato a ace- til-CoA. Vale la pena destacar que, sin importar el mecanismo enzimático utilizado para la formación de oxaloacetato, se necesita acetil-CoA como efector metabólico positivo para este proceso. Así, la síntesis de oxaloacetato se equilibra con la pro- ducción de acetil-CoA. La condensación de oxaloacetato con acetil-CoA da origen a la formación de citrato. La isomeriza- ción de la molécula de citrato produce isocitrato, el cual sufre descarboxilación oxidativa para dar origen a cetoglutarato α. VÍAS DE ASIMILACIÓN Crecimiento con acetato El acetato se metaboliza a través de acetil-CoA, y muchos microorganismos poseen la capacidad de formar acetil-CoA (figura 6-10). La molécula de acetil-CoA se utiliza para la bio- síntesis de cetoglutarato α y en la mayor parte de los microor- ganismos con mecanismos respiratorios, los fragmentos acetilo de acetil-CoA sufren oxidación completa a dióxido de carbono a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (figura 6-11). La capa- cidad de utilizar acetato como fuente neta de carbono se limita a unos cuantos microorganismos y plantas. La síntesis neta de apter 06_Carroll_4R.indd 84 apter 06_Carroll_4R.indd 84 14/04/16 14/04/16
- 98. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 85 Dihidroxiacetona fosfato (C3) Gliceraldehído 3-fosfato (C3) Fructosa 1,6-difosfato Dihidroxiacetona fosfato (C3) Eritrosa 4-fosfato (C4) Seudoheptulosa 1,7-difosfato Seudoheptulosa 7-fosfato (C7) Fructosa 6-fosfato (C6) Aldolasa, fosfatasa Cinasa, aldolasa Dihidroxiacetona fosfato (C3) Gliceraldehído 3-fosfato (C3) Fructosa 1,6-difosfato Fructosa 6-fosfato (C6) ADP ATP Transaldolasa Eritrosa 4-fosfato (C4) Fructosa 6-fosfato (C6) Seudoheptulosa 7-fosfato (C7) Gliceraldehído 3-fosfato (C3) Gliceraldehído 3-fosfato (C3) Fructosa 6-fosfato (C6) Xilulosa 5-fosfato (C5) Eritrosa 4-fosfato (C4) Gliceraldehído 3-fosfato (C3) Seudoheptulosa 7-fosfato (C7) Xilulosa 5-fosfato (C5) Ribosa 5-fosfato (C5) Transcetolasas Deshidrogenasas Ribulosa 5-fosfato (C5) Glucosa 6-fosfato (C6) NAD + NADH+H + NAD + NADH+H + CO2 H2O Fosfato H2O Fosfato FIGURA 66 Mecanismos bioquímicos para el cambio de longitud de las moléculas de carbohidrato. La fórmula empírica general para los ésteres fosfato de carbohidratos (Cn H2n On )-N-fosfato se abrevia (Cn ) con la finalidad de destacar los cambios en la longitud de la cadena. apter 06_Carroll_4R.indd 85 apter 06_Carroll_4R.indd 85 14/04/16 14/04/16
- 99. 86 SECCIÓN IFundamentos de microbiología precursores biosintéticos a partir de acetato se logra mediante reacciones de acoplamiento del ciclo del ácido tricarboxílico con dos reacciones adicionales catalizadas por isocitrato liasa y malato sintasa. Como se muestra en la figura 6-12, estas reaccio- nes permiten la conversión oxidativa neta de dos radicales acetilo a partir de acetil-CoA a una molécula de succinato. El succinato puede utilizarse con fines biosintéticos después de su conversión a oxaloacetato, cetoglutarato α, fosfoenolpiruvato o G6PD. 6NAD + 6NADH 6CO2 6NAD + 6NADH 6C5 6C6 Transce- tolasa Transal- dolasa 2C5 2C5 2C7 2C3 2C6 Transce- tolasa 2C4 2C5 2C6 2C3 C6 H2O Fosfato Aldolasa, fosfatasa Reacción neta Glucosa 6-fosfato + 12NAD+ 6CO2 + 12NADH + Fosfato + H2O FIGURA 67 Vía de monofosfato de hexosas. Las reacciones oxidativas (figura 6-6) reducen el NAD+ (fosfato dinucleótido de nicotinamida y adenina) y producen CO2 , lo que acorta seis moléculas de fosfatos de hexosa (que se abrevian como C6 ) a seis fosfatos de pentosa (que se abrevian como C5 ). La predisposición de los carbohidratos (figura 6-6) convierte los fosfatos de pentosa a fosfatos de hexosa de forma tal que puede continuar el ciclo oxidativo. CH2OPO3 2– CH2OH C O CH2OPO3 2– CHO HCOH CH2OPO3 2– CO2 – HCOH CH2OPO3 2– O COPO3 2– HCOH 3-fosfoglicerato CH2OH CO2 – HCOPO3 2– 2-fosfoglicerato CH2 CO2 – COPO3 2– Fosfoenolpiruvato FOSFORILACIÓN DEL SUSTRATO OXIDACIÓN 1,3-difosfoglicerato Fosfatos de triosa H2O Piruvato CH3 CO2 – C O FOSFORILACIÓN DEL SUSTRATO Pi ADP ATP ATP ADP NAD+ NADH+H+ FIGURA 68 Formación de fosfoenolpiruvato y de piruvato a partir de fosfatos de triosa. La figura llama la atención a dos sitios de fosforilación del sustrato y a un paso oxidativo que da origen a la reducción de NAD+ (fosfato dinucleótido de nicotinamida y adenina) a NADH (hidruro dinucleótido de nicotinamida y adenina). La repetición de esta vía productora de energía demanda un mecanismo de oxidación para NADH a NAD+ . Para lograr este objetivo, los microorganismos fermentadores utilizan piruvato o metabolitos derivados del piruvato como oxidantes. Crecimiento con dióxido de carbono: ciclo de Calvin Al igual que las plantas y algas, varias especies microbianas pueden utilizar dióxido de carbono como única fuente de carbono. En casi todos estos organismos, la vía primaria de asi- milación de carbono es mediante el ciclo de Calvin, en el cual el dióxido de carbono y difosfato de ribulosa se combinan para apter 06_Carroll_4R.indd 86 apter 06_Carroll_4R.indd 86 14/04/16 14/04/16
- 100. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 87 Piruvato CH3 CO2 – C O CH2 CO2 – COPO3 2– Oxaloacetato CH2CO2 – CCO2 – O Se necesita acetil-CoA para la actividad ATP ADP CO2 CO2 Cetoglutarato α Oxalosuccinato CH2CO2 – CHCO2 – CCO2 – O CH2CO2 – CH2 CCO2 – O Isocitrato CHCO2 – CHCO2 – HOCHCO2 – Piruvato CH3 CO2 – C O Acetil-CoA CH3CSCoA O CO2 NADH+H + NAD + HSCoA Aconitato CH2CO2 – CCO2 – CHCO2 – Citrato CH2CO2 – HOCCO2 – CH2CO2 – H2O H2O HSCoA H2O Pi ATP AMP NAD+ NADH+H+ CO2 H2O Fosfoenol- piruvato FIGURA 69 Conversión de piruvato a cetoglutarato α. El piruvato se convierte a cetoglutarato α por una desviación de la vía biosintética. En una dirección, el piruvato se oxida a acetil-CoA; en el otro sentido, el piruvato sufre carboxilación a oxaloacetato. OXIDACIÓN β Acetil-CoA CH3CSCoA O H3(CH2CH2)nCSCoA O Ácido graso-acil-CoA HSCoA ATP PPi AMP CH3CO2 – Acetato HSCoA ATP PPi AMP NAD+ HSCoA CO2 NADH+H+ Piruvato CH3 CO2 – C O CH3(CH2CH2)nCO2 – Ácidos grasos FIGURA 610 Fuentes bioquímicas de acetil-CoA. AMP, monofosfato de adenosina; ATP, trifosfato de adenosina. apter 06_Carroll_4R.indd 87 apter 06_Carroll_4R.indd 87 14/04/16 14/04/16
- 101. 88 SECCIÓN IFundamentos de microbiología formar dos moléculas de 3-fosfoglicerato (figura 6-13A). El 3-fosfoglicerato sufre fosforilación a 1,3-difosfoglicerato y este compuesto se reduce a gliceraldehído 3-fosfato, un derivado triosa. Las reacciones de reordenamiento de carbohidratos (figura 6-6) permiten que los fosfatos de triosa se conviertan a ribulosa 5-fosfato, un derivado pentosa, el cual sufre fosfori- lación para regenerar la molécula aceptora, ribulosa 1,5-difos- fato (figura 6-13B). El carbono adicional reducido, formado por la asimilación de reducción del dióxido de carbono, se convierte a metabolitos focales para las vías de biosíntesis. Las células que utilizan dióxido de carbono como única fuente de carbono se denominan autótrofas y las demandas de este patrón de asimilación de carbono pueden resumirse brevemente como sigue: además de las reacciones primarias de asimilación que dan origen a 3-fosfoglicerato, debe haber un mecanismo para la regeneración de la molécula aceptora, H2O HSCoA Acetil-CoA CH3CSCoA O Isocitrato CHCO2 – CH2CO2 – HOCHCO2 – Oxalosuccinato CH2CO2 – CHCO2 – CCO2 – O Succinil-CoA CH2CSCoA O CH2CO2 – CH2CO2 – CH2CO2 – Succinato CHCO2 – CHCO2 – Fumarato HOCHCO2 – CH2CO2 – L-malato Oxaloacetato CH2CO2 – CCO2 – O Citrato CH2CO2 – HOCCO2 – CH2CO2 – Aconitato CCO2 – CHCO2 – CH2CO2 – Cetoglutarato α CH2CO2 – CH2 CCO2 – O NAD + NADH+H + NAD + NADH+H + CO2 HSCoA HSCoA GTP GDP NAD+ NADH + H+ CO2 Enz(FADH2) Enz(FAD) Reacción neta Acetil-CoA + 3NAD+ + Enz(FAD) + GDP + Pi + 2H2O → HSCoA + 2CO2 + 3NADH + 3H + + Enz(FADH2) + GTP H2O H2O H2O FIGURA 611 Ciclo del ácido tricarboxílico. Hay cuatro etapas de oxidación, tres de las cuales dan origen a NADH (hidruro dinucleótido de nicotinamida y adenina) y una da origen a una flavoproteína reducida, Enz(FADH2 ). El ciclo puede continuar sólo si se dispone de aceptores de electrones para que oxiden el NADH y la flavoproteína reducida. GDP, difosfato de guanosina; GTP, trifosfato de guanosina. ribulosa 1,5-difosfato. Este proceso demanda la reducción dependiente de energía del 3-fosfoglicerato hasta el nivel de carbohidrato. Por eso, para los mecanismos autótrofos se nece- sita dióxido de carbono, ATP, NADPH y un grupo de enzimas específicas. Despolimerasas Muchos sustratos potenciales para el crecimiento se encuen- tran en forma de bloques de construcción en la estructura de polímeros biológicos. Estas moléculas grandes no se transpor- tan con facilidad por la membrana celular y a menudo perma- necen fijas a estructuras celulares incluso más grandes. Muchos microorganismos producen despolimerasas que hidrolizan proteínas (p. ej., proteasas), ácidos nucleicos (p. ej., nucleasas), apter 06_Carroll_4R.indd 88 apter 06_Carroll_4R.indd 88 14/04/16 14/04/16
- 102. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 89 Acetil-CoA CH3CSCoA O Isocitrato CHCO2 – CH2CO2 – HOCHCO2 – CH2CO2 – CH2CO2 – Succinato HOCHCO2 – CH2CO2 – L-malato Oxaloacetato CH2CO2 – CCO2 – O Citrato CH2CO2 – HOCCO2 – CH2CO2 – Aconitato CCO2 – CHCO2 – CH2CO2 – Glioxilato CHCO2 – O NAD + NADH+H+ HSCoA H2O HSCoA H2O Acetil-CoA CH3CSCoA O ISOCITRATO LIASA MALATO SINTASA H2O H2O Reacción neta 2Acetil-CoA + NAD+ + 2H2O → Succinato + 2HSCoA + NADH + H+ FIGURA 612 Ciclo del glioxilato. Obsérvese que las reacciones que convierten malato a isocitrato se comparten con el ciclo del ácido tricarboxílico (figura 6-11). La divergencia metabólica al nivel del isocitrato y la acción de dos enzimas, la isocitrato liasa y la malato sintasa, modifican el ciclo del ácido tricarboxílico de forma que por medio de reducción se convierten dos moléculas de acetil-CoA a succinato. polisacáridos (p. ej., amilasa) y lípidos (p. ej., lipasas). El patrón de las actividades de despolimerasas puede ayudar a identificar microorganismos. Oxigenasas Muchos compuestos del medio ambiente son relativamente resistentes a la modificación enzimática; el aprovechamiento de estos compuestos como sustratos para el crecimiento exige una clase especial de enzimas, las oxigenasas. Tales enzimas utili- zan directamente el oxígeno molecular, un oxidante potente, como sustrato para las reacciones que convierten compuestos relativamente intratables a una forma en la cual pueden asimi- larse, lo que es favorecido por reacciones termodinámicas. En la figura 6-14 se ilustra la acción de las oxigenasas y se muestra la participación de dos oxigenasas diferentes en el aprovecha- miento del benzoato. Vías de reducción Algunos microorganismos viven en entornos extremadamente reductores que favorecen reacciones químicas que no ocu- rrirían en organismos que utilizan oxígeno como aceptor de electrones. En estos organismos, pueden utilizarse reductores potentes para favorecer reacciones que permitan la asimilación de compuestos relativamente intratables. Un ejemplo es la asi- milación por reducción del benzoato, un proceso en el cual el anillo aromático sufre reducción y se rompen sus enlaces para dar origen a pimelato de ácido dicarboxílico. Otras reacciones metabólicas convierten el pimelato a metabolitos focales. Asimilación de nitrógeno La asimilación reductiva de nitrógeno molecular, también conocida como fijación de nitrógeno, es indispensable para la continuación de la vida en este planeta. La fijación de nitrógeno apter 06_Carroll_4R.indd 89 apter 06_Carroll_4R.indd 89 14/04/16 14/04/16
- 103. 90 SECCIÓN IFundamentos de microbiología ATP ADP CO2 CH2OH HCOH HCOH C O CH2OPO3 2– Ribulosa 5-fosfato (C5) CH2OPO3 2– HCOH HCOH C O CH2OPO3 2– Ribosa 1,5-difosfato 2HCOH CH2OPO3 2– CO2 – Dos moléculas de 3-fosfoglicerato 2HCOH CH2OPO3 2– COPO3 2– O Dos moléculas de 1,3-difosfoglicerato 2HCOH CH2OPO3 2– CHO Dos gliceraldehídos 3-fosfato (2 C3) 2ATP 2ADP 2NADPH 2NADP+ A B Trans- cetolasa 2C6 2C5 2C3 2C4 Aldolasa, fosfatasa 2C3 Trans- cetolasa 2C7 6C5 2C5 2C3 2C5 Aldolasa, fosfatasa Metabolitos focales y biosíntesis 2C3 4C3 6CO2 12NADP + 12NADPH 12C3 Asimilación reductiva de CO2 Reacción neta 6CO2 + 12NADPH + 18ATP → 2 Triosa-fosfato (C3) + 12NADP+ + 18ADP + 18Pi 12ATP 12ADP 6ATP 6ADP FIGURA 613 Ciclo de Calvin. A: Asimilación reductiva de CO2 . Se utilizan trifosfato de adenosina (ATP) y fosfatato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADPH) para convertir por medio de reducción la pentosa 5-fosfato (C5 ) a dos moléculas de triosa-fosfato (C3 ). B: El ciclo de Calvin se completa con las reacciones de reordenamiento de carbohidratos (figura 6-6) que permite la síntesis neta de carbohidrato y la regeneración de fosfatos de pentosa de forma que puede continuar el ciclo. ADP, difosfato de adenosina. se logra gracias a diversas bacterias y cianobacterias que uti- lizan varios componentes del complejo enzimático de nitro- genasas. Pese a los diversos microorganismos capaces de fijar nitrógeno, el complejo de nitrogenasas es similar en la mayor parte de ellos (figura 6-15). La nitrogenasa es un complejo de dos enzimas: una enzima contiene hierro (dinitrogenasa reductasa) y otra contiene hierro y molibdeno (dinitrogenasa). En conjunto, estas enzimas catalizan la siguiente reacción: N2 + 6H+ + 6e− + 12ATP → 2NH3 + 12ADP + 12Pi Por la alta energía de activación para el desdoblamiento del triple enlace, que es muy fuerte y que une los dos átomos apter 06_Carroll_4R.indd 90 apter 06_Carroll_4R.indd 90 14/04/16 14/04/16
- 104. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 91 de nitrógeno, esta asimilación de reducción de nitrógeno exige una cantidad sustancial de energía metabólica. Se hidrolizan entre 20 y 24 moléculas de ATP para que se reduzca una sola molécula de N2 a dos moléculas de NH3 . Otras demandas fisiológicas se derivan del hecho de que la nitrogenasa se desactiva con facilidad en presencia de oxí- geno. Los microorganismos aerobios que utilizan nitrogenasa han desarrollado un elaborado mecanismo para proteger la enzima contra la desactivación. Algunos microorganismos crean células especializadas en las cuales tienen lugar la fija- ción de nitrógeno y en otras se ha desarrollado una cadena de transporte de electrones que protegen las nitrogenasas contra la desactivación por el oxígeno. Las bacterias de mayor importancia en la agricultura son las Rhizobiaceae, que fijan nitrógeno en forma simbiótica en nódulos de la raíz de plantas leguminosas. La capacidad de utilizar amoniaco como fuente de nitró- geno está muy distribuida entre los microorganismos. El sitio primario de entrada del nitrógeno en el metabolismo del car- bono es el glutamato, el cual se forma por aminación reductiva de cetoglutarato α. Como se muestra en la figura 6-16, hay dos mecanismos bioquímicos por los cuales puede llevarse esto a cabo. El primero de ellos es, en un solo paso, la reducción catalizada por la glutamato deshidrogenasa (figura 6-16A), la Benzoato Catecol CO2 – CO2 – OH OH OH OH CO2 – CO2 – O2 CO2 NADH + H + NAD + O2 NADH + H + NAD + Succinil-CoA + Acetil-CoA 5 pasos 1 2 Fd-8e– 8NAD + 8NADH + H+ 8Fd 16MgADP + Pi 16MgATP Fe-proteína Prot eína – Fe N2 2NH3 2H + + 2e– 6H+ + 6e– Sistema de oxidasa terminal H2 2H+ + 2e– Hidrogenasa de captación Leghemoglobina O2 Carbohidrato (obtenido de la glucólisis o fotosíntesis) Mo FIGURA 614 Participación de las oxigenasas en la utilización aeróbica de benzoato como fuente de carbono. El oxígeno molecular participa directamente en las reacciones que rompen el anillo aromático de benzoato y catecol. FIGURA 615 Reducción de N2 a dos moléculas de NH3 . Además de ser reductora, la reacción de nitrogenasa necesita cantidades sustanciales de energía metabólica. Se desconoce el número de moléculas de trifosfato de adenosina (ATP) indispensables para la reducción de una sola molécula de nitrógeno a amoniaco; la cifra parece encontrarse entre 12 y 16. La reacción general necesita 8 NADH (fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina) H+ . Seis de estas moléculas se utilizan para reducir N2 a 2NH3 y dos se utilizan para la síntesis de H2 . La hidrogenasa de captación regresa H2 al sistema, con lo que se conserva la energía. (Redibujada y reproducida con autorización de Moat AG, Foster JW: Microbial Physiology, 4a. ed. Wiley-Liss, 2002. Copyright © 2002 Wiley-Liss, Inc, Nueva York. Reservados todos los derechos.) apter 06_Carroll_4R.indd 91 apter 06_Carroll_4R.indd 91 14/04/16 14/04/16
- 105. 92 SECCIÓN IFundamentos de microbiología C O CH2 CH2 CO2 – H3NCH + Glutamina + NH2 Cetoglutarato α + CH2 CH2 CO2 – CO2 – C O Dos moléculas de glutamato + + CH2 CH2 CO2 – CO2 – H3NCH + Bajas concentraciones de amoniaco B Glutamato + + C O CH2 CH2 CO2 – H3NCH + Glutamina NH2 NH3 + + ADP Pi CH2 CH2 CO2 – CO2 – C O Altas concentraciones de amoniaco A Cetoglutarato α + + NH3 NADPH NADPH CH2 CH2 CO2 – CO2 – Glutamato H3NCH + + NADP+ NADP + CH2 CH2 CO2 – CO2 – H3NCH + CH2 CH2 CO2 – CO2 – H3NCH + ATP FIGURA 616 Mecanismos para la asimilación de NH3 . A: Cuando la concentración de NH3 es alta, las células tienen la capacidad de asimilar el compuesto a través de reacciones de glutamato deshidrogenasa. B: Cuando la concentración de NH3 es baja (lo que sucede con mucha frecuencia) las células acoplan las reacciones de glutamina sintasa y de glutamato sintasa para invertir la energía producida por la hidrólisis de enlaces de pirofosfato para la asimilación de amoniaco. cual es eficaz en ambientes en los cuales existe un suministro abundante de amoniaco. El otro mecanismo es un proceso de dos pasos en el cual la glutamina es un producto intermedio (figura 6-16B), que se utiliza en ambientes con poco suministro de amoniaco. Este último mecanismo muestra que las células invierten energía libre formada por la hidrólisis de enlaces de pirofosfato en el ATP para la asimilación de amoniaco del medio ambiente. El nitrógeno amida de la glutamina, un intermediario en el proceso de asimilación de dos pasos del amoniaco a gluta- mato (figura 6-16B), también se transfiere directamente en el nitrógeno orgánico que aparece en las estructuras de purinas, pirimidinas, arginina, triptófano y glucosamina. La actividad y síntesis de la glutamina sintasa está regulada por el sumi- nistro de amoniaco y por la disponibilidad de metabolitos que contengan nitrógeno derivado directamente del nitrógeno amida de la glutamina. La mayor parte del nitrógeno orgánico de las células se deriva del grupo amino α del glutamato y la transaminación es el mecanismo principal por el cual se transfiere el nitrógeno. El aceptor habitual en estas reacciones es un cetoácido α, que se transforma al aminoácido α correspondiente. El cetoglutarato α es otro producto de reacciones de transaminación y puede convertirse en glutamato por aminación reductiva (figura 6-16). VÍAS BIOSINTÉTICAS Seguimiento de las estructuras de precursores biosintéticos: glutamato y aspartato En muchos casos, los esqueletos de carbono de un producto metabólico terminal pueden rastrearse hasta sus orígenes bio- sintéticos. La glutamina, un ejemplo obvio, se deriva evidente- mente del glutamato (figura 6-17). El esqueleto del glutamato en la estructura de arginina y prolina (figura 6-17) es menos obvio, pero se identifica con facilidad. De la misma forma, el esqueleto de carbono del aspartato, que se deriva directamente apter 06_Carroll_4R.indd 92 apter 06_Carroll_4R.indd 92 14/04/16 14/04/16
- 106. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 93 del metabolito focal oxaloacetato, es evidente en las estructuras de asparagina, treonina, metionina y pirimidinas (figura 6-18). En algunos casos, diferentes esqueletos de carbono se combi- nan en una vía sintética. Por ejemplo, el semialdehído de aspar- tato y el piruvato se combinan para dar origen a precursores metabólicos de lisina, ácido diaminopimélico y ácido dipicolí- nico (figura 6-19). Los dos últimos compuestos se encuentran sólo en células procariotas. El ácido diaminopimélico es com- ponente del peptidoglucano en la pared celular, en tanto que el ácido dipicolínico constituye un componente importante en las endosporas. Síntesis de peptidoglucano de la pared celular Enlafigura2-15semuestralaestructuradelpeptidoglucano;enla figura 6-20A se muestra una forma simplificada del mecanismo por el cual se sintetiza. La síntesis de peptidoglucano inicia con una síntesis escalonada en el citoplasma de UDP-ácido N-ace- tilmurámico-pentapéptido. La N-acetilglucosamina se une en primer lugar al difosfato de uridina (UDP, uridine diphosphate) y luego se convierte a UDP-ácido N-acetilmurámico por con- densación con fosfoenolpiruvato y reducción. Los aminoácidos del pentapéptido se añaden de manera secuencial, con cada adición catalizada por una enzima diferente, y cada una parti- cipa en el desdoblamiento de ATP a ADP + Pi . El complejo UDP-ácido N-acetilmurámico-pentapéptido se une al bactoprenol (un lípido de la membrana celular) y recibe una molécula de N-acetilglucosamina de UDP. Algunas bacterias (p. ej., Staphylococcus aureus) forman un derivado pentaglicina en una serie de reacciones que utilizan glicil-tRNA Arginina Glutamina Prolina CH2 CH2 CO2 – NH2 C O CH2 CH2 CH2 CO2 – NH2 NH C NH C H2 CH2 H2C HN CH CO2 – H3NCH + H3NCH + Asparagina CH2 CO2 – NH2 H3NCH + C O Treonina CHOH CH3 CO2 – H3NCH + Metionina CH2 CH2 S CH3 CO2 – H3NCH + Uracilo C O N H HN C O CH2 CH2 FIGURA 617 Aminoácidos formados de glutamato. FIGURA 618 Productos biosintéticos terminales formados de aspartato. como donador; el polisacárido completo se polimeriza a un intermediario oligomérico antes de ser transferido al extremo en crecimiento de un polímero de glucopéptido en la pared celular. Los enlaces cruzados finales (figura 6-20B) se llevan a cabo por una reacción de transpeptidación en la cual el grupo amino libre del residuo de pentaglicina desplaza el residuo terminal D-alanina del pentapéptido vecino. La transpepti- dación es catalizada por un grupo de enzimas denominadas proteínas de unión a la penicilina (PBP, penicillin-binding pro- teins), que producen la unión covalente de la penicilina y otros antibióticos β lactámicos en forma covalente debido en parte a similitudes estructurales entre estos antibióticos y precursores pentapeptídicos. Algunos PBP tienen actividad de transpepti- dasa o carboxipeptidasas, y quizá sus tasas relativas controlan el grado de formación de enlaces cruzados en el peptidoglu- cano (un factor importante en la tabicación celular). La vía biosintética es de particular importancia en la medi- cina porque proporciona la base para la acción antibacteriana selectiva de los fármacos quimioterapéuticos. A diferencia de las células hospedadoras, las bacterias no son isotónicas con los líquidos corporales. Su contenido se encuentra bajo altas presiones osmóticas y su viabilidad depende de que se conserve la integridad de la capa de peptidoglucano en la pared celular a lo largo del ciclo celular. Cualquier compuesto que inhiba algún paso en la biosíntesis de peptidoglucano ocasiona que la pared de la célula bacteriana en crecimiento se debilite con la destrucción subsiguiente de la célula. En la figura 6-20A y B se muestran los sitios de acción de varios antibióticos. Síntesis de los lipopolisacáridos de la envoltura celular En la figura 2-19 se muestra la estructura general de los lipo- polisacáridos antigénicos de la envoltura celular de bacterias gramnegativas. La biosíntesis de grupos terminales de repeti- ción, que proporciona a la envoltura celular su especificidad antigénica, se muestra en la figura 6-21. Obsérvese la similitud con la síntesis de peptidoglucano. En ambos casos, un grupo de subunidades se unen con un líquido transportador en la membrana y luego son transferidos a los extremos abiertos del polímero en crecimiento. Síntesis de polímeros capsulares extracelulares Los polímeros capsulares, de los cuales se enumeran unos cuan- tos ejemplos en el cuadro 2-2, se sintetizan por medios enzimá- ticos de subunidades activas. No ha intervenido en este proceso ningún transportador de lípidos unido a la membrana. La pre- sencia de una cápsula a menudo está determinada por situa- ciones ambientales: por ejemplo, los dextranos y levanos sólo pueden sintetizarse si se utiliza el disacárido sacarosa (fructo- sa-glucosa) como la fuente de la subunidad apropiada y, por lo tanto, su síntesis depende de la presencia de sacarosa en el medio. Síntesis de gránulos alimenticios de reserva Cuando los nutrientes exceden las cantidades necesarias para el crecimiento, las bacterias convierten algunos nutrientes apter 06_Carroll_4R.indd 93 apter 06_Carroll_4R.indd 93 14/04/16 14/04/16
- 107. 94 SECCIÓN IFundamentos de microbiología a gránulos alimenticios de reserva. Los principales incluyen almidón, glucógeno, poli-β-hidroxibutirato y volutina, que consiste principalmente de polifosfato inorgánico (capítulo 2). El tipo de gránulo formado es específico de una especie dada. Los gránulos sufren degradación cuando hay agotamiento de los nutrientes exógenos. PATRONES MICROBIANOS DEL METABOLISMO PARA LA PRODUCCIÓN DE ENERGÍA Como se menciona en el capítulo 5, hay dos mecanismos meta- bólicos principales para la generación de enlaces de pirofosfato ácido ricos en energía en el ATP: fosforilación del sustrato (transferencia directa de enlaces de fosfato anhídrido a partir de un donador orgánico para el ADP) y la fosforilación de ADP por un fosfato inorgánico. Esta última reacción es desfavorable en términos energéticos y debe ser estimulada por un gradiente electroquímico transmembrana, la fuerza motriz protónica. En la respiración el gradiente electroquímico se crea a partir de oxidantes y reductores suministrados por el medio externo. La energía liberada por transferencia de electrones de sustan- cias reductoras a oxidantes a través de transportadores unidos a la membrana se acopla para la formación de un gradiente H C N H2C HC HOOC CH C O COOH H3C C COOH H C NH2 H2C HC HOOC O N COOH HOOC + Semialdehído de aspartato Piruvato Ácido dihidropicolínico Ácido dipicolínico (esporas) –2H2O –2H H2 C N H2C HC HOOC CH2 C Ácido tetrahidropicolínico COOH H2 C O H2C C HOOC CH2 HC NH (Succ) COOH +H2O –CO2 CoA Succinil-CoA Ácido diaminopimélico (paredes celulares) (CH2)3 COOH COOH HC HC NH2 Lisina (proteínas y paredes celulares) (CH2)3 COOH H2C NH2 HC NH2 NH2 +2H FIGURA 619 Productos biosintéticos terminales formados de semialdehído de aspartato y piruvato. electroquímico transmembrana. En la fotosíntesis, la energía luminosa genera reductores y oxidantes relacionados con la membrana; la fuerza motriz protónica se genera a medida que estos transportadores de electrones regresan a un estado de equilibrio. Estos procesos se revisan más adelante. Vías de fermentación A. Estrategias para la fosforilación del sustrato En ausencia de respiración o de fotosíntesis, las células depen- den por completo de la fosforilación de sustrato para la pro- ducción de energía: la generación de ATP debe acoplarse con modificaciones químicas de compuestos orgánicos. Muchos compuestos pueden actuar como sustratos fermentables y para su fermentación varias vías han evolucionado. Estas vías tienen tres etapas generales: 1) conversión de un compuesto fermenta- ble a un donador de fosfato por fosforilación del sustrato. Esta etapa a menudo contiene reacciones metabólicas en las cua- les el NAD+ se reduce a NADH. 2) Fosforilación de ADP por un donador de fosfato rico en energía. 3) Pasos metabólicos que llevan a los productos de la fermentación a un equilibrio químico con los materiales iniciales. Lo que suele necesitarse en esta última etapa es un mecanismo para la oxidación de NADH, generado en el primer paso de fermentación, a NAD+ , de forma que pueda continuar la fermentación. En la siguiente apter 06_Carroll_4R.indd 94 apter 06_Carroll_4R.indd 94 14/04/16 14/04/16
- 108. Membrane Membrane – – – – Se sintetizan derivadosUDP de NAM y NAG (no se muestra). El complejo NAM-pentapéptido se transfiere al fosfato de bactoprenol. Se unen por medio de enlaces de pirofosfato. El UDP transfiere NAG al complejo bactoprenol-NAM-pentapéptido. Si se necesita la interposición de pentaglicina, se crea con moléculas especiales de glicil-tRNA, pero no con ribosomas. La formación de puentes ocurre en la membrana. Adición secuencial de aminoácidos a UDP-NAM para formar el complejo NAM-pentapéptido. Se utiliza ATP para favorecer la reacción, pero no participan el RNA y los ribosomas en la formación de enlaces peptídicos que unen los aminoácidos. Los enlaces cruzados entre las cadenas de peptidoglucano se forman por transpeptidación (no se muestran). El transportador bactoprenol se desplaza a través de la membrana. A medida que lo hace, pierde un fosfato y se convierte en fosfato de bactoprenol. Ahora está preparado para iniciar un nuevo ciclo. Los transportadores de bactoprenol transportan las unidades repetidas del complejo NAG-NAM pentapéptido a través de la membrana. El complejo NAG-NAM pentapéptido se une al extremo en crecimiento de la cadena de peptidoglucano, lo que aumenta la longitud de la cadena en repeticiones de una unidad. Periplasma Membrana Bactoprenol Bactoprenol Bactoprenol Citoplasma L-Ala L-Ala D-Glu D-Ala D-Ala UDP NAM L-Lys (DAP) NAM UDP NAG Lípido I Pentapéptido NAM NAG Pentapéptido Bactoprenol NAM Lípido II Pentapéptido Bactoprenol UDP D-Ala UDP NAM Pentapéptido NAG Cicloserina Peptidoglucano Peptidoglucano NAM NAG Pentapéptido Pi A Bacitracina Vancomicina P P P P P P P P P 7 2 1 3 3 4 5 6 4 2 8 7 5 6 UMP B D Ala L Ala D Ala Ala L D Glu Ala DAP D D Ala D Glu D DAP H2N Ala D NAG L Ala NAM ••• ••• ••• D NAG ••• NAM L Ala Glu Ala D DAP D Glu D Ala DAP Penicilinas L L D L Ala Ala NAM NAG ••• ••• ••• ••• NAG NAM NAG ••• NAG ••• NAM NAM ••• ••• ••• ••• NAG NAM L ••• NAM ••• NAG Ala D D GluNH2 GluNH2 Ala Lys D D Ala Lys (Gly)5 D Ala Ala L D L Ala GluNH2 -GluNH2 D Ala Lys D D Ala Lys (Gly)5 Ala L L Transpeptidación de Escherichia coli Transpeptidación de Staphylococcus aureus H2N FIGURA 620 A: Síntesis de peptidoglucano. Los pentapéptidos contienen L-lisina en el peptidoglucano de Staphylococcus aureus y ácido diaminopimélico (DAP) en Escherichia coli. También se muestra la inhibición con bacitracina, cicloserina y vancomicina. Los números corresponden a seis de las ocho etapas revisadas en el texto. Se ilustra la etapa ocho en B. NAM corresponde a ácido N-acetilmurámico y NAG a N-acetilglucosamina; UDP, difosfato de uridina. B: Transpeptidación. Reacciones de transpeptidación en la formación de peptidoglucanos de Escherichia coli y S. aureus. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. ed., McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) 95 apter 06_Carroll_4R.indd 95 apter 06_Carroll_4R.indd 95 14/04/16 14/04/16
- 109. 96 SECCIÓN IFundamentos de microbiología sección se consideran ejemplos de cada una de las tres etapas de fermentación. B. Fermentación de la glucosa La diversidad de las vías de fermentación queda demostrada si se tienen en cuenta algunos de los mecanismos utilizados por los microorganismos para lograr la fosforilación del sustrato a expensas de la glucosa. En principio, la fosforilación de ADP a ATP puede acoplarse para alguna de dos transformaciones equilibradas en términos químicos: Glucosa −−−→2 ácido láctico (C6 H12 O6 ) (C3 H6 O3 ) o Glucosa −−−→2 Etanol + 2 Dióxido de carbono (C6 H12 O6 ) (C2 H6 O) (CO2 ) Los mecanismos bioquímicos por medio de los cua- les ocurren estas transformaciones pueden variar de manera considerable. En general, la fermentación de la glucosa se inicia por la fosforilación a G6PD. Hay dos mecanismos por medio de los cuales ocurre esto: 1) la glucosa extracelular puede transpor- tarse a través de la membrana citoplásmica hacia el interior de la célula donde más tarde se fosforila por el ATP para dar ori- gen a G6PD y ADP. 2) En muchos microorganismos, la glucosa extracelular sufre fosforilación a medida que se transporta a través de la membrana citoplásmica por un sistema enzimático que produce la fosforilación extracelular de la glucosa a expen- sas de fosfoenolpiruvato, lo que da origen a G6PD y piruvato P BP- -gal-rha-man P P - BP- -(gal-rha-man)n–1 P P - BP- -gal-rha P P - BP- -(gal-rha-man)n P P - BP- -gal P P - BP- P P - BP- P BP- P P - Polisacárido central Polisacárido central-(gal-rha-man)n Pi UMP UDP-gal TDP GDP GDP-man TDP-rha FIGURA 621 Síntesis de las unidades de repetición de las cadenas laterales de polisacáridos de Salmonella newington y su transferencia a los lipopolisacáridos. BP, bactroprenol; GDP, difosfato de guanosina; TDP, difosfato de timidina; UDP, difosfato de uridina; UMP, monofosfato de uridina. intracelulares. Este último proceso es un ejemplo de metabo- lismovectorial,un grupo de reacciones bioquímicas en las cua- les se alteran la estructura y ubicación del sustrato (capítulo 2). Cabe hacer notar que la elección de ATP o de fosfoenolpiru- vato como agente de fosforilación no altera la cantidad de ATP producido por la fermentación porque el fosfoenolpiruvato se utiliza como fuente de ATP en etapas avanzadas de la fermen- tación (figura 6-8). C. Vía de Embden-Meyerhof Esta vía (figura 6-22) que con frecuencia se encuentra como mecanismo para la fermentación de la glucosa, utiliza una cinasa y una aldolasa (figura 6-6) para transformar el fosfato de hexosa (C6 ) a dos moléculas de fosfato de triosa (C3 ). Hay cua- tro reacciones de fosforilación del sustrato que acompañan la conversión de la triosa-fosfato a dos moléculas de piruvato. Así, si se tienen en consideración los dos enlaces de pirofosfato de ATP necesarios para la formación de triosa-fosfato a partir de glucosa, la vía de Embden-Meyerhof produce una cantidad neta de dos enlaces de pirofosfato de ATP. La formación de piru- vato a partir de triosa-fosfato es un proceso oxidativo en el cual se forma NADH en el primer paso metabólico (figura 6-22) que debe convertirse a NAD+ para que continúe la fermentación; en la figura 6-23 se ilustran dos mecanismos simples para lograr este objetivo. La reducción directa de piruvato por NADH pro- duce lactato como producto terminal de la fermentación, lo que da origen a la acidificación del medio. El piruvato también puede ser descarboxilado para formar acetaldehído, que des- pués se utiliza para oxidar el NADH, lo que da origen a la pro- ducción del etanol, un producto neutro. La vía tomada depende de los antecedentes evolutivos del microorganismo y, en algu- nos microorganismos, de las condiciones de crecimiento. apter 06_Carroll_4R.indd 96 apter 06_Carroll_4R.indd 96 14/04/16 14/04/16
- 110. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 97 D. Fermentaciones de Entner-Doudoroff y de heterolactato Las vías alternativas para la fermentación de glucosa incluyen algunas acciones enzimáticas especializadas, que se muestran en la figura 6-24. La vía de Entner-Doudoroff difiere de otras vías del metabolismo de carbohidratos por una deshidratación de 6-fosfogluconato seguido de una reacción de aldolasa que Glucosa Glucosa 6-fosfato Fructosa 6-fosfato Fructosa 1,6-difosfato Gliceraldehído 3-fosfato 1,3-difosfoglicerato Gliceraldehído 3-fosfato Dihidroxiacetona fosfato e2 NAD1 H2O H2O NADH 1 H1 Pi e2 NAD1 NADH 1 H1 Pi 1,3-difosfoglicerato 3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato Piruvato Ocurre fosforilación de la glucosa a expensas de un ATP, dando origen a glucosa 6-fosfato, un metabolito precursor en la molécula de inicio para la vía de las pentosas. Isomerización de la glucosa 6-fosfato (un aldehído) a fructosa 6-fosfato (una acetona y metabolito precursor). El ATP se consume para producir la fosforilación de C1 de la fructosa. La célula consume parte de su energía a fin de obtener beneficios en la siguiente parte de la glucólisis. La fructosa 1,6-difosfato se desdobla en dos moléculas con tres carbonos, cada una de las cuales es un metabolito precursor. El gliceraldehído 3-fosfato sufre oxidación y fosforilación simultánea, creando una molécula rica en energía. Los electrones liberados reducen NAD1 a NADH. Se crea un ATP por fosforilación al nivel del sustrato. Se elabora otro metabolito precursor. Se elabora otro metabolito precursor. El desdoblamiento oxidativo de una molécula de glucosa da origen a la formación de dos moléculas de piruvato. El piruvato es uno de los metabolitos precursores más importantes. PO4 1 C C C C C C H C C C C C C 1 C C C C C C 1 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C 1 C C C C C C ATP ATP ATP ATP ATP ATP PO4 PO4 PO4 PO4 PO4 PO4 PO4 PO4 PO4 PO4 Fase de seis carbonos Fase de tres carbonos 3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato Piruvato ADP ADP ADP ADP ADP ADP FIGURA 622 Vía de Embden-Meyerhof. Esta es una de tres vías glucolíticas que se utilizan para catabolizar la glucosa a piruvato y puede funcionar durante la respiración aerobia, anaerobia y la fermentación. Cuando se utiliza durante el proceso respiratorio, las moléculas de NAD+ (fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina) aceptan los electrones y se transfieren a la cadena de transporte de electrones donde finalmente son aceptadas por un aceptor exógeno de electrones. Cuando se utilizan durante la fermentación, los electrones aceptados por NAD+ son donados a un aceptor endógeno de electrones (p. ej., piruvato). La vía de Embden-Meyerhof también es una vía anfibólica importante, porque genera varios metabolitos precursores (que se muestran en azul). ADP, adenosindifosfato; ATP, adenosintrifosfato. Reimpresa con autorización de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. ed., McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) produce piruvato y triosa-fosfato (figura 6-24A). La fermenta- cióndeheterolactatoyalgunasotrasvíasdefermentacióndepen- den de una reacción de fosfocetolasa (figura 6-24B) que produce el desdoblamiento fosforolítico de cetosafosfato para pro- ducir acetil fosfato y triosa-fosfato. El anhídrido ácido de acetil fosfato puede utilizarse para la síntesis de ATP o puede per- mitir la oxidación de dos moléculas de NADH a NAD+ como ocurre con la reducción hacia etanol. apter 06_Carroll_4R.indd 97 apter 06_Carroll_4R.indd 97 14/04/16 14/04/16
- 111. 98 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Piruvato CH3 CO2 – C O Lactato CH3 CO2 – CHOH NAD + NADH+H + Acetaldehído CH3 H C O NAD + NADH+H + CO2 Etanol CH3 CH2OH FIGURA 623 Dos mecanismos bioquímicos por los cuales el piruvato puede producir oxidación de NADH (dinucleótido de nicotinamida y adenina híbrido). Izquierda: Formación directa de lactato, lo que da origen a la producción neta de ácido láctico a partir de glucosa. Derecha: Formación de productos neutrales como dióxido de carbono y etanol. A B CH2OH HOCH HCOH C O CH2OPO3 2– Xilulosa 5-fosfato CH3COPO3 2– Acetil fosfato O CHO HCOH CH2OPO3 2– Gliceraldehído 3-fosfato Pi H2O CO2 – HCOH HCOH HCOH HOCH CH2OPO3 2– 6-fosfogluconato CO2 – CH2 HCOH HCOH C O CH2OPO3 2– 2-ceto-3-desoxi- 6-fosfogluconato Piruvato CH3 CO2 – C O CHO HCOH CH2OPO3 2– Gliceraldehído 3-fosfato FIGURA 624 Reacciones asociadas a vías específicas de la fermentación de carbohidratos. A: Reacciones de deshidratasa y aldolasa utilizadas en la vía de Entner-Doudoroff. B: Reacción de fosfocetolasa. Esta reacción, que se encuentra en varias vías para la fermentación de carbohidratos, genera la mezcla de ácidos anhídridos acetil fosfato, que pueden utilizarse como sustrato en la fosforilación de difosfato de adenosina (ADP). En las figuras 6-25 y 6-26 se muestran las generalidades de las vías de Entner-Doudoroff y de heterolactato. Mediante estas vías se produce sólo una molécula de triosa-fosfato a partir de glucosa y, por lo tanto, la energía obtenida es baja. A diferencia de la vía de Embden-Meyerhof, las vías de Entner-Doudoroff y heterolactato producen sólo un sustrato neto de fosforila- ción de ADP por molécula de glucosa fermentada. ¿Por qué se han elegido vías alternativas para la fermentación de glucosa en el ambiente natural? Para responder esta pregunta deben tenerse en mente dos hechos. En primer lugar, en la compe- tencia directa por la proliferación de dos especies microbia- nas, la tasa de aprovechamiento del sustrato puede ser más importante que la cantidad de crecimiento. En segundo lugar, la glucosa es uno de los varios carbohidratos encontrados por los microorganismos en su ambiente natural. Por ejemplo, las pentosas pueden ser fermentadas con bastante eficiencia por la vía de heterolactato. E. Variaciones adicionales en la fermentación de carbohidratos Las vías para la fermentación de carbohidratos pueden dar cabida a diversos sustratos que se describen a continuación, y los productos terminales pueden ser más diversos de lo que podría sugerirse. Por ejemplo, hay numerosos mecanismos para la oxidación de NADH a expensas de piruvato. Una de tales vías es la formación de succinato por reducción. Muchas bacterias de importancia clínica producen piruvato a partir de apter 06_Carroll_4R.indd 98 apter 06_Carroll_4R.indd 98 14/04/16 14/04/16
- 112. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 99 (Véase figura 6-24A) Glucosa Glucosa 6-fosfato 6-fosfogluconato ATP ADP NAD+ NADH+H + Piruvato ADP ATP Triosa-fosfato NAD + NADH+H+ ADP ATP (Véase figura 6-7) Lactato NAD + NADH+H+ Piruvato Lactato NAD+ NADH+H + H2O FIGURA 625 Vía de Entner-Doudoroff. ADP, difosfato de adenosina; ATP, trifosfato de adenosina. FIGURA 626 Fermentación heteroláctica de la glucosa. ADP, difosfato de adenosina; ATP, trifosfato de adenosina. Pentosa 5-fosfato NAD + NADH+H + CO2 (Véase figura 6-24B) (Véase figura 6-6) Glucosa Glucosa 6-fosfato ATP ADP NAD + NADH+H+ CH3COPO3 2– Acetil fosfato O CH3CH2OH Etanol NAD+ NADH+H + NAD + NADH+H + Piruvato ADP ATP Triosa-fosfato NAD+ NADH+H + ADP ATP (Véase figura 6-7) Lactato NAD+ NADH+H+ la glucosa por medio de la vía de Embden-Meyerhof y deben diferenciarse con base en los productos de reducción formados a partir de piruvato, lo que refleja la constitución enzimática de las diferentes especies. Los principales productos de fermenta- ción, enumerados en el cuadro 6-1, forman la base de muchas pruebas diagnósticas que se utilizan en el laboratorio clínico. F. Fermentación de otros sustratos Los carbohidratos no son, de ninguna manera, el único sus- trato susceptible de fermentación. El metabolismo de amino- ácidos, purinas y pirimidinas puede permitir la fosforilación del sustrato. Por ejemplo, la arginina puede actuar como fuente energética para dar origen a fosfato de carbamoil, que puede utilizarse para fosforilar el ADP a ATP. Algunos microorganismos fermentan pares de aminoácidos, y utilizan a uno como donador de electrones y al otro como aceptor. Patrones de respiración La respiración necesita una membrana cerrada. En las bac- terias, la membrana es la membrana celular. Los electrones pasan de un reductor químico a un oxidante químico a través de un grupo específico de transportadores de electrones en la membrana y como consecuencia se establece la fuerza motriz protónica (figura 6-27); el retorno de protones a través de la membrana se acopla con la síntesis de ATP. Como se sugiere en la figura 6-27, el reductor biológico para la respiración con frecuencia es NADH y el oxidante a menudo es el oxígeno. apter 06_Carroll_4R.indd 99 apter 06_Carroll_4R.indd 99 14/04/16 14/04/16
- 113. 100 SECCIÓN IFundamentos de microbiología CUADRO 61 Fermentación microbiana con base en la vía de Embden-Meyerhof Fermentación Microorganismo Producto Etanol Algunos hongos (sobre todo algunas levaduras) Etanol, CO2 Lactato (homofermentación) Streptococcus Algunas bacterias del género Lactobacillus Lactato (compone al menos 90% de la fuente energética de carbono) Lactato (heterofermentación) Enterobacter, Aeromonas, Bacillus polymyxa Etanol, acetoína, 2,3-butilenglicol, CO2 , lactato, acetato, formato (ácidos totales = 21 mol)a Propionato Clostridium propionicum, Propionibacterium, Corynebacterium diphtheriae Algunas bacterias de los géneros Neisseria, Veillonella, Micromonospora Propionato, acetato, succinato, CO2 Ácidos mixtos Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus Lactato, acetato, formato, succinato, H2 , CO2 , etanol (ácidos totales = 159 mol)a Butanol-butirato Butyribacterium, Zymosarcina maxima Algunas bacterias del género Clostridium Butanol, butirato, acetona, isopropanol, acetato, etanol, H2 , CO2 a Por 100 mol de glucosa fermentada. Membrana Medio ambiente Citoplasma NADH + H+ NAD + 2H 2H+ 2H + 2H + H + H + H2O 2H+ 2H + 2e – 2e – 2e – 1 /2O2 + 2H + + Pi ATPasa ADP ATP FIGURA 627 Acoplamiento del transporte de electrones en la respiración para la generación de trifosfato de adenosina (ATP). Los movimientos indicados de protones y electrones están mediados por transportadores (flavoproteínas, quinona, citocromos) relacionados con la membrana. El flujo de protones sigue un gradiente electroquímico, a través de la ATPasa de membrana, proporcionando la energía para la generación de ATP a partir de ADP y Pi . Véase el texto para explicaciones. En las fuentes de reductores utilizados para generar NADH se observa una sorprendente diversidad microbiana y muchos microorganismos pueden utilizar aceptores de electrones dife- rentes al oxígeno. Los sustratos para el crecimiento orgánico se convierten a metabolitos focales que pueden reducir NAD+ a NADH ya sea por la vía de monofosfato de hexosa (figura 6-7) o por el ciclo del ácido tricarboxílico (figura 6-11). Pue- den generarse otros reductores durante el desdoblamiento de algunos sustratos de crecimiento, por ejemplo, ácidos grasos (figura 6-10). Algunas bacterias, conocidas como quimiolitótrofas, son capaces de utilizar reductores inorgánicos para la respiración. Estas fuentes energéticas incluyen hidrógeno, hierro ferroso y varias formas reducidas de azufre y nitrógeno. El ATP obtenido por la respiración y el NADPH generado por los reductores pue- den utilizarse para favorecer el ciclo de Calvin (figura 6-13). Los iones y compuestos diferentes al O2 pueden servir como oxidantes terminales en la respiración. Esta capacidad, es decir, la respiración anaerobia, es un rasgo microbiano muy generalizado. Los aceptores adecuados para los electrones incluyen nitrato, sulfato y dióxido de carbono. El metabolismo respiratorio que depende de dióxido de carbono como aceptor de electrones es una propiedad que se encuentra en un gran grupo de microbios, las arqueobacterias. Los microorganis- mos de este grupo tienen, por ejemplo, la capacidad de redu- cir dióxido de carbono a acetato como un mecanismo para la generación de energía metabólica. Fotosíntesis bacteriana Los organismos fotosintéticos utilizan energía luminosa para separar la carga electrónica y crear reductores y oxidantes rela- cionados con la membrana como consecuencia de un evento fotoquímico. La transferencia de electrones de reductores a oxidantes crea una fuerza motriz protónica. Muchas bacterias llevan a cabo el metabolismo fotosintético sin depender en lo absoluto del oxígeno. La energía luminosa se utiliza como fuente de energía metabólica y el carbono para el crecimiento se obtiene ya sea a partir de compuestos orgánicos (fotohete- rótrofos) o a partir de la combinación de reductores inorgá- nicos (p. ej., tiosulfato) y dióxido de carbono (fotolitótrofos). Estas bacterias tienen un sistema único que, aunque es sufi- ciente para proporcionar energía para la síntesis de ATP y para la generación de gradientes iónicos transmembrana esenciales, apter 06_Carroll_4R.indd 100 apter 06_Carroll_4R.indd 100 14/04/16 14/04/16
- 114. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 101 no permite la reducción muy exergónica de NADP+ a expensas de agua. Dicho proceso, esencial para la fotosíntesis a partir de oxígeno, depende de la energía adicional suministrada prove- niente del acoplamiento de dos eventos fotoquímicos distintos estimulados por dos sistemas fotoquímicos independientes. En las células procariotas esta característica se encuentra sólo en las cianobacterias (bacterias azul-verdosas). Entre los micro- organismos eucariotas, el rasgo es compartido por algas y plantas en las cuales el organelo esencial para la producción de energía es el cloroplasto. REGULACIÓN DE LAS VÍAS METABÓLICAS En su ambiente normal, las células microbianas por lo gene- ral regulan sus vías metabólicas de forma que no se produzcan productos intermedios en cantidades excesivas. Cada reacción metabólica no sólo es regulada respecto a las demás en la célula, sino también respecto a las concentraciones de nutrientes en el medio ambiente. Por eso, cuando una fuente de carbono dispo- nible en forma esporádica súbitamente se encuentra en canti- dades abundantes, las enzimas necesarias para su catabolismo se incrementan tanto en cantidad como en actividad; por el contrario, cuando un bloque de construcción (p. ej., un ami- noácido) se encuentra de manera súbita en cantidades abun- dantes, las enzimas necesarias para su biosíntesis disminuyen tanto en cantidad como en actividad. La regulación de la actividad y síntesis enzimáticas pro- porciona control fino y control grueso de las vías metabólicas. Por ejemplo, la inhibición de la actividad enzimática por un producto secundario de una vía constituye un mecanismo de control fino, porque el flujo de carbono a través de dicha vía se regula de manera instantánea y con precisión. La inhibición de la síntesis enzimática por el mismo producto terminal, por otro lado, constituye un mecanismo de control grueso. Las mo- léculas preexistentes de enzima continúan funcionando hasta que se diluyen a causa del crecimiento celular adicional, aunque la síntesis proteínica innecesaria se interrumpe de inmediato. Los mecanismos por los cuales la célula regula la actividad enzimática se revisan en la siguiente sección. En el capítulo 7 se revisa la regulación de la síntesis enzimática. Regulación de la actividad enzimática A. Enzimas como proteínas alostéricas En muchos casos, la actividad de una enzima que cataliza un paso metabólico temprano en la vía metabólica es inhibida por un producto terminal de dicha vía. Sin embargo, tal inhi- bición no puede depender de la competencia por el sustrato enzimático porque la estructura del producto terminal y el intermediario temprano (sustrato) por lo común son bastante diferentes. Más bien, la inhibición depende de la regulación enzimática alostérica: cada enzima posee un sitio catalítico que se une al sustrato, pero también tiene uno o más sitios que se unen a moléculas reguladoras pequeñas, conocidas como efectores. La unión de un efector a su sitio causa un cambio conformacional en la enzima de forma tal que la afinidad del sitio catalítico para el sustrato se reduce (inhibición alostérica) o se incrementa (activación alostérica). Las proteínas alostéricas por lo común son oligoméricas. En algunos casos las subunidades son idénticas; cada subuni- dad posee un sitio catalítico y un sitio efector. En otros casos, las subunidades son bastante diferentes y un tipo posee sólo un sitio catalítico y la otra sólo un sitio efector. B. Inhibición por retroalimentación El mecanismo general por el cual ha evolucionado en los microorganismos la regulación del flujo de carbono a través de vías biosintéticas es el más eficiente que se pueda imaginar. El producto terminal en cada caso produce inhibición alostérica de la actividad de la primera (y sólo de la primera) enzima en la vía metabólica. Por ejemplo, el primer paso en la biosíntesis de isoleucina en el que no participa ninguna otra vía es la conver- sión de l-treonina a ácido cetobutírico α, que es catalizado por la treonina desaminasa. La treonina desaminasa es inhibida de manera específica y alostérica por la l-isoleucina y por ningún otro compuesto (figura 6-28); las otras cuatro enzimas de la vía no se ven afectadas (aunque su síntesis se reprime). C. Activación alostérica En algunos casos, es conveniente para la célula y para un pro- ducto terminal o producto intermedio activar en lugar de inhi- bir una enzima en particular. En el desdoblamiento de la glucosa por E. coli, por ejemplo, la producción excesiva del intermedia- rio G6PD y fosfoenolpiruvato ocasiona la desviación de algunas moléculas de glucosa a la vía de síntesis de glucógeno; esto se realiza por la activación alostérica de la enzima que convierte las moléculas de glucosa 1-fosfato a ADP-glucosa (figura 6-29). D. Cooperatividad Muchas enzimas oligoméricas, que poseen más de un sitio de unión al sustrato, muestran interacciones cooperativas de las moléculas de sustrato. La unión del sustrato con un sitio cata- lítico incrementa la afinidad de los otros sitios para moléculas adicionales de sustrato. El efecto neto de esta interacción es producir un incremento exponencial de la actividad catalítica en respuesta al incremento aritmético de la concentración de sustrato. E. Modificación covalente de las enzimas Las propiedades reguladoras de algunas enzimas se alteran por modificaciones covalentes de la proteína. Por ejemplo, la res- puesta de la glutamina sintetasa a los efectores metabólicos se altera por la adenililación, la unión covalente de ADP a una cadena lateral específica de tirosilo con cada subunidad enzi- mática. Las enzimas que controlan la adenililación también se controlan por modificaciones covalentes. La actividad de otras enzimas se altera por su fosforilación. F. Desactivación enzimática La actividad de algunas enzimas se elimina por medio de su hidrólisis. El proceso puede ser regulado y en ocasiones seña- lado por la modificación covalente de la enzima que constituye el blanco de la eliminación. apter 06_Carroll_4R.indd 101 apter 06_Carroll_4R.indd 101 14/04/16 14/04/16
- 115. 102 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Piruvato AMP Fosfoenolpiruvato 3-fosfoglicerato Fructosa 1,6-difosfato ADP Glucosa 6-fosfato Glucosa monofosfato Fructosa 6-fosfato Glucosa ADP-glucosa Glucógeno FIGURA 629 Regulación de la utilización de glucosa por una combinación de activación alostérica ( ) e inhibición alostérica ( ). AMP, monofosfato de adenosina; ATP, trifosfato de adenosina. (Reproducida con autorización de Stanier RY, Adelberg EA, Ingraham JL: The Microbial World, 4a. ed. Prentice-Hall, 1976. Reproducida impresa y en forma electrónica con autorización de Pearson Education, Inc., Nueva York, Nueva, York.) L-treonina desaminasa Cetobu- tirato α Acetato-α- hidroxibutirato-α Dihidroxi α,β- metilvalerato β Ceto-α- metilvalerato β L-isoleucina Piruvato Aceto- lactato-α Dihidroxi-α, β-isovalerato Ceto- isovalerato-α L-valina L-treonina E1 E2 E3 E4 FIGURA 628 Inhibición por retroalimentación de la L-treonina desaminasa por la L-isoleucina (línea punteada). Las vías para la biosíntesis de isoleucina y valina son mediadas por un grupo común de cuatro enzimas, como se muestra. apter 06_Carroll_4R.indd 102 apter 06_Carroll_4R.indd 102 14/04/16 14/04/16
- 116. CAPÍTULO 6 Metabolismomicrobiano 103 RESUMEN DEL CAPÍTULO • El metabolismo tiene dos componentes, catabolismo y ana- bolismo. El catabolismo consta de procesos que albergan energía procedente de la degradación de los compuestos y utilizan esa energía para sintetizar ATP. El anabolismo, o biosíntesis, consta de procesos que aprovechan la ener- gía almacenada en el ATP para sintetizar las subunidades (o bloques para la construcción) de macromoléculas que forman la célula. • El origen biosintético de los bloques de construcción data de unos cuantos precursores, llamados metabolitos focales. • La biosíntesis de peptidoglucanos es exclusiva de las bac- terias. Para aniquilar las bacterias, algunos antibióticos inhiben de manera selectiva ciertos pasos en la biosíntesis de peptidoglucano. • Las vías de Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff y de heterolactato son tres vías utilizadas para el catabolismo de la glucosa en las bacterias. El patrón de los productos terminales es una característica utilizada para identificar las diversas especies bacterianas. • En ausencia de respiración o fotosíntesis, las bacterias dependen por completo de la fosforilación del sustrato para obtener energía. • Para que la vida continúe en nuestro planeta es necesaria la asimilación reductiva de nitrógeno molecular (o fijación de nitrógeno). Se trata de un proceso altamente energético que llevan a cabo diversas bacterias y cianobacterias con el uso de un complejo de multicomponentes de la enzima nitrogenasa. • La regulación de la actividad enzimática proporciona tanto control fino como control grueso de las vías metabó- licas para que no se elabore ningún producto intermedio en exceso. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. ¿La síntesis de cuál de los siguientes compuestos celulares depende de una plantilla? (A) Lipopolisacárido (B) Peptidoglucano (C) Polisacárido capsular (D) Ácido desoxirribonucleico (E) Fosfolípidos 2. ¿La síntesis de cuál de los siguientes componentes celulares depende por completo de especificidad enzimática? (A) DNA (B) DNA ribosómico (C) Flagelos (D) Lipopolisacárido (E) Proteína 3. Los pasos que conducen a la síntesis de peptidoglucanos ocu- rren en el citoplasma, en la membrana citoplásmica y fuera de la célula. ¿Qué antibióticos inhiben el paso extracelular en la biosín- tesis de peptidoglucanos? (A) Cicloserina (B) Rifampicina (C) Penicilina (D) Bacitracina (E) Estreptomicina 4. Los aminoácidos se encuentran en las proteínas, péptido gluca- nos y cápsula bacteriana. ¿Cuál de los siguientes aminoácidos se encuentra en el peptidoglucano? (A) l-lisina (B) Ácido diaminopimélico (C) d-glutamato (D) l-alanina (E) Ninguno de los anteriores 5. La capacidad de usar iones y compuestos diferentes al oxígeno como oxidantes terminales en la respiración es un rasgo micro- biano amplio. Esta capacidad se conoce como (A) Fotosíntesis (B) Fermentación (C) Respiración anaerobia (D) Fosforilación de sustrato (E) Fijación de nitrógeno 6. La vía principal para la asimilación del carbono que utilizan los microorganismos que pueden usar CO2 como única fuente de carbono es: (A) Derivación hexosa monofosfato (B) Vía de Entner-Doudoroff (C) Vía de Embden-Meyerhoff (D) Ciclo de glucoxalato (E) Ciclo de Calvin 7. La vía biosintética del péptidoglucano es particularmente impor- tante en la medicina porque proporciona la base para la acción antibacteriana selectiva de muchos medicamentos. Los antibióti- cos siguientes inhiben ciertos pasos en la biosíntesis del peptido- glucano, EXCEPTO: (A) Cicloserina (B) Vancomicina (C) Bacitracina (D) Estreptomicina (E) Penicilina 8. La regulación de la actividad enzimática permite la regulación fina de las vías metabólicas. ¿Cuál de los siguientes mecanismos reguladores permite la regulación fina de una vía biosintética? (A) Represión de catabolitos (B) Inducción (C) Inhibición de la retroalimentación (D) Atenuación (E) Ninguna de las anteriores 9. El origen biosintético de los bloques de construcción y las coenzi- mas proviene de unos cuantos precursores llamados metabolitos focales. ¿Cuáles de los siguientes son metabolitos focales? (A) cetoglutarato α (B) Oxaloacetato (C) Fosfoenolpiruvato (D) Glucosa 6-fosfatasa (E) Todas las anteriores 10. ¿Cuál de los siguientes NO es un componente del peptidoglucano? (A) Ácido N-acetilmurámico (B) N-acetilglucosamina (C) Lípido A (D) Pentaglicina (E) Ácido diaminopimélico apter 06_Carroll_4R.indd 103 apter 06_Carroll_4R.indd 103 14/04/16 14/04/16
- 117. 104 SECCIÓN IFundamentos de microbiología 11. ¿Cuál de estas vías confiere a una célula capacidad de producir la mayor cantidad de ATP? (A) Ciclo del TCA (B) Vía del fosfato de la pentosa (C) Glucólisis (D) Fermentación del ácido láctico (E) vía de Entner-Doudoroff 12. Durante el proceso de fosforilación oxidativa, la energía de la fuerza motriz protónica se utiliza para generar (A) NADH (B) ADP (C) NADPH (D) Acetil CoA (E) ATP Respuestas 1. D 2. D 3. C Fuchs G: Alternative pathways of carbon dioxide fixation: Insights into the early evolution of life? Annu Rev Microbiol 2011;65:631. Gibson J, Harwood CS: Metabolic diversity in aromatic com- pound utilization by anaerobic microbes. Annu Rev Microbiol 2002;56:345. Hillen W, Stülke J: Regulation of carbon catabolism in Bacillus spe- cies. Annu Rev Microbiol 2000;54:849. Hurst CJ, et al. (editors): Manual of Environmental Microbiology, 2a. ed. ASM Press, 2002. Ishihama A: Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase. Annu Rev Microbiol 2000;54:499. Leigh JA, Dodsworth JA: Nitrogen regulation in bacteria and archaea. Annu Rev Microbiol 2007;61:349. Lovering AL, Safadi SS, Strynadka NCJ: Structural perspectives of peptidoglycan biosynthesis and assembly. Annu Rev Biochem 2012;81:451. Moat AG, Foster JW: Microbial Physiology, 4a. ed. Wiley-Liss, 2002. Neidhardt FC, et al. (editors): Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology, vols. 1 y 2, 2a. ed. ASM Press, 1996. Peters JW, Fisher K, Dean DR: Nitrogenase structure and function. Annu Rev Microbiol 1995;49:335. Roberts IS: The biochemistry and genetics of capsular polysaccha- ride production in bacteria. Annu Rev Microbiol 1996;50:285. Russell JB, Cook GM: Energetics of bacterial growth: Balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev 1995;59:48. Schaechter M, Ingraham JL, Neidhardt FC: Microbe. ASM Press, 2006. 4. B 5. C 6. E 7. D 8. C 9. E BIBLIOGRAFÍA Atlas RM, Bartha R: Microbial Ecology: Fundamentals and Applications, 4a. ed. Benjamin Cummings, 1998. Downs DM: Understanding microbial metabolism. Annu Rev Micro- biol 2006;60:533. 10. C 11. A 12. E apter 06_Carroll_4R.indd 104 apter 06_Carroll_4R.indd 104 14/04/16 14/04/16
- 118. 105 7 Genética microbiana C AP Í T U L O La ciencia de la genética define y analiza la herencia de una amplia gama de funciones fisiológicas que constituyen las propiedades del organismo. La unidad básica de la herencia es el gen, un segmento de ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) que codifica en su secuencia de nucleó- tidos información para propiedades fisiológicas específicas. El método tradicional de la genética ha sido identificar los genes con base en su contribución al fenotipo, o las propiedades estructurales colectivas y fisiológicas de un organismo. Una propiedad fenotípica podría ser el color de los ojos en los seres humanos o la resistencia a los antibióticos en una bacteria, que por lo general se observan al nivel de cada organismo. La base química para la variación del fenotipo es un cambio en el geno- tipo o alteración en la secuencia de DNA, en un gen o en la organización de los genes. En el decenio de 1930 se sugirió la participación del DNA como elemento fundamental de la herencia en un experimento realizado por Frederick Griffith (figura 7-1). En este experi- mento, destruyó un Streptococcus pneumoniae virulento de tipo III-S (que poseía una cápsula) cuando se le inyectó a un ratón junto con neumococo vivo pero no virulento de tipo II-R (que carecía de cápsula), lo que ocasionó una infección letal en la cual se recuperó el neumococo tipo III-S viable. La implica- ción fue que algunas entidades químicas transformaron la cepa viva, no virulenta a un fenotipo virulento. Un decenio más tarde, Avery, MacLeod y McCarty descubrieron que el DNA era el agente transformador. Este conocimiento constituye el fundamento de la biología molecular, tal como se conoce hoy en día. La tecnología del DNA recombinante se creó entre 1960 y 1970, cuando las investigaciones con bacterias revelaron la pre- sencia de enzimas de restricción, proteínas que fragmentan el DNA en lugares específicos, lo que da lugar a fragmentos de restricción de DNA. Los plásmidos se identificaron como ele- mentos genéticos pequeños que transportan genes y son capa- ces de replicación independiente en bacterias y levaduras. La introducción de un fragmento restrictivo de DNA en el interior de un plásmido permite la amplificación de dicho fragmento muchas veces. La amplificación de regiones específicas de DNA también puede lograrse con enzimas bacterianas utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) u otro método basado en enzimas de amplificación de ácido nucleico. El DNA amplificado por estos medios y dige- rido con enzimas de restricción apropiadas puede insertarse en plásmidos. Los genes pueden colocarse bajo el control de pro- motores bacterianos de alta expresión, que codifican proteínas que se expresan en concentraciones elevadas. La genética bac- teriana ha fomentado el desarrollo de la ingeniería genética tanto en células procariotas como eucariotas. Esta tecnología es causante del notable avance en el campo de la medicina que ha ocurrido hoy en día. ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU ORGANIZACIÓN EN GENOMAS EUCARIÓTICO, PROCARIÓTICO Y VIRAL La información genética en bacterias se almacena como una secuencia de bases de DNA (figura 7-2). La mayor parte de moléculas de DNA son bicatenarias, con bases complementa- rias (A-T; G-C) unidas por puentes de hidrógeno en el centro de la molécula (figura 7-3). La orientación de las dos cadenas de DNA es antiparalela: una cadena tiene orientación química de 5′→ 3′ y su cadena complementaria sigue una dirección 3′→ 5′. La complementariedad de las bases permite que una cadena (cadena de plantilla) proporcione la información para la copia con la expresión de la información en la otra cadena (cadena de codificación). Los pares de bases se apilan en el centro de la doble hélice de DNA y determinan la información gené- tica. Cada giro de la hélice tiene un surco mayor y un surco en espejo. Algunas proteínas son capaces de unirse a DNA y regu- lar la expresión génica al interactuar de manera predominante con el surco principal, sitio en que están más expuestos los áto- mos que comprenden las bases. Cada una de las cuatro bases se une a una fosfo-2′-desoxirribosa para formar un nucleótido. El esqueleto fosfodiéster con carga negativa del DNA se encuentra en contacto con el solvente. La longitud de la molécula de DNA por lo común se expresa en miles de pares de bases o pares de kilobases (kbp, kilobase pairs). En tanto que un virus pequeño puede contener una sola molécula de DNA menor de 0.5 kbp, un solo genoma de DNA que codifica Escherichia coli rebasa los 4000 kbp. En cada caso, cada par de bases está separado de la siguiente por casi 0.34 nm o 3.4 × 10−7 mm, de forma que la longitud total del cromosoma de E. coli es de casi 1 mm. Apro- ximadamente las dimensiones globales de la bacteria son mil veces menores que tal cifra; por ello es evidente que un grado sustancial de plegamiento, o superenrrollado contribuye a la estructura física de la molécula in vivo. El ácido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) más a menudo se encuentra en forma de una sola tira (monocatena- rio). La base uracilo (U) sustituye a la timina (T) en el DNA, apter 07_Carroll_4R.indd 105 apter 07_Carroll_4R.indd 105 14/04/16 14/04/16
- 119. 106 SECCIÓN IFundamentos de microbiología de manera que las bases complementarias que determinan la estructura de RNA son A-U y C-G. La estructura general del RNA de una sola cadena (ssRNA, single-stranded RNA) depende del pareamiento entre las bases en las cadenas for- madoras de asas, con el resultado de que la molécula de RNA de una sola cadena asume una estructura compacta capaz de expresar información genética contenida en el DNA. La función más general del RNA es la comunicación de la secuencia génica del DNA en forma de RNA mensajero (mRNA, messenger RNA) a los ribosomas. Este proceso se conoce como transcripción y traducción. mRNA (conocido como +ssRNA) es transcrito en la forma de complemento de RNA en la cadena de codificación de DNA. Este mRNA es traducido por los ribosomas. Los ribosomas contienen RNA ribosómico (rRNA, ribosomal RNA) y proteínas, reduciendo este mensaje en la estructura primaria de proteínas a través de RNA de transferencia (tRNA, transfer-RNA). Las molécu- las de RNA varían en tamaño desde RNA pequeñas, que contienen menos de 100 bases hasta mRNA, que pueden trans- portar mensajes genéticos que se extienden hasta varios miles de bases. Los ribosomas bacterianos contienen tres tipos de rRNA con tamaños respectivos de 120, 1540 y 2900 bases y varias proteínas (figura 7-4). Las moléculas correspondientes de rRNA en los ribosomas de células eucariotas son un poco más grandes. La necesidad para la expresión de genes indivi- duales cambia en respuesta a las demandas fisiológicas y las necesidades para la expresión génica flexible y se reflejan en el intercambio metabólico rápido de la mayor parte de los mRNA. Por otra parte, el tRNA y rRNA (que se asocian con la función de síntesis de proteínas, universalmente necesaria) tienden a encontrarse estables y constituyen en conjunto más de 95% del RNA total en la célula bacteriana. Unas cuantas molécu- las de RNA parecen funcionar como enzimas (ribozimas). Por ejemplo, el RNA 23S en la subunidad ribosómica 50S (figura 7-4) cataliza la formación de un enlace peptídico durante la síntesis de proteínas. FIGURA 71 Experimento de Griffith que muestra la evidencia para un factor transformador, más tarde identificado como DNA. En una serie de experimentos, se inyectó a ratones Streptococcus pneumoniae vivos o muertos, encapsulados o no encapsulados, como se indica en los experimentos marcados con las letras A a D. El experimento fundamental está marcado con la letra D, en el que se demuestra que las bacterias encapsuladas muertas proporcionan un factor que permite que las bacterias no encapsuladas maten al ratón. Además de proporcionar un sustento fundamental para la importancia de la cápsula en la virulencia de los neumococos, el experimento D también ilustra el principio de que el DNA es la base fundamental para la transformación genética. (Reproducida con autorización de McClane & Mietzner, Microbial Pathogenesis: A Principles-Oriented Approach. Fence Creek Publishing, 1999). Experimento A Experimento B Experimento C Experimento D Inyección Ratón Ratón Ratón vivo Ratón vivo Ratón muerto Ratón muerto Bacterias vivas aisladas del ratón muerto Neumococos encapsulados = + Inyección Cepa A de bacterias vivas encapsuladas Cepa B de bacterias vivas no encapsuladas Cepa B de bacterias vivas no encapsuladas Cepa A de bacterias encapsuladas muertas Cepa B de bacterias muertas encapsuladas Ratón Inyección Ratón Inyección apter 07_Carroll_4R.indd 106 apter 07_Carroll_4R.indd 106 14/04/16 14/04/16
- 120. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 107 Genoma de las células eucariotas El genoma es la totalidad de información genética en un organismo. Casi todo el genoma de las células eucariotas se transporta en dos o más cromosomas lineales separados del citoplasma por medio de una membrana que limita el núcleo. Las células eucariotas diploides contienen dos homólogos (copias divergentes desde el punto de vista evolutivo) de cada cromosoma. Las mutaciones, o cambios genéticos, con fre- cuencia no pueden detectarse en las células diploides porque la contribución de una copia génica compensa los cambios en la función de su homólogo. El gen que no alcanza su expresión fenotípica en presencia de su homólogo es recesivo, en tanto que aquel que rebasa el efecto del homólogo es dominante. Los efectos de las mutaciones pueden diferenciarse con facilidad en las células haploides, que transportan una sola copia de la mayor parte de los genes. Las células de levadura (que son eucariotas) con frecuencia se investigan porque se mantienen FIGURA 72 Esquema de Watson y Crick de la estructura de DNA, que muestra el esqueleto helicoidal formado por azúcares-fosfato, bicatenario, que permanecen unidos por enlaces de hidrógeno entre las bases. (Dibujo reelaborado con autorización de Snyder L. Champness W: Molecular genetics of bacteria, 2a. ed. Washington, DC: ASM Press, 2003. ©2003 American Society for Microbiology. No se autoriza la reproducción o distribución adicional sin el permiso escrito de la American Society for Microbiology.) FIGURA 73 Pares de bases normales en el DNA. Arriba: par de adenina-timina (A-T); abajo: par de guanina-citocina (G-C). Los enlaces de hidrógeno se indican por medio de líneas punteadas. Nótese que los pares G-C comparten tres grupos de enlaces de hidrógeno, en tanto que el par A-T sólo contiene dos. En consecuencia, las interacciones G-C son más fuertes que las interacciones A-T (dR, desoxirribosa de la estructura básica de azúcar-fosfato del DNA). FIGURA 74 Composición de un ribosoma que contiene una copia de las fracciones 16S, 23S y 5S de RNA, así como varias proteínas. Las proteínas más grandes de la subunidad 50S se denominan L1 a L31. Las proteínas que son más pequeñas que la subunidad 30S se designan como S1 a S21. (Dibujo reelaborado con autorización de Snyder L. Champness W: Molecular genetics of bacteria, 2a. ed. Washington, DC: ASM Press, 2003. ©2003 American Society for Microbiology. No se autoriza la reproducción o distribución adicional sin el permiso escrito de la American Society for Microbiology.) Enlace de hidrógeno 5’ 3’ A A A A A A A A A T T T T T T T T T G G G G G C C C C C 5’ 3’ Un giro de hélice = 3.4 nm Surco menor Surco mayor Base Estructura básica de azúcares-fosfato C HC N N C N H H N C N C H (dR) (dR) 7 9 8 2 3 1 4 5 6 C C CH3 CH N C N H 1 2 6 3 4 5 O O C HC N N C O N C N C H H (dR) (dR) 7 9 8 2 3 1 4 5 6 C CH CH N C N N 1 2 6 3 4 5 O N H H H Proteínas 31 (L1– L31) 21 (S1– S21) Subunidades rRNA + 23S (2.9 kb) 5S (0.12 kb) 16S (1.54 kb) 50S 70S 30S apter 07_Carroll_4R.indd 107 apter 07_Carroll_4R.indd 107 14/04/16 14/04/16
- 121. 108 SECCIÓN IFundamentos de microbiología y se analizan en un estado haploide. Sólo 2% de la totalidad del genoma humano se considera DNA codificador; el resto es DNA no codificador. La células eucariotas contienen mitocondrias y en algunos casos cloroplastos. En cada uno de estos organelos existe una molécula circular de DNA que contiene unos cuantos genes cuya función se relaciona con el organelo en particular. Los cro- mosomas eucariotas transportan la mayor parte de los genes relacionados con la función orgánica. Muchas levaduras con- tienen elementos genéticos adicionales, un DNA independiente en replicación circular de 2 μm que contiene casi 6.3 kbp. Los pequeños círculos de DNA mencionados, calificados de plás- midos o episomas, a menudo están vinculados con las células procariotas. El tamaño pequeño de los plásmidos los hace sus- ceptibles a la manipulación genética y, después de su alteración, puede permitir su introducción a las células. Por lo tanto, los plásmidos se utilizan a menudo en la ingeniería genética. El DNA repetitivo cada vez se identifica con más frecuen- cia en células procariotas y se encuentra en grandes cantidades en células eucariotas. En los genomas eucariotas, el DNA repe- titivo se asocia con poca frecuencia con regiones de codifica- ción y se ubica principalmente en regiones extragénicas. Estas repeticiones de secuencia corta (SSR, short-sequence repeats) o secuencias cortas de repetición en grupo (STR, tandemly repea- ted sequences) ocurren en varias o miles copias dispersadas en todo el genoma. La presencia de SSR y STR está bien documen- tado en células procariotas y muestra amplio polimorfismo en cuanto a longitud. Se cree que esta variabilidad es causada por el deslizamiento con formación inapropiada de pares de bases y es un prerrequisito importante para la variación de fase y adap- tación bacterianas. Muchos genes eucariotas son interrumpidos por intrones, secuencias interpuestas de DNA que se pierden en el mRNA procesado cuando se traducen. Se han observado intrones en genes de arqueobacterias, pero con pocas excepcio- nes no se encuentran en eubacterias (cuadro 3-3). Genoma de células procariotas La mayor parte de genes procariotas son transportados en los cromosomas bacterianos. Con pocas excepciones, los genes bacterianos son haploides. Los datos de la secuencia del genoma obtenidos de más de 340 genomas microbianos, demostraron que muchos de los genomas procarióticos (> 90%) consisten en una sola molécula de DNA circular que contiene de 580 kbp a más de 5220 kbp de DNA (cuadro 7-1). Unas cuantas bac- terias (p. ej., Brucella melitensis, Burkholderia pseudomallei y Vibrio cholerae) tienen genomas que consisten de dos moléculas de DNA circular. Muchas bacterias contienen genes adiciona- les en los plásmidos que varían en tamaño desde varios hasta 100 kbp. Al contrario de lo que sucede en genomas eucarióti- cos, 98% de genomas bacterianos está formado por secuencias codificadoras. Los círculos de DNA están cerrados por enlaces covalentes (cromosomas y plásmidos bacterianos), que contienen la infor- mación genética necesaria para su propia replicación, lo que se denomina replicones o episomas. Las células procariotas no contienen un núcleo, y por lo tanto no existe una membrana que separa los genes bacterianos del citoplasma, como ocurre en las células eucariotas. CUADRO 71 Comparación del tamaño de los genomas en procariotas, bacteriófagos y virus selectos Microorganismo Tamaño (kbp) Procariotas Arqueobacterias Methanococcus jannaschii 1660 Archaeoglobus fulgidus 2180 Eubacterias Mycoplasma genitalium 580 Mycoplasma pneumoniae 820 Borrelia burgdorferi 910 Chlamydia trachomatis 1040 Rickettsia prowazekii 1112 Treponema pallidum 1140 Chlamydia pneumoniae 1230 Helicobacter pylori 1670 Haemophilus influenzae 1830 Francisella tularensis 1893 Coxiella burnetii 1995 Neisseria meningitides del serogrupo A 2180 Neisseria meningitides del serogrupo B 2270 Brucella melitensisa 2117 + 1178 Mycobacterium tuberculosis 4410 Escherichia coli 4640 Bacillus anthracis 5227 Burkholderia pseudomalleia 4126 + 3182 Bacteriófago Lambda 48 Virus Ébola 19 Viruela 186 Viriolovacuna 192 Citomegalovirus 229 a Organismos con dos cromosomas circulares diferentes. Algunas especies bacterianas son eficientes al causar enfermedades en organismos superiores porque poseen genes específicos que actúan como determinantes patógenos. Estos genes a menudo se agrupan en el DNA lo que se conoce como isla de patogenicidad. Estos segmentos de genes pueden ser bastante grandes (hasta 200 kbp) y codifican un grupo de genes de virulencia. Las islas de patogenia: 1) tienen un contenido de G + C diferente del resto del genoma; 2) guardan una relación más cercana en el cromosoma con los genes de tRNA; 3) están flanqueados por repeticiones directas y 4) contienen genes diversos que son importantes para la patogenia, que incluye resistencia a antibióticos, adhesinas, invasinas y exotoxinas, así como genes que pueden participar en la movilización genética. Los genes esenciales para el desarrollo bacteriano (a menudo conocidos como “genes constitutivos”) pueden trans- portarse en los cromosomas, mientras que los plásmidos transportan genes relacionados con funciones especializadas (cuadro 7-2). Muchos plásmidos también codifican secuencias genéticas que median su transferencia desde un microorga- nismo a otro (como los que interactúan con la pilosidad sexual) y también otros vinculados con la adquisición o redisposición apter 07_Carroll_4R.indd 108 apter 07_Carroll_4R.indd 108 14/04/16 14/04/16
- 122. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 109 CUADRO 72 Ejemplos de actividades metabólicas determinadas por plásmidos Microorganismo Actividad Pseudomonas sp. Degradación de alcanfor, tolueno, octano, ácido salicílico Bacillus stearothermophilus Amilasa α Alcaligenes eutrophus Utilización de H2 como fuente de energía oxidable Escherichia coli Captación y metabolismo de sacarosa, captación de citrato Klebsiella sp. Fijación de nitrógeno Streptococcus (grupo N) Utilización de lactosa, sistema de galactosa fosfotransferasa, metabolismo de citrato Rhodospirillum rubrum Síntesis de pigmento fotosintético Flavobacterium sp. Degradación de nailon genética de DNA (p. ej., la transposasa). Por lo tanto, los genes con orígenes evolutivos independientes pueden asimilarse por los plásmidos y más tarde se diseminan de forma amplia entre la población bacteriana. Una consecuencia de tales eventos genéticos se ha observado en la modificación entre las pobla- ciones bacterianas de resistencia originada por plásmidos a los antibióticos después de su uso liberal en hospitales. Los transposones son elementos genéticos que contienen varios genes, lo que incluye aquellos necesarios para la migra- ción de un locus genético a otro. Al hacerlo de esta forma, crean mutaciones de inserción. La participación de transposo- nes relativamente cortos (longitud de 0.75 a 2 kbp), conocidos como elementos de inserción, produce la mayor parte de las mutaciones de inserción. Estos elementos de inserción (tam- bién conocidos como elementos de secuencias de inserción [IS, insertion sequence]) transportan sólo los genes para las enzi- mas necesarias a fin de favorecer su propia transposición a otro locus genético, pero no pueden replicarse por sí mismos. Casi todas las bacterias transportan elementos IS y cada especie porta sus propias características. Los elementos IS relacionados pueden encontrarse en ocasiones en diferentes bacterias, lo que implica que en algún punto de la evolución ocurrieron recom- binaciones con otras bacterias. Los plásmidos también portan elementos IS, que son importantes para la formación de cepas recombinantes de alta frecuencia (Hfr, high-frequency recom- binant) (véase adelante). Los transposones complejos portan genes para funciones especializadas como resistencia a anti- bióticos y están rodeadas por secuencias de inserción. Los transposones no portan información genética necesa- ria para acoplarse a su propia réplica de la división celular, y por esta razón su propagación depende de su integración física con un replicón bacteriano. Dicha relación se induce por enzi- mas que confieren a los transposones la capacidad de formar copias de sí mismos; dichas enzimas permiten a los transpo- sones integrarse dentro del mismo replicón o de otro indepen- diente. La especificidad de la secuencia en el punto de inserción suele ser pequeña de tal forma que los transposones a menudo se insertan de manera aleatoria pero tienden a hacerlo en regio- nes que codifican tRNA. De una a otras bacterias son trans- feridos muchos plásmidos y la inserción de un transposón en un plásmido de ese tipo constituye un vehículo que permite la diseminación del transposón en toda la población bacteriana. Genoma viral Los virus son capaces de sobrevivir, pero no de proliferar en ausencia de una célula hospedadora. La replicación del genoma viral depende de la energía metabólica y maquinaria de sín- tesis de macromoléculas del hospedador. Con frecuencia, esta forma de parasitismo genético da origen a la debilitación o muerte de la célula hospedadora. Por lo tanto, para la propaga- ción exitosa de los virus se requiere: 1) una forma estable que permita que el virus sobreviva en ausencia de su hospedador; 2) un mecanismo para la invasión de la célula hospedadora; 3) información genética necesaria para la replicación de los com- ponentes virales en el interior de la célula y 4) información adi- cional que pueda ser necesaria para el empaquetamiento de los componentes virales y la liberación del virus resultante desde la célula hospedadora. Con frecuencia se hacen distinciones entre los virus rela- cionados con células eucariotas y aquellos relacionados con las procariotas; a estas últimas se les denomina bacteriófago o fago. Cuando el DNA viral se incorpora al genoma eucarió- tico, recibe el nombre de provirus; cuando un fago se incor- pora a un genoma bacteriano o episoma, se denomina profago. Con más de 5000 aislamientos de morfología conocida, los bacteriófagos constituyen el mayor grupo de todos los virus. Gran parte de la comprensión actual de los virus (y muchos conceptos fundamentales de biología molecular) han surgido de investigaciones de bacteriófagos. Los bacteriófagos se presentan en más de 140 géneros bac- terianos y en diversos hábitat. La molécula de ácido nucleico de los bacteriófagos está rodeada por una cubierta proteí- nica. Existe una variabilidad notable en el ácido nucleico de los bacteriófagos. Muchos de éstos contienen DNA bicatena- rio (dsDNA, double-stranded DNA); otros contienen RNA bicatenario (dsRNA, double-stranded RNA), ssRNA, o DNA monocatenario (ssDNA, single-stranded DNA). En ocasiones se encuentran bases poco comunes como hidroximetilcitosina en el ácido nucleico de bacteriófagos. Éstos muestran una amplia gama de morfologías. Muchos contienen estructuras especiali- zadas con forma similar a jeringas (colas) que se unen a recep- tores sobre la superficie celular e inyectan el ácido nucleico del bacteriófago en la célula hospedadora (figura 7-5). FIGURA 75 Ilustraciones del fago T2 con o sin ácido nucleico. Obsérvese que cuando el fago se encuentra cargado con ácido nucleico adquiere una forma diferente que cuando carece del mismo. Este diagrama se dibujó con base en observaciones realizadas en una micrografía electrónica. Cabeza (ácido nucleico presente) Cabeza vacía Centro hueco Placa de la base Vaina (expandida) Vaina (contraída) Fibras de la cola apter 07_Carroll_4R.indd 109 apter 07_Carroll_4R.indd 109 14/04/16 14/04/16
- 123. 110 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Losbacteriófagospuedendiferenciarseconbaseensumodo de propagación. Los bacteriófagos líticos producen muchas copias de sí mismos conforme destruyen la célula hospedadora. Los bacteriófagos líticos estudiados más a fondo, los bacterió- fagos T “pares” (p. ej., T2, T4) han demostrado la necesidad de expresión oportuna de los genes virales a fin de coordinar los eventos relacionados con la formación del bacteriófago. Los bac- teriófagos moderados pueden penetrar en un probacteriófago no lítico, lo que indica que se insertaron dentro del cromosoma de la bacteria, estado en el cual la réplica de su ácido nucleico queda unida a la réplica del DNA de la bacteria hospedadora. Las bacterias que portan probacteriófagos se denominan lisó- genas porque una señal fisiológica puede desencadenar un ciclo lítico que da origen a la destrucción de la célula hospedadora y la liberación de muchas copias del bacteriófago. El bacteriófago moderado mejor identificado es el bacteriófago λ (lambda) de E. coli. Los fagos filamentosos, que se ejemplifican bien con el bacteriófago M13 de E. Coli, son excepcionales en varios aspec- tos. Sus filamentos contienen ssDNA que forma complejos con proteínas y presentan extrusión desde la célula hospedadora, la cual se debilita pero no muere a causa de la infección por fagos. La ingeniería de DNA en el interior del fago M13 ha proporcio- nado cadenas únicas que son fuentes de gran utilidad para el análisis y manipulación del DNA. REPLICACIÓN El dsDNA se sintetiza por replicación semiconservadora. Conforme la doble cadena original se desenrolla, cada cadena sirve como plantilla (es decir, como la fuente de información de la secuencia) para la replicación de DNA. Nuevas cadenas se sintetizan con la colocación de bases en orden complemen- tario a las cadenas preexistentes. Cuando se ha completado la síntesis, cada molécula hija contiene una cadena original y una cadena de síntesis reciente. DNA bacteriano La replicación de DNA bacteriano inicia en un punto y se des- plaza en ambas direcciones (replicación bidireccional). En el proceso, las dos cadenas viejas de DNA se separan y se utili- zan como plantilla para la síntesis de nuevas cadenas (replica- ción semiconservadora). La estructura donde dos cadenas se separan y ocurre la nueva síntesis se conoce como horquilla de replicación. La replicación del cromosoma bacteriano es un proceso estrechamente controlado; el número de cada cromo- soma (cuando hay más de uno) por célula en desarrollo dismi- nuye entre uno y cuatro. Algunos plásmidos bacterianos pueden tener incluso 30 copias dentro de una bacteria, y las mutaciones que ocasionan control disminuido de la réplica del plásmido pueden producir un número de copias 10 veces mayor. La replicación de DNA bacteriano circular bicatenario ini- cia en el locus ori e implica interacciones con varias proteínas. En el caso de E. coli, la replicación cromosómica termina en una región denominada ter. Los sitios de origen (ori) y de ter- minación (ter) para la replicación se ubican en puntos opuestos en el DNA circular del cromosoma. Los dos cromosomas hijos se separan o se resuelven antes de la división celular, de forma que cada progenie cuenta con un DNA hijo. Esto se logra con la ayuda de la recombinación y con topoisomerasas, enzimas que alteran el superenrollado del DNA bicatenario. Las topoi- somerasas actúan al cortar en forma transitoria una o ambas cadenas de DNA para interrumpir la espiral y extender la molécula de DNA. Las topoisomerasas bacterianas son esen- ciales y peculiares, por lo tanto son el sitio de acción de anti- bióticos (como las quinolonas). Un proceso similar conduce a la replicación de DNA de plásmidos, con la excepción de que en algunos casos la replicación es unidireccional. Bacteriófagos Los fagos muestran diversidad considerable en cuanto a la naturaleza de su ácido nucleico; dicha diversidad se refleja en los diferentes modos de replicación. Los fagos líticos y mode- rados muestran estrategias de propagación fundamentalmente diferentes. Los fagos líticos producen muchas copias de sí mis- mos en un solo brote de crecimiento. Los fagos moderados se establecen en la forma de profagos ya sea al volverse parte de un replicón establecido (cromosoma o plásmidos) o al for- mar un replicón independiente. El dsDNA de muchos fagos líticos es lineal y la primera etapa en su replicación es la formación de DNA circular. Este proceso depende de extremos de cohesión, complementarios monocatenarios de DNA que se hibridizan. La ligadura, que consiste en la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 5′ y 3′ de DNA, da origen a DNA circular unido por enlaces componentes que puede sufrir replicación de una forma similar a la utilizada por otros replicones. El desdoblamiento de esta estructura circular produce DNA lineal que se empaca en cubiertas proteínicas para formar la progenie de los fagos. El ssDNA de los fagos filamentosos cambia a una forma de replicación circular bicatenario. Una cadena de las formas de replicación se utiliza como plantilla en un proceso continuo que produce ssDNA. La plantilla es un círculo cerrado y el ssDNA que se produce sufre desdoblamiento y empaqueta- miento con proteínas para su extrusión de la célula. Los fagos ssRNA se encuentran entre las partículas extra- celulares más pequeñas que contienen información que per- mite su propia replicación. Por ejemplo, el fago MS2 de RNA contiene (en menos de 4000 nucleótidos) los tres genes que pueden actuar como mRNA después de una infección. Un gen codifica la cubierta de proteínas en tanto que otro codifica la polimerasa de RNA que forma un dsRNA para la replicación. El ssRNA producido por la forma replicativa es la parte princi- pal de esta nueva partícula infecciosa. Cuando el genoma P1 del bacteriófago moderado de E. coli sufre un ciclo de lisogénesis, existe como un plásmido autó- nomo en la bacteria. El dsDNA de otro bacteriófago moderado se establece como probacteriófago mediante la inserción en el cromosoma del hospedador. El sitio de inserción puede ser bas- tante específico, como se ejemplifica por la integración del bac- teriófago λ de E. coli en el locus int del cromosoma bacteriano. La especificidad de la integración depende de la identidad de la secuencia de DNA compartido por el locus cromosómico int y una región correspondiente del genoma del fago. Otro bac- teriófago moderado, como el Mu de E. coli, se integra en cual- quier sitio de una amplia gama de sitios cromosómicos y en este aspecto se comporta de manera similar a los transposones. apter 07_Carroll_4R.indd 110 apter 07_Carroll_4R.indd 110 14/04/16 14/04/16
- 124. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 111 Los profagos contienen genes necesarios para la replicación lítica (también conocida como replicación vegetativa); la expre- sión de estos genes se conserva reprimida durante el manteni- miento del estado de profago. Una manifestación de represión es que un profago establecido con frecuencia confiere inmunidad celular contra infecciones líticas por medio de un fago similar. Una cascada de interacciones moleculares desencadena la des- represión (liberación de la represión), de forma que los profagos sufren replicación vegetativa, lo que conduce a la formación de un brote de partículas infecciosas. Los estímulos como la luz ultravioleta (UV, ultraviolet) pueden eliminar la desrepresión del profago. El cambio entre la lisogenia (propagación del genoma del fago en el hospedador) y el crecimiento de un fago vegetativo ocurre a expensas de la célula y puede depender en parte del estado fisiológico de la misma. Una bacteria que no presenta replicación no dará soporte vegetativo al crecimiento del fago, en tanto que una célula en crecimiento intensivo con- tiene energía y cantidades suficientes de bloques de construc- ción para soportar la replicación rápida del bacteriófago. TRANSFERENCIA DE DNA Puede suponerse que la naturaleza haploide del genoma bac- teriano limita la plasticidad genómica de una bacteria. Sin embargo, la distribución ubicua de diversas bacterias en el medio ambiente proporciona un amplio acervo genético que contribuye a su notable diversidad genética a través de meca- nismos de intercambio genético. El intercambio genético bacteriano está tipificado por la transferencia de fragmentos relativamente pequeños de genoma donador a una célula recep- tora, seguida de su recombinación genética. La recombinación genética bacteriana es muy diferente a la fusión de los gametos observada en las células eucariotas; este proceso demanda que el DNA donador se replique en el organismo recombinante. La replicación puede lograrse a través de la integración del DNA donador en un cromosoma del receptor o mediante el estable- cimiento de DNA donador como un episoma independiente. Restricción y otras limitantes de la transferencia génica Las enzimas de restricción (endonucleasas de restricción) pro- porcionan a las bacterias mecanismos para diferenciar entre su propio DNA y el DNA de otros orígenes biológicos. Estas enzi- mas hidrolizan (desdoblan) el DNA en sitios de restricción que dependen de secuencias específicas de DNA que van desde cua- tro a 13 bases. Cada cepa bacteriana posee un sistema de restric- ción que es capaz de ocultar estos sitios de reconocimiento en su propio DNA al modificarlos mediante metilación o la adición de residuos de citocina en el sitio. Dichos sistemas de modifi- cación de la restricción caen en dos grupos amplios: sistemas tipo I, en el cual las actividades de restricción y modificación se combinan en una proteína con varias subunidades, y el sistema tipo II, que consiste de endonucleasas y metilasas separadas. Una consecuencia biológica directa de la restricción pudiera ser la separación del DNA donante antes de que haya tenido la oportunidad de establecerse como parte de un replicón recom- binante y hacer a la bacteria “inmune” al DNA de entrada. Algunos plásmidos muestran un número limitado de hospedadores y son capaces de replicarse sólo en un grupo de bacterias con relación estrecha. Otros plásmidos, ejemplifi- cados por algunos plásmidos de resistencia a fármacos, mues- tran replicación en géneros muy diversos de bacterias. En algu- nos casos, coexisten de manera estable dentro de la bacteria dos o más plásmidos, pero otros pares interferirán con la réplica o la partición. Si se introducen en la misma bacteria dos de los plásmidos con tales características, terminará por perderse uno u otro con mayor rapidez de lo normal cuando se divida la bacteria. El fenómeno se denomina incompatibilidad de plás- midos; dos plásmidos que no pueden coexistir de manera esta- ble pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad (Inc); dos plásmidos que pueden coexistir en forma estable pertenecen a diferentes grupos Inc. Mecanismos de recombinación El DNA donador que no porta información necesaria para su propia replicación debe combinarse con el DNA del receptor a fin de establecerse en la cepa receptora. La recombinación puede ser homóloga, una consecuencia de la enorme seme- janza de las secuencias del DNA del donante y el receptor, o no homóloga, como resultado de la recombinación catalizada por enzimas entre dos secuencias de DNA diferentes. La recom- binación homóloga casi siempre implica el intercambio entre genes que comparten ancestros comunes. El proceso requiere un grupo de genes designados como rec. La recombinación no homóloga depende de enzimas codificadas por el DNA inte- grado y se ejemplifica con mayor claridad por la inserción de DNA en un receptor para formar una copia de un transposón donador. El mecanismo de recombinación mediada por los pro- ductos génicos del gen rec es recíproco: la introducción de una secuencia donadora en un receptor corresponde con la transferencia de una secuencia receptora homóloga en el DNA donador. La comunidad científica pone cada vez más atención a la participación de la conversión génica (transferencia no recíproca de secuencias de DNA del donador al receptor) en la adquisición de diversidad genética. Mecanismos de transferencia génica La composición de DNA de los microorganismos es notable- mente fluida. El DNA puede transferirse de un organismo a otro; dicho DNA puede incorporarse de manera estable en el receptor, modificando de manera permanente su composición genética. Este proceso se denomina transferencia génica hori- zontal para diferenciarla de la herencia proveniente de genes paternos, un proceso conocido como herencia vertical. Los tres mecanismos amplios que median el desplazamiento efi- ciente del DNA entre las células son: conjugación, transduc- ción y transformación. La conjugación requiere que la célula donadora y recep- tora se encuentre en contacto para la transferencia de una sola cadena de DNA (figura 7-6). El receptor completa la estructura del DNA bicatenario mediante la síntesis de la cadena que com- plementa a la cadena adquirida del donador. En la transduc- ción, el DNA del donador se transporta en un fago cubierto y se transfiere al receptor por un mecanismo utilizado para la apter 07_Carroll_4R.indd 111 apter 07_Carroll_4R.indd 111 14/04/16 14/04/16
- 125. 112 SECCIÓN IFundamentos de microbiología infección por bacteriófagos. La transformación consiste en la captación directa de DNA “desnudo” del donador por la célula receptora, lo cual puede ser natural o forzado. La transforma- ción forzada es inducida en el laboratorio, donde después del tratamiento con altas concentraciones de sales y un golpe tér- mico, muchas bacterias se tornan competentes para la capta- ción de plásmidos extracelulares. La capacidad para forzar a las bacterias para incorporar plásmidos extracelulares mediante transformación es un proceso fundamental para la ingeniería genética. A. Conjugación Los plásmidos se transfieren con frecuencia por conjugación. Las funciones genéticas necesarias para la transferencia están codificadas por los genes tra, que son transportados por plás- midosautotransmisibles.Estos últimos pueden movilizar otros plásmidos o porciones del cromosoma para su transferencia. En algunos casos se logra la movilización porque los genes tra proporcionan las funciones necesarias para la transferencia de un plásmido por lo demás no susceptible de transmisión (figu- ras 7-7 y 7-8). En otros casos, los plásmidos autotransmisibles se integran con el DNA de otro replicón y, como una extensión de sí mismo, portan cadenas de DNA a la célula receptora. El análisis genético de E. coli avanzó en gran medida al dilu- cidar los factores defertilidad que portaban los plásmidos desig- nados como F+ . Este plásmido confiere ciertas características del donador a las células; tales características incluyen una pilosi- dad sexual, extrusión de proteínas multiméricas extracelulares FIGURA 77 Mecanismos de movilización de plásmidos. La célula donadora porta dos plásmidos, un plásmido autotransmisible F que codifica las funciones tra que promueven el contacto celular y la transferencia de plásmidos y un plásmido susceptible de movilización. Las funciones mob codificadas por un plásmido susceptible de movilización crean una muesca monocatenaria en oriT en la región mob. Entonces ocurre la transferencia y replicación del plásmido susceptible de movilización. También puede transferirse el plásmido autotransmisible. (Dibujo reelaborado con autorización de Snyder L. Champness W: Molecular genetics of bacteria, 2a. ed. Washington, DC: ASM Press, 2003. ©2003 American Society for Microbiology. No se autoriza la reproducción o distribución adicional sin el permiso escrito de la American Society for Microbiology.) FIGURA 76 Mecanismos de transferencia de DNA durante la conjugación. La célula donadora produce una pilosidad, que es codificado por plásmidos y se pone en contacto con una célula receptora potencial que no contiene el plásmido. La retracción de la pilosidad acerca a las células y se forma un poro en las membranas celulares adyacentes. Formación de señales de apareamiento que indican que el plásmido inicia la transferencia de un fragmento monocatenario en oriT. El fragmento está constituido por un plásmido codificado con funciones tra. El extremo 5′ de una cadena del plásmido se transfiere al receptor a través del poro. Durante la transferencia, el plásmido se replica del donador e inicia la síntesis de DNA a partir del extremo 3′ del fragmento oriT. La replicación de una cadena en el receptor continúa por diferentes mecanismos con cebadores de RNA. Ambas células contienen ahora plásmidos bicatenarios y las células se separan. (Dibujo reelaborado con autorización de Snyder L. Champness W: Molecular genetics of bacteria, 2a. ed. Washington, DC: ASM Press, 2003. ©2003 American Society for Microbiology. No se autoriza la reproducción o distribución adicional sin el permiso escrito de la American Society for Microbiology.) Donador Receptor Célula donadora Célula con transconjugación Formación de la pareja Fragmento monocatenario oriT y desplazamiento de la cadena Transferencia y replicación de la cadena Separación de las células 5' o r i T El plásmido autotransmisible codifica las funciones tra que permiten el contacto celular Se crea una muesca en oriT del plásmido susceptible de movilización Transferencia del plásmido susceptible de movilización El plásmido susceptible de movilización se replica en el receptor mo b tra F F apter 07_Carroll_4R.indd 112 apter 07_Carroll_4R.indd 112 14/04/16 14/04/16
- 126. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 113 que se unen a las células del donador al organismo receptor que carece de factor de fertilidad. Un puente entre las células per- mite que una cadena de plásmido F+ , sintetizada por el dona- dor, pase hacia el receptor, donde se forma una cadena de DNA complementario. El factor de fertilidad F+ puede integrarse en numerosos locus en los cromosomas de las células donadores. El factor de fertilidad integrado crea donadores con recombina- ciones de alta frecuencia (Hfr) en la cual se transfiere DNA cro- mosómico (del sitio de inserción) en una dirección determinada por la orientación de la inserción (figura 7-9). La tasa de transferencia cromosómica de las células Hfr es constante y la compilación de resultados de muchos expe- rimentos de conjugación ha permitido la preparación de un mapa genético de E. coli, en el cual se mide la distancia entre los locus en el número de minutos necesarios para la trans- ferencia en la conjugación. Se ha construido un mapa similar para coliformes relacionadas como Salmonella typhimurium y de la comparación de los dos mapas se han mostrado tipos de organización genómica relacionados. En la actualidad esta clase de mapeo ha sido reemplazado por secuenciación genó- mica de alto rendimiento. La integración del DNA cromosómico en un plásmido de conjugación puede producir un replicón recombinante (un cebador F [de fertilidad] o R [de resistencia], lo que depende del plásmido) en el cual el DNA cromosómico integrado puede replicarse en el plásmido de manera independiente del cromo- soma. Esto ocurre cuando el plásmido integrado (p. ej., F) es rodeado por dos copias de un elemento IS. Las bacterias que portan copias de genes, un grupo completo de cromosomas y un grupo parcial de cebadores, son parcialmente diploides o merodiploides y son útiles para estudios de complementa- ción. Un gen natural con frecuencia se complementa con un homólogo mutante y la selección de un fenotipo natural puede permitir el mantenimiento de merodiploides en el laboratorio. Es posible que tales cepas permitan el análisis de interaccio- nes entre los diferentes alelos, variantes genéticas del mismo gen. Los merodiploides con frecuencia son inestables desde el punto de vista genético porque las recombinaciones entre los plásmidos y el cromosoma homólogo pueden ocasionar pér- dida o cambio del mutante o alelos de tipo natural. Este pro- blema a menudo se supera al conservar los merodiploides en un entorno genético en el cual se haya inactivado el gen recA, que es necesario para la recombinación entre segmentos homó- logos de DNA. Los genes homólogos de diferentes organismos pueden ser divergentes en un área tal que evite la recombinación homó- loga entre ellos, pero que no se altere la capacidad de un gen para complementar la actividad perdida de otro. Por ejemplo, el origen genético de una enzima necesaria para la biosínte- sis de un aminoácido probablemente no influya la actividad catalítica en el citoplasma de un hospedador distante desde el punto de vista biológico. Un merodiploide que porta un gen para tal enzima podría estar rodeado por genes derivados del organismo donador. Por lo tanto, la genética microbiana con- vencional, con base en la selección de plásmidos cebadores, puede utilizarse para aislar genes de un organismo de creci- miento lento para utilizarse en E. coli o P. aeruginosa. B. Transducción La transducción es una recombinación genética en las bac- terias mediada por bacteriófagos. En términos simples, una partícula de transducción puede considerarse como el ácido nucleico bacteriano en un fago cubierto. Incluso una población de fagos líticos puede contener algunas partículas en las cuales la cubierta del fago está rodeada por DNA derivado de la bacte- ria más que del propio fago. Tal población se ha utilizado para transferir genes de una bacteria a otra. Los fagos moderados son los vehículos preferidos para la transferencia génica porque la infección de las bacterias receptoras bajo condiciones que favorecen la lisogenia reduce la lisis celular y por lo tanto favorece la supervivencia de las cepas recombinantes. Además, la bacteria receptora porta un profago apropiado que puede formar un represor que a su vez da origen a inmunidad celular FIGURA 78 A: Las células macho y hembra se unen por medio de una pilosidad F (pilosidad sexual). B: Parejas las células de E. coli. Hay elongación de las células Hfr. C: Micrografía electrónica de un corte delgado de una pareja de células. Las paredes celulares se encuentran en contacto íntimo con un área en la que se ha formado un “puente” (Fotografía [A]: por cortesía de Carnahan J y Brinton C. Fotografías B y C reproducidas con autorización de Gross JD and Caro LG: DNA transfer in bacterial conjugation. J Mol Biol 1966;16:269). A B C apter 07_Carroll_4R.indd 113 apter 07_Carroll_4R.indd 113 14/04/16 14/04/16
- 127. 114 SECCIÓN IFundamentos de microbiología FIGURA 79 Transferencia de DNA cromosómico por un plásmido integrado. Formación de parejas de células, formación de una muesca en la secuencia F de oriT y transferencia del extremo 5′ de DNA monocatenario F que continúa como una transferencia de plásmido F. La transferencia de DNA cromosómico tendrá lugar con un enlace covalente en tanto permanezca estable la pareja de células. Rara vez ocurre la transferencia de cromosomas completos de forma que la célula receptora permanece como F- , incluso después de la recombinación. La replicación en el donador por lo común acompaña la transferencia de DNA. También puede ocurrir cierta replicación de la cadena transferida. Una vez en la célula receptora, el DNA transferido puede sufrir la combinación con secuencias homólogas en el cromosoma receptor. (Dibujo reelaborado con autorización de Snyder L. Champness W: Molecular genetics of bacteria, 2a. ed. Washington, DC: ASM Press, 2003. ©2003 American Society for Microbiology. No se autoriza la reproducción o distribución adicional sin el permiso escrito de la American Society for Microbiology.) o r i T F Hfr F– F F– Hfr El plásmido F codifica las funciones tra, incluyendo las pilosidades Una muesca en oriT inicia la transferencia La replicación ocurre en el donador como una cadena que se transfiere El fragmento transferido sufre recombinación en el receptor F contra la infección lítica; tales células pueden aún captar DNA bacteriano a partir de partículas de transducción. Las mezclas de transducción portan DNA donador que puede prepararse bajo condiciones que favorecen el ciclo del fago lítico. El tamaño del DNA en las partículas de transducción por lo común constituye un pequeño porcentaje del cromosoma bac- teriano y por lo tanto la cotransducción (transferencia de más de un gen a la vez) se limita a los genes bacterianos vinculados. La velocidad y capacidad por las cuales los fagos se recombinan y replican los han convertido en objetos centrales de estudio de genética bacteriana e ingeniería genética. En la naturaleza, los fagos a menudo transportan a las islas de patogenicidad. Por ejemplo, dos fagos transportan islas de patogenicidad de los que depende por conversión una forma benigna de V. cholerae en la variante patógena causativa del cólera epidémico (capítulo 17). Estos fagos codifican genes de la toxina del cólera (que causa los síntomas) y las fimbrias forma- doras de haces (de las que depende la fijación), las cuales com- binadas aumentan sustancialmente la virulencia de V. cholerae. C. Transformación Según se describió, la transformación forzada se concibe de forma típica como un procedimiento de laboratorio. Sin embargo, ahora es claro que a la HGT de baja frecuencia se debe a los mecanismos comunes de antibioticorresistencia en diversas especies de bacterias. Esto no debe sorprender, dado lo complejo de la diversidad y densidad de la flora intestinal de las biopelículas que se forman en la dentadura durante la noche. Lo anterior, junto con la administración terapéutica de anti- bióticos que seleccionan microorganismos resistentes y una “tormenta perfecta”, existe para la diseminación de material genético que cruza límites de especies. Encontrasteconlatransformaciónforzada(descritaantes), la competencia natural es inusual entre bacterias. La captación directa del DNA del donador por bacterias receptoras depende de su competencia para la transformación. Las bacterias trans- formables naturalmente competentes, de importancia médica, se encuentran en varios géneros que incluyen Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis y S. pneumoniae. La transformación natural es un proceso activo que demanda proteínas específicas producidas por la célula receptora. Además, secuencias de DNA específicas (secuencias captadoras) se requieren para captar el DNA. Tales secuencias captadoras son específicas de especie, de manera que restrin- gen el intercambio genético a una especie única. El DNA que no se incorpora puede degradarse y usarse como una fuente de nutrientes que favorece el crecimiento microbiano. Es claro que la transformación genética es una fuerza principal en la evolución microbiana. MUTACIÓN Y REORDENACIÓN GENÉTICA Mutaciones espontáneas Las mutaciones espontáneas para un gen dado en un entorno natural por lo general ocurren con una frecuencia de 10-6 a 10-8 en una población derivada de una sola bacteria (dependiendo de las condiciones utilizadas para identificar la mutación). Las mutaciones incluyen sustituciones de bases, deleciones, inser- ciones y reordenamientos. Las sustituciones de bases pueden surgircomoconsecuenciadelacolocacióninapropiadadepares de bases entre bases complementarias durante la replicación. En el caso de E. coli, esto ocurre una vez cada 1010 veces que se incorpora un nucleótido, un proceso notablemente preciso. La aparición de colocación inapropiada de bases se reduce por la presencia de enzimas asociadas con la reparación de errores, un mecanismo que en esencia asegura que una cadena es per- fectamente complementaria con su plantilla. Las enzimas de apter 07_Carroll_4R.indd 114 apter 07_Carroll_4R.indd 114 14/04/16 14/04/16
- 128. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 115 reparación de errores diferencian la cadena de síntesis reciente de la cadena preexistente con base en la metilación de adenina en las secuencias GATC de la cadena preexistente. Cuando el daño del DNA es demasiado extenso, un sistema de reparación especial de DNA, la respuesta SOS, rescata la célula en la cual se ha dañado el DNA. La respuesta SOS es un sistema de repa- ración de DNA después de la replicación, que permite que la replicación de DNA ocurra sin errores en él. Muchassustitucionesdebaseescapanaladetecciónalnivel fenotípico porque no alteran de manera significativa la fun- ción de los productos génicos. Por ejemplo, las mutaciones de aminoácido, que resultan de la sustitución de un aminoácido por otro, pueden presentarse sin efecto fenotípico discerni- ble. Por otra parte, las mutaciones interruptoras o finalizado- ras terminan la síntesis de proteínas y por lo tanto dan origen a proteínas truncadas en el sitio de mutación. Los productos génicos de las mutaciones interruptoras suelen ser inactivos. Los reordenamientos son consecuencia de deleciones que eliminan grandes zonas de genes o incluso conjuntos de los mismos. Tales deleciones grandes implican recombinación entre secuencias repetidas directamente (p. ej., elementos IS) y casi nunca se revierten. Otras mutaciones espontáneas causan duplicación, con frecuencia en grupo o longitudes comparables de DNA. Dichas mutaciones por lo común son inestables y se revierten con facilidad. Otras mutaciones pueden invertir lon- gitudes aún más largas de DNA o causar la transposición de tales secuencias a nuevos locus. Los mapas génicos comparati- vos de cepas bacterianas relacionadas han mostrado que tales reordenamientos pueden fijarse en poblaciones naturales. Estas observaciones señalan el hecho de que la separación lineal de lugares de DNA en un cromosoma bacteriano no altera del todo las posibilidades de interacción física y química entre ellos. Mutágenos La frecuencia de mutaciones se incrementa en gran medida por la exposición de las células a los mutágenos. La luz ultravioleta (UV) es un mutágeno físico que daña el DNA al unir bases cercanas de timina para formar dímeros. Pueden introducirse errores de secuencia durante la reparación enzimática de este daño genético. Los mutágenos químicos pueden actuar al alterar la estructura física o química del DNA. Los compues- tos químicos reactivos alteran la estructura de las bases en el DNA. Por ejemplo, el ácido nitroso (HNO2 ) sustituye grupos hidroxilo por aminoácidos en bases del DNA. El DNA resul- tante tiene actividad de plantilla alterada durante las rondas subsiguientes de replicación. Un desplazamiento del marco de lectura es una mutación genética causada por inserciones o deleciones de un número de nucleótidos en una secuencia de DNA que no es divisible entre tres. Dicho deslizamiento es facilitado por la exposición a colorantes acridínicos (como el naranja de acridina) que se intercalan entre una y otra bases. En términos generales, el efecto directo de los mutágenos químicos o físicos es el daño al DNA. La mutación resultante se introduce por un proceso de replicación y escape de la repara- ción por las enzimas antes descritas. Las mutaciones que modi- fican la actividad de replicación o las enzimas de reparación pueden hacer más susceptibles a las bacterias a los mutágenos biológicos y se conocen como cepas mutantes. Reversión y supresión La recuperación de la actividad perdida como consecuencia de una mutación, conocida como reversión fenotípica, puede o no ocasionar el restablecimiento de la secuencia original de DNA, como sería obligado para la reversión genotípica. Con frecuencia una mutación en un segundo locus (mutación de supresión) restablece la actividad perdida. En la supresión intragénica, después de que una mutación primaria ha cam- biado la estructura enzimática de forma tal que se ha perdido su actividad, una segunda mutación en un sitio diferente en los genes de la enzima restablece la estructura necesaria para la actividad. La supresión extragénica es causada por una segunda mutación que se encuentra fuera del gen original- mente afectado. EXPRESIÓN GÉNICA La notable separación evolutiva de los genomas de las células eucariota y procariota se ilustra al comparar sus mecanismos de expresión génica, los cuales comparten sólo un pequeño grupo de propiedades. En ambos grupos, la información gené- tica se codifica en el DNA, se transcribe en el mRNA y se tra- duce en los ribosomas por medio de tRNA para dar origen a la formación de proteínas. Los codones del triplete de nucleóti- dos se utilizan en la traducción y por lo general se comparten; muchas enzimas relacionadas con síntesis macromolecular en los dos grupos biológicos tienen propiedades similares. El mecanismo por el cual la secuencia de nucleótidos en un gen determina la secuencia de los aminoácidos en una proteína es muy similar en las células procariotas y eucariotas y consiste en lo siguiente: 1. La polimerasa de RNA forma una cadena de polirribonu- cleótidos, conocida como RNA mensajero (mRNA, messen- ger ribonucleic acid), utilizando DNA como plantilla; este proceso se denomina transcripción. El mRNA tiene una secuencia complementaria de nucleótidos para la plantilla en el DNA de doble hélice si se lee en la dirección 3′ a 5′. Así, una cadena de mRNA se orienta en dirección 5′ a 3′. 2. Ocurre activación enzimática de los aminoácidos con transferencia a moléculas adaptadoras específicas de RNA, conocidas como RNA de transferencia (tRNA, transfer ribonucleic acid). Cada molécula adaptadora tiene un tri- plete de bases (anticodón) complementaria al triplete de bases en el mRNA y en un extremo su aminoácido especí- fico. El triplete de bases en el mRNA se denomina codón para dicho aminoácido. 3. El mRNA y tRNA se encuentran juntos en la superficie del ribosoma. Conforme cada tRNA encuentra su triplete de nucleótidos complementarios en el mRNA, el aminoá- cido que transporta se coloca en la cadena peptídica con el aminoácido de la molécula de tRNA precedente. La enzima peptidiltransferasa (que es en realidad 23S rRNA, es decir, una ribozima) cataliza la formación del enlace peptídico. El ribosoma se desplaza a lo largo del mRNA, y el péptido crece en forma secuencial hasta que la totalidad del mRNA con el polipéptido naciente se traduce en una secuencia correspondiente de aminoácidos. Este proceso se denomina traducción y se ilustra en la figura 7-10. apter 07_Carroll_4R.indd 115 apter 07_Carroll_4R.indd 115 14/04/16 14/04/16
- 129. 116 SECCIÓN IFundamentos de microbiología En las células procariotas, los genes asociados con fun- ciones relacionadas por lo común están agrupados en forma de operones. Como no existe núcleo, hay acoplamiento de la transcripción y la traducción, lo cual denota que el mRNA naciente se une a un ribosoma y es traducido de forma simultá- nea con su transcripción. Este acoplamiento de transcripción y traducción permite la respuesta rápida a cambios en el entorno. De la misma forma, el mRNA tiene un recambio rápido del mRNA, con una semivida en el orden de segundos o minutos. En células eucariotas, el agrupamiento de genes rela- cionados es poco común. Las secuencias de incremento son regiones del DNA eucariota que incrementa la transcripción y que pueden encontrarse distantes del gen transcrito. Los genes eucariotas portan intrones, inserciones de DNA que no se encuentran en genes procariotas. Los intrones separan a los exones, las regiones de codificación de los genes eucariotas. Los intrones transcritos son eliminados de la transcripción eucariota durante el procesamiento de RNA, una serie de reac- ciones enzimáticas que tienen lugar en el núcleo. El mRNA de células eucariotas es poliadenilado en el extremo 3′, lo que lo protege de las exonucleasas, de forma tal que pueden atravesar la membrana nuclear en el citosol, donde se ubican los riboso- mas; en este caso, la traducción se encuentra desacoplada de la transcripción. Por esta poliadenilación, el mRNA eucariota tiene una semivida en términos de horas a días. Los ribosomas eucariotas y procariotas difieren en muchos aspectos.Losribosomaseucariotassongrandesytienenuncoe- ficiente de sedimentación de 80S en comparación con el coefi- ciente de sedimentación 70S de los ribosomas procariotas. Las subunidades ribosómicas eucariotas 40S y 60S son más grandes FIGURA 710 Cuatro etapas para la elongación de una cadena polipeptídica en la superficie de un ribosoma 70S. Arriba a la izquierda: una molécula de tRNA que porta el anticodón complementario para el codón 1 en un extremo y AA1 en el otro extremo se une al sitio A. AA1 se une a tRNA a través de su grupo carboxilo; su hidrógeno del grupo amino porta un grupo formilo (F). Arriba a la derecha: una molécula de tRNA porta AA2 que se une al sitio B; su anticodón es complementario con el codón 2. Abajo a la derecha: un complejo enzimático cataliza la transferencia de AA1 al grupo amino de AA2 , al formar un enlace peptídico (obsérvese que la transferencia en dirección opuesta está bloqueada por la formilación previa del grupo amino de AA1 ). Arriba a la izquierda: los ribosomas se desplazan a la derecha de forma tal que los sitios A y B se encuentran en codones opuestos 2 y 3; en el proceso, el tRNA1 se desplaza y tRNA2 se mueve al sitio A. El sitio B se encuentra nuevamente vacante y está listo para aceptar tRNA3 , portando AA3 (cuando el polipéptido se completa y se libera, el grupo formilo se elimina por medios enzimáticos.) (Dibujo reelaborado y reproducido con autorización de Stanier RY, Doudoroff M, Adelberg EA: The microbial world, 3a. ed. Copyright © 1970. Prentice-Hall, Inc. Impresa y reproducida electrónicamente con autorización de Pearson Education, Inc., Nueva York, Nueva York.) Anticodón 3 C C O OH NH2 NH AA1 F AA2 C NH2 F AA2 C OH C O NH Codón NH AA1 F N H 2 O A A 3 AA2 C O NH AA1 F 1 2 3 4 mRNA O C NH AA1 O 1 2 3 4 mRNA 1 2 3 4 mRNA tRNA3 tRNA1 1 2 3 4 mRNA Sitio A Sitio B Anticodón 2 N H 2 O A A 2 tRNA2 O O O O O O O C O C O apter 07_Carroll_4R.indd 116 apter 07_Carroll_4R.indd 116 14/04/16 14/04/16
- 130. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 117 que las subunidades correspondientes 30S y 50S de las células procariotas, los ribosomas eucariotas son relativamente ricos en proteínas. Hay diferencias inherentes significativas en la sensibilidad de las actividades ribosómicas a los antibióticos (p. ej., tetraciclinas), muchas de las cuales causan inhibición selectiva de la síntesis proteínica en células procariotas pero no en el citoplasma de células eucariotas (capítulo 9). Sin embargo, debe recordarse que los ribosomas de las mitocondrias en célu- las eucariotas semejan los de las procariotas y pueden ser sus- ceptibles a inhibidores de la síntesis de proteínas bacterianas. Regulación de la expresión génica en células procariotas Las proteínas específicas, productos de genes reguladores, con- trolan la expresión de genes estructurales que codifican enzi- mas. La transcripción de DNA a mRNA inicia en el promotor, la secuencia de DNA que se une a la polimerasa de RNA. El nivel de expresión génica depende de la capacidad del promotor para unirse a la polimerasa, y la eficacia intrínseca de los promoto- res difiere de forma amplia. Las proteínas reguladoras ejercen control adicional sobre la expresión génica; dichas proteínas pueden unirse a regiones de DNA cercanas a los promotores. Muchos genes procarióticos estructurales que codifican una serie afín de reacciones metabólicas están agrupados en operones. Esta serie contigua de genes se expresa como una transcripción de mRNA y la expresión de la transcripción puede ser controlada por un gen regulador único. Por ejemplo, cinco genes asociados con la biosíntesis de triptófano se agrupan en el operón trp de E. coli. La expresión génica se rige por la atenua- ción, como se describe a continuación, y también se controla por la represión: la unión del aminoácido triptófano por parte de una proteína represora le confiere una conformación que le permite unirse al operador trp, una secuencia corta de DNA que regula la expresión génica. La unión de la proteína repre- sora impide la transcripción de los genes trp, porque la bacteria percibe que existe suficiente triptófano y si sintetiza más de él, iría en contra de los mejores intereses de los recursos metabó- licos de dicho microorganismo. La represión puede percibirse como un mecanismo que controla el curso, un método de regu- lación génica de todo o nada. Esta forma de control es indepen- diente de la atenuación, un mecanismo de control fino que se utiliza para controlar la expresión génica trp. La atenuación es un mecanismo regulador de algunas vías biosintéticas (p. ej., vía biosintética del triptófano) que controla la eficiencia de la transcripción después que ésta se ha iniciado, pero antes que tenga lugar la síntesis de mRNA de los genes del operón, en especial cuando los productos terminales de la vía son escasos. Por ejemplo, bajo condiciones normales de cre- cimiento, la mayor parte de la transcripción de mRNA de trp termina antes de que alcancen los genes estructurales del ope- rón trp. Sin embargo, durante condiciones de carencia grave de triptófano, esa terminación prematura de la transcripción se suprime, lo que permite la expresión del operón en niveles 10 veces más altos de los que se observan en condiciones norma- les. La explicación para este fenómeno reside en la secuencia reguladora de 162 pares de bases frente a los genes estructura- les trp (figura 7-11) conocida como secuencia líder o trpL. La secuencia líder trp puede transcribirse en el mRNA y más tarde traducirse en un polipéptido de 14 aminoácidos con dos resi- duos de triptófano adyacentes, una secuencia que tiene lugar en muy raras ocasiones. Al final de la secuencia trpL, y hacia las señales reguladoras que controlan la traducción de los genes estructurales trp, se encuentra el codón finalizador indepen- diente Rho. La secuencia de DNA de esta región sugiere que el mRNA codificado tiene una alta probabilidad de formar estructuras secundarias de asa y tallo. Éstas se han deno- minado como asa de pausa (1:2), asa finalizadora (3:4) y asa antifinalizadora (2:3). La atenuación del operón trp utiliza una estructura secundaria de mRNA para percibir la cantidad de triptófano en la célula (como trp-tRNA) de acuerdo al modelo que se muestra en la figura 7-11. La prevención de la transcripción por una proteína repre- sora se denomina control negativo. La forma opuesta de regu- lación transcripcional (inicio de la transcripción en respuesta a la unión con una proteína activadora) se conoce como control positivo. Ambas formas de control se ejercen sobre la expre- sión del operón lac, que son genes relacionados con la fermen- tación de lactosa en E. coli. Los operones contienen tres genes estructurales. El transporte de lactosa en la célula está mediado por el producto del gen lacY. La β-galactosidasa es la enzima que hidroliza la lactosa a galactosa y glucosa y es codificada por el gen lacZ. El producto del tercer gen (lacA) es una transaceti- lasa cuya función no se ha dilucidado de manera clara. Como un producto secundario de su función normal, la β-galactosidasa produce alolactosa, un isómero estructural de la lactosa. La lactosa por sí misma no influye en la regulación transcripcional; más bien su función depende de la alolactosa, la cual es un inductor del operón lac porque su metabolito des- encadena directamente la expresión génica. En ausencia de la alolactosa, el represor lac, que es un producto controlado de manera independiente por el gen lacI, ejerce control negativo sobre la transcripción del operón lac al unirse con el operador lac. En presencia del inductor, se libera el represor del opera- dor y ocurre la transcripción. La expresión del operón lac y de muchos otros operones relacionados con la generación de energía se incrementa por la unión con la proteína transportadora de AMP cíclico (CAP, ciclyc AMP-binding protein) a una secuencia específica de DNA cerca del promotor para el operón regulado. La proteína ejerce control positivo al incrementar la actividad de la polimerasa de RNA. El metabolito que desencadena el control positivo al unirse a CAP es el 3′,5′-AMP cíclico (cAMP). Este compuesto formado en células privadas de energía, actúa a través de CAP para incrementar la expresión de las enzimas catabólicas que dan origen a un incremento en la energía metabólica. El AMP cíclico no es el único con la capacidad de ejer- cer control sobre los genes no relacionados en E. coli. Varios genes diferentes responden al nucleótido ppGpp (en el cual “p” denota fosfodiéster y “G” indica guanina) como señal de ausen- cia de un aminoácido y los genes no relacionados se expresan como parte de la respuesta SOS al daño del DNA. INGENIERÍA GENÉTICA La ingeniería es la aplicación de las ciencias a las necesidades sociales. En los últimos 40 años, la bioingeniería basada en la apter 07_Carroll_4R.indd 117 apter 07_Carroll_4R.indd 117 14/04/16 14/04/16
- 131. 118 SECCIÓN IFundamentos de microbiología FIGURA 711 Modelo de atenuación de replicación bacteriana. Paso 1. El acoplamiento de transcripción/traducción tiene lugar como para cualquier gen bacteriano. Paso 2. La polimerasa de RNA hace pausa y se forma un asa 1:2. Paso 3. Los ribosomas interrumpen en el asa 1:2 y se encuentran con dos codones trp. Paso 4. Si hay suficiente triptófano presente los RNA cargados con trp se encuentran presentes y los ribosomas realizarán la traducción de trpL. Esto causa que la polimerasa de RNA se interrumpa en el determinador independiente Rho compuesto por un asa 3:4. Paso 4 alternativo. Si hay limitación del triptófano (sin Trp-tRNA), los ribosomas se detienen en los dos codones trp, en tanto que la polimerasa de RNA continúa. Se forma el asa 2:3. Paso 5 alternativo. El determinador 3:4 no puede formarse y la polimerasa de RNA continúa la transcripción en genes estructurales trp. Esto expone el sitio de unión del ribosoma (RBS) antes de trpE, lo que permite la traducción. (Reproducida con autorización de Trun N, Trempy J: Fundamental Bacterial Genetics. Copyright © 2004 por Blackwell Science Ltd. Con autorización de Wiley.) Determinador independiente Rho AUG Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4 AUG AUG DNA AUG Polimerasa de RNA Paso 4 alternativo Paso 5 alternativo apter 07_Carroll_4R.indd 118 apter 07_Carroll_4R.indd 118 14/04/16 14/04/16
- 132. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 119 genética bacteriana ha transformado la biología. Es posible ais- lar fragmentos específicos de DNA y amplificarse, y sus genes pueden expresarse en concentraciones elevadas. La especi- ficidad de los nucleótidos necesarios para el desdoblamiento de las enzimas de restricción permite que los fragmentos que contienen genes o partes de los mismos se unan (incorporen) a los plásmidos (vectores) que pueden usarse a su vez para trans- formar a las células bacterianas. Las colonias bacterianas o clonas portan genes específicos que pueden identificarse por hibridación de DNA o RNA con sondas marcadas (similares a las que se muestran en la figura 3-4). De manera alternativa, los productos proteínicos codificados por los genes pueden identi- ficarse ya sea por actividad enzimática o por técnicas inmuno- lógicas. Así, pueden utilizarse técnicas de ingeniería genética para aislar prácticamente cualquier gen, por lo que dichos genes pueden expresarse de forma tal que es posible estudiar o explotar las propiedades bioquímicas identificables. Los genes aislados pueden utilizarse para diversos pro- pósitos. La mutagénesis de sitio dirigido puede identificar y alterar la secuencia de DNA de un gen. Es posible determi- nar y, si se desea, alterar los residuos de nucleótidos esenciales para las funciones de los genes. Con las técnicas de hibrida- ción, el DNA puede utilizarse como una sonda que reconozca los ácidos nucléicos correspondientes a las secuencias comple- mentarias de su propio DNA. Por ejemplo, un virus latente en un tejido animal se detecta con una sonda de DNA incluso en ausencia de infección viral evidente. Los productos proteí- nicos de los genes virales aislados ofrecen una gran promesa como vacunas porque se preparan sin genes que codifican la replicación de ácido nucleico viral. Por ejemplo, las proteínas de la cápside del virus del papiloma humano se clonaron y expresaron; se les llama partículas similivíricas no infecciosas (VLP, virus-like particles) y forman la base de una vacuna con- tra cepas transformadoras de este virus. Además, proteínas como la insulina que tienen funciones útiles pueden prepa- rarse en grandes cantidades a partir de bacterias que expresan los genes clonados. Preparación de fragmentos de DNA con enzimas de restricción La diversidad genética de las bacterias se refleja por su amplia gama de enzimas de restricción, las cuales poseen una selec- tividad notable que les permite identificar regiones específi- cas de DNA para su desdoblamiento. Las secuencias de DNA reconocidas por enzimas de restricción son de manera predo- minante palíndromos (secuencias de repeticiones invertidas). Una secuencia típica en palíndromo, reconocida por EcoR1, una enzima de restricción más utilizada, es GAATTC; la repe- tición invertida, inherente en su complementariedad en los pares de bases G-C y A-T, da origen a la secuencia 5′ TTC que se refleja como AAG en la cadena 3′. La longitud de los fragmentos de DNA producidos por enzimas de restricción varía en gran medida por la individua- lidad de secuencias de DNA. La longitud promedio de los frag- mentos de DNA depende en gran parte del número de bases específicas reconocidas por una enzima. La mayor parte de las enzimas de restricción reconoce cuatro, seis u ocho secuencias de bases; sin embargo, otras enzimas de restricción reconocen 10, 11, 12 o 15 secuencias de bases. El reconocimiento de cua- tro bases da origen a fragmentos con una longitud promedio de 250 pares de bases y por lo tanto suele ser útil para el análisis o manipulación de fragmentos génicos. Con frecuencia genes completos son abarcados por enzimas de restricción que reco- nocen seis bases y producen fragmentos con un tamaño prome- dio de 4 kbp. Las enzimas de restricción que reconocen ocho bases producen fragmentos con un tamaño típico de 64 kbp y son útiles para el análisis de regiones genéticas grandes. Las enzimas de restricción que reconocen más de 10 bases son útiles para la construcción de un mapa físico y de la tipificación mo- lecular mediante electroforesis en gel en un campo de pulsos. Separación física de fragmentos de DNA de tamaño diferente Gran parte de la simplicidad de las técnicas de ingeniería gené- tica yace en el hecho de que la electroforesis en gel permite la separación de fragmentos de DNA con base en el tamaño (figura 7-12): mientras más pequeños los fragmentos, más rápida será la tasa de migración. La tasa general de migración y el intervalo óptimo de tamaño para la separación puede deter- minarse con base en la naturaleza química del gel y el grado de formación de enlaces cruzados. Los geles con alto grado de enlacescruzadosoptimizanlaseparacióndefragmentospeque- ños de DNA. El colorante bromuro de etidio forma un aducto de color floreciente brillante que se une al DNA, de forma que pequeñas cantidades de fragmentos separados de DNA pueden visualizarse sobre los geles (figura 7-12A). Fragmentos específicos de DNA pueden identificarse por sondas que con- tienen secuencias complementarias (figuras 7-12B y C). La electroforesis en gel en campo de pulsos permite la separación de fragmentos de DNA que contienen hasta 100 kbp que se separan en geles de poliacrilamida de alta resolu- ción. La identificación de fragmentos tan grandes ha permi- tido la construcción de un mapa físico para los cromosomas de varias especies bacterianas y han sido de gran utilidad para la identificación de huellas genéticas de aislados bacterianos rela- cionados con brotes epidémicos de enfermedades infecciosas. Clonación de fragmentos de restricción de DNA Muchas enzimas de restricción producen desdoblamiento asimétrico y fragmentos de DNA con extremos cohesivos (adhesivos) que pueden hibridizarse con otros fragmentos. Este DNA puede utilizarse como donador con un plásmido receptor para formar un plásmido recombinante por medio de ingeniería genética. Por ejemplo, el desdoblamiento de DNA con EcoR1 produce DNA que contiene una secuencia AATT en el extremo 5′ y la secuencia complementaria TTAA en el extremo 3′ (figura 7-13). El desdoblamiento de un plásmido con la misma enzima de restricción produce un fragmento lineal con extremos adhesivos que son idénticos uno con otro. La eliminación enzimática de los grupos de fosfato libres de estos extremos asegura que no se unirán para formar el plás- mido circular original. La ligadura en presencia de otros frag- mentos de DNA que contienen grupos de fosfato libres genera apter 07_Carroll_4R.indd 119 apter 07_Carroll_4R.indd 119 14/04/16 14/04/16
- 133. 120 SECCIÓN IFundamentos de microbiología plásmidos recombinantes, que poseen fragmentos de DNA en la forma de insertos dentro del DNA circular cerrado covalen- temente. Los plásmidos deben tener forma circular para mos- trar réplica dentro de la bacteria hospedadora. Los plásmidos recombinantes pueden introducirse en el hospedador bacteriano, con frecuencia E. coli, por medio de transformación forzada. La electroporación es un pro- cedimiento que introduce DNA en la bacteria utilizando un gradiente eléctrico. Las células transformadas pueden seleccio- narse con base en uno o más factores de resistencia a fármacos codificados por los genes de los plásmidos. La población bacte- riana resultante contiene una biblioteca de plásmidos recom- binantes que portan varias clonas de fragmentos de restricción insertados, derivados del DNA del donador. Las técnicas de hibridación pueden utilizarse para identificar colonias bac- terianas portadoras de fragmentos de DNA específico (figura 7-14) o, si el plásmido expresa el gen insertado, las colonias pueden tamizarse para el producto génico por un anticuerpo específico para la proteína producida. IDENTIFICACIÓN DEL DNA CLONADO Mapa de restricción La manipulación del DNA clonado requiere la comprensión de su secuencia de ácidos nucleicos. La preparación de un mapa de restricción es la primera etapa en la obtención de dicho conocimiento. Un mapa de restricción se construye en forma muy similar a un rompecabezas a partir de fragmentos produ- cidos por digestión simple, los cuales se preparan con enzimas de restricción individuales. Los mapas de restricción también son el paso inicial hacia la secuenciación de DNA porque iden- tifican fragmentos que proporcionarán subclonas (fragmentos relativamente pequeños de DNA) que se someten a un análi- sis más riguroso, que puede incluir la secuenciación del DNA. Además, los mapas de restricción proporcionan información muyespecíficarespectoalasbases,quepermitequelosfragmen- tos de DNA, que se identifican con base en el tamaño, se asocien con funciones génicas específicas. FIGURA 712 A: separación de los fragmentos de DNA con base en el tamaño por electroforesis en gel. Los fragmentos pequeños migran con mayor rapidez que los fragmentos grandes y en un intervalo determinado por las propiedades del gen, la distancia de migración proporciona en términos generales el logaritmo del tamaño del fragmento. Los fragmentos de DNA pueden visualizarse con base en su florescencia después de la tinción con colorante. B: el tamaño de los fragmentos de restricción depende de su ubicación en los sitios de restricción en el DNA. En este ejemplo, un fragmento de 4 pares de kilobases (kbp) formado por enzimas de restricción EcoR1 (E) contiene los sitios respectivos para las enzimas de restricción HindIII (H) y SalI (S) en las posiciones correspondientes a 1 y 3.5 kbp. El patrón de electroforesis en A revela que la enzima de restricción E no corta el fragmento de 4 kbp (primer trayecto); el desdoblamiento con enzima de restricción H produce fragmentos de 3 y 1 kbp (segundo trayecto); el desdoblamiento con enzima de restricción S da origen a fragmentos de 3.5 y 0.5 kbp (tercer trayecto) en tanto que el desdoblamiento de los fragmentos H y S forma fragmentos de 2.5, 1 y 0.5 kbp (cuarto trayecto). Los fragmentos de 0.5 kbp se encuentran entre los sitios S y E, que se eligieron como sonda para determinar el DNA con secuencias de hibridación, como se muestra en C. C: Identificación de fragmentos de hibridación. Los fragmentos de restricción se separaron como se observa en A. El procedimiento de hibridación revela los fragmentos que se sometieron a hibridación con una sonda de 0.5 kbp. Estos son fragmentos de 4 kbp formados por enzimas de restricción E, el fragmento de 3 kbp que se encuentra entre los sitios E y H, y el fragmento de 0.5 kbp que se encuentra entre los sitios S y H. Sitios de restricción Longitud (kbp) Sitio enzimático E E H S Sonda 1 2 3 4 Fragmentos de restricción Fragmentos de restricción para hibridación Tamaño del fragmento (kbp) E Enzimas E/H E/S E/H/S Tamaño del fragmento (kbp) E Enzimas E/H E/S E/H/S 4 3 2 1 0.5 1 0.5 4 3 2 A C B apter 07_Carroll_4R.indd 120 apter 07_Carroll_4R.indd 120 14/04/16 14/04/16
- 134. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 121 FIGURA 713 Formación de un plásmido recombinante o quimérico a partir de DNA detonador y un vector del receptor. El vector es un plásmido que porta el sitio de restricción EcoR1, que sufre desdoblamiento por enzimas y se prepara para ligadura mediante la eliminación de los grupos fosfato terminales. Este paso evita que los extremos adhesivos del plásmido se unan en ausencia de material insertado. El DNA donador se trata con las mismas enzimas de restricción y un enlace covalente cierra la molécula mediante una ligadura. Un marcador de resistencia farmacológica, mostrado como ampR en el plásmido puede utilizarse para seleccionar los plásmidos recombinantes después de su transformación en la Escherichia coli. Las enzimas de la bacteria hospedadora completan el enlace covalente del DNA circular y media su replicación. DNA donador AATTC GAATTC G G G G C C C C G G CTTAA G AATTC G G G 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ CTTAAG CTTAA GAATTC AATTC CTTAAG CTTAA TTAA T T A A T T A A TTAA Vector receptor Sitio de restricción EcoR1 Sitio de restricción EcoR1 RESTRICCIÓN HIBRIDACIÓN DE LOS EXTREMOS ADHESIVOS Sitio de restricción EcoR1 GAATTC CTTAAG RESTRICCIÓN P P P P P P P Pi P ampR ampR ampR ampR G CTTAA C C C G G T T A A T T A A TTAAG P P ampR LIGADURA Plásmido recombinante (o quimérico) G CTTAA G AATTC Fosfatasa H2O + H2O H2O ATP apter 07_Carroll_4R.indd 121 apter 07_Carroll_4R.indd 121 14/04/16 14/04/16
- 135. 122 SECCIÓN IFundamentos de microbiología FIGURA 714 Uso de sondas para identificar clonas que contienen fragmentos específicos de DNA. Las colonias pueden transferirse a un filtro y calentarse de forma tal que las células se destruyan y el DNA se adhiera al filtro. Más tarde, el filtro puede ser tratado con una solución que contenga una sonda de DNA marcada en forma apropiada, lo que produce hibridación específica con las clonas deseadas. La autorradiografía subsiguiente del filtro identifica estas clonas (círculos oscuros). Las clonas también pueden ser expuestas a sondas con anticuerpos para saber si sintetizan un producto proteínico específico. FIGURA 715 Determinación de la secuencia de DNA por el método de Sanger (terminación didesoxi). La elongación enzimática del DNA se interrumpe por la inclusión de análogos didesoxi de trinucleótidos correspondientes con A, C, G y T por separado en mezclas de reacciones paralelas. El grupo resultante de cadenas elongas interrumpidas se separa por secuenciación en gel y puede deducirse la secuencia al notar la base que corresponde a cada incremento en la longitud de la cadena. La secuenciación en gel se lee de abajo hacia arriba, y cada línea corresponde con un incremento en una base. Transferencia al filtro Fijación del DNA Se añade una sonda con DNA marcado Lavado de los marcadores no unidos Autorradiografía Terminación en A C G T Secuencia: CACGTG Secuenciación La secuenciación de DNA muestra la estructura génica y per- mite a los investigadores deducir la secuencia de aminoácidos de los productos génicos. A su vez, esta información hace posi- ble manipular los genes en orden para comprender o alterar su función. Además, el análisis de secuencias de DNA revela regiones reguladoras que controlan la expresión génica y “pun- tos calientes” genéticos que son en particular susceptibles a la mutación. La comparación de secuencias de DNA revela rela- ciones evolutivas que proporcionan un marco de referencia para la clasificación sin ambigüedades de especies bacterianas. Tales comparaciones pueden facilitar la identificación de regio- nes conservadas que pueden ser en especial útiles como sondas específicas de hibridación para detectar organismos o virus en una muestra clínica. El método original para conocer la secuencia de DNA uti- lizó la técnica de Maxam-Gilbert que depende de la suscepti- bilidad química relativa de diferentes enlaces de nucleótidos. Las técnicas utilizadas cambiaron enormemente para el uso del método de Sanger (terminación dideoxi) que interrumpe la elongación de las secuencias de DNA al incorporar didesoxinu- cleótidos al interior de las secuencias. Ambas técnicas produ- cen un grupo de oligonucleótidos que inician de un solo origen e implica la separación de cadenas de secuencias de DNA en gel que difieren por el incremento de un solo nucleótido. La secuenciación en gel de poliacrilamida separa cadenas que difieren en longitud desde uno hasta varios cientos de nucleó- tidos y revela secuencias de DNA de longitudes variables. Cuatro trayectos paralelos sobre el mismo gel revelan la longitud relativa de las cadenas sometidas a terminación didesoxi en adenina, citidina, guanina y timidina. La com- paración de los cuatro trayectos que contienen la reacción se mezcla de forma tal que difieren únicamente en el método de terminación de la cadena, lo que hace posible determinar la secuencia de DNA por el método de Sanger (figura 7-15). La relativa simplicidad del método de Sanger ha conducido a su uso más generalizado, pero la técnica de Maxam-Gilbert se emplea de manera amplia porque puede exponer regiones de DNA que están protegidas por proteínas específicas contra modificaciones químicas. La secuenciación de DNA se facilita en gran medida por la manipulación genética del bacteriófago M13 de E. coli, el cual apter 07_Carroll_4R.indd 122 apter 07_Carroll_4R.indd 122 14/04/16 14/04/16
- 136. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 123 FIGURA 716 Mutagénesis dirigida al sitio. Un cebador sintetizado por medios químicos que contiene la mutación G (en el recuadro) se hibridiza con una secuencia natural insertada en el DNA a partir de un fago monocatenario. Se utilizan reacciones de polimerización para formar heterodúplex bicatenario que porta la mutación en una cadena. La introducción del heterodúplex en la bacteria hospedadora seguida de segregación produce cepas que portan la forma de replicación con el DNA natural insertado o un fragmento insertado que adquiere la mutación química diseñada. GTGC CGTG Cebador mutado GTGC CGTG G G CACGTGCAC Secuencia natural Plantilla Heterodúplex de replicación Forma mutante de replicación Forma natural de replicación Replicación de la plantilla CACGTGCAC GTGCA CGTG CACGTGCAC GTGC CGTG C ACG C GCA C Transformación en la bacteria hospedadora G contiene DNA monocatenario. La forma retrospectiva del DNA del fago es un DNA bicatenario circular cerrado por un enlace covalente, producido por ingeniería genética de forma tal que contenga un sitio de clonación múltiple que permita la integra- ción de fragmentos específicos de DNA que se han identificado previamente por mapeo de restricción. Las bacterias infectadas con la forma replicativa secretan fagos modificados que con- tienen, en el interior de su envoltura proteínica, ssDNA que incluye la secuencia insertada. Este DNA actúa como planti- lla para reacciones de elongación. El origen para la elongación depende de un cebador de DNA que puede sintetizarse por máquinas automatizadas para la síntesis química de oligonu- cleótidos. Tales máquinas pueden producir cadenas de DNA que contienen 75 o más oligonucleótidos en una secuencia predeterminada y son esenciales para la secuenciación y para la modificación del DNA por mutagénesis dirigida al sitio. Los oligonucleótidos sintetizados por medios químicos pueden servir como cebadores para la reacción en cadena de polimerasa (PCR, polymerase chain reaction), un procedi- miento que permite la amplificación y secuenciación del DNA que se encuentra entre los cebadores. Así, en muchos casos, el DNA no necesita ser clonado a fin de secuenciarse o para que esté disponible para procedimientos de ingeniería genética. El estudio de la biología se ha revolucionado con el desa- rrollodetecnologíaquepermitelasecuenciaciónyanálisisdela totalidad de los genomas, que varía desde virus, microorganis- mos unicelulares procariotas y eucariotas hasta seres humanos. Esto se ha facilitado con el uso de un procedimiento conocido como escopetazo (shotgunning). En este procedimiento, el DNA se rompe en fragmentos más pequeños para crear una biblioteca de fragmentos. Tales fragmentos desordenados son secuenciados por secuenciadores de DNA automáticos y se reensamblan utilizando programas de cómputo poderosos. Un número suficiente de fragmentos son secuenciados para asegurar que se abarque la totalidad del genoma de forma que cuando se ensamblen, la mayor parte del genoma se represente sin dejar demasiadas brechas. (Para lograr esto, la totalidad del genoma por lo común se revisa cinco a ocho veces, con lo que se deja casi 0.1% del total de DNA sin secuenciar.) Después que los fragmentos aleatorios se han ensamblado por medio de áreas con superposición de secuencias, todos los espacios rema- nentes deben identificarse y cerrarse. Los datos avanzados de procesamiento permiten la anotación de los datos de la secuencia en la cual se identifican regiones putativas de codi- ficación, operones y secuencias reguladoras. Los genomas de varios microorganismos importantes han sido secuenciados. El análisis continuo de los datos de secuenciación de patóge- nos humanos importantes combinados con los estudios de patogenia molecular facilitará la comprensión de la forma en que estos organismos causan enfermedad y por último, lleva- rán a la producción de mejores vacunas y mejores estrategias terapéuticas. MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO La síntesis química de oligonucleótidos permite a los investi- gadores realizar una introducción controlada de sustituciones de bases en la secuencia de DNA. La sustitución especificada puede utilizarse para explorar los efectos de una mutación pre- diseñada sobre la expresión génica, con el fin de examinar la contribución de un aminoácido sustituido para una función proteínica o (con base en la información previa respecto a los residuos esenciales para su función) a fin de inactivar un gen. apter 07_Carroll_4R.indd 123 apter 07_Carroll_4R.indd 123 14/04/16 14/04/16
- 137. 124 SECCIÓN IFundamentos de microbiología Los oligonucleótidos monocatenarios que contienen la muta- ción específica se sintetizan por medios químicos y se some- ten a hibridación con un fago con DNA monocatenario, el cual lleva insertada la secuencia natural (figura 7-16). El DNA bicatenario parcialmente resultante se convierte por medios enzimáticos a una forma bicatenaria replicativa. Este DNA, que contiene la secuencia natural en una cadena y la secuen- cia mutante en otra se utiliza para infectar a la bacteria que actuará como hospedador mediante transformación. La repli- cación da origen a la segregación de DNA mutante y natural, y el gen mutante bicatenario puede ser aislado y más tarde clo- nado a partir de la forma replicativa del fago. ANÁLISIS CON DNA CLONADO: SONDAS DE HIBRIDACIÓN Las sondas de hibridación (transferencia de Southern, figura 3-4) se utilizan de manera habitual para la clonación de DNA. La secuencia de aminoácidos de una proteína puede utilizarse para deducir la secuencia de DNA por medio de la cual puede construirse una sonda y emplearse para detectar colonias bac- terianas que contengan el gen clonado. El DNA complementa- rio (cDNA, complementary DNA) codificado por mRNA puede utilizarse para detectar el gen que codifica dicho mRNA. La hibridación de DNA a RNA por el método de membrana de Northern puede proporcionar información cuantitativa res- pecto a la síntesis de RNA. Las secuencias específicas de DNA en fragmentos de restricción separados en gel pueden reve- larse por medio del método de transferencia de Southern, un método que utiliza la hibridación de DNA a DNA. Estos méto- dos pueden utilizarse para detectar superposición de frag- mentos de restricción. La clonación de estos fragmentos hace posible aislar las regiones que rodean al DNA por una técnica conocida como deslizamiento cromosómico. Otra técnica de detección empleada con frecuencia es la transferencia de tipo Western, donde se utilizan anticuerpos para detectar genes clonados mediante la unión con sus productos proteínicos. Pueden utilizarse sondas en una amplia gama de pro- cedimientos analíticos. Algunas regiones de DNA humano muestranvariaciónsustancialenladistribucióndesitiosderes- tricción. Esta variabilidad se denomina polimorfismo de lon- gituddefragmentosderestricción(RFLP,restrictionfragment length polymorphism). Las sondas de oligonucleótidos que pro- ducen hibridación con fragmentos de DNA de RFLP pueden utilizarse para rastrear DNA a partir de muestras pequeñas de su donador humano. Así, la técnica es útil para la ciencia forense. Las aplicaciones de RFLP para la medicina incluyen la identificación de regiones genéticas que tienen relación estre- cha con genes humanos con disfunción que están relacionados con enfermedades genéticas. Esta información ha sido de gran utilidad y continua siéndolo en el consejo genético. Las sondas de DNA ofrecen la promesa de técnicas para la identificación rápida de microorganismos de crecimiento lento en muestras clínicas que son difíciles de cultivar en un laboratorio de microbiología. Además, extensiones de la téc- nica ofrecen oportunidades para identificar agentes patógenos en forma rápida y directa en tejidos infectados. Se encuentran disponibles en el mercado equipos para la identificación de muchos patógenos bacterianos y virales. La aplicación de sondas diagnósticas de DNA requiere apreciar: 1) a las sondas mismas; 2) a los sistemas utilizados para detectar las sondas; 3) los objetivos (el DNA con el cual ocurrirá hibridación con las sondas) y 4) las condiciones de la hibridación. Las sondas pueden ser fragmentos de restricción relativamente grandes derivados del DNA clonado o de oligo- nucleótidos correspondientes a una región específica del DNA. Las sondas grandes pueden proporcionar gran precisión por- que son menos sensibles a los cambios de una sola base en el DNA estudiado. Por otra parte, las reacciones de hibridación ocurren con mayor rapidez con sondas pequeñas, y pueden ser diseñadas contra regiones conservadas de DNA en las cuales es poco probable que ocurran sustituciones de bases. Las ampli- ficaciones de una región estudiada por PCR seguida por detec- ción de un producto amplificado después de hibridación con una sonda han demostrado mayor sensibilidad que los méto- dos de detección directa. En fechas recientes han ocurrido mejorías significativas en los métodos para pruebas diagnósticas moleculares, en especial aquellas que incorporan tecnologías de amplificación de ácidos nucléicos como PCR. A nivel comercial, se encuentran dispo- nibles varios instrumentos que combinan la amplificación de PCR del DNA estudiado de amplicones en el mismo contene- dor cerrado. Esta tecnología se conoce como PCR en tiempo real, lo que implica que los amplicones de PCR pueden detec- tarse y cuantificarse en tiempo real. En la actualidad “tiempo real” se refiere a la detección de amplicones después de cada ciclo de PCR. Los formatos de detección con sonda implican la detección de fluoróforos. Los resultados son semicuantitativos y pueden obtenerse en un tiempo considerablemente menor que el necesario para realizar un análisis de PCR convencional. MANIPULACIÓN DEL DNA CLONADO Las técnicas de ingeniería genética permiten la separación y expresión completamente independiente de genes relacionados con los patógenos. Las vacunas preparadas con genes creados por ingeniería genética permiten medidas de seguridad que no era posible lograr con anterioridad. Por ejemplo, puede prepa- rarse una vacuna contra una proteína de la cubierta viral (antí- geno de superficie del virus de la hepatitis B) que fue producida en ausencia de cualquier gen relacionado con las funciones de replicación viral; la inoculación con tales vacunas no implica el riesgo de introducir un virus funcional. Las dificultades poten- ciales en el desarrollo de tales vacunas radica en la facilidad con la cual las mutaciones virales pueden producir variantes genéticas que no son reconocidas por el sistema inmunitario de defensa de un individuo vacunado. Por último, las vacunas actuales (y en el futuro) contienen una amplia gama de proteí- nas que anticipan la respuesta genética del patógeno. Cepas recombinantes en el medio ambiente Los avances científicos importantes han desencadenado en ocasiones reacciones públicas adversas, de forma que es pru- dente considerar las consecuencias potenciales de la ingeniería genética. Un tema de preocupación más inmediata es conocer apter 07_Carroll_4R.indd 124 apter 07_Carroll_4R.indd 124 14/04/16 14/04/16
- 138. CAPÍTULO 7 Genéticamicrobiana 125 si los patógenos han sufrido relativamente pocas modifica- ciones genéticas. Éstas deben ser investigadas en laboratorios diseñados especialmente para controlar a los microorganis- mos. La necesidad de contención disminuye después que los genes para las funciones específicas, como cubiertas proteíni- cas, son separados de los genes relacionados con la replicación o toxicidad de un patógeno. Sobre todo, deben observarse las precauciones estándar relacionadas con laboratorios de micro- biología, principalmente porque fomentan hábitos que son de utilidad si un patógeno potencial entra al laboratorio. Excepciones interesantes a esta regla general son los microorganismos creados por ingeniería genética que pue- den proporcionar beneficios sociales si se introducen al medio ambiente. Muchos microorganismos se derivan de bacterias no patógenas que se presentan naturalmente con frecuencia de hasta 105 /g de tierra. La evidencia disponible sugiere que la depredación y competencia eliminan con rapidez a las cepas de bacterias creadas por ingeniería genética después que se introducen al medio ambiente. El reto primario sería mantener los beneficios biológicos en el medio ambiente de los microor- ganismos modificados por ingeniería genética, más que eli- minarlos. Sin embargo, esto no está exento de consecuencias sociales. Entre los ejemplos de microorganismos modificados por ingeniería genética se encuentran las cepas de Pseudomo- nas que producen una proteína que favorece la formación de cristales de hielo. La utilidad de estos organismos naturales es apreciada por propietarios dependientes utilizados para el esquí, quienes de manera deliberada introducen las bacterias en el ambiente sin despertar preocupaciones del público en gene- ral. Un efecto secundario desafortunado de la introducción de estos microorganismos es que los cristales de hielo favorecen el daño de cultivos, por ejemplo de la lechuga, durante la tempo- rada en la cual es probable que se presenten heladas leves. Las bacterias mutantes que no forman cristales de hielo se diseña- ron por microbiólogos quienes esperan que el microorganismo mutante pueda proteger los cultivos de lechuga al ocupar tem- poralmente el nicho que normalmente no es habitado por cepas formadoras de hielo; sin embargo, los intentos para utilizar microorganismos mutantes en estudios de campo se acompa- ñaron de protestas sustanciales y los estudios se realizaron sólo después de procesos judiciales prolongados y costosos. Los pre- cedentes legales que han surgido de lo anterior, además de otras aplicaciones similares recientes, establecerán las guías respecto al uso progresivo y beneficioso de las técnicas de bioingeniería genética y facilitarán el conocimiento de situaciones en que está justificada la cautela extrema. OBJETIVOS 1. Describir la estructura de un nucleótido, un par de bases y la estructura líneal y tridimensional de DNA bicatenario. 2. Conocer las diferencias entre RNA y DNA en lo referente a estructura, complejidad y tamaños relativos. 3. Identificar las funciones de formas de RNA, por ejemplo, mRNA, rRNA, tRNA y ribozimas. 4. Detallar las diferencias básicas entre un cromosoma pro- cariótico y otro eucariótico. 5. Explicar específicamente los términos que se han apli- cado a la recombinación bacteriana y la transferencia genética: transposones, conjugación, transformación y transducción. 6. Describir los mecanismos de mutación bacteriana y redis- posición génica. 7. Articular los medios fundamentales por los cuales son transcritos los genes bacterianos que incluyan los con- ceptos de transcripción y traducción acopladas, activador, represor y atenuación. 8. Señalar las diferencias entre ribosomas eucarióticos y los procarióticos y describir las fases en la traducción ribosó- mica procariótica 9. Comprender el concepto de bioingeniería genética y comentar los instrumentos importantes que intervienen en tal proceso (como enzimas restrictivas, ligadura, clona- ción y expresión). 10. Describir los instrumentos que permiten la identificación del DNA: restricción, mapeo, secuenciación, mutagénesis, hibridación y otros métodos de detección. 11. Apreciar los beneficios y posibles aspectos negativos de bacterias recombinantes (obtenidas por bioingeniería) en el entorno. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. ¿Cuál es el mecanismo por el que pueden surgir mutaciones en las bacterias? (A) Sustitución de bases (B) Deleciones (C) Inserciones (D) Reordenamiento (E) Todas las anteriores 2. La forma de intercambio genético en el cual el DNA donador se introduce en el receptor por medio de un virus bacteriano es: (A) Transformación (B) Conjugación (C) Transfección (D) Transducción (E) Transferencia horizontal 3. La enzima DNAsa degrada el DNA desnudo. Si dos cepas de bac- terias de la misma especie se mezclaron en presencia de DNAsa, ¿cuál método de transferencia génica sería inhibido con mayor probabilidad? (A) Conjugación (B) Transducción (C) Transformación (D) Transposición (E) Todos los anteriores 4. La replicación, ¿de cuál de los siguientes requiere la integración física con el replicón bacteriano? (A) Bacteriófago con DNA monocatenario (B) Bacteriófago con DNA bicatenario (C) Bacteriófago con RNA monocatenario (D) Plásmido (E) Transposón 5. La transformación de un par de bacterias durante el proceso de conjugación en la Escherichia coli requiere: (A) Lisis del donador (B) Una pilosidad sexual apter 07_Carroll_4R.indd 125 apter 07_Carroll_4R.indd 125 14/04/16 14/04/16
- 139. 126 SECCIÓN IFundamentos de microbiología (C) Transferencia de DNA bicatenario (D) Una endonucleasa de restricción (E) Integración de un transposón 6. ¿Por qué las bacterias contienen enzimas de restricción? (A) Para fisurar el RNA con la finalidad de que se incorpore a los ribosomas (B) Para aumentar la longitud de cromosomas bacterianos (C) Para evitar que DNA extraño se incorpore al genoma bacteriano (D) Para procesar los exones de mRNA procariótico (E) Para fracturar proteolíticamente promotores nucleares 7. Si la secuencia de bases en una hebra de DNA codificador es 5′ CATTAG3′ , entonces ¿cuál de las secuencias de mRNA siguien- tes sería su complemento en la otra cadena? (A) 5′ GTAATC3′ (B) 5′ CUAAUG3′ (C) 5′ CTAATG3′ (D) 5′ GUAAUC3′ (E) 5′ CATTAG3′ Bushman F: Lateral DNA Transfer. Mechanisms and Consequences. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002. Condon C: RNA processing and degradation in Bacillus subtilis. Microbiol Mol Biol Rev 2003;67:157. Fraser CM, Read TD, Nelson KE (editors): Microbial Genomes. Humana Press, 2004. Grohmann E, Muuth G, Espinosa M: Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 2003;67:277. Hatfull GF: Bacteriophage genomics. Curr Opin Microbiol 2008;5:447. Kornberg A, Baker T: DNA Replication, 2a. ed. Freeman, 1992. Lengler JW, Drews G, Schlegel HG (editors): Biology of the Prokaryotes. Blackwell Science, 1999. Liebert CA, Hall RM, Summers AO: Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiol Mol Biol Rev 1999;63:507. Murray NE: Type I restriction systems: Sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani and Weigle). Microbiol Mol Biol Rev 2000;64:412. Ptashne M: A Genetic Switch: Phage Lambda and Higher Organisms, 2a. ed. Blackwell, 1992. Rawlings DE, Tietze E: Comparative biology of IncQ and IncQ-like plasmids. Microbiol Mol Biol Rev 2001;65:481. Reischl U, Witter C, Cockerill F (editors): Rapid Cycle Real-Time PCR—Methods and Applications. Springer, 2001. Rhodius V, Van Dyk TK, Gross C, LaRossa RA: Impact of genomic technologies on studies of bacterial gene expression. Annu Rev Microbiol 2002;56:599. Sambrook J, Russell NO: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001. Singleton P, Sainsbury D: A Dictionary of Microbiology and Molecu- lar Biology, 3a. ed. Wiley, 2002. Trun N, Trempy J: Fundamental Bacterial Genetics. Blackwell Sci- ence Ltd, 2004. Van Belkum A, Scherer S, van Alphen L, Verbrugh H: Short- sequence DNA repeats in prokaryotic genomes. Microbiol Mol Biol Rev 1998;62:275. Respuestas 1. E 2. D 3. C 4. E 5. B 6. C 7. B BIBLIOGRAFÍA Alberts B, et al.: Molecular Biology of the Cell, 4a. ed. Garland, 2002. Avery O, Mcleod C, McCarty M: Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a deoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J Exp Med 1944;79(2):137. Barlow M: What antimicrobial resistance has taught us about hori- zontal gene transfer. Methods Mol Biol 2009;532:397-411. apter 07_Carroll_4R.indd 126 apter 07_Carroll_4R.indd 126 14/04/16 14/04/16
- 140. 127 8 Inmunología C A PÍ T U L O GENERALIDADES La función del sistema inmunitario es conferir protección. Actúa como un mecanismo de defensa del hospedador contra enfermedades infecciosas y antígenos externos (ajenos). Para lograr este objetivo, el sistema inmunitario cuenta con un mecanismo de respuesta rápida, especificidad exquisita, adap- tabilidad, una red reguladora intrincada y memoria. En las últimas décadas han ocurrido progresos dramáticos en el área de la inmunología. En consecuencia, se han logrado avances significativos no sólo en el ámbito de la investigación sino también en el campo de la clínica y el diagnóstico. Estos progresos han permitido comprender mejor la forma en la que el sistema inmunitario trabaja y han proporcionado conoci- mientos sobre una variedad de trastornos inmunitarios, como infecciones, alergias, enfermedades autoinmunitarias, inmu- nodeficiencias, cáncer y trasplantes. Esta información ha per- mitido mejorar el diagnóstico y el control de estos pacientes e integrar nuevas estrategias de tratamiento. Este capítulo se enfoca en los principios básicos de la inmunología y la forma particular en la que se relacionan con la respuesta a las infecciones. En la bibliografía se presentan referencias mucho más detalladas sobre los diversos aspectos del sistema inmunitario. Respuesta inmunitaria El sistema inmunitario defiende al hospedador contra patóge- nos al utilizar diferentes mecanismos de reconocimiento que eliminan de forma efectiva al microbio invasor o a sus pro- ductos. Una reacción generada contra un patógeno potencial se llama respuesta inmunitaria. La primera línea de defensa, que no es específica para el agente invasor, se moviliza con rapidez hacia el sitio infectado, pero carece de memoria inmunitaria. A esta respuesta se le llama inmunidad innata. El segundo sis- tema de defensa se conoce como inmunidad adaptativa. Ésta es específica para el patógeno infeccioso y confiere inmunidad protectora contra reinfecciones subsiguientes. La inmunidad adaptativa es capaz de reconocer y destruir de manera espe- cífica a los patógenos porque los linfocitos portan receptores celulares especializados y producen anticuerpos específicos. Una proteína que se produce en respuesta a un patógeno par- ticular se conoce como anticuerpo y la sustancia que induce la producción de anticuerpos se llama antígeno. En resumen, la respuesta inmunitaria innata es esencial para eliminar la ma- yoría de los patógenos. Si este mecanismo falla, sin embargo, se inicia una respuesta inmunitaria adaptativa que confronta de forma específica al patógeno y establece inmunidad. Por lo tanto, los dos sistemas interactúan y colaboran para lograr el objetivo final, que es destruir al patógeno. INMUNIDAD INNATA La inmunidad innata es una respuesta inmediata contra un patógeno, la cual no confiere inmunidad protectora por mucho tiempo. Es un sistema de defensa no específico e incluye barre- ras contra agentes infecciosos como la piel (epitelio) y las membranas mucosas. También incluye muchos componentes inmunitarios que son importantes en la respuesta inmunitaria adaptativa, como fagocitos, linfocitos citolíticos naturales (NK, natural killers), receptores de tipo Toll (TLR, Toll-like recep- tors), citosinas y factores del sistema del complemento. Barreras de la inmunidad innata Pocos microorganismos logran penetrar las superficies cor- porales. Éstas tienen capas de células epiteliales que actúan como barreras, las cuales se encuentran en la piel, las vías res- piratorias, el sistema gastrointestinal (GI) y el aparato genitou- rinario. Las células de los epitelios tienen uniones estrechas y producen un número de péptidos antimicrobianos potentes que ayudan a proporcionar protección contra patógenos inva- sores. La lisozima es un ejemplo de un péptido antimicrobiano que disuelve algunas paredes celulares bacterianas. Otras SECCIÓN II INMUNOLOGÍA apter 08_Carroll_4R.indd 127 apter 08_Carroll_4R.indd 127 14/04/16 14/04/16
- 141. 128 SECCIÓN IIInmunología moléculas con propiedades antimicrobianas importantes para la defensa innata son las defensinas. Éstas son péptidos con carga positiva localizados principalmente en el GI y las vías respiratorias inferiores que forman perforaciones en las pare- des celulares bacterianas y por lo tanto rompen las membranas plasmáticas. Los neutrófilos ubicados en el intestino delgado contienen gránulos azurófilos con α defensinas, que se liberan después de la activación de los TLR. Por otra parte, las célu- las epiteliales de las vías respiratorias secretan β defensina. Las α defensinas también han mostrado actividad antiviral, por ejemplo al inhibir al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) uniéndose al receptor CXCR4 (C-X-C receptor de qui- miocina tipo 4); de esta manera interfieren con la entrada del virus a las células. El epitelio mucoso de las vías respiratorias ofrece otra forma de protección contra las infecciones. El moco, una mez- cla compleja de mucinas, proteínas, proteasas e inhibidores de proteasas, es un componente muy importante del epitelio delasmucosas.Algunasbacteriasseunenalascélulasepiteliales mediante proteínas adhesivas que portan en su superficie (p. ej., las pilosidades de los gonococos y de Escherichia coli). Sin embargo, la presencia de moco limita la adhesión de las bacterias a estas superficies celulares. Además, una vez atrapa- dos en el moco, los microorganismos se eliminan por el movi- miento ciliar. Por lo tanto, la superficie mucosa y las células epiteliales ciliadas tienden a inhibir la adhesión de microbios y limitan el tiempo de exposición. De forma similar, el GI tiene mecanismos para inhibir la colonización de bacterias. La aci- dez del estómago y las enzimas proteolíticas del intestino del- gado hacen que este ambiente sea hostil para muchas bacterias. Una barrera adicional para la invasión de microbios es el efecto del ambiente químico. Por ejemplo, el pH ácido del sudor, las secreciones sebáceas y el estómago tiene propiedades antimicrobianas. Asimismo, la producción de ácidos grasos en la piel también tiende a eliminar organismos patógenos. Mecanismos de la inmunidad innata Aunque la inmunidad innata no genera protección contra antígenos específicos y no se sustenta en el reconocimiento de patógenos específicos, es una poderosa línea de defensa. Además de las barreras de protección fisiológicas, el sistema innato dispone de células y proteínas (como las citosinas y el complemento). Los leucocitos fagocíticos, como los leucocitos neutrofílicos polimorfonucleares (neutrófilos), los macrófa- gos y los linfocitos NK son los componentes celulares prima- rios para combatir microbios. La interacción entre microbios invasores y estas células (entre otras del cuerpo) activa al com- plemento y numerosas citosinas. Muchas de éstas son mo- léculas proinflamatorias, como la interleucina 1 (IL-1), el factor de necrosis tumoral α (TNF-α, tumor necrosis factor-α), inter- leucina 6 (IL-6) y los interferones. Su liberación es inducida por interacciones con los TLR. Con estas herramientas especiales, el hospedador inicia su defensa contra patógenos invasores. A. Sensores microbianos Cuando un patógeno entra a la piel se enfrenta a los macrófagos yaotrascélulasfagocíticasqueposeen“sensoresmicrobianos”. Hay tres grupos principales de estas moléculas: 1) los TLR; 2) los receptores similares al NOD (NLR, NOD-like recep- tors) y 3) las helicasas tipo RIG-1 y MDA-5. Los TLR son los sensores microbianos mejor estudiados. Son una familia de receptores de reconocimiento de patrones (PRR, pattern recognition receptors), conservados en términos evolutivos, que reconocen modelos moleculares asociados a microorga- nismos patógenos (PAMP, pathogen-associated molecular pat- terns). Son la primera línea de defensa contra una variedad de patógenos y son fundamentales para iniciar la respuesta inmunitaria innata. Los TLR son proteínas transmembrana tipo 1 con un dominio extracelular, una sola hélice α trans- membrana y un dominio citoplasmático. Cuando los TLR reconocen estos patrones microbianos específicos, se activa una cascada de transducción de señales que genera una res- puesta inflamatoria rápida y sólida que se caracteriza por la activación de células y la liberación de citosinas. Hasta ahora se han identificado 10 TLR humanos; cada uno de ellos parece estar involucrado en el reconocimiento de un grupo único de patrones microbianos. Por ejemplo, el TLR2 identifica a varios ligandos (p. ej., el ácido lipoteicoico) expresados por bacterias grampositivas, mientras que el TLR3 se une al ácido ribonucleico bicatenario (dsRNA, double-stran- ded RNA) en la replicación vírica. Los TLR 1 y 6 reconocen a muchos péptidos diacilados (p. ej., en el micoplasma), mientras que el TLR4 es específico para lipopolisacáridos (LPS) gramne- gativos. El TLR5, por otra parte, reconoce a la flagelina bacte- riana; los TLR 7 y 8 interactúan con RNA de cadena individual (ssRNA, single-stranded RNA) en la replicación de los virus. El TLR9 se une al DNA de bacterias y virus. En la actualidad se desconoce el ligando del TLR10. Los NLR, otra gran familia de receptores innatos, se loca- lizan en el citoplasma y sirven como sensores intracelulares para productos microbianos. Activan la vía del factor nuclear potenciador de la cadena ligera κ de los linfocitos B activados (NF-κB, nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B cells) y generan respuestas inflamatorias similares a las indu- cidas por los TLR. El tercer grupo de sensores microbianos es el de las helicasas tipo RIG-1 y la proteína 5 relacionada con la diferenciación del melanoma (MDA-5, melanoma differentia- tion-associated protein 5). Éstos son sensores citoplasmáticos de ssRNA vírico. La unión del ssRNA con estos sensores activa la producción de los interferones (IFN, interferon) tipo 1. Éstos son inhibidores muy efectivos de la replicación vírica. B. Componentes celulares y fagocitosis Para que la inmunidad innata sea efectiva se requieren respues- tas rápidas, no específicas y de corta duración. Estas caracte- rísticas son distintivas del proceso de la fagocitosis. Durante una infección se incrementa el número de células fagocíticas circulantes, que pueden participar en procesos de quimiota- xia, migración, ingestión y eliminación de microbios. Cual- quier antígeno (microorganismo) que entra al cuerpo a través de los vasos linfáticos, los pulmones o el torrente sanguíneo es ingerido por fagocitos. Por lo tanto, los fagocitos presentes en la sangre, el tejido linfático, el hígado, el bazo, los pulmones y otros tejidos, son las células responsables de la captación y la remoción de antígenos apter 08_Carroll_4R.indd 128 apter 08_Carroll_4R.indd 128 14/04/16 14/04/16
- 142. CAPÍTULO 8 Inmunología129 externos. Entre los fagocitos se incluyen: 1) los monocitos y los macrófagos; 2) los granulocitos, incluidos los neutrófilos, eosinófilos y basófilos y 3) las células dendríticas. Los mono- citos son leucocitos pequeños que circulan en la sangre y que maduran para transformarse en macrófagos, que se encuen- tran en casi todos los tejidos. Por ejemplo, en el hígado se cono- cen como células de Kupffer y en el tejido nervioso se les llama microgliocitos. Los macrófagos son células esenciales que fago- citan y eliminan patógenos, procesan y presentan antígenos y regulan la reactividad inmunitaria al producir una variedad de moléculas (p. ej., citosinas). Los granulocitos son leucocitos que contienen gránulos que se tiñen densamente. Los neutrófilos tienen una vida corta y son importantes células fagocíticas que destruyen patógenos dentro de vesículas intracelulares. Los eosinófilos y los basó- filos son menos abundantes y almacenan gránulos que con- tienen enzimas y proteínas tóxicas que se liberan cuando las células se activan. Las células dendríticas también son fagocí- ticas y tienen la capacidad de degradar patógenos; sin embargo, su función principal es activar a los linfocitos T en la respuesta inmunitaria adaptativa, puesto que actúan como células pre- sentadoras de antígenos (APC, antigen presenting cells) y pro- ducen citosinas reguladoras (p. ej., IFN-α). La fagocitosis es un proceso de múltiples pasos en el que un fagocito, como un neutrófilo, reconoce a un patógeno, lo ingiere y después lo destruye. Una vez que un patógeno entra a la sangre o a algún tejido, la célula fagocítica se desplaza a ese sitio. Esta migración depende de la liberación de señales de factor quimiotáctico producidos por las células del hospedador o por el patógeno. La IL-8 es una potente quimiotaxina que atrae neutrófilos. En fecha reciente se demostró que la IL-17 también es una quimiotaxina efectiva. En la etapa inicial del proceso de migración, los neutrófilos se adhieren a la superficie de las células endoteliales a través de moléculas de adhesión como la selectina P. Los neutrófilos, que siguen la atracción de las quimiocinas, salen de la circulación sanguínea, atraviesan el endotelio y llegan hasta el sitio de infección en el interior de los tejidos. Ahí reconocen y fagocitan los patógenos en una vesícula endocítica llamada fagosoma. Una vez adentro del neutrófilo, el patógeno es eliminado. Los fagocitos utilizan diversos mecanismos antimicrobia- nos para eliminar patógenos. Por ejemplo: 1) la acidificación se produce dentro del fagosoma, cuyo pH interior es de 3.5 a 4; este nivel de acidez es bacteriostático o bactericida; 2) también se generan productos tóxicos derivados del oxígeno, como el superóxido O2 − , el peróxido de hidrógeno H2 O2 y el oxígeno molecular O2 ; 3) asimismo se producen óxidos de nitrógeno tó- xicos y óxido nítrico (NO) y 4) las células fagocíticas fabrican péptidos antimicrobianos que participan en la eliminación de patógenos. En los macrófagos hay catelicidina y péptidos deri- vados de la elastasa de los macrófagos. Los neutrófilos, por otra parte, producen una gran cantidad de α defensina, β defensina, catelicidina y lactoferricina. Los fagocitos utilizan todos estos mecanismos para destruir patógenos. Los neutrófilos experi- mentan apoptosis después de completar su objetivo. Como se mencionó antes, la fagocitosis puede ocurrir sin anticuerpos. Sin embargo, es más eficiente cuando éstos están disponibles para recubrir la superficie de las bacterias y facilitar su ingestión. Este proceso se llama opsonización y se produce por medio de los siguientes mecanismos: 1) los anticuerpos por sí mismos pueden actuar como opsoninas; 2) los anticuerpos y los antígenos activan el sistema del complemento (a través de la vía clásica) para generar opsonina y 3) la opsonina se produce cuandoseactivalavíaalternativaysegeneraC3.Losmacrófagos tienen receptores de membrana para la porción Fc de los anti- cuerpos y para el componente C3 del complemento. Estos dos receptores facilitan la fagocitosis de patógenos recubiertos con anticuerpos. C. Linfocitos citolíticos naturales Los linfocitos NK son grandes células granulares relacionadas morfológicamente con los linfocitos T que representan el 10 a 15% de los leucocitos sanguíneos. Los linfocitos NK contribu- yen con la inmunidad innata proporcionando protección con- tra virus y otros patógenos intracelulares. Estas células tienen la capacidad de reconocer y matar células cancerígenas o infec- tadas por virus. Expresan dos tipos de receptores de superficie: 1) los receptores de linfocitos NK similares a la lectina que se unen a proteínas pero no a carbohidratos y 2) los receptores similares a inmunoglobulina citolítica (KIR, killer immunoglo- bulin-like), que reconocen a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, major histocompatibility complex) tipo I. Estos receptores de los linfocitos NK tienen propiedades tanto inhibidoras como activadoras. Estas células contienen grandes cantidades de perforinas y granzimas, sustancias que median sus acciones citolíticas. Además, cuando inicia la producción de anticuerpos en la respuesta inmunitaria adaptativa, los linfocitos NK tienen una función crítica en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, antibody-dependent celular cytotoxicity). En este proceso, un anticuerpo específico se une a la super- ficie celular efectora. Los linfocitos NK tienen receptores de la región Fc que se unen al anticuerpo adherido a su diana y matan a la célula. Esta propiedad le da a las células NK otra oportunidad para inhibir la replicación de virus y bacterias intracelulares. Los linfocitos NK y el sistema de IFN son partes integrales de la inmunidad innata que se comunican entre sí. Los linfoci- tos NK son una de las dos fuentes primarias de IFN-γ, un anti- vírico potente y una citosina inmunorreguladora. Además, la actividad lítica de estas células es potenciada por los IFN tipo 1 (IFN-α e IFN-β). De hecho, la producción de estas dos citosi- nas es inducida por el virus invasor. D. Sistema del complemento El sistema del complemento es otro componente clave de la inmunidad innata. Este sistema está formado por 30 proteí- nas que se encuentran en el suero o en la membrana de célu- las específicas que interactúan en una cascada de reacciones secuenciales. Cuando se activa el complemento, éste inicia una serie de reacciones bioquímicas que culminan en lisis celular o en la destrucción de patógenos. Como se describirá más ade- lante en este capítulo, hay tres vías del complemento: la clásica, la alternativa y la de la lectina. Aunque cada una de éstas tiene un mecanismo de iniciación diferente, todas provocan la lisis del organismo invasor. Las vías alternativa y de la lectina sirven como primeras líneas de defensa principales y proporcionan apter 08_Carroll_4R.indd 129 apter 08_Carroll_4R.indd 129 14/04/16 14/04/16
- 143. 130 SECCIÓN IIInmunología protección inmediata contra microorganismos. La vía alterna- tiva del complemento se activa por superficies microbianas y puede proceder en ausencia de anticuerpos. De forma similar, la vía de la lectina (que utiliza lectina fijadora de manosa [MBL, mannose-binding lectin]) evita el uso de anticuerpos y para ini- ciar eventos. Las proteínas del complemento logran su misión defensiva de muchas formas, incluyendo la opsonización, la lisis de bacterias y la amplificación de respuestas inflamatorias a través de anafilatoxinas, C5 y C3a. El complemento se des- cribe con mayor detalle más adelante. Algunos microbios han desarrollado mecanismos para sabotear al sistema del complemento y evadir las respuestas inmunitarias. Por ejemplo, los poxvirus, como el virus de la variolovacuna y el virus de la viruela, producen una proteína soluble que inhiben a este sistema. E. Mediadores de la inflamación e interferones En la sección sobre mecanismos de la inmunidad innata se mencionó que varias células y los componentes del complemen- to de la inmunidad innata orquestan sus efectos a través de la producción de mediadores solubles. Éstos incluyen las citosi- nas, las prostaglandinas y los leucotrienos. En esta sección se resume la función de estos mediadores en los procesos infla- matorios. En la sección de la respuesta inmunitaria adaptativa se describen las citosinas de forma detallada. La lesión de los tejidos inicia una respuesta inflamato- ria dominada en primera instancia por mediadores solubles, conocidos como citosinas. Éstas son moléculas inflamato- rias o antiinflamatorias, quimiocinas, moléculas de adhesión y factores de crecimiento. Durante la respuesta inmunitaria innata, leucocitos, como los macrófagos, liberan una variedad de citosinas, incluidas IL-1, TNF-α e IL-6. Otros mediadores que liberan macrófagos activados y otras células son las pros- taglandinas y los leucotrienos. Estos mediadores inflamatorios regulan cambios en vasos sanguíneos locales caracterizados por dilatación de arteriolas y capilares. Durante la dilatación escapa plasma que se acumula en el área de la lesión. Después se forma fibrina que ocluye los conductos linfáticos y limita así la diseminación del organismo. Un segundo efecto de estos mediadores es inducir cam- bios en la expresión de moléculas de adhesión expresadas en la superficie de células endoteliales y leucocitos. Estas proteínas (p. ej., selectinas e integrinas) provocan que los leucocitos se adhieran a las células endoteliales y en consecuencia promue- van su movimiento a través de la pared vascular. Por lo tanto, las células se pegan a las paredes de los capilares y después migran hacia fuera de ellos (extravasación) dirigiéndose hacia el irri- tante. Esta migración (quimiotaxia) la estimulan proteínas del exudado inflamatorio, incluyendo algunas quimiocinas. Una variedad de tipos celulares, incluidos los macrófagos y las célu- las endoteliales, pueden producir quimiocinas. Una vez que los fagocitos migran al sitio de la infección inician la fagocitosis de microorganismos. La fiebre es otra manifestación sistémica común de res- puestas inflamatorias y es un síntoma cardinal de las enfer- medades infecciosas. El principal regulador de la temperatura corporal es el centro termorregulador que se encuentra en el hipotálamo. Entre las sustancias capaces de inducir fiebre (pirógenos) se encuentran las endotoxinas de bacterias gram- negativas y algunas citosinas (p. ej., IL-1, IL-6, TNF-α y los interferones) liberadas por una variedad de células. Los interferones (IFN) son citosinas importantes que tienen una función esencial en la defensa contra infecciones víricas y otros organismos intracelulares, como Toxoplasma gondii. Aunque los IFN se identificaron por primera vez en 1957 como proteínas antivirales, ahora se reconocen como proteí- nas reguladoras de las respuestas inmunitarias fundamentales, capaces de alterar diversos procesos celulares como el creci- miento, la diferenciación, la transcripción génica y traducción. La familia de IFN está formada por tres grupos. Los IFN tipo I comprenden numerosos genes y en primera instancia incluyen a los interferones α y β. El IFN tipo II es un solo gen que pro- duce IFN-γ. El IFN-λ es un tercer grupo de citosinas similares a los IFN, que se descubrieron en fecha reciente. Una infección víricaactivaporsímismalaproduccióndeinterferonesdetipoI. Despuésdeentraraunacélula,unvirusinicialareplicaciónysu ácido nucleico interactúa con sensores microbianos especí- ficos (TLR3, TLR7, TLR9, RIG-1 y MDA-5). Esta interacción inicia la producción de IFN por parte de la célula infectada. En contraste, el IFN-γ se produce por linfocitos NK activados en respuestas inmunitarias innatas y por linfocitos T especí- ficamente sensibilizados en respuestas inmunitarias adaptati- vas. Además, las citosinas IL-2 e IL-12 son capaces de activar la producción de IFN-γ por parte de los linfocitos T. El sistema de IFN consiste en una serie de eventos que pro- tege a las células de la replicación vírica. Ya que fue producido por la célula infectada o por los linfocitos NK o T activados, el IFN se une a su receptor celular específico. Esta interacción activa las vías de señalización JAK-STAT, lo cual activa los genes que inician la producción de proteínas específicas que inhiben la replicación de los virus. Todos los IFN comparten actividades biológicas que se superponen, como acciones anti- virales, efectos contra la proliferación y actividades inmuno- rreguladoras. Sin embargo, también tienen funciones únicas que no coinciden. Por ejemplo, el IFN-β se utiliza de forma exitosa para tratar pacientes con esclerosis múltiple. Por otra parte, se ha demostrado que el IFN-γ exacerba esta enferme- dad. Estas potentes acciones de los IFN y los avances en bio- tecnología son los factores subyacentes que han identificado la relevancia clínica de dichas moléculas. De hecho, la Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos aprobó muchos de los IFN para el tratamiento de infecciones, procesos cance- rígenos, trastornos autoinmunes e inmunodeficiencias. INMUNIDAD ADAPTATIVA A diferencia de la inmunidad innata, la inmunidad adaptativa es muy específica, tiene memoria y puede responder de forma rápida y contundente a una segunda exposición de antíge- nos. La respuesta inmunitaria adaptativa involucra respues- tas inmunitarias mediadas por anticuerpos y conducidas por células. A continuación se resumen los componentes de la res- puesta inmunitaria adaptativa y sus interacciones. Los detalles se presentan a lo largo de este capítulo. apter 08_Carroll_4R.indd 130 apter 08_Carroll_4R.indd 130 14/04/16 14/04/16
- 144. CAPÍTULO 8 Inmunología131 Bases celulares de la respuesta inmunitaria adaptativa Las células linfoides tienen una función significativa en la res- puesta inmunitaria adaptativa. Durante el desarrollo embrio- nario, los precursores de las células sanguíneas (células madre hematopoyéticas) se originan en el hígado fetal y otros teji- dos; en la vida posnatal residen en la médula ósea. Las células madre pueden diferenciarse en células de la serie mieloide o de la linfoide. Las células madre linfoides se transforman en dos poblaciones principales de linfocitos, los B y los T. Las células madre destinadas a transformarse en linfoci- tos B se desarrollan en la médula ósea. Ellas reestructuran sus genes de inmunoglobulinas y expresan un único receptor de antígenos sobre su superficie. Después de este paso, los linfoci- tos B migran a un órgano linfático secundario (p. ej., el bazo) y pueden activarse por un encuentro con un antígeno o transfor- marse en plasmocitos secretores de anticuerpos. LoslinfocitosTseproducenenlamédulaóseaperosetrans- portan al timo para madurar. Ahí, experimentan recombina- ción VDJ (variable diverse joining) del DNA de la cadena β del receptor de linfocito T (TCR, T cell receptor) y del DNA de la cadena α del TCR. Una vez que ha ocurrido la reestructuración Citosina Activación de macrófagos Linfocito T Citosinas Citosinas Inflamación mediante PMN, etc. Linfocito T Linfocito T Interacción con antígenos específicos Célula presentadora de antígenos (p. ej., un macrófago) Linfocito T Linfocito B Linfocito T Citosinas Citosinas Interacción con antígenos específicos Célula plasmática Diferenciación de linfocitos T citotóxicos Linfocito T Anticuerpos Célula madre de la médula ósea Timo del TCR y han terminado las selecciones positiva y negativa, estas células forman subclases de linfocitos T con funciones específicas (p. ej., linfocitos T CD4+ y CD8+ ). Éstos son los res- ponsables de la inmunidad mediada por células. La figura 8-1 presenta un resumen de los procesos inmu- nitarios específicos que se revisan en esta sección. Los dos tipos de respuesta inmunitaria, mediada por células y por anti- cuerpos, se desarrollan de forma concurrente. En la respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos, los linfocitos T CD4+ reconocen a los antígenos de los patógenos, unidos a molécu- las del MHC clase II ubicadas en la superficie de una célula presentadora de antígenos (APC, antigen-presenting cell) (p. ej., un macrófago o un linfocito B). Esta interacción induce la pro- ducción de citosinas que estimulan a los linfocitos B para que expresen anticuerpos con especificidad por antígenos. Los lin- focitos B experimentan proliferación clonal y se transforman en plasmocitos. En la respuesta inmunitaria mediada por célu- las, el complejo antígeno-MHC clase II se reconoce por linfo- citos T CD4+ , mientras que el complejo antígeno-MHC clase I es identificado por linfocitos T CD8+ . Ambos subgrupos de linfocitos T producen citosinas, se activan y se multiplican por proliferación clonal. Los linfocitos T CD4+ recién generados estimulan a los linfocitos B para que produzcan anticuerpos y FIGURA 81 Esquema de las interacciones celulares que ocurren en la respuesta inmunitaria. apter 08_Carroll_4R.indd 131 apter 08_Carroll_4R.indd 131 14/04/16 14/04/16
- 145. 132 SECCIÓN IIInmunología promuevan eventos de hipersensibilidad tardía, mientras que los linfocitos T CD8+ destruyen células de injertos, canceríge- nas o infectadas por virus. Antígenos Un antígeno es una sustancia que reacciona con un anti- cuerpo. Los inmunógenos inducen una respuesta inmunita- ria y la mayoría de los antígenos también son inmunógenos. Hay muchas características que determinan en gran medida la inmunogenicidad. Entre ellas se encuentran las siguientes: 1) reconocimiento de agentes externos: en general, las mo- léculas reconocidas como “propias” no son inmunógenas. Para que lo sean, deben ser reconocidas como externas (“ajenas”); 2) tamaño: los inmunógenos más potentes por lo general son grandes proteínas complejas; moléculas con un peso molecular (MW, molecular weight) menor a 10 000 Da son poco inmunó- genas, y, como se esperaría, moléculas muy pequeñas no lo son. Algunas moléculas pequeñas, llamadas haptenos, se vuelven inmunógenassólocuandoseunenaunaproteínaportadora.Un ejemplo son los lípidos y los aminoácidos que son haptenos no inmunógenos. Requieren unirse a una proteína o una molécula de polisacárido portadora para ser inmunógenas o generar una respuesta inmunitaria; 3) complejidad estructural y química: la complejidad química es otra característica fundamental de la inmunogenicidad. Por ejemplo, los homopolímeros de aminoácidos son menos inmunogénicos que los heteropolíme- ros que contienen dos o más aminoácidos diferentes; 4) cons- titución genética del hospedador: debido a diferencias en los alelos del MHC, dos razas de la misma especie animal pueden responder de forma distinta al mismo antígeno y 5) dosis, vía y momento de la administración de antígenos: otros factores que afectan la inmunogenicidad incluyen la concentración, la vía y el momento de la administración de antígenos. Estos conceptos son importantes para diseñar vacunas para potenciar la inmunogenicidad. Sin embargo, para elabo- rar fármacos proteínicos se consideran métodos para inhibir las respuestas inmunitarias. Esto puede observarse en un indi- viduo capaz de responder a cierto medicamento y producir anticuerpos contra él. Estos anticuerpos contra fármacos pue- den inhibir la eficiencia de los fármacos. Por último, cabe mencionar que es posible potenciar la inmunogenicidad de una sustancia al combinarla con un adyuvante. Éste es una sustancia que estimula las respuestas inmunitarias al facilitar la actividad fagocítica de las APC. Moléculas para el reconocimiento de antígenos Durante una respuesta inmunitaria, es esencial un sistema de reconocimiento capaz de distinguir lo “propio” de lo “ajeno” para una inmunidad eficaz. Esta sección del capítulo se con- centra en las moléculas utilizadas para reconocer antígenos externos. Primero se revisan las moléculas del MHC y la pre- sentación de antígenos, después se resumen la estructura y la función de los anticuerpos y por último se presenta una sinop- sis de los receptores específicos para el reconocimiento de antí- genos (p. ej., el receptor de linfocito B [BCR, B-cell receptor] y el TCR). Complejo mayor de histocompatibilidad Desde el punto de vista histórico, el complejo mayor de his- tocompatibilidad (MHC, major histocompatibility complex) se descubrió primero como un locus genético que codificaba a un grupo de antígenos responsables del rechazo de injertos tumorales. Ahora se sabe que los productos de los genes de esta región son los principales antígenos reconocidos en el rechazo de trasplantes. También está claro que las moléculas del MHC se unen a antígenos peptídicos y los presentan a los linfocitos T. Por lo tanto, estas moléculas son responsables del reconoci- miento de antígenos por parte de dichas células y tienen una función importante en el control de una variedad de funciones inmunitarias básicas. También debe notarse que el TCR no es un anticuerpo. Éstos se unen a los antígenos de forma directa, mientras que el TCR sólo reconoce antígenos peptídicos pre- sentados por el MHC de una APC. El TCR es específico para antígenos, pero éstos deben ser presentados por moléculas de MHC propias. El TCR también es específico para la molécula de MHC. Si un antígeno es presentado por otra forma alélica de MHC in vitro, el TCR no reconoce al complejo. A esto se le conoce como restricción del MHC. El MHC es un grupo de genes bien estudiados que están vinculados de forma estrecha en el cromosoma 6 en seres huma- nos. El MHC humano se llama complejo antígeno leucocitario humano (HLA, human leukocyte antigen). Entre los numerosos genes importantes que se encuentran en el MHC humano están los que codifican a las proteínas de los MHC de las clases I, II y III. Como se resume en el cuadro 8-1, las proteínas del MHC clase I son codificadas por los genes HLA-A, -B y -C. Estas pro- teínas están formadas por dos cadenas: 1) una glucoproteína transmembrana con peso molecular de 45000 Da, vinculada de forma no covalente a 2) un polipéptido no codificado por el MHC (con un peso molecular de 12000 Da) llamado micro- globulina β2 . Las moléculas del MHC clase I se expresan en casi todas las células nucleadas del cuerpo. Algunas excepciones importantes son ciertas células del cerebro y la retina. Las proteínas de clase II están en la región HLA-D. Las proteínas del MHC clase II se agrupan en tres familias: las mo- CUADRO 81 Características importantes de los productos génicos de los MHC clases I y II Clase I Clase II Loci genético (lista parcial) HLA-A, -B y -C HLA-DP, -DQ y -DR Composición de polipéptidos MW de 45000 Da + β2 M (12000 Da) Cadena α (33000 Da), Cadena β (29000 Da), Cadena li (30000 Da) Distribución celular En la mayoría de las células somáticas nucleadas, excepto células del cerebro y la retina En células presentadoras de antígenos (macrófagos, células dendríticas, linfocitos B, etc.) y células activadas por el IFN-γ Presenta antígenos peptídicos a Linfocitos T CD8+ Linfocitos T CD4+ Tamaño del péptido unido 8 a 10 residuos 10 a 30 residuos o más apter 08_Carroll_4R.indd 132 apter 08_Carroll_4R.indd 132 14/04/16 14/04/16
- 146. CAPÍTULO 8 Inmunología133 Complejo MHC clase II-antígeno en la superficie Complejo MHC clase I-antígeno en la superficie Hacia la superficie celular Antígeno exógeno Péptidos Endosoma Vesícula exocítica Fusión vesicular Procesamiento Endocitosis Hacia la superficie celular Superficie celular Transportador de péptidos Vía del MHC clase I Péptidos endógenos Núcleo Síntesis de proteínas víricas Proteína vírica intacta Proteasoma MHC clase II Vía del MHC clase II MHC clase I β2m β2m α α αβ RER Ii Golgi Vesícula FIGURA 82 Vías de procesamiento de antígenos (MHC clases I y II). (Modificada y reproducida con autorización de Parslow T. G. et al., [editores]: Medical immunology, 10a. edición. McGraw-Hill, 2001. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) léculas codificadas HLA-DP, -DQ y -DR (cuadro 8-1). Este locus controla la reactividad inmunitaria y distintas formas alélicas de estos genes confieren diferencias en la capacidad de un individuo para montar una respuesta inmunitaria. Las moléculas codificadas en el locus HLA-D son hetero- dímeros de la superficie celular que contienen dos subunidades llamadas α y β, que tienen pesos moleculares cercanos a 33000 y 29000 Da, en dicho orden. A diferencia de las proteínas de clase I, las proteínas del MHC clase II tienen una distribución hística bastante restringida y se expresan de forma constitu- tiva en los macrófagos, las células dendríticas y los linfocitos B. Sin embargo, la expresión de estas moléculas en otros tipos de células (p. ej., células endoteliales o células epiteliales) requiere inducción por el IFN-γ. El locus del MHC clase I también contiene genes que codifi- can proteínas necesarias para el tratamiento de antígenos (p. ej., transportadores asociados al procesamiento de antígenos [TAP, transporters associated with antigen processing]) (figura 8-2). El locus del MHC clase III codifica proteínas del complemento y numerosas citosinas. Los genes de los MHC de las clases I y II exhiben una variabilidad extraordinaria. Estudios de mapeo genético demostraron que hay una alto nivel de polimorfismo en el MHC y diferentes individuos por lo general expresan distintas variantes alélicas de dicho complejo (restricción del MHC). Se han definido cerca de 300 variantes alélicas en algunos loci del HLA. En la actualidad, los genes del MHC son los más poli- morfos conocidos. Cada individuo hereda un grupo restrin- gido de alelos de alguno de sus padres. Un grupo de genes del MHC vinculados de manera estrecha se heredan como un blo- que o haplotipo. En 1987 se reveló la estructura tridimensional de las proteínas de los MHC de las clases I y II utilizando cristalo- grafía por rayos X. Este elegante trabajo proporcionó informa- ción fundamental sobre la forma en la que las proteínas del MHC funcionan y activan las respuestas inmunitarias. Análisis apter 08_Carroll_4R.indd 133 apter 08_Carroll_4R.indd 133 14/04/16 14/04/16
- 147. 134 SECCIÓN IIInmunología C N N C β2m α3 α1 α2 Cadena plegada β de ocho cadenas Hendidura de unión a péptidos Hélice α FIGURA 83 Diagrama de una molécula de HLA clase I. (Reproducida con autorización de Macmillan Pubishers Ltd: Bjorkman P.J., et al.: Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature 1987;329:506. Derechos de autor © 1987.) A B Vα Vβ Superantígeno MHC clase II Linfocito T APC Cα Cβ Cα Cβ Péptido antigénico Vα Vβ Linfocito T APC o célula diana MHC FIGURA 84 Unión de antígenos al MHC y al receptor de linfocito T (TCR). En el panel A se muestra un modelo de la interacción entre un péptido antigénico, el MHC y el TCR. Se muestran las regiones Vα y Vβ del TCR, interactuando con las hélices α que forman la hendidura de unión a péptidos el MHC. En el panel B se muestra un modelo de la interacción entre un superantígeno, el MHC y el TCR. El superantígeno interactúa con la región Vβ del TCR y con el MHC clase II fuera de la hendidura de unión a péptidos. (Adaptada con autorización de DG, et al. [editores]: Medical Immunology, 9a. ed. McGraw-Hill, 1997. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) con rayos X (figura 8-3) demuestran que la estructura completa parece una hendidura cuyas paredes están formadas por las hélices α y el piso está moldeado por láminas plegadas β. El análisis con rayos X muestra que la hendidura está ocupada por un péptido. En esencia, el TCR reconoce al antígeno pep- tídico unido a una hendidura proporcionada por el MHC. La figura 8-4A ilustra esta interacción. Las proteínas del MHC tienen una especificidad amplia por antígenos peptídicos. De hecho, muchos péptidos dife- rentes pueden ser presentados por un alelo del MHC distinto. Un concepto clave de este modelo implica que el polimorfismo del MHC permite la unión de muchos péptidos específicos y diferentes en la hendidura. Esto significa que alelos distintos pueden unirse a diferentes antígenos peptídicos y presentarlos. Presentación y procesamiento de antígenos El procesamiento y la presentación de antígenos son distintivos de la respuesta inmunitaria adaptativa. Este complejo meca- nismo comienza con antígenos que se vinculan con moléculas del MHC propias para ser presentados a linfocitos T con recep- tores apropiados. Proteínas provenientes de antígenos exóge- nos, como bacterias, son internalizados por las APC (células dendríticas o macrófagos) y experimentan desnaturalización o proteólisis parcial en las vesículas endocíticas. Mientras se encuentran en el interior del endosoma, estos fragmentos peptídicos se fusionan con vesículas exocíticas que contienen moléculas del MHC clase II. Como se observa en la figura 8-2, en este paso se expone el fragmento peptídico apropiado que eventualmente se expresará en la superficie de la APC (en forma del complejo “péptido-MHC”). Las moléculas del MHC clase II se sintetizan en el retícu- lo endoplásmico (ER, endoplasmic reticulum) rugoso y después pasan a través del aparato de Golgi. La cadena invariable, un polipéptido que ayuda a transportar las moléculas del MHC, forma un complejo con el MHC clase II en un endosoma. Esta vesícula se llama compartimento del MHC clase II; esta cadena invariable es útil y bloquea la unión de péptidos celulares endó- genos propios con el complejo MHC clase II. La cadena inva- riable es entonces removida por medios enzimáticos. A través de una serie de pasos, el MHC clase II se une al antígeno exó- geno (fragmentos peptídicos) y lo transporta a la membrana celular para su presentación. En la figura 8-2 se ilustra la interacción entre los antígenos endógenos de una célula infectada por un virus y una molécu- la de MHC clase I. En resumen, un complejo proteolítico, lla- mado endosoma, fragmenta proteínas citosólicas. Los péptidos apter 08_Carroll_4R.indd 134 apter 08_Carroll_4R.indd 134 14/04/16 14/04/16
- 148. CAPÍTULO 8 Inmunología135 citosólicos resultantes se unen a las moléculas nacientes del MHC clase I en el ER rugoso mediante sistemas transportado- res de péptidos (TAP). Los genes de las proteínas TAP también están en el MHC. En la luz del ER, antígenos peptídicos de ocho a 10 residuos de longitud se asocian a proteínas nacientes del MHC clase I y cooperan con la microglobulina β2 para crear un estable complejo MHC clase I-antígeno peptídico completa- mente plegado. Éste después se transporta a la superficie celular para ser exhibido y reconocido por los linfocitos T citotóxico CD8+ . La hendidura de unión de la molécula de clase I está más restringida que la de la molécula de clase II y, por lo tanto, ostenta péptidos más pequeños. Una vez que los linfocitos T citotóxicos reconocen los complejos MHC clase I-péptido anti- génico, pueden matar a las células colonizadas por virus. Muchos virus intentan derrotar a la respuesta inmunitaria al interferir con las vías de procesamiento de antígenos. Por ejemplo, una proteína Tat del VIH es capaz de inhibir la expre- sión de moléculas del MHC clase I. Una proteína del virus del herpes se une a los TAP, e impide el transporte de péptidos víricos al interior del ER, donde las moléculas del MHC clase I se sintetizan. Una consecuencia de este mecanismo inhibidor es que las células infectadas no son reconocidas por linfocitos citotóxicos. Algunos antígenos bacterianos y otros víricos son capa- ces de activar grandes cantidades de linfocitos T a través de una vía especial. Estas proteínas se denominan superantíge- nos. Estas moléculas no necesitan ser procesadas y por lo tanto son capaces de unirse a moléculas del MHC fuera de la hendi- dura de unión a péptidos (figura 8-4B). En comparación con la respuesta estándar de los linfocitos T inducida por antígenos (donde un pequeño número de estas células es activado), los superantígenos pueden estimular a muchos más linfocitos T (cerca de 25% más). Algunas toxinas bacterianas son ejemplos clásicos de superantígenos, como las enterotoxinas estafilocó- cicas, la toxina del síndrome de choque tóxico y la exotoxina A pirogénica estreptocócica del grupo A. Una consecuencia de esta activación masiva de linfocitos T es la sobreproducción de citosinas, en particular de IFN-γ. Dicha molécula a su vez activa a los macrófagos para que éstos produzcan IL-1, IL-6 y TNF-α, los cuales pueden contribuir a la formación de una “tormenta de citosinas” que provoca muchos de los síntomas de estados de choque e insuficiencia de órganos múltiple. Linfocitos B y anticuerpos La respuesta humoral es mediada por anticuerpos. Cada indi- viduo tiene un gran acervo de linfocitos B únicos (cerca de 1011 ) que tienen un tiempo de vida de días o semanas y que se encuentran en la sangre, la linfa, la médula ósea, los ganglios linfáticos y los tejidos linfáticos relacionados con el intestino (p. ej., las amígdalas, las placas de Peyer y el apéndice). A. Receptor de antígenos de los linfocitos B Los linfocitos B exhiben un solo tipo de molécula clonal homo- génea de inmunoglobulina (alrededor de 105 copias/célula) en su superficie. Estas inmunoglobulinas actúan como recepto- res (receptores de linfocitos B [BCR, B-cell receptors]) para un antígeno específico, de tal manera que cada linfocito B puede responder a sólo un antígeno o a un grupo de antígenos estre- chamente relacionados. Todos los linfocitos B inmaduros por- tan inmunoglobulina M (IgM) en su superficie, y la mayoría también expresan IgD. Además, los linfocitos B tienen recepto- res en su superficie para la porción Fc de las inmunoglobulinas y para muchos elementos del complemento. UnantígenointeractúaconellinfocitoBconelque“encaja” mejor por virtud de su inmunoglobulina receptora en la super- ficie. Cuando un antígeno se une a su BCR, se estimula la división del linfocito B y se forma un clon (selección clonal). Estos linfocitos B seleccionados proliferan y se transforman en plasmocitos que secretan anticuerpos. Debido a que cada per- sona puede crear cerca de 1011 moléculas de anticuerpo dife- rentes, hay un sitio de unión a antígenos en un linfocito B que empalma con casi cualquier determinante antigénico. El paso inicial para la formación de anticuerpos comienza con la unión de un antígeno a una inmunoglobulina de super- ficie (BCR). Después: 1) el BCR con su antígeno unido es internalizado por el linfocito B y el antígeno se degrada para generar péptidos que después regresan a la superficie celular unidos a moléculas del MHC clase II; 2) este complejo MHC clase II-péptido expuesto sobre el linfocito B es reconocido por linfocitos T cooperadores (CD4+ ) específicos para antígenos. Estos linfocitos interactuaron antes con células dendríticas presentadoras de antígenos y se transformaron en respuesta al mismo patógeno. Esta interacción es posible debido a que el linfocito B y el linfocito T que se han encontrado con un antí- geno, migran hacia las fronteras entre dichas células en tejidos linfáticos secundarios; 3) las quimiocinas, como CXCL13 y su receptor CXCR5, tienen una función importante en este pro- ceso migratorio; 4) el ligando CD40 ubicado sobre el linfocito T se une al CD40 del linfocito B, lo cual induce que el primero produzca IL-4, IL-5 e IL-6, moléculas que promueven la pro- liferación de linfocitos B y 5) por último, los linfocitos B acti- vados migran al interior de folículos y proliferan para formar centros germinativos; ahí ocurren hipermutación somática y cambio de la clase de inmunoglobulina. Los linfocitos B del centro germinativo que sobreviven este proceso se transfor- man en plasmocitos productores de anticuerpos o en linfocitos B de memoria. En el capítulo de referencia de Murphy et al., (2012) se encuentran detalles adicionales sobre este tema. Es importante mencionar que algunos antígenos bacte- rianos pueden estimular de forma directa esta producción de anticuerpos y no requieren la ayuda de linfocitos T para activar linfocitos B. Estos antígenos por lo general son polisacáridos bacterianos y LPS. Estos antígenos tímicos independientes de linfocitos T inducen respuestas de los linfocitos B (cambios de clase limitados) y no promueven la formación de linfoci- tos B de memoria. Al evitar la participación de los linfocitos T puede representarse una ventaja para el hospedador, debido a que puede generarse una respuesta inmunitaria expedita (por la producción de IgM) contra organismos selectos, como Hae- mophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae. B. Estructura y función de los anticuerpos Los anticuerpos son inmunoglobulinas, las cuales reaccionan de forma específica con el antígeno que estimuló su produc- ción. Representan cerca de 20% de las proteínas plasmáticas. apter 08_Carroll_4R.indd 135 apter 08_Carroll_4R.indd 135 14/04/16 14/04/16
- 149. 136 SECCIÓN IIInmunología Los anticuerpos creados en respuesta a un solo antígeno com- plejo son heterogéneos, debido a que son creados por muchos clones diferentes de células. Cada clon expresa un anticuerpo capaz de reaccionar con un determinante antigénico distinto ubicado en el antígeno complejo. Estos anticuerpos se llaman policlonales. En contraste, las inmunoglobulinas que sur- gen de un solo grupo de clones de células, como un tumor de células plasmáticas (mieloma), son homogéneos y se les llama anticuerpos monoclonales. Éstos pueden producirse in vitro al fusionar una célula de mieloma con un linfocito B productor de anticuerpos. Las inmunoglobulinas (Ig) comparten características es- tructurales comunes; es decir, todas están formadas por cade- nas polipeptídicas tanto ligeras (L) como pesadas (H), según su peso molecular. Las cadenas L tienen un peso molecular aproximado de 25000 Da, mientras que las H pesan cerca de 50000 Da. Cada molécula de Ig está formada por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) iguales, ligadas por puentes disulfuro. Las cadenas L pueden ser κ (kappa) o λ (lambda) y su clasificación se realiza con base en diferencias de aminoácidos en sus regiones constantes (figura 8-5). Los dos tipos de cadenas ligeras pueden encontrarse en todas las clases de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE). Sin embargo, cualquier molécula de Ig contiene sólo un tipo de cadena L. La porción terminal amino de cada cadena L contiene parte del sitio de unión a antígenos. De forma similar, las cadenas H son distintas para cada uno de los cinco tipos de inmunoglo- bulina y se les denomina γ (gamma), μ (mu), α (alfa), δ (delta) y ε (épsilon) (cuadro 8-2). La porción terminal amino de cada cadena H forma parte del sitio de unión a antígenos; el otro extremo (carboxilo-terminal) forma el fragmento Fc (figura Región de bisagra Hidrato de carbono Se une al antígeno Cadena ligera Cadena pesada Activa el complemento y fagocitos Amino-terminal Carboxilo-terminal Enlaces S-S Fragmentos Fab Fragmento Fc Constante C o n s t a n t e V a r i a b l e C o n s t a n t e V a r i a b l e V a r i a b l e C o n s t a n t e V a r i a b l e C o n s t a n t e Constante Constante Constante FIGURA 85 Representación esquemática de una molécula de IgG, que indica la localización de las regiones constante y variable en las cadenas pesada y ligera. El fragmento Fab sirve para la unión de los antígenos y la región Fc es el fragmento cristalizable. 8-5). La porción Fc de una Ig participa en diversas actividades biológicas, como la activación del complemento. Por lo tanto, una molécula de anticuerpo individual está formadaporcadenasHidénticasycadenasLiguales.Lamolécu- la de anticuerpo más simple tiene forma de Y (figura 8-5) y con- siste en cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas H y dos L. Las cuatro cadenas están unidas de forma covalente por puen- tes disulfuro. Al estudiar la estructura de las Ig, se identificó de manera experimental que una molécula de anticuerpo, como la IgG, se puede dividir en dos fragmentos al utilizar la enzima pro- teolítica llamada papaína. Cuando esto ocurre, se rompen los enlaces peptídicos de la región de bisagra. La actividad de unión a antígenos está relacionada con uno de estos fragmen- tos, la porción Fab. El segundo fragmento es la porción Fc que está involucrada en la transferencia placentaria, la fijación del complemento, la adhesión de varias células y otras actividades biológicas. Las cadenas H y las L de una molécula de Ig se subdividen en regiones variablesy regiones constantes. Las regiones están formadas por segmentos repetitivos plegados de manera tridi- mensional, llamados dominios. Al utilizar cristalografía por rayos X de alta resolución se ha podido determinar la estruc- tura de estos dominios. Una cadena L está compuesta por un dominio variable (VL ) y un dominio constante (CL ), mientras que la mayoría de las cadenas H tienen un dominio variable (VH ) y tres o más dominios constantes (CH ). Cada dominio está formado por cerca de 110 aminoácidos. Las regiones variables de una molécula de Ig están involucradas en la unión a los antí- genos, mientras que las regiones constantes son responsables de las funciones biológicas que se describen más adelante. apter 08_Carroll_4R.indd 136 apter 08_Carroll_4R.indd 136 14/04/16 14/04/16
- 150. CAPÍTULO 8 Inmunología137 Dentro de las regiones variables de las cadenas tanto L como H se encuentran subregiones formadas por secuencias de aminoácidos extremadamente variables, llamadas hiper- variables, que cooperan en el espacio para formar el sitio de unión a antígenos. Las regiones hipervariables forman el área de la molécula de Ig que tiene una estructura complementaria al determinante antigénico (epítopo). Esta área se conoce como región determinante de la complementariedad (CDR, comple- mentarity-determining región). Sólo de cinco a 10 aminoáci- dos en cada región hipervariable constituyen el sitio de unión a antígenos. La unión de los antígenos no es covalente, sino que involucra fuerzas de van der Waals y electrostáticas, entre otras. Clases de inmunoglobulinas A. IgG La IgG es la principal clase de inmunoglobulina presente en el suero. Esta molécula tiene cuatro cadenas, dos L y dos H (H2 L2 ) (figura 8-5). Hay cuatro subclases de IgG: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada subtipo contiene una cadena H distinta, pero rela- cionada, y cada una difiere un poco en cuanto a sus actividades biológicas. La IgG1 representa 65% del total de IgG. La IgG2 se dirige contra antígenos hechos de polisacáridos y puede ser una importante defensa del hospedador contra bacterias encapsu- ladas. La IgG3 es un activador efectivo del complemento por su rígida región de bisagra, mientras que la IgG4 no activa el complemento debido a su estructura compacta. La IgG es la única clase de inmunoglobulina que cruza la placenta y por lo tanto es la más abundante en recién naci- dos. El transporte específico de isotipos de IgG a través de la placenta favorece a las subclases IgG1 e IgG3. La IgG también media la opsonización de antígenos a través de la unión de complejos antígeno-anticuerpo a receptores del fragmento Fc, localizados sobre los macrófagos y otras células. B. IgM La primera inmunoglobulina producida en respuesta a un antígeno es la IgM. Este anticuerpo se secreta como un pen- támero y está formado por cinco unidades H2 L2 (similares a CUADRO 82 Propiedades de las inmunoglobulinas humanas IgG IgA IgM IgD IgE Símbolo de la cadena pesada γ α μ δ ε Valencia 2 4a 5 2 2 Peso molecular (daltones) 143000 a 160000 159000 a 447000a 900000 177000 a 185000 188000 a 200000 Concentración sérica (mg/ml) (en adultos) 8 a 16 1.4 a 4.0 0.4 a 2.0 0.03 Cantidades traza Semivida en el suero (días) 21b 7 7 2 2 Porcentaje de inmunoglobulinas en el suero 80 15 5 0.2 0.002 Capacidad de fijación del complemento Sí (+) No Sí (++) No No Transferencia placentaria al fetoc + − − − − a En secreciones, como saliva, leche y lágrimas y en secreciones de los sistemas respiratorio, intestinal y genital, la IgA se encuentra por lo general como dímeros o tetrámeros, pero en el suero existe principalmente como monómero. b Subclases 1, 2 y 4. La subclase 3 tiene una semivida de siete días. c Principalmente las subclases IgG1 e IgG3, pero todas las subclases se han detectado. una unidad de IgG) y una molécula de una cadena J (figura 8-6). El pentámero (con un peso molecular de 900000 Da) tiene un total de 10 sitios idénticos de unión a antígenos y por lo tanto una valencia de 10. Es la inmunoglobulina más efi- ciente para la aglutinación, la fijación del complemento y otras reacciones antígeno-anticuerpo y también es importante en la defensa contra bacterias y virus. Debido a que los 10 sitios de unión participan en la interacción con antígenos, la IgM tiene la mayor capacidad de adhesión y formación de puentes cruza- dos de todas las inmunoglobulinas. Valorar la presencia de este anticuerpo en el suero puede ser útil para diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas. Por ejemplo, la IgM no cruza la pla- centa y su presencia en un feto o en un recién nacido propor- ciona evidencias de infección intrauterina. S-S S S - - S S S – S S-S S - S S - S S – S S - S S - S S–S Cadena J S-S S -S S – S S-S S-S S -S S - S S - S S - S S-S S - S S – S S - S S - S FIGURA 86 Diagrama esquemático de la estructura pentamérica de la IgM humana. Los monómeros de IgM están conectados entre sí y la cadena J por puentes disulfuro. apter 08_Carroll_4R.indd 137 apter 08_Carroll_4R.indd 137 14/04/16 14/04/16
- 151. 138 SECCIÓN IIInmunología C. IgA La IgA es la inmunoglobulina más importante en la inmunidad en las mucosas. Sus niveles en el suero son bajos; representan de 10 a 15% del total de las inmunoglobulinas séricas. En contraste, esta inmunoglobulina predomina en las secreciones vascu- lares. Los plasmocitos localizados en glándulas y membranas mucosas producen principalmente IgA, por lo tanto ésta se encuentra en sustancias como la leche, la saliva y las lágrimas, y en otras secreciones de los sistemas respiratorio, intestinal y genitourinario. Debido a sus ubicaciones, este anticuerpo entra en contacto con el ambiente externo y en consecuencia es la primera línea de defensa contra virus y bacterias. Las propiedades de la IgA difieren dependiendo de su localización. En el suero, este anticuerpo se secreta como un monómerosemejanteala IgG. En secrecionesmucosases un dí- mero, denominado IgA secretora, formado por dos monóme- ros que contienen dos polipéptidos adicionales: la cadena J que estabiliza la molécula y un componente secretor que se incor- pora a la IgA secretora cuando se transporta a través de una célula epitelial. Hay al menos dos subclases de IgA: la IgA1 y la IgA2. Algunas bacterias (p. ej., Neisseria spp.) son capaces de destruir la IgA1 al producir una proteasa y en consecuen- cia pueden superar la resistencia mediada por anticuerpos en superficies mucosas. D. IgE La inmunoglobulina IgE está presente en muy pequeñas can- tidades en el suero. La región Fc de esta inmunoglobulina se une a su receptor de alta afinidad ubicado en la superficie de mastocitos, basófilos y eosinófilos. Este anticuerpo actúa como receptor de los antígenos específicos que estimularon su pro- ducción. El complejo antígeno-anticuerpo resultante desenca- dena respuestas alérgicas inmediatas (anafilácticas) a través de la liberación de mediadores inflamatorios como la histamina. E. IgD La IgD está presente en pequeñas cantidades en el suero. Sin embargo, es la principal inmunoglobulina de superficie en lin- focitos B maduros que no se han expuesto a ningún antígeno. Estos linfocitos portan IgD e IgM en una proporción de tres a uno. Aún no se conoce por completo la función de la IgD. Genes de inmunoglobulinas y generación de diversidad La capacidad que tiene un individuo para producir un número muy grande de moléculas de inmunoglobulina (cerca de 3 × 1011 ), con una cantidad relativamente pequeña de genes, ha evolucionado a través de mecanismos genéticos especiales. Esto ocurre porque los genes de las Ig experimentan recombi- nación somática, la cual genera una gran diversidad de especi- ficidades de anticuerpos. Cada cadena de inmunoglobulina está formada por una región variable (V) y una constante (C). Para cada cadena (p. ej., cadena ligera kappa [κ], cadena ligera lambda [λ] y cinco cadenas pesadas [γH, μH, αH, δH y εH]) hay un acervo sepa- rado de segmentos de genes localizados en cromosomas dis- tintos. En seres humanos, las familias de genes múltiples se encuentran en los siguientes cromosomas: λ en el cromosoma 22, κ en el cromosoma 2 y la familia de cadenas pesadas en el cromosoma 14. Cada uno de estos tres loci contiene un grupo de segmentos de genes V diferentes que están separados de los segmentos de genes C. Durante la diferenciación de los linfo- citos B, el DNA se reordena para agrupar los segmentos de los genes identificados que sean adyacentes en el genoma. En resumen, el proceso de reordenamiento de genes es complejo e implica un número de pasos. La región variable de cada cadena L es codificado por dos segmentos de genes: V y J. La región variable de cada cadena H es codificada por tres fragmentos génicos: V, D y J. Los segmentos se unen para formar un gen variable-V funcional por reordenamiento del DNA. Después cada uno de estos genes se transcribe junto con el gen constante-C apropiado para producir una RNA mensa- jero (mRNA, messenger RNA) que codifica la cadena peptídica completa. Las cadenas L y H se sintetizan por separado en poli- somas y después se ensamblan en el citoplasma para formar las unidades catenarias H2 L2 . Después se agrega la porción de carbohidratos de la molécula de Ig, durante su paso a través de los organelos membranosos celulares (p. ej., el aparato de Golgi), y es liberada. Este mecanismo de reordenamiento de genes genera una enorme variedad de moléculas de inmunoglobulina. La diver- sidad de anticuerpos depende de: 1) segmentos múltiples de genes V, D y J; 2) la asociación combinatoria, es decir, la con- jugación de cualquier segmento de gen V con cualquier seg- mento D o J; 3) la combinación aleatoria de diferentes cadenas L y H; 4) hipermutación somática y 5) diversidad de unión pro- ducida por la adhesión imprecisa durante el reordenamiento. Cambio de clase de inmunoglobulina Al inicio, todos los linfocitos B unidos a un antígeno portan IgM específica para él y producen dicho anticuerpo. Después, el reordenamiento de genes genera anticuerpos de diferente clase pero con la misma especificidad antigénica. En el cam- bio de clase, el mismo gen VH ensamblado puede vincularse de manera secuencial con diferentes genes CH , de tal manera que la inmunoglobulina que se produce (IgG, IgA o IgE) tiene la misma especificidad que la IgM original pero con diferen- tes características biológicas. El cambio de clase depende de citosinas liberadas de los linfocitos T. En fecha reciente se ha demostrado que la IL-4, la IL-5, el IFN-γ y el factor transfor- mador de crecimiento β (TGF-β, transforming growth factor-β) participan en la regulación del cambio de clase de Ig. Respuestas mediadas por anticuerpos A. Respuesta primaria Cuando un individuo se encuentra con un antígeno por pri- mera vez, el anticuerpo que se produce se detecta en el suero días o semanas después. Este lapso varía dependiendo de la naturaleza, la dosis y la vía de administración del antígeno (p. ej., oral o parenteral). La concentración sérica de anticuer- pos continúa elevándose durante muchas semanas y después disminuye, en ocasiones hasta niveles muy bajos (figura 8-7). Los primeros anticuerpos que se producen son IgM. Después, IgG o IgA, o ambas. Los niveles de IgM tienden a disminuir antes que los de IgG. apter 08_Carroll_4R.indd 138 apter 08_Carroll_4R.indd 138 14/04/16 14/04/16
- 152. CAPÍTULO 8 Inmunología139 B. Respuesta secundaria Cuando ocurre un segundo encuentro con el mismo antígeno, meses o años después de la respuesta primaria, la segunda respuesta mediada por anticuerpos es más rápida y de mayor magnitud que la primera reacción (figura 8-7). Este cambio se atribuye a la persistencia de las células de memoria sensibles a antígenos que se generaron durante la respuesta inmunita- ria primaria. En la respuesta secundaria, la cantidad de IgM producida es cualitativamente similar a la producida después del primer contacto con el antígeno; sin embargo, se produce más IgG que persiste durante mucho más tiempo que en la res- puesta primaria. Además, dicho anticuerpo tiende a unirse a los antígenos con más firmeza (con mayor afinidad) y por lo tanto se disocia con menor facilidad. Funciones protectoras de los anticuerpos La función protectora de los anticuerpos se basa en el hecho de que es posible crear inmunoglobulinas específicas que reco- nocen patógenos determinados y se unen a ellos. Esta interac- ción desencadena una serie de respuestas defensivas por parte del hospedador. Los anticuerpos pueden generar resistencia a infecciones a través de cinco mecanismos principales: 1. Potenciación de la fagocitosis. Los anticuerpos pro- ducen resistencia al opsonizar (cubrir) organismos, lo cual facilita su ingestión por parte de fagocitos. Además, la inmuni- dad mediada por anticuerpos es más efectiva cuando se dirige contra infecciones por microbios cuya virulencia está relacio- nada con cápsulas de polisacáridos (p. ej., por neumococos, Haemophilus spp. y Neisseria spp.). En estas infecciones, los anticuerpos forman complejos con los antígenos capsulares y hacen a los organismos susceptibles a la ingestión por fagoci- tos. Esta internalización conduce a la destrucción del patógeno. 2. Neutralización de virus. Los anticuerpos dirigidos contra proteínas víricas específicas pueden unirse a los virus y bloquear su capacidad para adherirse a su receptor celular. Respuesta primaria a A Respuesta secundaria a A Respuesta primaria a B Inyección de antígeno A Cantidad de anticuerpos en el suero Segunda inyección de antígeno A, inyección de antígeno B 1 Tiempo (meses) 2 3 4 5 6 FIGURA 87 Tasa de producción de anticuerpos después de la administración inicial de un antígeno y una segunda inyección de “refuerzo”. Debido a que los virus ya no pueden invadir las células, no pue- den replicarse. 3. Neutralización de toxinas. Los anticuerpos pueden neutralizar toxinas de microorganismos (p. ej., difteria, tétanos y botulismo) e inactivar sus efectos dañinos. 4. Lisis mediada por el complemento. La adhesión de anticuerpos a proteínas víricas en células infectadas, a células cancerígenas o a una pared celular microbiana puede activar el sistema del complemento, provocando así lisis celular. 5. Citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). La adhesión de anticuerpos específicos para virus a proteínas víricas en una célula infectada puede inducir la des- trucción lítica de dicha célula. Esta lisis es mediada por una célula citolítica (un linfocito NK, un macrófago o un neutró- filo) que se une a la porción Fc específica de dicho anticuerpo activado. La ADCC mediada por eosinófilos es un importante mecanismo de defensa contra los helmintos. La IgE recubre a los parásitos y los eosinófilos se adhieren a la porción Fc de este anticuerpo y liberan el contenido de sus gránulos. Formas de inmunidad Puesto que los anticuerpos son protectores, se han desarrollado estrategias para inducir su producción (inmunidad activa) o para administrar al hospedador anticuerpos creados con ante- rioridad (inmunidad pasiva). A. Inmunidad activa Se confiere inmunidad activa cuando un individuo entra en contacto con un antígeno externo (agente infeccioso). Esta inmunidad puede ocurrir cuando hay una infección clínica o subclínica, se proporciona inmunización con organismos vivos o muertos, hay exposición a productos microbianos (p. ej., toxinas y toxoides) o se recibe un trasplante. En todos estos casos, el individuo produce anticuerpos de manera activa. Las inmunoglobulinas producidas durante la inmunidad activa tienen una duración prolongada. Sin embargo, la protección se retrasa hasta que la producción de anticuerpos alcanza un nivel eficaz. B. Inmunidad pasiva La inmunidad pasiva se genera a través de la administración de anticuerpos creados con anterioridad. La ventaja principal de este tipo de inmunización radica en que el receptor recibe una gran concentración de anticuerpos de forma inmediata. Esto no confiere protección a largo plazo, pero es útil cuando el paciente no tiene tiempo para producir sus propios anticuer- pos. La inmunidad pasiva es eficaz contra ciertos virus (p. ej., el virus de la hepatitis B) que pueden transmitirse por lesiones con instrumentos punzantes o cortantes, en personas no vacu- nadas o inmunodeficientes, incapaces de producir anticuerpos. La administración de anticuerpos no sólo confiere protec- ción, sino que también puede tener efectos dañinos. En ocasio- nes, la inmunidad pasiva inicia reacciones de hipersensibilidad si los anticuerpos provienen de otra especie. Sin embargo, en la inmunidad activa la unión de anticuerpos a antígenos provoca apter 08_Carroll_4R.indd 139 apter 08_Carroll_4R.indd 139 14/04/16 14/04/16
- 153. 140 SECCIÓN IIInmunología la formación de complejos inmunitarios circulantes. La depo- sición de estos complejos puede ser un factor importante en el desarrollo de disfunción de órganos. Por ejemplo, es posible que los complejos inmunitarios se depositen en los riñones e induzcan glomerulonefritis capaz de generar infecciones por estreptococos. Linfocitos T A. Inmunidad mediada por células En la respuesta inmunitaria adaptativa, la interacción coope- rativa entre la inmunidad celular y la mediada por anticuerpos proporciona la mejor oportunidad para combatir una infec- ción. De hecho, respuestas efectivas mediadas por anticuerpos dependen de la activación de los linfocitos T. Esta sección se enfoca en la activación de dichas células, la forma en que reco- nocen a los antígenos, los subgrupos que existen, su función, su desarrollo, su proliferación y su diferenciación. 1. Desarrollo de los linfocitos T. Como se mencionó antes, los linfocitos T derivan de las mismas células madre hematopoyéticas que los linfocitos B. En el timo, los linfoci- tos T maduran y se transforman en células que expresan un TCR específico, gracias a la influencia de hormonas. Estas células experimentan recombinación VDJ en la cadena β y después reordenamiento de sus cadenas α. Después, pasan por dos procesos de selección: uno positivo y otro negativo. Durante la selección positiva sobreviven las células que reco- nocen a los antígenos y a los MHC propios con poca afinidad. A estas células se les denomina restringidas al MHC propio. Durante la selección negativa, las células que reconocen a los péptidos propios y a los MHC con gran afinidad son elimina- das. Los supervivientes, linfocitos T CD4+ CD8+ , continúan madurando hasta transformarse en CD4+ o en CD8+ . Sólo una minoría de linfocitos T en desarrollo expresa los receptores apropiados y entra a la periferia donde se une al acervo de lin- focitos T maduros. 2. Receptor de linfocito T, aceptor de antígenos. El TCR es la molécula de reconocimiento de los linfocitos T. Es una proteína heterodimérica transmembrana que contiene dos cadenas unidas por puentes disulfuro. Existen dos clases diferentes de TCR: alfa-beta (α y β) y gamma-delta (γ y δ). La mayoría de los linfocitos T contiene el fenotipo TCR αβ y un porcentaje más pequeño expresa el TCR γδ. Los linfocitos T αβ se subdividen según sus marcadores de superficie en CD4+ o CD8+ . Se conoce poco sobre las actividades de los linfocitos T γδ, sin embargo se sabe que se localizan principalmente en los epitelios de los sistemas gastrointestinal y reproductivo. La estructura del TCR se asemeja a la del fragmento Fab de una inmunoglobulina; es decir, este receptor tiene regiones tanto variables como constantes. De forma más específica, cada cadena tiene dos dominios extracelulares: una región variable y una constante. La parte constante está más cerca de la mem- brana celular mientras que la variable se une al complejo pép- tido-MHC. Cuando el TCR se une a este complejo ocurre una serie de eventos, los cuales se discuten más adelante. Como ocurre con las inmunoglobulinas, la diversidad del TCR es similar a la del BCR. La cadena α del TCR resulta de recombinación VJ mientras que la cadena β se genera por recombinación VDJ. Estos segmentos se pueden combinar de forma aleatoria en diferentes maneras para generar el com- plejo TCR. Este complejo está formado por las cadenas altamente variables α y β del TCR, más las proteínas CD3 invariables. Éstas transducen la señal recibida por el TCR cuando ocurre el reconocimiento de antígenos. Las diferentes proteínas del com- plejo CD3 son moléculas transmembrana capaces de interac- tuar con cinasas de tirosina citosólicas que inician la traducción de señales que induce la transcripción de genes, la activación de células y las actividades funcionales de los linfocitos T. Además del complejo TCR, la señal de los linfocitos T tam- bién es potenciada por la presencia de correceptores (segunda señal). Las moléculas CD4 y CD8 funcionan como moléculas correceptoras. Durante el reconocimiento de antígenos, estos CD interactúan con el complejo TCR y con moléculas del MHC localizadas sobre las APC. El CD4 se une a moléculas del MHC clase II y el CD8 a moléculas del MHC clase I. 3. Proliferación y diferenciación de los linfocitos T. La proliferación de los linfocitos T depende de una serie de eventos. En la presentación del MHC clase II se requieren dos señales para activar un linfocito T CD4+ virgen. La primera señal proviene de la interacción entre el TCR (del linfocito T) y el complejo péptido-MHC, localizado en la APC. La gluco- proteína CD4 del linfocito T virgen actúa como correceptor uniéndose a moléculas del MHC clase II. Este evento ayuda a estabilizar la unión entre ambas células. La segunda señal (coestimuladora) que se requiere para la activación del lin- focito T deriva de la interacción entre moléculas coestimu- ladoras de la familia B7 (B7-1/B7-2 también conocidas como CD80 y CD86) pertenecientes a la APC con el CD28 del lin- focito T. Éstas son las moléculas coestimuladoras principales. Al completarse estos dos pasos de estimulación (p. ej., la unión del TCR con el complejo MHC clase II-péptido y la unión del CD28 con B7-1/B7-2), se activa un grupo de vías bioquímicas que provocan la síntesis y la proliferación de DNA. Durante estos eventos, el linfocito T secreta citosinas, principalmente IL-2 e IFN-γ, e incrementa la expresión de receptores de IL-2. Estos linfocitos T son capaces de proliferar y transformarse en células efectoras. La activación de los linfocitos T CD8+ ocurre cuando el TCR interactúa con el complejo MHC clase I-péptido de una célula infectada. La glucoproteína CD8 actúa como correcep- tor, uniéndose a moléculas de MHC clase I provenientes de la APC. De nuevo, esta interacción mantiene a las dos células unidas durante la activación. Una vez que el linfocito citotóxico se ha activado, produce IL-2 e IFN-γ, factores de crecimiento y diferenciación para linfocitos T. A diferencia de la activación de los linfocitos CD4+ , la activación de los linfocitos T CD8+ en la mayoría de los casos no depende de coestimulación y una célula infectada por un virus es destruida mediante la liberación del contenido de los gránulos citotóxicos del linfocito CD8+ . B. Funciones de los linfocitos T efectores 1. Células efectoras CD4. Los linfocitos T CD4+ que pro- liferan pueden transformarse en una de cuatro principales apter 08_Carroll_4R.indd 140 apter 08_Carroll_4R.indd 140 14/04/16 14/04/16
- 154. CAPÍTULO 8 Inmunología141 categorías de linfocitos T efectores: Th1, Th2, Th17 o linfocitos T reguladores (T reg). Th1. Las células Th1 se activan por las interleucinas 2 y 12, y activan a los macrófagos o provocan que los linfocitos B cambien la producción de anticuerpos a diferentes subclases de IgG. En cualquier caso, esto puede promover la eliminación de bacterias por destrucción directa mediante macrófagos acti- vados por IFN-γ o por destrucción de partículas opsonizadas fagocitadas. Estas células Th1 también producen IL-2 e IFN-γ. Th2. Las células Th2 predominan en un ambiente donde se produce Il-4. Éstas activan mastocitos y eosinófilos, y pro- vocan que los linfocitos B sinteticen IgE. Ésto ayuda en la res- puesta contra helmintos. Las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. Th17. Cuando hay TGF-β, IL-6 e IL-23, los linfocitos T CD4+ pueden transformarse en células Th17. Éstas producen IL-17, IL-21 e IL-22. La IL-17 es una citosina que induce la pro- ducción de IL-8 en células epiteliales y del estroma. Esta inter- leucina es una quimiocina potente que se encarga de reclutar neutrófilos y macrófagos en tejidos infectados. T reg. Los linfocitos T CD4+ pueden transformarse en T reguladores (T reg) cuando son expuestos sólo a TGF-β. Estas células suprimen las respuestas de los linfocitos T. Se identifi- can por la expresión de CD4 y CD25 en su superficie y el factor de transcripción, Foxp3. Los linfocitos T reg producen TGF-β e IL-10, moléculas que suprimen las respuestas inmunitarias. 2. Linfocitos CD8 efectores. Los linfocitos T CD8+ se transforman en células citolíticas efectoras cuando su TCR reco- noce al complejo MHC clase I-péptido en la superficie de una célula infectada, eliminándola. El método principal de elimina- ción involucra gránulos citotóxicos que contienen perforinas, la familia de granzimas y una tercera proteína recientemente identificada llamada granulisina. Las perforinas ayudan a las granzimasyalagranulisinaaentraralacélulainfectada.Lasgran- zimas inician la apoptosis (muerte celular programada) al ac- tivar a las caspasas celulares. Debe notarse que ocurre un pro- ceso similar cuando los linfocitos T CD8+ reconocen a células cancerígenas. Véase el artículo de Murphy (2011) para obtener información adicional. COMPLEMENTO El sistema del complemento, una compleja y sofisticada cas- cada de varias proteínas, está diseñado para proporcionar defensa contra microbios invasores. El sistema del comple- mento incluye proteínas séricas y de membrana que partici- pan en la inmunidad innata y en la adaptativa. Estas proteínas están muy reguladas e interactúan a través de una serie de cas- cadas proteolíticas. Muchos de los componentes del comple- mento son proenzimas, las cuales se deben dividir para formar enzimas activas. Efectos biológicos del complemento Las proteínas del complemento activadas inician una varie- dad de funciones que tienen cuatro resultados principales: 1, citólisis, 2, quimiotaxia, 3, opsonización y 4, producción de anafilatoxinas. 1. La citólisis es la lisis de células cancerígenas o células infec- tadas por virus o bacterias. Este proceso ocurre mediante el desarrollo del complejo de ataque de membrana (MAC, membrane attack complex) (C5b, 6, 7, 8, 9), el cual se inserta en la membrana de un organismo o una célula. El MAC perfora la membrana celular, lo cual provoca pérdida de la integridad osmótica y rotura del microbio o célula. 2. La quimiotaxia es el movimiento dirigido de los leucocitos en contra de un gradiente de concentración, hacia el sitio de una infección. Este movimiento ocurre en respuesta a un factor quimiotáctico. Una de las sustancias quimiotác- ticas más importantes es la molécula C5a, un fragmento de la proteína C5 que estimula el movimiento de neutrófi- los y monocitos hacia sitios de inflamación. 3. Opsonización es un término que se usa para describir la manera en la que los anticuerpos o la proteína C3b pue- den potenciar la fagocitosis de microbios. Los macrófagos y los neutrófilos tienen receptores para C3b y por lo tanto pueden unirse a organismos cubiertos con dicha molécula. Esta unión activa la fagocitosis. 4. Las anafilatoxinas promueven la vasodilatación e incre- mentan la permeabilidad vascular. Dos componentes del complemento, C3a y C5a son anafilatoxinas potentes. Ambas se unen a receptores ubicados en los mastocitos y los basófilos para que liberen histamina. Este evento aumenta el flujo sanguíneo hacia el sitio de la infección, permitiendo que más proteínas del complemento, anti- cuerpos y células inmunitarias entren al sitio afectado. Vías del complemento Hay tres vías principales que activan el complemento: la clá- sica, la alternativa y la MBL (figura 8-8). Cada una de éstas pro- voca la formación de MAC y la liberación de convertasa C5, la cual se divide en los fragmentos C5a y C5b. Como se mencionó antes, C5a es una anafilatoxina y un factor quimiotáctico. C5b se une a C6 y a C7 para formar un complejo que se inserta en la membrana. Después, C8 se une al complejo C5b-C6-C7, lo cual induce la polimerización de hasta 16 moléculas de C9 para producir el MAC. Éste genera un poro en la membrana y provoca citólisis al permitir el libre paso de agua a través de la membrana celular. Vía clásica La molécula C1, que se une a la región Fc de una inmunoglobu- lina, está formada por tres proteínas: C1q, C1r y C1s. C1q es un agregado de polipéptidos que se une a la porción Fc de la IgG y de la IgM. El complejo antígeno-anticuerpo se une a C1 y activa a C1s, que divide a C4 y C2 para formar C4b2b. Esta proteína es una convertasa activa que divide a C3 en dos fragmentos: C3a y C3b. Como se mencionó antes, C3a es una anafilatoxina potente. C3b forma un complejo con C4b2b, produciendo una nueva enzima (la convertasa de C5) que divide a C5 para for- mar C5a y C5b. C5b ahora está disponible para unirse a C6 y C7, y formar el complejo C5b/C6/C7. Por último, C9 se une a este complejo recién formado para producir la formación del MAC. Una vez que esto ocurre, la lisis celular sucede poco tiempo después. Sólo la IgM y la IgG fijan al complemento a apter 08_Carroll_4R.indd 141 apter 08_Carroll_4R.indd 141 14/04/16 14/04/16
- 155. 142 SECCIÓN IIInmunología través de la vía clásica. Además, sólo las subclases 1, 2 y 3 de la IgG fijan al complemento, a diferencia de la IgG4. Un ejemplo de la vía clásica del complemento en acción se puede observar en las infecciones por el virus del herpes simple (HSV, herpes simplex virus). La replicación de este virus den- tro de las células está acompañada de la inserción de proteínas víricas en la superficie de la membrana celular. Un anticuerpo anti-HSV específico puede unirse a la superficie de la célula infectada por su fragmento Fab. La porción Fc del complejo antígeno-anticuerpo queda ahora expuesta y está lista para que se adhiera la proteína C1. La vía clásica ahora queda activada y la célula infectada es destruida por el MAC. Vía alternativa La vía alternativa del complemento puede ser activada por agen- tes infecciosos que inducen el sistema del complemento al iniciar la producción celular de los factores B, D y properdina. Estos factores dividen a C3 y generan convertasa de C3. Esta molécula (C3bBb)queseprodujoenlavíaalternativacreamásC3b.LaC3b Complejo de ataque de membrana C5b–C9 Lisis celular Convertasas de C3 C5b C6,C7,C8,C9 Factor B Factor D Properidina C4 C2 C1 activado Complejo inmunitario Superficies microbianas Vía clásica Vía alternativa C3 [C4b2b] [C3bBb] Convertasas de C5 [C4b2bC3b] [C3bBbC3b] Anafilatoxinas C3b C3a C3 C5a C5 Vía de la lectina fijadora de manosa Superficies microbianas MBL FIGURA 88 Secuencia de reacciones del sistema del complemento. adicional se une a la convertasa de C3 para formar C3bBbC3b. Esta enzima es la convertasa C5 de la vía alternativa que genera C5b, lo que provoca la producción del MAC antes descrito. Vía de la lectina fijadora de manosa La vía de la lectina es un componente importante de la res- puesta inmunitaria innata y es similar a la vía clásica en el punto de división de C4. Sin embargo, la diferencia principal radica en que inicia por la unión de lectina fijadora de manosa (MBL, mannose-binding lectin) a polisacáridos localizados en la superficie de las bacterias. La unión de MBL a un patógeno resulta en la formación de un complejo triple de MBL con dos proteasas de serina (MASP-1 y MASP-2). Este complejo triple ahora es activado para dividir a C4 en C4a y C4b y a C2 en C2a y C2b. El nuevo complejo C4bC2a es una convertasa de C3 y la serie de reacciones procede como en la vía clásica. A. Regulación del sistema del complemento Para evitar la constante activación del complemento, existe una red reguladora para terminar su actividad. Muchas pro- teínas séricas regulan el sistema del complemento en etapas diferentes: 1) la proteína inhibidora C1 se une a C1r y C1s e inactiva su actividad de proteasa de serina, provocando que se disocien de C1q; 2) el factor I divide a C3b y a C4b, reduciendo así la cantidad de convertasa de C5 disponible; 3) el factor H potencia el efecto del factor I sobre C3b y (4) el factor P (pro- perdina) protege a C3b y estabiliza la convertasa de C3 de la vía alternativa. Proteínas con la capacidad de acelerar la destruc- ción de las proteínas del complemento también sirven como reguladores, tales como el factor de aceleración de la destruc- ción (DAF, decay-accelerating factor) que se expresa en la san- gre y las células endoteliales, y puede apresurar la disociación de convertasas C3 de las tres vías. Deficiencias del complemento y evasión de patógenos Se han descrito muchas deficiencias genéticas de las proteínas del complemento; éstas por lo general incrementan la sus- ceptibilidad a desarrollar enfermedades infecciosas (p. ej., la deficiencia de C2 a menudo provoca infecciones piogénicas graves). La deficiencia de los componentes de la MAC mejora de manera considerable la susceptibilidad a las infecciones por neisseria. También se conocen deficiencias de los componentes de la vía alternativa (p. ej., la insuficiencia de properdina está relacionada con mayor susceptibilidad a enfermedades menin- gocócicas). También hay deficiencias de proteínas que regulan al complemento. Por ejemplo, la falta de la proteína inhibidora C1 causa angioedema hereditario. El complemento es un importante sistema protector del hospedador. Sin embargo, algunas bacterias han desarrollado mecanismos para evadir la actividad del complemento. Por ejemplo, son capaces de interferir con la opsonización u obs- truir la inserción del MAC. La activación del complemento también se inhibe por la presencia de proteínas producidas por las bacterias, como la proteína A y la proteína C, que se unen a la porción Fc de la IgG. Por último, pueden producir enzimas apter 08_Carroll_4R.indd 142 apter 08_Carroll_4R.indd 142 14/04/16 14/04/16
- 156. CAPÍTULO 8 Inmunología143 que degradan componentes del complemento. Los organis- mos que poseen estas propiedades inhibidoras por lo general son más patogénicos. El sistema del complemento también ha desarrollado estrategias para atacar a virus libres y a células infectadas por virus. En respuesta, los virus han desarrollado mecanismos para evadir el ataque del complemento. Algunos virus, como el de la viruela, codifican proteínas capaces de inhibir la función del complemento del hospedador. Otros virus con envoltura, como un citomegalovirus, pueden recoger algunas de las pro- teínas reguladoras del complemento conforme maduran salen de la célula infectada. Estas proteínas reguladoras (CD46, CD55 y CD59) presentes en la envoltura del virus son capaces de inhibir la activación del complemento. Por último, muchos virus (p. ej., el virus de Epstein-Barr [EBV, Epstein-Barr virus] y el del sarampión) utilizan receptores del complemento para entrar a las células e infectarlas. CITOSINAS En las dos últimas décadas se ha incrementado en gran medida el estudio de la biología de las citosinas. Estas moléculas son potentes reguladores celulares proteínicos de bajo peso mo- lecular, que son producidos de forma transitoria y regional por numerosos tipos de células. Hoy se reconoce que las cito- sinas son proteínas multifuncionales cuyas propiedades bioló- gicas sugieren una función importante en la hematopoyesis, la inmunidad, las enfermedades infecciosas, la formación de tumores, la homeostasis, la reparación de los tejidos y el desa- rrollo y el crecimiento celulares. Las citosinas por lo general actúan como moléculas de señalización al unirse a sus propios receptores glucoproteínicos localizados en las superficies celulares. Esta interacción inicial es seguida por la transmisión de la señal al núcleo de la célula. La transducción de señales es mediada, como en muchos siste- mas receptores de hormonas, a través de la fosforilación de pro- teínas citoplasmáticas mediante cinasas. De hecho, la actividad de cinasa de tirosina es característica de muchos receptores de citosinas. Debido a su participación en múltiples actividades inmunitarias, las citosinas se mencionan a lo largo de este capítulo. En los siguientes párrafos se describen las citosinas principales y sus funciones. Clasificación y funciones Las citosinas se categorizan en grupos con base en sus funcio- nes comunes. Algunos ejemplos de categorías funcionales son la inmunorregulación, la proinflamación e inhibición de la infla- mación, la quimiotaxia, la adhesión molecular, el crecimiento y la diferenciación. El IFN-γ es una citosina inmunorregu- ladora importante, debido a su importante participación en la presentación de antígenos. Las citosinas proinflamatorias por lo general proliferan en enfermedades infecciosas e incluyen la IL-1, la IL-6, el TNF-α y los interferones. Algunas citosinas antiinflamatorias son el TGF-β, el IFN-β y las interleucinas 10 y 11. Éstas pueden ser necesarias para disminuir una respuesta inflamatoria hiperactiva. Entre las citosinas importantes para el crecimiento o la diferenciación se encuentran los factores estimulantes de colonias (CSF, colony-stimultating factors) y el factor de células madre. En el cuadro 8-3 se muestran las fuen- tes y las principales actividades de citosinas selectas. Citosinas en el desarrollo de células inmunitarias y defensa del hospedador contra infecciones Los linfocitos T CD4+ vírgenes se transforman en clases dife- rentes dependiendo del ambiente exógeno de citosinas. Las células Th1 se desarrollan en presencia de IL-12; las Th2 se forman gracias a la acción de IL-4; las células Th17 se produ- cen en presencia de TGF-β, IL-6 e IL-23, y las T reg se crean en presencia sólo de TGF-β. Cada uno de estos cuatro linajes produce citosinas que tienen una función primordial en la defensa del hospedador contra microorganismos selectivos. Las células Th1 producen IL-2 e IFN-γ, citosinas capaces de controlar con eficacia infecciones víricas y organismos intra- celulares como micobacterias y Toxoplasma gondii. El IFN-γ es un importante activador de macrófagos y linfocitos T cito- tóxicos CD8+ . Las células Th2 producen las interleucinas 4, 5, 6, 10 y 13, citosinas que dirigen respuestas mediadas por IgE y ayudan a controlar infecciones parasitarias. Las células Th17 producen IL-17, una citosina que atrae neutrófilos y protege al hospedador en barreras epiteliales y mucosas. Se ha demos- trado que la IL-17 limita infecciones en la piel por Staphylo- coccus aureus, en el colon por Citrobacter rodentium, en los pulmones por Klebsiella pneumoniae, en la boca por Candida albicans y en la vagina por Chlamydia. También se ha demos- trado que la IL-17 inhibe infecciones fúngicas provocadas por Pneumocystis carinii. Estudios recientes han demostrado que mutaciones en los genes que codifican la IL-17 y sus receptores predisponen a los individuos a experimentar mucocandidia- sis crónica por C. albicans. Por último, los linfocitos T reg son células reguladoras que ayudan a suprimir la proliferación de linfocitos T y a mantener la tolerancia a los antígenos propios. Se ha sugerido que la función de los linfocitos T reg es facili- tada en parte por la producción de citosinas inmunosupreso- ras, como la IL-10 y el TGF-β. EsteanálisissobreladiferenciacióndelinfocitosTdemues- tra la forma en la que subgrupos de estas células secretan sus propias citosinas con distintas propiedades reguladoras. Por lo tanto, las citosinas dirigen el tipo de respuesta inmunitaria protectora que se genera. Aplicaciones clínicas Hasta la fecha hay al menos cuatro aplicaciones clínicas para las citosinas. En primer lugar, estas moléculas pueden actuar como biomarcadores de enfermedades y proporcionar pistas para descifrar mecanismos fisiopatogénicos. Por ejemplo, las citosinas proinflamatorias TNF-α, IL-1 e IL-6 pueden detec- tarse en el suero de pacientes con choque séptico. Estas molécu- las parecen tener una función importante en el desarrollo de choque séptico, y monitorizar su presencia puede tener valor pronóstico en casos de septicemia grave. En segundo lugar, la medición de la producción de citosinas in vitro sirve para monitorizar el estado del sistema inmunitario. El funcio- namiento de los linfocitos T se refleja en su capacidad para apter 08_Carroll_4R.indd 143 apter 08_Carroll_4R.indd 143 14/04/16 14/04/16
- 157. 144 SECCIÓN IIInmunología CUADRO 83 Citosinas selectas: producción y actividades Familia de citosinas Tipo celular primarioa Actividad Interferones Alfa Leucocitos Antivírica, inmunorreguladora (potencia la actividad de los linfocitos NK y del MHC clase I), antiproliferativa Beta Fibroblastos y células epiteliales Antivírica, inmunorreguladora (potencia la actividad de los linfocitos NK y del MHC clase I), antiproliferativa Gamma Linfocitos T y NK Antivírica, inmunorreguladora (potencia la activación de los macrófagos y los MHC clases I y II), antiproliferativa TNF Alfa Macrófagos y linfocitos Activa macrófagos y células citotóxicas e induce caquexia, proteínas de fase aguda y citosinas como las interleucinas 1 y 6 Beta Linfocitos T Activa macrófagos e induce citosinas (IL-1 e IL-6) Interleucinas IL-1 La mayoría de las células, macrófagos y células dendríticas Induce inflamación, fiebre y septicemia. Activa al TNF-α IL-2 Linfocitos T Induce proliferación y maduración de linfocitos T IL-6 La mayoría de las células Estimula linfocitos B y media reacciones de fase aguda IL-10 Linfocitos T y monocitos/macrófagos Inhibe la producción de IFN-γ e IL-12 IL-11 Células del estroma de la médula ósea (BM, bone marrow) Tiene efectos sinérgicos sobre la hematopoyesis y la trombopoyesis, efectos citoprotectores en células epiteliales e induce inmunosupresión IL-12 Células dendríticas, macrófagos y linfocitos B Induce la producción de IFN-γ, TNF-α e IL-12 por parte de linfocitos T y NK activos e inactivos IL-15 Linfocitos T, astrocitos, microgliocitos, fibroblastos y células epiteliales Promueve actividades biológicas similares a las de la IL-2, induce la proliferación de sangre periférica y células mononucleares y la maduración de linfocitos NK (IL-1, IFN-γ y TNF-α) IL-17 (A-F) Linfocitos Th17 Estimula la producción de IL-6, IL-8, G-CSF e ICAM-1 proinflamatoria, por parte de fibroblastos y células epiteliales y endoteliales IL-23 Macrófagos y células dendríticas Tiene actividad similar a la de la IL-12 (induce al IFN-γ) y ayuda a la transformación de linfocitos T CD4+ en células Th17 Factores de crecimiento M-CSF Monocitos Induce la proliferación de precursores de macrófagos G-CSF Macrófagos Induce la proliferación, la diferenciación y la activación de neutrófilos GM-CSF Linfocitos T y macrófagos Induce la proliferación de granulocitos y precursores de macrófagos Factor de células madre Células del estroma de la BM, fibroblastos y hepatocitos fetales Induce la proliferación y la diferenciación de células mieloides y linfoides tempranas (experimenta sinergia con otras citosinas) TGF-β La mayoría de las células Tiene actividad antiinflamatoria, dirige la transformación de linfocitos T CD4+ en linfocitos T reg; en presencia de IL-6 promueve el cambio de linfocitos T CD4+ a células Th17 VEGF-A La mayoría de las células Estimula la angiogénesis Quimiocinas IL-8 (CXCL8) La mayoría de las células Quimiotaxia y activación de neutrófilos RANTES (CCL5) La mayoría de las células Quimiotaxia de linfocitos T, monocitos, eosinófilos y basófilos CXCL9 CXCL10 CXCL11 La mayoría de las células Quimiotaxia de linfocitos Th1 (linfocitos T CXCR3 positivos) y son inducidas por los IFN Moléculas de adhesión ICAM-1 Células endoteliales Adhesión y migración VCAM-1 Leucocitos Adhesión y migración Selectina E Células endoteliales Adhesión y migración a Esta lista no es inclusiva; se han identificado células primarias. apter 08_Carroll_4R.indd 144 apter 08_Carroll_4R.indd 144 14/04/16 14/04/16
- 158. CAPÍTULO 8 Inmunología145 producir IFN-γ. Este parámetro se utiliza en la actualidad para identificar reactividad contra tuberculosis (TB) y se expone más adelante. En tercer lugar, las citosinas recombinantes son antibióticos importantes. Un ejemplo de esto se puede obser- var en los interferones. La FDA ha aprobado el uso de IFN-α para tratar hepatitis C, de IFN-β como terapia para esclerosis múltiple y de IFN-γ para la enfermedad granulomatosa crónica (CGD, chronic granulomas disease). En cuarto lugar, las cito- sinas pueden ser tratamientos efectores. En fecha reciente se han utilizado de manera efectiva antagonistas de receptores de citosinas y anticuerpos monoclonales contra dichas molécu- las, debido a que ambos disminuyen las respuestas patogénicas a la producción exagerada de citosinas. Algunos ejemplos son los inhibidores del TNF-α, utilizados para tratar artritis reu- matoide (RA, rheumatoid arthritis), y los inhibidores de IL-2 e IL-15, usados en pacientes con trasplantes y cáncer. HIPERSENSIBILIDAD La hipersensibilidad es una respuesta inmunitaria exagerada que es dañina para el hospedador. Esta condición requiere de un estado de sensibilización previa. Por ejemplo, en un indivi- duo determinado este tipo de reacciones por lo general ocurre después de un segundo encuentro con un antígeno específico (alérgeno). En 1963, Coombs y Gell clasificaron la hipersensibili- dad en cuatro tipos: I, II, III (mediada por anticuerpos) y IV (mediada por linfocitos T). Tipo I: hipersensibilidad inmediata (alergia) La hipersensibilidad tipo I se manifiesta como reacciones hís- ticas que ocurren segundos después de que un antígeno se ha combinado con su IgE específica. Los síntomas pueden mani- festarse como anafilaxia sistémica (p. ej., después de la admi- nistración intravenosa de proteínas heterólogas) o como una reacción local (p. ej., una alergia atópica que involucra rinitis, como ocurre en la fiebre del heno). El mecanismo general de la hipersensibilidad inmediata involucra una serie de pasos. Primero, un antígeno induce la formación de IgE, la cual se une con firmeza, por su porción Fc, a receptores de IgE de alta afinidad ubicados sobre mastocitos, basófilos y quizá eosinófilos. Si un individuo experimenta una segunda exposición al mismo antígeno cierto tiempo después, habrá entrecruzamiento entre las moléculas de IgE unidas a las células antes mencionadas y se liberarán mediadores farma- cológicamente activos. Los nucleótidos cíclicos y el calcio son esenciales para la liberación de estas moléculas. Los mediadores farmacológicos de la hipersensibilidad tipo I son los siguientes: 1. Histamina. La histamina existe en un estado preformado en las plaquetas y en los gránulos de mastocitos, basófilos y eosinófilos. Su liberación provoca vasodilatación, aumento de la permeabilidad capilar y contracción de músculo liso (p. ej., broncoespasmo). Los antihistamínicos bloquean los receptores de histamina y son relativamente efectivos para tratar casos de rinitis alérgica. La histamina es uno de los principales media- dores de las reacciones de tipo I. 2. Prostaglandinas y leucotrienos. Las prostaglandinas y los leucotrienos son mediadores provenientes del ácido ara- quidónico, que se forman través de la vía de la ciclooxigenasa. Las prostaglandinas inducen edema y broncoespasmo. El leu- cotrieno B4 es una sustancia quimiotáctica que activa y recluta leucocitos en sitios de lesión. Los leucotrienos C4 y D4 cau- san vasodilatación y permeabilidad vascular. Estas moléculas, junto con el TNF-α y la IL-4, se conocen como mediadores secundarios de una reacción de tipo I. A. Atopia Los trastornos de hipersensibilidad atópica exhiben una pre- disposición familiar fuerte y se relacionan con niveles altos de IgE. La predisposición a la atopia es claramente genética, sin embargo los síntomas son inducidos por exposición a alérge- nos específicos. Estos antígenos por lo general son ambientales (p. ej., pólenes, ambrosias o polvo) o alimentos (p. ej., mariscos). La fiebre del heno, el asma, el eccema y la urticaria son mani- festaciones clínicas comunes. Muchos pacientes experimentan reacciones de tipo inmediato a pruebas cutáneas (inyecciones, parches o rascado) que involucran al antígeno ofensor. B. Tratamiento y prevención de reacciones anafilácticas El tratamiento tiene como objetivo revertir la acción de los mediadores al mantener permeables las vías respiratorias, con ventilación artificial si es necesario, y dar soporte a la función cardiaca. A menudo se administran adrenalina, antihistamí- nicos y corticosteroides. Sin embargo, el mejor método de pre- vención recae en la identificación del antígeno (detectado por pruebas cutáneas o serología de IgE) y evitar contactos subsi- guientes. Tipo II: hipersensibilidad La hipersensibilidad tipo II implica la unión de anticuerpos IgG a antígenos de superficie celular o a moléculas de la matriz extracelular. Un anticuerpo dirigido contra antígenos de superficie celular es capaz de activar el complemento o dañar a las células portadoras. El resultado puede ser lisis mediada por el complemento, como ocurre en la anemia hemolítica, reacciones a los grupos ABO por transfusiones y enfermedad hemolítica por el factor Rh. Fármacos como la penicilina pueden adherirse a proteí- nas superficiales de eritrocitos e iniciar la formación de anti- cuerpos. Estas inmunoglobulinas autoinmunitarias después se combinan con la superficie celular y provocan hemólisis. En el síndrome de Goodpasture se generan anticuerpos contra las membranas basales de los riñones y los pulmones. Esto activa el complemento, induce quimiotaxia de leucocitos y genera daño grave de las membranas. En algunos casos, los anticuer- pos contra los receptores de las superficies celulares alteran la función de las células sin dañarlas (p. ej., como ocurre en la enfermedad de Graves, en la que un autoanticuerpo se une al receptor de la hormona estimulante de la tiroides, lo cual genera estimulación de dicha glándula e hipertiroidismo). apter 08_Carroll_4R.indd 145 apter 08_Carroll_4R.indd 145 14/04/16 14/04/16
- 159. 146 SECCIÓN IIInmunología Tipo III: hipersensibilidad por complejos inmunitarios Cuando un anticuerpo se combina con su antígeno específico, se forman complejos inmunitarios. Éstos, por lo general, se eli- minan de inmediato, pero en ocasiones persisten y se depositan en los tejidos. En infecciones bacterianas o víricas persistentes pueden depositarse complejos inmunitarios en los órganos (p. ej., los riñones), lo cual resulta en insuficiencia del órgano afectado y daño hístico. En las enfermedades autoinmunita- rias, los antígenos “propios” inducen la formación de anticuer- pos que se unen a ellos o se depositan en órganos y tejidos en forma de complejos, en particular en las articulaciones (artri- tis), los riñones (nefritis) y los vasos sanguíneos (vasculitis). Por último, ciertos antígenos ambientales, como las esporas de hongos y ciertos fármacos, son capaces de provocar la forma- ción de complejos inmunitarios que causan daño similar de órganos y tejidos. Siempre que se depositan complejos inmunitarios se puede activar el complemento. Una vez que esto ocurre, macrófagos y neutrófilos migran al sitio de inflamación y ocurre daño hís- tico. Hay dos tipos principales de hipersensibilidad mediada por complejos inmunitarios. Uno de ellos se produce de forma local y se denomina reacción Arthus. Ésta ocurre cuando se inyecta una pequeña dosis de antígeno en la piel. Esto induce la producción de anticuerpos IgG y la activación del com- plemento. Además se estimula la liberación de mediadores, provenientes de mastocitos y neutrófilos, que incrementan la permeabilidad vascular. Esta reacción por lo común ocurre en un lapso de 12 h. Otro ejemplo de hipersensibilidad tipo III involucra enfermedades sistémicas por complejos inmunita- rios, como la glomerulonefritis posestreptocócica aguda. La glomerulonefritis posestreptocócica aguda es una patología bien conocida, provocada por complejos inmuni- tarios. Inicia varias semanas después de una infección por estreptococo β-hemolítico del grupo A, en particular en la piel, y a menudo también ocurre después de una infección por tipos nefritogénicos de estreptococos. El nivel de proteínas del com- plemento por lo general es bajo, lo que sugiere una reacción antígeno-anticuerpo que las consume. A lo largo de la mem- brana basal glomerular se observan depósitos grumosos de inmunoglobulinas conjugadas con la proteína C3 del comple- mento. Estas membranas pueden teñirse con inmunofluores- cencia y visualizarse con microscopia con luz UV. Este tipo de patrón revela complejos antígeno-anticuerpo. Es probable que complejos estreptocócicos antígeno-anticuerpo se filtren hacia afuera de los glomérulos, fijen el complemento y atraigan neu- trófilos. Esta serie de eventos provoca un proceso inflamatorio que daña los riñones. Tipo IV: hipersensibilidad mediada por células (tardía) La hipersensibilidad mediada por células es una respuesta inducida por los linfocitos T. La interacción entre antígenos y linfocitos T sensibilizados de forma específica resulta en la proliferación de dichas células, la liberación de citosinas infla- matorias potentes (IFN-γ e IL-2), y la activación de macrófa- gos. Esta respuesta inflamatoria a menudo comienza dos o tres días después del contacto con el antígeno y por lo general dura muchos días. A. Hipersensibilidad por contacto La hipersensibilidad por contacto ocurre después de eventos de sensibilización con sustancias químicas simples (p. ej., el níquel o el formaldehído), materiales de plantas (p. ej., hie- dra venenosa o roble venenoso), medicamentos de aplicación tópica (p. ej., sulfonamidas o neomicina), algunos cosméticos, jabones y otras sustancias. En todos los casos entran peque- ñas moléculas a la piel y después actúan como haptenos, que se adhieren a las proteínas del cuerpo para transformarse en antígenos completos. En estos casos se induce hipersensibili- dad mediada por células, en particular en la piel. Cuando se entra de nuevo en contacto con el agente ofensor, la persona sensibilizada desarrolla eritema, prurito, vesículas, eccema o necrosis cutáneos en 12 a 48 h. Para impedir recurrencias hay que evitar el contacto con el material incitante. Una prueba cutánea puede identificar el antígeno en cuestión. Las células de Langerhans en la epidermis, que interactúan con los linfoci- tos CD4+ Th1, parecen intervenir en esta respuesta. B. Hipersensibilidad similar a la de la tuberculina La hipersensibilidad tardía a antígenos de microorganismos ocurre en numerosas enfermedades infecciosas y se ha uti- lizado como adyuvante para el diagnóstico. La reacción a la tuberculina es un buen ejemplo de una respuesta de hipersensi- bilidad tardía (DTH, delayed-type hypersensitivity). Cuando se inyecta una pequeña cantidad de tuberculina en la epidermis de un paciente que ya ha sido expuesto a Mycobacterium tubercu- losis, hay una reacción inmediata discreta. De forma gradual, sin embargo, se desarrolla induración y enrojecimiento que alcanzan su máxima expresión en 24 a 72 h. Las células mono- nucleares, en particular los linfocitos T CD4+ Th1, se acumu- lan en el tejido subcutáneo. Una prueba cutánea positiva indica que la persona ha sido infectada por el microorganismo pero no implica la presencia de la enfermedad. No obstante, un cambio reciente de la respuesta a la prueba cutánea (de nega- tiva a positiva) sugiere una infección reciente y posible activi- dad concomitante. DEFICIENCIAS DE LA RESPUESTA INMUNITARIA Enfermedades por inmunodeficiencia La inmunodeficiencia se divide en dos categorías: primaria y secundaria. Las enfermedades por inmunodeficiencia pri- maria son trastornos del sistema inmunitario en los cuales el defecto se encuentra en las células del sistema inmune. En las enfermedades por inmunodeficiencia secundaria, el defecto es inducido por factores externos como virus, cáncer y fár- macos. Esta sección es claramente relevante para el estudio de la microbiología médica, puesto que las enfermedades por inmunodeficiencia primaria por lo general se identifican pri- mero por el organismo etiológico, la duración y la frecuencia de enfermedades infecciosas. apter 08_Carroll_4R.indd 146 apter 08_Carroll_4R.indd 146 14/04/16 14/04/16
- 160. CAPÍTULO 8 Inmunología147 A. Inmunodeficiencias primarias Las inmunodeficiencias primarias son un grupo heterogéneo de trastornos del sistema inmunitario. Muchas de estas enfer- medades tienen un componente genético y se heredan como defectos monogénicos. En la actualidad se han identificado más de 150 patologías con componentes genéticos subyacentes. El defecto genético disminuye el funcionamiento y el número de linfocitos B, linfocitos T, fagocitos, componentes del com- plemento, citosinas o TLR. Es claro que la pérdida de estos elementos funcionales incrementa la susceptibilidad a infec- ciones. Un ejemplo es la enfermedad granulomatosa crónica (CGD, chronic granulomatous disease), un trastorno que altera el funcionamiento de los fagocitos. Los pacientes tienen nive- les normales de inmunoglobulinas, fagocitos y linfocitos T y B. Las células fagocíticas, sin embargo, no matan microbios por un defecto genético en el citocromo b-558. Esto genera un des- perfecto metabólico que impide que los fagocitos produzcan peróxido y superóxido, y puede identificarse usando la prueba de nitroazul de tetrazolio (NBT, nitroblue tetrazolium). Estas células son incapaces de matar algunos hongos o bacterias de forma eficiente, como Staphylococcus, E. coli y Aspergillus spp. A menos que se trate, la CGD por lo común es fatal en la primera década de la vida. Se ha demostrado que el IFN-γ restablece la función de los fagocitos. Por lo tanto, en la mayo- ría de los casos, la administración de IFN-γ o un trasplante de médula ósea son tratamientos eficaces. Un segundo ejemplo es la inmunodeficiencia combinada grave (SCID, severe combi- ned immunodeficiency). Ahora se sabe que este síndrome es la expresión ulterior de muchos defectos genéticos diferentes que alteran el funcionamiento de los linfocitos T y de los B. Estos individuos son susceptibles a desarrollar infecciones por casi cualquier microbio y si no reciben tratamiento mueren en el primer año de vida. B. Inmunodeficiencias secundarias Las inmunodeficiencias secundarias son causa importante de infecciones. Los estados de inmunodeficiencia secundaria se relacionan con infecciones, cáncer y fármacos. C. Infecciones Las infecciones pueden suprimir la inmunidad del hospedador. Se sabe que los pacientes infectados por el EBV y que presentan mononucleosis tienen una respuesta cutánea de DTH depri- mida para la TB y otros antígenos. La negatividad de esta prueba indica inhibición de la respuesta de los linfocitos T. Análisis de la replicación del EBV han revelado un mecanismo posible para esta inmunosupresión; el genoma del EBV codifica un aná- logo de la IL-10 humana, una citosina inmunosupresora que inhibe la proliferación de los linfocitos Th1 y en consecuencia la producción de citosinas, como el IFN-γ. Esto puede explicar los resultados negativos de una prueba cutánea de DTH. El ejemplo más obvio de una inmunodeficiencia inducida por un virus es la infección por el VIH y la patología resul- tante, el sida. El VIH primero infecta a los linfocitos T CD4+ . Esto es posible debido a que el virus usa la molécula CD4 como receptor y al receptor de quimiocinas CCR5 como correceptor para entrar a la célula. La replicación del VIH en los linfocitos T CD4+ provoca una pérdida progresiva de estas células y el desarrollo del sida. En consecuencia, los pacientes afectados son atacados por muchas infecciones oportunistas. Como se mencionó antes en este capítulo, los linfocitos T CD4+ son fun- damentales para generar poblaciones de células Th1, Th2, Th17 y T reg. Estos tipos celulares son necesarios para una variedad de reacciones inmunitarias, ayudan a los linfocitos B durante la producción de anticuerpos y sirven como fuente de IL-2 e IFN-γ. Por lo tanto, la replicación de un virus citotóxico en este tipo de células es devastador para la respuesta inmunitaria. D. Cáncer Leucemias, linfomas, mieloma múltiple y otros tipos de cán- cer pueden provocar inmunodeficiencia y exacerbar las infec- ciones. Por ejemplo, los pacientes con leucemia pueden tener deficiencia de neutrófilos, lo cual reduce la capacidad de fago- citosis y favorece la proliferación de bacterias u hongos en sitios infectados. Algunos tumores secretan niveles altos de TGF-β capaces de suprimir una variedad de respuestas, incluyendo las de las células Th1. E. Fármacos Medicamentos citotóxicos utilizados para tratar cánceres (p. ej., el cisplatino), fármacos inmunosupresores (p. ej., la ciclosporina) que se emplean como antibióticos en pacien- tes con trasplantes y los nuevos medicamentos anticitosinas (anti-TNF-α) utilizados para tratar enfermedades autoinmu- nitarias (p. ej., RA) pueden aumentar el riesgo de desarrollar infecciones. EXÁMENES DE LABORATORIO PARA ENFERMEDADES INMUNITARIAS PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Datos excitantes sobre biología molecular, proteínas y DNA recombinante, biología de las citosinas y genética humana han incrementado el conocimiento de las enfermedades inmu- nitarias. Con estos avances, han madurado y aumentado las aplicaciones de los análisis de laboratorio relacionados con trastornos inmunitarios. Por lo tanto, el objetivo de estos estudios ahora se extiende a una gran variedad de disciplinas como el trasplante de órganos, la reumatología, la oncología, la dermatología, la infectología, la alergología y la inmunolo- gía. El objetivo de estas pruebas es sustentar los diagnósticos y la monitorización de pacientes con trastornos inmunitarios. Ahora se utilizan muchas tecnologías para valorar aspectos de los anticuerpos y los componentes celulares de la respuesta inmunitaria. En el artículo de Detrick et al. (2015) se muestra una revisión extensa de los sistemas de valoración que se utili- zan en la actualidad en ambientes nosocomiales. A continua- ción se describen ensayos de interés. Ensayos para la evaluación de anticuerpos A. Prueba de inmunoadsorbente ligado a enzimas El enzimoinmunoanálisis (EIA, enzyme immunoassay) es una de las pruebas de laboratorio más populares para monitorizar una variedad de especificidades de anticuerpos. Este método depende de la conjugación de una enzima con un anticuerpo. apter 08_Carroll_4R.indd 147 apter 08_Carroll_4R.indd 147 14/04/16 14/04/16
- 161. 148 SECCIÓN IIInmunología La enzima se detecta buscando la actividad enzimática con su sustrato. Para medir la concentración de anticuerpos, se adhieren antígenos conocidos a una fase sólida (p. ej., una placa de plástico microtitulada) que se incuba con diluciones de anticuerpos, se lava y se incuba de nuevo con una antiin- munoglobulina marcada con una enzima (p. ej., peroxidasa de Armoracia rusticana [rábano picante]). La enzima conjugada a la fracción de detección produce color cuando se agrega el sustrato específico. Entre más antígenos se unan a los anticuer- pos, mayor será la concentración de enzima y la tinción será más notable. En consecuencia, la intensidad de color generada es directamente proporcional a la concentración de anticuer- pos adheridos. Esta prueba serológica se utiliza para detectar anticuerpos en un gran número de enfermedades infeccio- sas, como anticuerpos contra proteínas del VIH en muestras de sangre o anticuerpos contra Treponema pallidum, el orga- nismo causante de la sífilis. Este ensayo se usa con frecuencia para detectar autoanticuerpos presentes en la circulación de pacientes con enfermedades autoinmunitarias sistémicas o de órganos específicos (p. ej., anticuerpos en pacientes con lupus eritematoso sistémico, escleroderma y el síndrome de Sjögren). La prueba tradicional de inmunoadsorbente ligado a enzimas tiene algunas variaciones nuevas, como el ensayo de quimioluminiscencia (CIA, chemiluminescence assay) y los análisis múltiplex basados en partículas. B. Inmunofluorescencia Cuando un anticuerpo es marcado con un tinte fluorescente (p. ej., fluoresceína o rodamina), es posible observar su presen- cia utilizando luz ultravioleta en un microscopio de fluores- cencia. Este sistema puede ser directo o indirecto. En el ensayo de fluorescencia directa, se marca un anticuerpo específico conocido con un tinte fluorescente. Se agrega una muestra con organismos desconocidos a un portaobjetos y se incuba con el anticuerpoespecíficomarcadoconfluoresceína(p.ej.,anticuer- po contra estreptococos). Después se lava la muestra y se ana- liza con un microscopio de fluorescencia. Si la muestra contiene estreptococos, se observará fluorescencia de color verde. En los ensayos de fluorescencia indirecta se utiliza un procedimiento de dos pasos para detectar la presencia de anticuerpos especí- ficos para organismos determinados (como anticuerpos con- tra treponema) en una muestra de suero. Primero se coloca un antígeno conocido (treponema) en un portaobjetos, el cual se incuba con una muestra de suero. Después se remueve la muestra, se lava la laminilla y se agrega una segunda anti-in- munoglobulina macada con fluoresceína. A continuación se lava el portaobjetos y se examina con un microscopio de fluo- rescencia. Si el suero del paciente contenía anticuerpos contra treponema, el organismo se verá de color verde. Este ensayo se ha utilizado para detectar anticuerpos contra ciertos organis- mos (p. ej., T. pallidum) y es el procedimiento estándar para identificar autoanticuerpos en pacientes con enfermedades autoinmunitarias (p. ej., anticuerpos antinucleares). C. Inmunotransferencia Western La inmunotransferencia Western se utiliza para identifi- car un antígeno en una mezcla compleja de proteínas. Ésta (p. ej., microorganismos) se analiza mediante el método de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis)-dodecilsulfato de sodio (SDS, sodium dode- cyl sulfate). Con este procedimiento se separan las proteínas en un gel según su carga y su peso molecular. Después se cubre el gel con una membrana (por ejemplo de nitrocelulosa) para transferir las proteínas a ella. La membrana, que ahora con- tiene las proteínas separadas, se incuba con una muestra de suero. Si éste contiene un anticuerpo específico que reacciona con una proteína de la membrana, el anticuerpo permanecerá en la nitrocelulosa. A continuación se incuba la membrana con una antiinmunoglobulina marcada con una enzima. Después se lava la membrana y se incuba nuevamente con el sustrato de la enzima. La mezcla que contiene la enzima y su sustrato permite la detección colorimétrica. El complejo antígeno-an- ticuerpo es visible como una banda separada. Este método se utiliza mucho como prueba secundaria para diagnosticar la enfermedad de Lyme y detectar al HCV. En la actualidad esta tecnología se aplica para identificar autoanticuerpos en enfer- medades autoinmunitarias específicas (p. ej., polimiositis). Algunas variaciones de este método son los ensayos de hibri- dación dot o slot blot, los cuales utilizan antígenos purificados que se adhieren a una membrana de nitrocelulosa. D. Otros estudios de laboratorio Otros estudios de laboratorio a menudo disponibles son la electroforesis de proteínas y la electroforesis por inmunofija- ción, exámenes esenciales para identificar la producción irre- gular de inmunoglobulinas en el suero o la orina de pacientes con mieloma. La nefelometría es otra prueba de laboratorio que cuantifica una amplia variedad de análitos en el suero o en el plasma. Éste es el método de elección para cuantificar los componentes del complemento, las inmunoglobulinas y otros analitos séricos. Estos ensayos también se utilizan para valo- rar otras irregularidades relacionadas con estas infecciones específicas (p. ej., el HCV puede relacionarse con una proteína monoclonal y la presencia de crioglobulinas). Evaluación de respuestas celulares A. Citometría de flujo La citometría de flujo es un método basado en láser que se uti- liza para analizar células y sus componentes particulares. Una de las aplicaciones más populares de este método es la deter- minación del inmunofenotipo de poblaciones celulares. En este método se hacen fluir suspensiones con una sola célula a través de una celda de flujo en la que las células pasan por un láser y son detectadas por la luz que dispersan. Si las células también contienen moléculas fluorescentes, esto se revelará. La luz dispersada y la fluorescencia se registran y analizan para identificar subpoblaciones en la muestra. Es relativamente fácil separar las células en clases mayores; los linfocitos, que son pequeños, se aíslan de los granulocitos, que son más grandes y contienen más gránulos (y que por lo tanto disipan más la luz). Una segunda manera de analizar estas células es evaluar moléculas de su superficie marcadas con tintes fluorescentes. Se usa la nomenclatura de los conglomerados de diferenciación (CD). En la actualidad se han identificado más de 300 CD. Hay disponibles anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD que apter 08_Carroll_4R.indd 148 apter 08_Carroll_4R.indd 148 14/04/16 14/04/16
- 162. CAPÍTULO 8 Inmunología149 pueden etiquetarse con marcas fluorescentes. La incubación de células con una variedad de anticuerpos contra CD marcados permite el análisis de distintas poblaciones de células en una muestra mediante citometría de flujo. Al utilizar este método es posible identificar células CD4, CD8, linfocitos B, macró- fagos y células que expresan una variedad de citosinas. Esta tecnología se utiliza con frecuencia en laboratorios clínicos y en la investigación biomédica (p. ej., para cuantificar linfocitos T CD4+ en pacientes VIH positivos o para distinguir células cancerígenas de leucocitos normales). B. Ensayos de función celular Para evaluar el funcionamiento de los linfocitos T in vitro, se analiza la capacidad de las células para proliferar o producir citosinas específicas, como el IFN-γ. Este ensayo es la con- traparte in vitro de las reacciones de hipersensibilidad tipo IV, donde se utilizan las pruebas cutáneas para TB como modelo. En la piel, el antígeno contra TB administrado interactúa con linfocitos T específicos y los hace proliferar, producir IFN-γ y generar una reacción positiva. En este ensayo in vitro, se incu- ban leucocitos de sangre periférica (PBL, peripheral blood leukocytes) con un antígeno específico durante 24 a 72 h. Cuando los linfocitos T sensibilizados de manera específica interactúan con su antígeno particular (p. ej., antígeno con- tra TB), proliferan y producen IFN-γ. La proliferación se mide por la incorporación de timidina H3 o por la monitorización de IFN-γ mediante EIA o citometría de flujo. Este ensayo se utiliza también para valorar el estado inmunitario de un indi- viduo, en particular de pacientes inmunocomprometidos por una enfermedad infecciosa, un proceso cancerígeno o terapia farmacológica. RESUMEN DEL CAPÍTULO • La inmunidad innata es una respuesta inmediata y no específica contra un patógeno. Los componentes de esta reacción son los fagocitos (macrófagos y neutrófilos), los linfocitos NK, los TLR, las citosinas y el sistema del complemento. • La fagocitosis es una respuesta inmunitaria que detecta y destruye patógenos. El proceso incluye los siguientes pasos: quimiotaxia, migración, ingestión y eliminación de microbios. • La inmunidad adaptativa es un proceso de la respuesta inmunitaria que tiene una elevada especificidad, memo- ria inmunológica y responde con rapidez y de forma contundente a una exposición secundaria a antígenos. Involucra respuestas inmunitarias mediadas por células o anticuerpos. • La presentación de antígenos es un proceso fundamental de la inmunidad adaptativa. Proteínas de antígenos exóge- nos son procesadas por las APC y después son expuestas en la superficie celular en complejos MHC clase II-péptido. Éstos son reconocidos por TCR localizados en linfocitos T CD4+ . La molécula CD4 actúa como correceptor. Es nece- saria una segunda señal para la activación de los linfocitos T, que deriva de la interacción entre el CD80 de la APC y el CD28 del linfocito T; éstos proliferan y se diferencian en linfocitos T efectores. Los antígenos endógenos son proce- sados por las APC mediante complejos MHC clase I-pép- tido. Éstos son reconocidos por TCR de linfocitos T CD8+ . • Producción de anticuerpos: los linfocitos B reordenan sus genes de inmunoglobulinas y expresan un receptor de antígenos (BCR). Cuando el antígeno interactúa con el BCR, se estimula la división del linfocito B para que forme un clon. El linfocito B se transforma en un plasmocito secretor de anticuerpos o en un linfocito B de memoria. • Funciones de los anticuerpos: un anticuerpo tiene diver- sas funciones protectoras. Puede potenciar la fagocitosis, inducir la neutralización de virus y toxinas bacterianas y participar en la lisis mediada por el complemento y la ADCC. • Funciones de los linfocitos T: 1) Los linfocitos T CD4+ pueden transformarse en células Th1, Th2, Th17 y T reg. Las primeras producen citosinas (IL-2 e IFN-γ), activan macrófagos o promueven que los linfocitos B produzcan IgG. Los linfocitos Th2 activan a los mastocitos y a los eosinófilos, y promueven que los linfocitos B produzcan IgE. Los linfocitos Th17 producen IL-17, la cual induce la formación de IL-8 y el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos. Los linfocitos T reg producen TGF-β e IL-10, moléculas que suprimen respuestas inmunitarias y 2) los linfocitos T CD8+ funcionan como linfocitos T citotóxicos. • Sistema del complemento: hay tres vías principales para la activación del complemento: la clásica, la alternativa y la de la lectina fijadora de manosa. Cada una de ellas resulta en la formación del MAC, que se encarga de la lisis de células. El complemento proporciona protección con- tra patógenos mediante cuatro mecanismos: 1) citólisis, 2) quimiotaxia, 3) opsonización y 4) vasodilatación y per- meabilidad vascular. • Las citosinas son potentes moléculas de bajo peso mo- lecular que regulan el comportamiento celular. Las produ- cen numerosas células de forma transitoria y local, como los macrófagos, las células dendríticas y los linfocitos NK, T y B. Los IFN son potentes moléculas inmunorregulado- ras que actúan contra los virus. • Reacciones de hipersensibilidad: ° Tipo I, inmediata: el alérgeno induce la producción de IgE, que se unen a los mastocitos y a los eosinófilos a través de los receptores de la porción Fc. Después una segunda exposición a un antígeno, la IgE fija forma puentes cruzados, lo cual induce la liberación de los mediadores contenidos en los gránulos, en especial histamina. ° Tipo II: antígenos de una superficie celular se combi- nan con anticuerpos, lo cual induce lisis mediada por el complemento (p. ej., en transfusiones o reacciones por el factor Rh) u otro daño citotóxico de la mem- brana (p. ej., anemia hemolítica autoinmunitaria). ° Tipo III, complejo inmunitario: complejos inmunita- rios antígeno-anticuerpo se depositan en los tejidos, se activa el complemento y se atraen linfocitos PMN al sitio, que provocan daño hístico. ° Tipo IV, tardía: es una reacción mediada por los lin- focitos T, en la cual estas células son sensibilizadas apter 08_Carroll_4R.indd 149 apter 08_Carroll_4R.indd 149 14/04/16 14/04/16
- 163. 150 SECCIÓN IIInmunología por un antígeno y liberan citosinas cuando ocurre un segundo contacto con el mismo antígeno. Las citosinas inducen inflamación y activan los macrófagos. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. La clase de inmunoglobulina que con mayor frecuencia inhibe bacterias presentes en superficies mucosas es: (A) IgG (B) IgM (C) IgA (D) IgE (E) IgD 2. En la respuesta inmunitaria innata, ¿qué células participan en la fagocitosis? (A) Macrófagos y mastocitos (B) Macrófagos y plasmocitos (C) Linfocitos NK y neutrófilos (D) Macrófagos y neutrófilos (E) Linfocitos T y mastocitos 3. ¿Cuál de las siguientes citosinas atrae neutrófilos e inhibe bacterias? (A) IFN-γ (B) IL-8 (C) IL-2 (D) IL-6 (E) TGF-β 4. ¿Las moléculas de MHC clase II son fundamentales para cuál de los siguientes procesos inmunológicos? (A) Presentación de antígenos (B) Fagocitosis (C) Cambio de la clase de inmunoglobulina (D) Citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ (E) Opsonización 5. ¿Las moléculas de MHC clase I son fundamentales para cuál de los siguientes procesos inmunológicos? (A) Liberación de histamina mediada por IgE (B) Fagocitosis (C) Cambio de la clase de inmunoglobulina (D) Citotoxicidad de los linfocitos T CD8+ (E) Opsonización 6. ¿La respuesta del hospedador a la interacción entre un patógeno y su TLR especifico genera cuál de los siguientes eventos? (A) Producción de IgG (B) Activación de células y producción de citosinas y quimio- cinas (C) Cambio de la clase de inmunoglobulina (D) Fagocitosis (E) Presentación de patógenos a los linfocitos T cooperadores 7. En la respuesta inmunitaria innata, ¿qué célula mata a células infectadas por virus? (A) Linfocito T (B) Linfocito NK (C) Macrófago (D) Neutrófilo (E) Linfocito B 8. ¿La interacción entre dos moléculas de IgG que se unen a un antí- geno, seguida de la unión de C1 a la porción Fc del anticuerpo resulta en cuál de los siguientes eventos? (A) Inicio de la presentación de antígenos (B) Inicio de la vía clásica del complemento (C) Inicio de la vía alternativa del complemento (D) Inicio de la vía de la lectina fijadora de manosa 9. ¿Cuál de las siguientes opciones es una característica de la res- puesta inmunitaria adaptativa y no de la respuesta innata? (A) Barreras físicas (B) Barreras químicas (C) Expansión clonal de células efectoras (D) Mediadores inflamatorios (E) Fagocitosis 10. ¿Cuál de los siguientes mecanismos genéticos genera anticuerpos de la misma especificidad pero de diferente clase? (A) Recombinación del segmento génico V (B) Cambio de clase (C) Hipermutación somática (D) Variabilidad debida a unión imprecisa de V, D y J (E) Duplicación de genes, p. ej., múltiples segmentos de los genes V, D y J 11. ¿Qué anticuerpo tiene la capacidad de cruzar la placenta? (A) IgG (B) IgA (C) IgM (D) IgE (E) IgD 12. Un varón en la segunda década de la vida se presenta al servicio de urgencias con disnea y fatiga. Dos días antes se le administró penicilina para tratar una infección. Antes había recibido este fármaco sin complicaciones y refirió no ser alérgico a la penici- lina. Los exámenes de laboratorio muestran que hay anticuerpos contra la penicilina en el suero del paciente que están lisando sus propios eritrocitos. Se le diagnostica anemia hemolítica inmu- nitaria. ¿Qué tipo de reacción de hipersensibilidad presenta el paciente? (A) Tipo I (B) Tipo II (C) Tipo III (D) Tipo IV (DTH) 13. ¿Cuál de las siguientes células expresa receptores de IgE en su superficie, que estimulan una respuesta contra gusanos para- sitarios? (A) Linfocito T (B) Linfocito B (C) Linfocito NK (D) Mastocito (E) Célula dendrítica 14. Los linfocitos NK expresan receptores similares a inmunoglobu- lina de linfocitos citolíticos (KIR), que reconocen a: (A) Moléculas de MHC clase I (B) Moléculas de adhesión celular (C) Glucofosfolípidos (D) moléculas CD40 15. ¿Antes del cambio de clase, todos los linfocitos B unidos a antí- genos tienen cuál de las siguientes clases de anticuerpos en su superficie? (A) IgA (B) IgG (C) IgM (D) IgE 16. ¿La liberación de histamina mediada por IgE se clasifica como qué tipo de reacción de hipersensibilidad? (A) Tipo I (B) Tipo II apter 08_Carroll_4R.indd 150 apter 08_Carroll_4R.indd 150 14/04/16 14/04/16
- 164. CAPÍTULO 8 Inmunología151 (C) Tipo III (D) Tipo IV 17. ¿Una célula infectada produce los interferones α y β por la inte- racción del ácido nucleico del virus con cuál de las siguientes moléculas? (A) C3 (tercer componente del complemento) (B) Defensinas (C) Vía de los TLR (D) IL-12 18. ¿Qué citosinas tienen funciones importantes en la atracción de neutrófilos al sitio de una infección? (A) IFN-α e IFN-γ (B) IL-8 e IL-17 (C) IL-2 e IL-4 (D) IL-6 e IL-12 19. ¿Cuál de los siguientes ensayos de laboratorio se considera con- traparte in vitro de las reacciones de hipersensibilidad tipo IV observadas en las pruebas cutáneas para TB? (A) Inmunotransferencia Western para el antígeno TB (B) Análisis EIA del suero de un paciente con TB (C) Ensayo de inmunofluorescencia para el anticuerpo TB (D) Producción de IFN-γ por parte de leucocitos tratados con el antígeno TB 20. ¿Cuál de los siguientes estudios de laboratorio puede utilizarse para detectar el número y los tipos de células inmunitarias en muestras de sangre periférica? (A) Electroforesis por inmunofijación (B) EIA (C) Citometría de flujo (D) Inmunotransferencia Western Respuestas 1. C 2. D 3. B 4. A 5. D 6. B 7. B 8. B 9. C 10. B 11. A 12. B 13. D 14. A 15. C 16. A 17. C 18. B 19. D 20. C BIBLIOGRAFÍA Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S: Cellular and Molecular Immunol- ogy, 8a. ed. Saunders Elsevier, 2014. Detrick B, Schmitz J, Hamilton RG: Manual of Molecular and Clini- cal Laboratory Immunology, 8a. ed. ASM Press, 2015. Murphy K, Travers P, Wolport M: Janeway’s Immunobiology, 8a. ed. Garland Science, 2012. Nairn R, Helbert M: Immunology for Medical Students, 2a. ed. Mosby/Elsevier, 2007. O’Gorman MRG, Donnenberg AD: Handbook of Human Immunol- ogy, 2a. ed. CRC Press, 2008. Paul WE (editor): Fundamental Immunology, 7a. ed. Lippincott Wil- liams & Wilkins, 2012. apter 08_Carroll_4R.indd 151 apter 08_Carroll_4R.indd 151 14/04/16 14/04/16
- 165. apter 08_Carroll_4R.indd 152 apter08_Carroll_4R.indd 152 14/04/16 14/04/16
- 166. 153 9 Patogenia de lainfección bacteriana C A P Í T U L O La patogenia de la infección bacteriana comprende el comienzo del proceso infeccioso y los mecanismos que provocan la apari- ción de los signos y síntomas de la enfermedad. En este capítulo se describen los factores bioquímicos, estructurales y genéti- cos que contribuyen más a la patogenia bacteriana, pero también se pueden consultar en las secciones sobre cada microorganis- mo. Algunas de las características de las bacterias patógenas son transmisibilidad, adhesión a las células hospedadoras, persis- tencia, invasión de las células y tejidos hospedadores, toxigenici- dad y capacidad para evadir o sobrevivir al sistema inmunitario del hospedador. La resistencia a los antimicrobianos y desin- fectantes también contribuye a la virulencia, o a la capacidad que tiene cada microorganismo para producir una enfermedad. Muchas infecciones producidas por bacterias que suelen consi- derarse patógenas permanecen ocultas o son asintomáticas. La enfermedad ocurre cuando la bacteria o las reacciones inmuni- tarias que se desencadenan por su presencia dañan lo suficiente a la persona. Los términos que se utilizan con frecuencia para describir una serie de aspectos de la patogenia se definen en el glosario (véase más adelante). Consúltese el glosario del capítulo 8 para obtener definiciones de los términos utilizados en inmunología y para describir los aspectos relacionados con la respuesta del hos- pedador ante la infección. SECCIÓN III BACTERIOLOGÍA GLOSARIO Adhesión (adherencia, unión): proceso por medio del cual las bacterias se unen a las superficies de las células hospedadoras. Una vez que las bacterias penetran en el organismo,elpasoprincipalenlaevolucióndelainfección es la adhesión. Los términos adherencia, adhesión y unión se utilizan en forma indistinta. Portador: persona o animal con una infección asintomática que puede transmitir a otra persona o animal susceptible. Infección: multiplicación de un microorganismo infeccioso dentro del organismo. La multiplicación de las bacterias que forman parte de la microbiota normal del tubo digestivo, piel, etc., no suele considerarse infección; por otro lado, la multiplicación de las bacterias patógenas (p. ej., especies de Salmonella), incluso cuando la persona se encuentra asintomática, se considera infección. Invasión: proceso a través del cual las bacterias, parásitos animales, hongos y virus penetran en las células o tejidos del hospedador y se diseminan dentro del organismo. Microbiota: flora microbiana que habita en las personas sanas. No patógenos: un microorganismo que no es patógeno también puede formar parte de la microbiota normal. Patógeno oportunista: microorganismo con el potencial de producir una enfermedad sólo cuando la resistencia del hospedador es deficiente (p. ej., cuando el paciente se encuentra “inmunodeprimido”). Patógeno: microorganismo que puede causar una enfer- medad. Patogenicidad: potencial de un microorganismo infeccioso de producir una enfermedad (véase también virulencia). Superantígenos: toxinasformadasporproteínasqueactivan el sistema inmunitario fijándose al complejo mayor de his- tocompatibilidad (MHC, major histocompatibility complex) y los receptores de linfocitos T (TCR, T-cell receptors) y que estimulan a un gran número de linfocitos T para que pro- duzcan cantidades masivas de citocinas. apter 09_Carroll_4R.indd 153 apter 09_Carroll_4R.indd 153 14/04/16 14/04/16
- 167. 154 SECCIÓN IIIBacteriología Toxigenicidad: potencial de un microorganismo de produ- cir una toxina que contribuye a la enfermedad. Virulencia: potencial cuantitativo de un microorganismo de producir una enfermedad. Los microorganismos viru- IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS QUE CAUSAN ENFERMEDADES Los seres humanos y los animales poseen una microbiota nor- malabundantequenosuelegenerarenfermedades(capítulo10), pero que logra un equilibrio que garantiza la supervivencia, el crecimiento y la propagación tanto de las bacterias como del hospedador. Algunas bacterias que son causas importantes de diversas enfermedades se obtienen con el cultivo de la micro- biota normal (p. ej., Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus). Algunas veces existen bacterias que son claramente patógenas (p. ej., el serotipo Typhy de la Salmonella), pero la infección permanece latente o subclínica y el hospedador es un “portador” de la bacteria. Otras veces es difícil demostrar que una especie bacteriana específica constituye la causa de determinada enfermedad. En 1884, Robert Koch propuso una serie de postulados que se han aplicado de manera extensa con el fin de vincular una serie de especies de bacterias con determinadas enfermedades. En el cuadro 9-1 se resumen los postulados de Koch. Los postulados de Koch siguen siendo un pilar de la microbiología; sin embargo, desde finales del siglo xix, se ha demostrado que muchos microorganismos que no satisfacen los criterios de estos postulados también causan enfermedades. Por ejemplo, Treponema pallidum (sífilis) y Mycobacterium leprae (lepra) no se pueden cultivar in vitro; no obstante, exis- ten modelos animales de infección con estos microorganismos. lentos generan la enfermedad cuando un pequeño nú- mero se introduce en el organismo. La virulencia abarca adhesión, persistencia, invasión y toxigenicidad (véase antes). CUADRO 91 Postulados para establecer las causas de las infecciones Postulados de Koch Postulados moleculares de Koch Postulados moleculares para establecer la causa microbiana de una enfermedad 1. El microorganismo se debe encontrar en todos los casos de la enfermedad en cuestión y su distribución en el organismo debe concordar con las lesiones observadas. 2. El microorganismo se debe cultivar in vitro (o fuera del cuerpo del hospedador) durante varias generaciones. 3. Cuando este tipo de cultivo puro se inocula en un animal susceptible, debe causar la enfermedad típica. 4. El microorganismo se debe aislar de nuevo a partir de las lesiones de las enfermedades producidas en forma experimental. 1. El fenotipo o propiedad investigada debe tener una relación estrecha con las cepas patógenas de la especie y no con las cepas no patógenas. 2. La inactivación específica del gen o genes vinculados con el rasgo de virulencia sospechado debe provocar una reducción medible de la patogenicidad o virulencia. 3. La inversión o sustitución del gen mutado con un gen natural debe restablecer la patogenicidad o virulencia. 1. En la mayoría de los casos de una infección debe existir una secuencia de ácidos nucleicos del supuesto microorganismo patógeno y de preferencia en los sitios anatómicos donde son evidentes los datos patológicos. 2. En la mayoría de los testigos sanos que participan, no debe haber secuencia de ácidos nucleicos del supuesto patógeno. Si se identifica la secuencia en controles sanos, su prevalencia debe ser menor que en los pacientes con la infección y con un menor número de copias. 3. El número de copias de la secuencia de ácido nucleico del supuesto microorganismo patógeno debe disminuir o ser indetectable una vez que se resuelve la enfermedad (p. ej., con tratamiento efectivo) y debe aumentar cuando la infección recurre o se produce una recaída. 4. La presencia de una secuencia de ácidos nucleicos vinculada a un microorganismo patógeno en personas sanas debe ayudar a pronosticar el desarrollo ulterior de la enfermedad. 5. La naturaleza del microorganismo patógeno inferida a partir del análisis de la secuencia de ácidos nucleicos debe concordar con las características biológicas conocidas de otros microorganismos afines y con la naturaleza de la enfermedad. La importancia de una secuencia microbiana detectada aumenta cuando el genotipo microbiano pronostica la morfología microbiana, patología, características clínicas de la enfermedad y respuesta del hospedador. Otro ejemplo es la infección por Neisseria gonorrhoeae (gono- rrea) aunque la bacteria se puede cultivar con facilidad in vitro; también se ha producido infección experimental en seres humanos, que sustituye al modelo animal. En otros casos, los postulados de Koch se han cumplido cuando menos parcialmente al demostrar patogenicidad bacte- riana en un modelo de infección in vitro en lugar de un modelo animal. Por ejemplo, algunas variedades de diarrea inducida por Escherichia coli (capítulo 15) se han definido por la interac- ción del E. coli con células del hospedador en cultivo. Al investigar a determinado microorganismo como posi- ble causa de una enfermedad, también es importante tomar en consideración las respuestas inmunitarias del hospedador. Por consiguiente, la elevación de un anticuerpo específico durante la recuperación de una enfermedad, constituye un comple- mento importante de los postulados de Koch. La genética microbiana moderna ha abierto nuevas fronte- ras para estudiar a las bacterias patógenas y distinguirlas de las no patógenas. La clonación molecular ha permitido a los inves- tigadores aislar y modificar genes específicos de virulencia y estudiarlos con modelos de infección. Gracias al estudio de los genes vinculados con la virulencia se han propuesto los postu- lados moleculares de Koch. Estos postulados se resumen en el cuadro 9-1. Algunos microorganismos patógenos son difíciles o impo- sibles de cultivar y por esta razón no es posible establecer la causadelaenfermedadquegeneranpormediodelospostulados apter 09_Carroll_4R.indd 154 apter 09_Carroll_4R.indd 154 14/04/16 14/04/16
- 168. CAPÍTULO 9 Patogeniade la infección bacteriana 155 de Koch o los postulados moleculares de Koch. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) se utiliza para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos espe- cíficas de cada microorganismo a partir de los tejidos o líquidos del hospedador. Estas secuencias se utilizan para identificar a los microorganismos causales. En el cuadro 9-1 se enumeran los postulados moleculares para establecer la causa de una enfer- medad microbiana. Este método se ha utilizado para establecer la causa de diversas enfermedades como la enfermedad de Whi- pple (Tropheryma whipplei), angiomatosis bacilar (Bartonella henselae), ehrlichiosis monocítica humana (Ehrlichia chaffeen- sis), síndrome pulmonar por hantavirus (virus Sin Nombre) y sarcoma de Kaposi (herpesvirus humano 8). El análisis de la infección y la enfermedad aplicando una serie de normas como los postulados de Koch, permite clasi- ficar a las bacterias en patógenas, patógenas oportunistas o no patógenas. Algunas especies de bacterias siempre se con- sideran patógenas y su presencia es anormal; dos ejemplos de esto son Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) y Yersinia pestis (peste). Estas bacterias cumplen con facilidad los pos- tulados de Koch. Otras especies que a menudo forman parte de la microbiota normal de los seres humanos (y animales) también producen enfermedades con frecuencia. Por ejemplo, E. coli forma parte de la microbiota digestiva de los seres hu- manos sanos, pero también constituye una causa frecuente de infecciones urinarias, diarrea del turista y otras enfermedades. Las cepas de E. coli que causan enfermedades se distinguen de las que no lo hacen al establecer: 1) si son virulentas en mode- los animales o modelos in vitro y 2) si tienen una composi- ción genética ligada a la generación de enfermedades. Otras bacterias (p. ej., especies de Pseudomonas, Stenotrophomonas maltophilia y levaduras y mohos) sólo causan enfermedad en personas inmunodeprimidas y débiles, por lo que son patóge- nos oportunistas. TRANSMISIÓN DE LA INFECCIÓN Las bacterias (y otros microorganismos) se adaptan a diversos ambientes que comprenden fuentes externas como tierra, agua y materia orgánica o fuentes internas encontradas dentro de los insectos vectores, animales y seres humanos, donde por lo general habitan y subsisten. Al hacerlo, las bacterias aseguran su supervivencia y aumentan la probabilidad de transmisión. Al producir una infección asintomática o enfermedad leve, en lugar de la muerte del hospedador, los microorganismos que habitan normalmente en las personas aumentan la probabili- dad de transmisión de una persona a otra. Algunas bacterias que con frecuencia causan enfermeda- des en los seres humanos, existen principalmente en animales e infectan de manera incidental al ser humano. Por ejemplo, algunas especies de Salmonella y Campylobacter infectan a los animales y son transmitidas en productos alimenticios al ser humano. Otras bacterias generan infecciones en los seres humanos de manera involuntaria, un error en el ciclo vital nor- mal del microorganismo; éstos no se han adaptado a las per- sonas y la enfermedad que generan en ocasiones es grave. Por ejemplo, Y. pestis (peste) tiene un ciclo vital bien establecido en los roedores y pulgas de roedores y su transmisión a través de las pulgas a los seres humanos es involuntaria; Bacillus anthra- cis (carbunco) vive en el medio ambiente; en ocasiones infecta a los animales y se transmite a los seres humanos a través de cier- tos productos como pelo natural de animales infectados. Las especies de Clostridium se encuentran en el medio ambiente y se transmiten al ser humano a través de su ingestión (p. ej., gas- troenteritis por C. perfringens y C. botulinum [botulismo]) o cuando las heridas se contaminan con tierra (p. ej., C. perfrin- gens [gangrena gaseosa] y C. tetani [tétanos]). Tanto Bacillus anthracis como las especies de Clostridium, elaboran esporas para proteger el ácido nucleico del microorganismo de diver- sos factores ambientales nocivos como la luz ultravioleta, la desecación, los detergentes químicos y los pH extremos. Estas esporas garantizan la supervivencia en ambientes externos, incluidos los alimentos que ingiere el ser humano. Después de ser ingeridas o inoculadas, las esporas germinan para for- mar una estructura vegetativa y metabólicamente activa del microorganismo patógeno. Las manifestaciones clínicas de las enfermedades (p. ej., diarrea, tos, secreción genital) producidas por los microorga- nismos, a menudo facilitan su transmisión. Algunos ejemplos de síndromes clínicos y la manera como facilitan la transmi- sión de la bacteria causal son los siguientes: Vibrio cholerae pro- voca diarrea abundante que contamina el agua salada y el agua dulce; el agua potable o los mariscos como ostiones y cangrejos también se contaminan; al consumir agua o mariscos conta- minados la persona se infecta y enferma. Asimismo, la con- taminación de los productos alimenticios con aguas residuales que contienen E. coli que provoca diarrea, tiene como resultado la transmisión de las bacterias. M. tuberculosis (tuberculosis) infecta de manera natural sólo al ser humano; causa una enfer- medad respiratoria con tos y producción de aerosoles, lo que provoca la transmisión de la bacteria de persona a persona. Muchas bacterias se transmiten de persona a persona a través de las manos. El individuo con S. aureus en las narinas se frota la nariz, recoge los estafilococos en las manos y dise- mina las bacterias hacia otras partes del cuerpo o a otra per- sona, donde genera una infección. Muchos microorganismos patógenos oportunistas que causan infecciones hospitalarias se transmiten de un paciente a otro a través de las manos del personal que trabaja en el hospital. Por lo tanto, el hecho de lavarse las manos constituye un componente importante en el control de infecciones. Las vías de entrada de bacterias patógenas al cuerpo más frecuentes son los sitios donde las mucosas se unen con la piel, p. ej., aparato respiratorio (vías respiratorias superiores e infe- riores), tubo digestivo (principalmente la boca), aparato genital y urinario. Las áreas anormales de mucosas y piel (p. ej., lace- raciones, quemaduras y otras lesiones) también constituyen sitios frecuentes de entrada. La piel y mucosas íntegras propor- cionan la defensa principal contra la infección. Para producir una enfermedad, los microorganismos patógenos deben vencer estas barreras. PROCESO INFECCIOSO En el organismo, la mayor parte de las bacterias que generan enfermedades lo hacen al adherirse a las células del hospedador, apter 09_Carroll_4R.indd 155 apter 09_Carroll_4R.indd 155 14/04/16 14/04/16
- 169. 156 SECCIÓN IIIBacteriología CUADRO 92 Ejemplos de factores de virulencia codificados por los genes en elementos genéticos móviles Género/especie Factor de virulencia y enfermedad Codificados por plásmidos Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli y especies de Shigella Bacillus anthracis Enterotoxinas termolábiles y termoestables que causan diarrea Hemolisina (citotoxina) de enfermedades invasoras e infecciones urinarias Factores de adhesión y productos genéticos que participan en la invasión de la mucosa Cápsula indispensable para la virulencia (en un plásmido) Factor de edema, factor mortal, antígeno protector, todos indispensables para la virulencia (en otro plásmido) Codificados por fagos Clostridium botulinum Corynebacterium diphtheriae Vibrio cholerae Toxina de botulismo que causa parálisis Toxina diftérica que inhibe la síntesis de proteínas humanas Tóxina del cólera que causa diarrea líquida abundante que casi siempre son epiteliales. Una vez que las bacterias han establecido un sitio primario de infección, se multipli- can y diseminan directamente a través de los tejidos o por el sistema linfático hasta el torrente sanguíneo. Esta infección (bacteriemia) puede ser transitoria o persistente. La bacterie- mia permite la diseminación de las bacterias en el organismo hasta llegar a los tejidos que son en especial adecuados para su multiplicación. Un ejemplo del proceso infeccioso es la neumonía neu- mocócica. Es posible aislar S. penumoniae a partir de la nasofaringe de 5 a 40% de las personas sanas. En ocasiones, se aspiran neumococos desde la nasofaringe hacia los pulmo- nes; esta aspiración es más frecuente en individuos debilitados y en determinadas circunstancias como el coma, cuando los reflejos normales del vómito y la tos se encuentran atenuados. La infección empieza en los espacios aéreos terminales de los pulmones, en personas que carecen de anticuerpos protecto- res contra el polisacárido capsular. La multiplicación de los neumococos con la inflamación resultante genera neumonía. Los neumococos penetran en los linfáticos de los pulmones y de ahí pasan al torrente sanguíneo. Entre 10 y 20% de las per- sonas con neumonía neumocócica manifiesta bacteriemia en el momento en el que se establece el diagnóstico. Cuando se produce la bacteriemia, los neumococos pueden diseminarse a sitios secundarios (p. ej., líquido cefalorraquídeo, válvulas car- diacas y espacios articulares). Las complicaciones principales de la neumonía neumocócica son meningitis, artritis séptica y rara vez endocarditis. En el cólera, el proceso infeccioso comprende la ingestión de V. cholerae, la quimiotaxia de la bacteria hacia el epitelio intestinal, su movilidad por medio de un solo flagelo polar y su penetración a la capa mucosa de la superficie intestinal. La adhesión de V. cholerae a las células epiteliales es controlada por pilosidades y quizá otras adhesinas. La producción de la toxina del cólera provoca la salida de cloruro y agua hacia la luz intestinal, lo que genera diarrea y desequilibrio electrolítico. GENÓMICA Y PATOGENICIDAD BACTERIANA Las bacterias son haploides (capítulo 7) y tienen interacciones genéticas limitadas que pueden cambiar sus cromosomas y posiblemente modificar su adaptación y supervivencia a deter- minados entornos ambientales. Un resultado importante de la conservación de los genes cromosómicos en las bacterias es que son clonales. Muchos de los microorganismos patógenos tienen unos cuantos tipos clonales diseminados en el mundo durante determinado periodo. Por ejemplo, la meningitis meningocó- cica epidémica del serogrupo A existe en Asia, Medio Oriente y África, y en ocasiones se extiende hasta el norte de Europa y América. En diversas ocasiones, a lo largo de varias décadas, se ha observado un solo tipo clonal de Neisseria meningitidis sero- grupo A en un área geográfica que se extiende posteriormente hacia otras y de esta manera genera una epidemia. Existen dos tipos clonales de Bordetella pertussis y ambos son patógenos. Sin embargo, existen mecanismos que las bacterias utilizan o han utilizado durante largo tiempo en el pasado, para transmi- tir genes de virulencia de una a otra. Elementos genéticos móviles Algunos de los mecanismos principales para el intercambio de información genética entre las bacterias son la transformación natural y los elementos genéticos móviles transmisibles como plásmidos, transposones y bacteriófagos (a menudo llamados “fagos”).Latransformaciónocurrecuandoelácidodesoxirribo- nucleico (DNA, deoxyribonucleic acid) de un microorganismo es liberado en el ambiente y tomado por otro microorganis- moquelopuedereconoceryfijaraél.Enotroscasos,losgenesque codifican muchos factores de virulencia bacteriana son trans- portados en los plásmidos, transposones o fagos. Los plásmi- dos son fragmentos extracromosómicos de DNA con potencial para multiplicarse. Los transposones son segmentos altamente móviles de DNA que se desplazan de una parte de éste a otra. El resultado es la recombinación entre el DNA extracromosómico y el cromosómico (recombinación ilegítima o no homóloga; capítulo 7). Cuando se produce esta recombinación, los genes que codifican factores de virulencia se tornan cromosómi- cos.Porúltimo,losvirusbacterianosofagossonotromecanismo por medio del cual se transporta DNA de un microorganis- mo a otro. La transferencia de estos elementos genéticos móvi- les entre miembros de una sola especie o, con menos frecuencia, entre diversas especies, tiene como resultado la transferencia de factores de virulencia, incluidos genes de resistencia anti- microbiana. En el cuadro 9-2 se muestran algunos ejemplos de factores de virulencia codificados por plásmidos y fagos. Islas de patogenicidad Las islas de patogenicidad (PAI, pathogenicity islands) son grandes grupos de genes relacionados con patogenicidad, que se ubican en el cromosoma bacteriano. Son grandes grupos de genes organizados, por lo general de 10 a 200 kb. Las principa- les propiedades de los PAI son las siguientes: poseen uno o más genes de virulencia; aparecen en el genoma de patógenos de unaespecie,masnoenlosmiembrosnopatógenos;songrandes; apter 09_Carroll_4R.indd 156 apter 09_Carroll_4R.indd 156 14/04/16 14/04/16
- 170. CAPÍTULO 9 Patogeniade la infección bacteriana 157 tienen una relación guanina-citosina (G + C) distinta al resto de los genomas bacterianos; suelen estar vinculados con ge- nes de tRNA; a menudo se les encuentra relacionados con ele- mentos genéticos del movimiento; con frecuencia poseen ines- tabilidad genética; y por lo general representan estructuras de mosaico con componentes adquiridos en distintos momentos. En conjunto, las propiedades de los PAI sugieren que se origi- nan a partir de la transferencia genética de una especie ajena. En el cuadro 9-3 se muestran algunos ejemplos de factores de virulencia PAI. REGULACIÓN DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA BACTERIANA Las bacterias patógenas (y otros microorganismos patógenos) se han adaptado a una vida saprófita o libre, quizá a ciertos ambientes fuera del organismo y al hospedador humano. Han creado sistemas complejos de transducción de señales para regular los genes que son importantes para la virulencia. Con frecuencia una serie de señales ambientales regula la expresión de los genes de virulencia. Algunas de las señales más frecuen- tes son la temperatura, la disponibilidad de hierro, la osmo- lalidad, la fase del desarrollo, el pH y determinados iones (p. ej., Ca2+ ) o nutrientes. En los párrafos siguientes se muestran algunos ejemplos. El gen de la toxina diftérica de Corynebacterium diphthe- riae es transportado en bacteriófagos lisogénicos. La toxina es producida sólo por cepas lipogenizadas por los bacteriófagos. La producción de toxina aumenta cuando C. diphtheriae se cultiva en un medio con poco hierro. La expresión de los genes de virulencia de B. pertussis aumenta cuando la bacteria se cultiva a 37 °C y se suprime cuando se cultiva a una temperatura menor o en presencia de una concentración elevada de sulfato de magnesio o ácido nicotínico. Los factores de virulencia de V. cholerae son regulados por numerosos factores ambientales. La expresión de la toxina del cólera es mayor a un pH de 6 que a un pH de 8.5 y también es mayor a una temperatura de 30 °C que a 37 °C. También son importantes la osmolalidad y composición de aminoácidos. Existen hasta 20 genes adicionales de V. chole- rae que se regulan en forma similar. Y. pestis produce una serie de proteínas codificadas por plásmidos de virulencia. Una de éstas es una proteína capsu- lar antifagocítica fracción 1, que genera la función antifagocí- tica. La expresión de esta proteína es mayor entre 35 y 37 °C, la temperatura del hospedador, y menor entre 20 y 28 °C, que es la temperatura de la pulga en la que no se necesita actividad antifagocítica. La regulación de otros factores de virulencia en las especies de Yersinia también está influenciada por factores ambientales. La movilidad de las bacterias les permite diseminarse y multiplicarse en sus entornos ambientales o en los pacientes. Yersinia enterocolitica y Listeria monocytogenes son frecuentes en el ambiente, donde la movilidad es importante para ellas. Supuestamente, la motilidad no es importante en la patogenia de las enfermedades causadas por estas bacterias. Yersinia ente- rocolitica es móvil cuando se cultiva a 25 °C, pero no a 37 °C. De igual forma, Listeria es móvil cuando se cultiva a 25 °C pero prácticamente es inmóvil a 37 °C. FACTORES DE VIRULENCIA BACTERIANA Muchosfactoresdeterminanlavirulenciabacterianaoelpoten- cial de las bacterias para causar infecciones y enfermedades. Factores de adhesión Cuando las bacterias penetran en el cuerpo del hospedador, se deben adherir a las células de una superficie hística. Si no se adhiere, es eliminada por el moco y otros líquidos que bañan las superficies de los tejidos. Después de la adhesión, que cons- tituye únicamente un paso en el proceso infeccioso, se forman CUADRO 93 Algunos ejemplos del gran número de islas de patogenicidad de los microorganismos patógenos para el ser humano Género y especie Nombre PAI Características de virulencia Escherichia coli PAII536 II536 Hemolisina alfa, fimbrias, adhesión, en infecciones urinarias Escherichia coli PAIIJ96 Hemolisina alfa, pilosidades P en infecciones urinarias Escherichia coli (EHEC) O157 Toxinas de macrófagos de Escherichia coli enterohemorrágica Salmonella serotipo Typhimurium SPI-1 Invasión y daño de las células hospedadoras; diarrea Yersinia pestis HPI/pgm Genes que aumentan la captación de hierro Vibrio cholerae El TorO1 VPI-1 Neuraminidasa, utilización de aminoazúcares Staphylococcus aureus SCC mec Resistencia a la meticilina y otros antibióticos Staphylococcus aureus SaPI1 Toxina 1 del síndrome de choque tóxico, enterotoxinas Enterococcus faecalis NPm Citolisina, formación de biopelícula PAI, isla de patogenicidad SPI, isla de patogenicidad de Salmonella HPI, isla de alta patogenicidad VPI, isla de patogenicidad de Vibrio SCC, casete cromosómico estafilocócico mec SAPI, isla de patogenicidad de Staphylococcus aureus NP, no proteasa apter 09_Carroll_4R.indd 157 apter 09_Carroll_4R.indd 157 14/04/16 14/04/16
- 171. 158 SECCIÓN IIIBacteriología microcolonias y se llevan a cabo los pasos ulteriores en la pato- genia de la infección. Las interacciones entre las bacterias y las superficies celu- lares de los tejidos durante la adhesión son complejas. Diversos factores desempeñan funciones importantes p. ej., la hidrofobi- cidad de superficie y la carga neta de la superficie, las moléculas de unión en las bacterias (ligandos) y las interacciones de los receptores celulares del hospedador. Con frecuencia las bacte- rias y células hospedadoras poseen una carga neta negativa en la superficie, por lo tanto, las fuerzas electrostáticas se repe- len. Estas fuerzas son vencidas por acciones hidrófobas y otras interacciones más específicas entre la bacteria y la célula hos- pedadora. En general, entre más hidrófoba sea la superficie de la célula bacteriana, mayor es su adhesión a la célula hospeda- dora. Las propiedades hidrófobas de la superficie y el potencial para adherirse a las células hospedadoras varían en las diversas cepas de bacterias de una sola especie. Asimismo, las bacterias poseen moléculas específicas de superficie que interactúan con las células hospedadoras. Muchas bacterias poseen pilosidades, que son apéndices grue- sos similares a bastones o fimbrias, que son estructuras más cortas (parecidas a “pelos”) que se extienden en la superficie de la célula bacteriana y participan en la adhesión de la bacteria a la superficie de las células hospedadoras. Por ejemplo, algunas cepas de E. coli tienen pilosidades tipo 1, que se adhieren a los receptores de las células epiteliales; esta adhesión se puede blo- quear in vitro agregando d-manosa al medio. Las cepas de E. coli que causan infecciones urinarias casi siempre carecen de adhesión controlada por d-manosa, tienen pilosidades P, que se adhieren a una porción del antígeno P del grupo sanguí- neo; la estructura mínima de reconocimiento es el disacárido α-d-galactopiranosil-(1-4)-β-d-galactopiranósido (enlace de adhesión GAL-GAL). La E. coli que produce diarrea (véase el capítulo 15) se adhiere por medio de pilosidades (fimbrias) a las células epiteliales intestinales. Al parecer, el tipo de pilosi- dades y los mecanismos moleculares específicos de la adhesión difieren dependiendo del tipo de E. coli que induce la diarrea. Existen otros mecanismos específicos entre ligando y receptor que han evolucionado para facilitar la adhesión bac- teriana a las células hospedadoras, lo cual ilustra los diversos mecanismos que utilizan las bacterias. El estreptococo del grupo A (Streptococcus pyogenes) (capítulo 14) también posee apéndices similares a pelos llamados fimbrias que se extien- den desde la superficie celular. Las fimbrias contienen ácido lipoteicoico, proteína F y proteína M. El ácido lipoteicoico y la proteína F inducen la adhesión del estreptococo a las células epiteliales bucales; esta adhesión es controlada por la fibronec- tina, que actúa como molécula receptora en la célula del hos- pedador. La proteína M actúa como molécula antifagocítica y constituye uno de los principales factores de virulencia. Los anticuerpos que actúan contra determinados ligan- dos bacterianos que fomentan la adhesión (p. ej., pilosidades y ácido lipoteicoico) pueden bloquear la adhesión a las células hospedadoras y protegen al hospedador contra la infección. Después de la adhesión, se producen cambios de la con- formación de la célula hospedadora que provocan cambios del citoesqueleto que permiten que el microorganismo sea absor- bido por la célula. Algunas veces los cambios de la molécula adhesina después de su fijación, desencadenan la activación de genes de virulencia que fomentan la invasión o que tienen como resultado otros cambios patógenos, como se describirá más adelante. Invasión de las células y tejidos del hospedador El término utilizado por lo regular para describir el ingreso de bacterias a las células hospedadoras y para muchas bacterias que causan enfermedad es invasión. La invasión del epitelio del hospedador es fundamental en el proceso infeccioso. Algunas bacterias (p. ej., especies de Salmonella) invaden tejidos a través de las uniones entre células epiteliales. Otras bacterias (p. ej., especies de Yersinia, N. gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis) invaden tipos específicos de las células epiteliales del hospe- dador y pueden entrar subsecuentemente al tejido. En muchas infecciones, las bacterias producen factores de virulencia que causan que las células del hospedador absorban (ingieran) las bacterias. Las células del hospedador tienen una participación muy activa en el proceso. Cuando penetran la célula hospedadora, las bacterias pueden permanecer encerradas en una vacuola compuesta de la membrana celular del hospedador, o la membrana de la vacuola puede disolverse y las bacterias pueden dispersarse en el citoplasma. Algunas bacterias (p. ej., especies de Shigella) se multiplican dentro de las células hospedadoras, pero otras bac- terias no lo hacen. Por lo general, la producción de toxinas y otras propie- dades de virulencia son independientes de la capacidad que tiene la bacteria para invadir las células y tejidos. Por ejem- plo, C. diphtheriae puede invadir el epitelio de la nasofaringe lo que genera una faringitis asintomática aunque las cepas del microorganismo no sean toxígenas. Los estudios in vitro con células de tejidos en cultivos han ayudado a clasificar los mecanismos de la invasión para algu- nos microorganismos patógenos; sin embargo, los modelos in vitro no necesariamente ofrecen una visión completa del pro- ceso de la invasión. Para comprender en forma integral este proceso, tal y como sucede en las infecciones que se adquieren en forma natural, es necesario estudiar mutantes producidos por ingeniería genética y su potencial para infectar animales y seres humanos susceptibles. Por consiguiente, para conocer la invasión bacteriana de la célula eucariota es necesario observar gran parte de los postulados de Koch así como sus postula- dos moleculares. A continuación se proporcionarán algunos ejemplos de invasión bacteriana de células hospedadoras como parte del proceso infeccioso. Las especies de Shigella se adhieren a las células hospe- dadoras in vitro. Por lo general se utilizan células HeLa; estas células no polarizadas e indiferenciadas se obtuvieron de un carcinoma cervical. La adhesión provoca polimerización de actina en la porción cercana de la célula HeLa, lo que induce la formación de seudópodos en las células y absorción de la bacte- ria. La adhesión e invasión son mediadas de forma parcial por productos de los genes ubicados en un gran plásmido común para numerosas shigellas. Existen diversas proteínas, inclui- dos los antígenos del plásmido de invasión (IpA-D, invasion plasmid antigens) que contribuyen al proceso. Dentro de las células HeLa, la shigella es liberada o escapa de la vesícula apter 09_Carroll_4R.indd 158 apter 09_Carroll_4R.indd 158 14/04/16 14/04/16
- 172. CAPÍTULO 9 Patogeniade la infección bacteriana 159 fagocítica y se multiplica en el citoplasma. La polimerización de actina impulsa a la shigella dentro de la célula HeLa y de una célula a otra. In vivo, las shigellas se adhieren a las integri- nas situadas en la superficie de las células M de las placas de Peyer y no a las células polarizadas de absorción de la mucosa. Las células M por lo general prueban antígenos y los presen- tan a los macrófagos en la submucosa. Las shigellas son fago- citadas por las células M y atraviesan a estas células hacia el conglomerado subyacente de macrófagos. Las shigellas dentro de las células M y los macrófagos provocan la muerte de estas células al activar el proceso normal de muerte celular (apopto- sis). Las shigellas se extienden hacia las células adyacentes de la mucosa de manera similar al modelo in vitro, por medio de polimerización de la actina, que impulsa a las bacterias. Según estudios que utilizan células in vitro, el proceso de adhesión invasión de Y. enterocolitica es similar al de Shi- gella. Yersinia se adhiere a la membrana celular hospedadora y provoca la formación de proyecciones protoplasmáticas. A continuación las bacterias son absorbidas por la célula hos- pedadora con formación de vacuolas. La invasión es mayor cuando las bacterias se cultivan a 22 °C en lugar de 37 °C. Una vez que Yersinia ha penetrado en la célula, la membrana vacuo- lar se disuelve y las bacterias son liberadas hacia el citoplasma. In vivo, se cree que Yersinia se adhiere a las células M de las placas de Peyer y las invade, en lugar de utilizar a las células de absorción de la mucosa, muy similar a Shigella. L. monocytogenes del medio ambiente se ingiere en los alimentos. Supuestamente, la bacteria se adhiere a la mucosa intestinal y la invade, llega hasta el torrente sanguíneo y se disemina. La patogenia de este proceso se ha estudiado in vitro. L. monocytogenes se adhiere e invade con facilidad a los macrófagos y células intestinales indiferenciadas cultivadas. A continuación estimulan a las células hospedadoras para que las absorban. Ciertas proteínas llamadas internalinas, tienen una función importante en este proceso. El proceso de absor- ción, que es el desplazamiento hacia el interior de una célula y el desplazamiento entre células, requiere la polimerización de actina para impulsar a las bacterias, como sucede con Shigella. Legionella pneumophila infecta a los macrófagos pul- monares y genera neumonía. La adhesión de Legionella a los macrófagos induce la formación de un seudópodo largo y delgado que se enrosca alrededor de la bacteria formando una vesícula (fagocitosis en espiral). La vesícula permanece intacta, se inhibe la fusión fagolisosómica y la bacteria se mul- tiplica dentro de la vesícula. N. gonorrhoeae utiliza pilosidades como adhesinas prin- cipales y proteínas asociadas a la opacidad (Opa, opacity associated proteins) como adhesinas secundarias a las células hospedadoras. Algunas proteínas Opa median la adhesión a los polimorfonucleares. En ocasiones el gonococo sobrevive des- pués de ser fagocitado por estas células. Las pilosidades y las Opa en conjunto, fomentan la invasión de las células cultivadas in vitro. En cultivos de la trompa uterina (falopio), el gonococo se adhiere a las microvellosidades de las células no ciliadas y al parecer induce su fagocitosis por estas células. El gonococo se multiplica dentro de la célula y emigra hacia el espacio subepi- telial por un mecanismo desconocido. Toxinas Por lo general, las toxinas producidas por bacterias se clasifican en dos grupos: endotoxina, que se encuentra en la membrana externa de los bacilos gramnegativos, y toxinas que son secre- tadas, como las enterotoxinas y exotoxinas. Las enterotoxinas y exotoxinas se clasifican a menudo por mecanismos de acción y el impacto sobre células hospedadoras; se describen con más detalle después en este capítulo. En el cuadro 9-4 aparecen las características principales de ambos grupos. CUADRO 94 Características de las exotoxinas y endotoxinas (lipopolisacáridos) Exotoxinas Endotoxinas Excretadas por células vivas; concentración elevada en medio líquido Forman parte integral de la pared celular de las bacterias gramnegativas. Liberadas cuando la bacteria muere y en parte durante el crecimiento. No siempre es necesaria su liberación para que posean actividad biológica Producidas por bacterias grampositivas y gramnegativas Se encuentran sólo en bacterias gramnegativas Polipéptidos con peso molecular de 10000 a 900000 Complejos de lipopolisacáridos. Probablemente la porción del lípido A es la responsable de toxicidad Relativamente inestable; sus efectos nocivos suelen destruirse con rapidez al calentarlas a más de 60 °C Relativamente estable; soportan el calor por arriba de 60 °C durante varias horas sin perder su toxicidad Muy antigénicas; estimulan la formación de una concentración abundante de antitoxina. La antitoxina neutraliza a la toxina Débilmente inmunógenas; los anticuerpos son antitóxicos y protectores. La relación existente entre la concentración de anticuerpos y la protección contra la enfermedad es menos clara que con las exotoxinas Se convierte en toxoide antigénico y no tóxico con formalina, ácido, calor, etc. Los toxoides se utilizan para vacunar (p. ej., toxoide tetánico) No se convierten en toxoides Altamente tóxica; mortales para animales en microgramos o menos Moderadamente tóxicas; mortales para animales en decenas a cientos de microgramos Por lo general se unen con receptores específicos en las células No existen receptores específicos en las células Por lo general no causan fiebre en el hospedador Por lo general causan fiebre en el hospedador a causa de la liberación de interleucina-1 y otros mediadores Con frecuencia reguladas por genes extracromosómicos (p. ej., plásmidos) La síntesis es controlada por genes cromosómicos apter 09_Carroll_4R.indd 159 apter 09_Carroll_4R.indd 159 14/04/16 14/04/16
- 173. 160 SECCIÓN IIIBacteriología A. Exotoxinas Muchas bacterias tanto grampositivas como gramnegativas producen exotoxinas que tienen gran importancia médica. Algunas de estas toxinas han tenido una participación muy importante en la historia mundial. Por ejemplo, el tétanos cau- sado por la toxina de C. tetani mató cerca de 50 000 soldados de la Potencias del Eje (Axis powers) en la Segunda Guerra Mun- dial; sin embargo, las fuerzas aliadas vacunaron a sus soldados contra el tétanos y muy pocos murieron por esta enfermedad. Se han creado vacunas contra algunas enfermedades mediadas por exotoxinas y siguen siendo importantes en la prevención de la enfermedad. Estas vacunas, llamadas toxoides, son elabora- das a base de exotoxinas, que se modifican para que ya no sean tóxicas. Muchas exotoxinas consisten en subunidades A y B (a menudo llamadas toxinas binarias o toxinas de tipo III). Por lo general la subunidad B controla la adhesión del complejo de toxina a una célula hospedadora y ayuda a que la exotoxina penetre en la célula hospedadora. La subunidad A proporciona actividad tóxica. A continuación se ofrecen algunos ejemplos de los mecanismos patógenos ligados a las exotoxinas. En los capítulos que tratan sobre estas bacterias se describen otras toxinas bacterianas. C. diphtheriae es un bacilo grampositivo que se reproduce en las mucosas del aparato respiratorio superior o en heridas cutáneas menores (capítulo 12). Las cepas de C. diphtheriae que transportan un corinebacteriófago temperado y lisógeno (fago β o fago ω) con el gen estructural para la toxina, son toxí- genos y producen la toxina de la difteria que causa difteria. Son numerosos los factores que regulan la producción de la toxina; cuando la disponibilidad de hierro inorgánico consti- tuye el factor que limita la velocidad de proliferación, entonces se produce la máxima cantidad de toxina. La toxina es secre- tada como una sola molécula de polipéptido (peso molecu- lar [MW, molecular weight] 62000). Esta toxina natural sufre degradación enzimática para formar dos fragmentos, A y B, unidos por un puente disulfuro. El fragmento B (PM 40 700) se une a ciertos receptores de la célula hospedadora y facilita la penetración del fragmento A (MW 21150) hacia el citoplasma. El fragmento A inhibe al factor de elongación EF-2 de la cadena peptídica, al catalizar una reacción que adhiere un difosfato de adenosina–ribosilo al EF-2, lo que genera un complejo inactivo de difosfato de adenosina-ribosa-EF-2. La interrupción de la síntesis de proteínas altera las funciones fisiológicas celulares normales. La toxina diftérica es muy potente. C. tetani es un bacilo anaerobio grampositivo que causa tétanos (capítulo 11). C. tetani del medio ambiente contamina las heridas y sus esporas germinan en el medio anaerobio del te- jido desvitalizado. Con frecuencia la infección es leve y no tiene manifestaciones clínicas. Las formas vegetativas de C. tetani producenlatoxinatetanoespasmina(MW150000)queesfrag- mentada por una proteasa bacteriana hasta formar dos pépti- dos (MW 50000 y MW 100000) unidos por un puente disul- furo. Al principio la toxina se fija a receptores en las membra- nas presinápticas de las neuronas motoras. Después migra por el sistema de transporte axonal retrógrado hasta los cuerpos celulares de estas neuronas y hasta la médula espinal y tronco del encéfalo. La toxina se difunde hasta las terminales de las células inhibidoras incluidas interneuronas glicinérgicas y neuronas secretoras de ácido aminobutírico gamma (GABA, gamma-aminobutyric acid) del tronco del encéfalo. La toxina degrada a la sinaptobrevina, proteína necesaria para el aco- plamiento de las vesículas neurotransmisoras en la membrana presináptica. La liberación de glisina inhibidora y GABA se bloquea y las neuronas motoras no se inhiben. El resultado es una parálisis espástica. Incluso una cantidad sumamente pequeña de toxina es mortal para el ser humano. El tétanos se puede evitar en las personas con una inmunidad normal vacu- nándolos con toxoide tetánico. C. botulimun produce botulismo. Este microorganismo anerobio, grampositivo productor de esporas se encuentra en la tierra o el agua y algunas veces crece en los alimentos (p. ej., alimentos envasados o enlatados) cuando el ambiente es lo sufi- cientemente anaerobio. Produce una toxina sumamente po- tente (la más potente que se conoce). Es termolábil y por lo tanto se destruye con calor suficiente. Existen siete tipos serológicos de toxina. Los que con mayor frecuencia causan enfermedad en el ser humano son los tipos A, B, E y F. La toxina es muy simi- lar a la toxina tetánica, con una proteína con un peso mo- lecular de 150000 que se fragmenta hasta formar una proteína con un peso molecular de 100000 y otra con peso molecular de 50000 unidas por un puente disulfuro. La toxina botulínica es absorbida en el intestino, se adhiere a los receptores de las membranas presinápticas de las neuronas motoras, localiza- das en el sistema nervioso periférico y pares craneales. La pro- teólisis, a través de la cadena ligera de la toxina botulínica, en las neuronas, inhibe la liberación de acetilcolina en la sinapsis, lo que tiene como resultado ausencia de contracción muscular y parálisis flácida. Las esporas de C. perfringens se introducen en las heridas por contaminación con tierra o materia fecal. En presencia de tejido necrótico (ambiente anaerobio), las esporas germinan y las células vegetativas producen muchas toxinas distintas. Muchas de éstas son necrosantes y hemolíticas y, junto con la distensión de los tejidos por el gas formado a partir de los carbohidratos y la interferencia con la irrigación, favorecen la diseminación de gangrena gaseosa. La toxina alfa de C. per- fringens es una lecitinasa que daña las membranas celulares al degradar a la lecitina para formar fosforilcolina y diglicérido. La toxina teta también posee un efecto necrosante. Las especies de Clostridium también producen colagenasas y DNAsas. Algunas cepas de S. aureus que proliferan en las membra- nas mucosas (p. ej., la vagina durante la menstruación) o en las heridas, elaboran toxina-1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1, toxic shock syndrome toxin-1), que causa el síndrome de choque tóxico (capítulo 13). Esta enfermedad se caracteriza por choque, fiebre elevada y un eritema rojo difuso que más tarde se descama; abarca muchos otros órganos y sistemas. TSST-1 es un superantígeno (también denominado toxina de tipo I), y los superantígenos no necesitan entrar a las células para causar su potente alteración celular. La TSST-1 estimula a la mayor parte de linfocitos T mediante unión directa a recep- tores de MHC-II y a linfocitos T. El resultado neto es la produc- ción de cantidades grandes de citocinas interleucina 2 (IL-2, interleukin-2), interferón gamma y factor de necrosis tumoral (TNF, tumor necrosis factor) (capítulo 8). Las manifestaciones clínicas principales de la enfermedad parecen ser secundarias a los efectos de las citocinas. Los efectos sistémicos de TSST-1 se deben a la estimulación masiva de citocina. Ciertas cepas apter 09_Carroll_4R.indd 160 apter 09_Carroll_4R.indd 160 14/04/16 14/04/16
- 174. CAPÍTULO 9 Patogeniade la infección bacteriana 161 del estreptococo β hemolítico del grupo A producen exotoxina A y C pirógena que es similar o igual a la toxina eritrógena estreptocócica, que provoca la escarlatina. La infección de tejidos blandos por estreptococo productor de exotoxina A pirógena progresa con rapidez y se acompaña de una serie de manifestaciones clínicas similares a las del síndrome de cho- que tóxico estafilocócico. La exotoxina A pirógena también es un superantígeno que actúa de manera similar a la TSST-1. Las toxinas tipo II son proteínas que afectan de manera típica a las membranas celulares, lo cual facilita la invasión por el patógeno que las secreta (véase también la sección Enzimas que degradan tejidos más adelante). Como ejemplos cabe men- cionar las hemolisinas y fosfolipasas, que también se tratan en los capítulos dedicados a los microorganismos. B. Exotoxinas relacionadas con enfermedades diarreicas e intoxicación alimentaria Las exotoxinas relacionadas con enfermedades diarreicas son llamadas a menudo enterotoxinas y muchas pertenecen a la familia de toxina tipo III (véase también el cuadro 48-3.) Las características de algunas enterotoxinas se comentan a continuación. V. cholerae ha causado enfermedad diarreica epidémica (cólera) en muchas partes del mundo (capítulo 17) y es otra enfermedad causada por una toxina de importancia tanto his- tórica como actual. Una vez que penetra en el hospedador a través de alimentos o bebidas contaminadas, V. cholerae invade la mucosa intestinal y se adhiere a las microvellosidades del borde de cepillo de las células epiteliales intestinales. Por lo general, el serotipo O1 (y O139) de V. cholerae, produce una enterotoxina con un peso molecular de 84000. Esta toxina consta de dos subunidades: A, que se degrada hasta formar dos péptidos, A1 y A2 , unidos por un puente disulfuro; y B. Esta subunidad posee cinco péptidos idénticos y une con rapidez las moléculas de gangliósido de la membrana celular. La subuni- dad A penetra en la membrana celular incrementando la acti- vidad de la adenilato ciclasa y la concentración de AMP cíclico (cAMP, cyclic AMP). El efecto neto es la secreción rápida de electrólitos hacia la luz del intestino delgado, con absorción deficiente de sodio y cloruro y pérdida de bicarbonato. Algu- nas veces la diarrea voluminosa pone en riesgo la vida (p. ej., 20 a 30 L/día), e incluso se puede presentar acidosis. Los efectos nocivos del cólera son secundarios a la pérdida del líquido y al desequilibrio acidobásico; por lo tanto, el tratamiento es la restitución de líquidos y electrólitos. Algunas cepas de S. aureus producen enterotoxinas mien- tras proliferan en carnes, productos lácteos u otros alimentos. En los casos típicos, el alimento se ha preparado recientemente pero no se ha refrigerado en forma adecuada. Existen cuando menos siete tipos de enterotoxina estafilocócica. Una vez que se ingiere la toxina preformada, se absorbe en el intestino, donde estimula a los receptores del nervio vago. Este estímulo se transmite al centro del vómito en el sistema nervioso cen- tral. El resultado es la aparición de vómito en unas cuantas horas en forma de proyectil. La diarrea es menos frecuente. La intoxicación alimentaria más frecuente es la estafilocócica. Las enterotoxinas de S. aureus son superantígenos. También producen enterotoxinas algunas cepas de Y. ente- rocolitica (capítulo 19), Vibrio parahaemolyticus (capítulo 17), especies de Aeromonas (capítulo 17) y otras bacterias, pero la participación de estas toxinas en la patogenia aún no se esta- blece con claridad. La enterotoxina producida por C. perfrin- gens se describe en el capítulo 11. C. Lipopolisacáridos de las bacterias gramnegativas Los LPS (endotoxina) de las bacterias gramnegativas, forman parte de la pared celular bacteriana y a menudo son liberados cuando la bacteria es lisada. Estas sustancias son termoestables, tienen un peso molecular de 3000 a 5000 (lipooligosacáridos, LOS) y es posible extraer varios millones (lipopolisacáridos) (p. ej., con fenol-agua). Poseen tres regiones principales (véase figura 2-19). El dominio A de lípido es la región reconocida por el sistema inmunológico y es el componene al que se debe la estimulación de citocina (véase luego). Los otros dos compo- nentes son un núcleo de oligosacárido y un polisacárido de antígeno O exterior. Los efectos fisiopatológicos de los LPS son similares en cuanto a su origen bacteriano con excepción de las especies de Bacteroides, que poseen una estructura distinta y son menos tóxicos (capítulo 21). Al principio, los LPS en el torrente san- guíneo se fijan a las proteínas circulantes, las cuales interactúan con los receptores de macrófagos, neutrófilos y otras células del sistema reticuloendotelial. Se liberan citocinas proinflamato- rias como IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α y otras, y se activan las casca- das del complemento y la coagulación. En la clínica o durante la experimentación se observa lo siguiente: fiebre, leucopenia e hipoglucemia; hipotensión y choque con hipoperfusión de los órganos vitales (p. ej., cerebro, corazón, riñón); coagulación intravascular y muerte por disfunción masiva de órganos. La inyección de LPS provoca fiebre en un lapso de 60 a 90 min, que es el tiempo necesario para que el organismo libere IL-1. La inyección de IL-1 produce fiebre en los primeros 30 min. La inyección reiterada de IL-1 produce la misma respuesta febril cada vez, pero la inyección reiterada de LPS genera una respuesta febril que desciende en forma gradual por tolerancia que en parte es secundaria al bloqueo reticuloendotelial y en parte a los anticuerpos IgM contra los LPS. La inyección de LPS genera leucopenia precoz, al igual que la bacteriemia con microorganismos gramnegativos. Más adelante se produce leucocitosis secundaria. La leucopenia pre- coz coincide con el inicio de la fiebre por la liberación de IL-1. Los LPS fomentan la glucólisis en muchos tipos celulares y en ocasiones provoca hipoglucemia. Al principio de la bacteriemia por gramnegativos o des- pués de la inyección de LPS, aparece hipotensión. En ocasio- nes se observa contracción arteriolar y venular diseminada seguida de dilatación vascular periférica, aumento de la per- meabilidad vascular, reducción del retorno venoso y del gasto cardiaco, estancamiento en la microcirculación, vasoconstric- ción periférica, choque e hipoperfusión de los órganos con sus consecuencias. La coagulación intravascular diseminada (DIC, disseminated intravascular coagulation) también contribuye a estos cambios vasculares. Los LPS son una de muchas sustancias que activan la vía alterna de la cascada del complemento, lo cual precipita una gran variedad de reacciones mediadas por el comple- mento (anafilatoxinas, respuestas quimiotácticas, daño de la apter 09_Carroll_4R.indd 161 apter 09_Carroll_4R.indd 161 14/04/16 14/04/16
- 175. 162 SECCIÓN IIIBacteriología membrana, etc.) y descenso en la concentración sérica de los componentes del complemento (C3, C5 a C9). La coagulación intravascular diseminada es una compli- cación frecuente de la bacteriemia por gramnegativos y tam- bién ocurre en otras infecciones. Los LPS activan al factor xii (factor de Hageman), que es el primer paso en el sistema intrín- seco de la coagulación, y desencadena la cascada de la coagula- ción, que culmina en la conversión de fibrinógeno a fibrina. Al mismo tiempo, los LPS activan al plasminógeno para formar plasmina (enzima proteolítica), que ataca a la fibrina con la for- mación de productos de degradación de la fibrina. Dos indicios de DIC son la reducción en el número de plaquetas y en la con- centración de fibrinógeno y en la detección de productos de degradación de la fibrina. Algunas veces la heparina previene las lesiones que acompañan a la DIC. Los LPS provocan adhesión de las plaquetas al endotelio vascular y obstrucción de los vasos sanguíneos pequeños, con necrosis isquémica o hemorrágica en diversos órganos. La concentración de endotoxinas se mide en la prueba de limulus: el lisado de amebocitos provenientes del cangrejo herradura (limulus) forma un gel o se coagula en presencia de 0.0001 μg/ml de endotoxina. Esta prueba se utiliza rara vez en los laboratorios clínicos puesto que es difícil realizarla con precisión. D. Peptidoglucano de las bacterias grampositivas El peptidoglucano de las bacterias grampositivas está formado por macromoléculas entrecruzadas que rodean las paredes bac- terianas (capítulo 2 y figura 2-15). También pueden ocurrir cam- bios vasculares que provocan choque en las infecciones por bac- teriasgrampositivasquenocontienenLPS.Estasbacteriasposeen mucho más peptidoglucano en la pared celular que las bac- terias gramnegativas. El peptidoglucano liberado durante la in- fección comparte muchas de las actividades biológicas de los LPS, aunque el peptiglucano es mucho menos potente que el LPS. Enzimas Numerosas especies de bacterias producen enzimas que no son tóxicas en sí, pero que participan en el proceso infeccioso. A continuación se describen algunas de estas enzimas. A. Enzimas que degradan tejidos Muchas bacterias producen enzimas que degradan tejidos. Las mejor estudiadas son las enzimas de C. perfringens (capí- tulo 11) y, en menor grado, de las bacterias anaerobias (capítulo 21), S. aureus (capítulo 13) y estreptococo del grupo A (capí- tulo 14). La participación de las enzimas que degradan tejidos en la patogenia de las infecciones es evidente, pero ha sido difí- cil de comprobar, en especial de cada enzima individual. Por ejemplo, los anticuerpos contra las enzimas del estreptococo que degradan tejidos, no modifican las características de la enfermedad estreptocócica. Además de lecitinasa, C. perfringens produce la enzi- ma proteolítica colagenasa, que degrada colágena (la principal proteína del tejido conjuntivo fibroso) y fomenta la disemina- ción de la infección en los tejidos. S. aureus produce coagulasa, que actúa en conjunto con una serie de factores sanguíneos para coagular el plasma. La coagulasa contribuye a la formación de paredes de fibrinas alrededor de las lesiones estafilocócicas, lo que les ayuda a per- sistir en los tejidos. Asimismo, la coagulasa provoca depósito de fibrina en la superficie de los estreptococos, lo que ayuda a protegerlos de la fagocitosis o de la destrucción dentro de las células fagocíticas. Las hialuronidasas son enzimas que hidrolizan ácido hialurónico, componente de la sustancia base del tejido con- juntivo. Muchas bacterias producen hialuronidasas (p. ej., estafilococos, estreptococos y anerobios) y ayudan a su disemi- nación en los tejidos. Muchos estreptococos hemolíticos producen estreptoci- nasa (fibrinolisina), sustancia que activa a una enzima pro- teolítica del plasma. Así, esta enzima puede disolver el plasma coagulado y quizá ayuda a la diseminación rápida del estrep- tococo en los tejidos. La estreptocinasa se ha utilizado en el tratamiento del infarto agudo del miocardio para disolver los coágulos de fibrina. Muchas bacterias producen sustancias que son citolisinas, es decir, disuelven a los eritrocitos (hemolisinas) o aniquilan células hísticas o leucocitos (leucocidinas). Por ejemplo, la estreptolisina O es producida por el estreptococo del grupo A y es mortal para ratones y hemolítica para los eritrocitos de muchos animales. La estreptolisina O es oxígeno-lábil y, por lo tanto, puede ser oxidada y desactivada pero se reactiva con las sustancias reductoras. Es antigénica. El mismo estreptococo produce una estreptolisina S inducida en el suero y oxígeno-es- table, que no es antigénica. Los Clostridium producen diversas hemolisinas, como la lecitinasa antes descrita. La mayor parte de las cepas de S. aureus produce hemolisinas; el estafilococo también produce leucocidinas. La mayor parte de los bacilos gramnegativos obtenidos a partir de sitios de infección pro- duce hemolisinas. Por ejemplo, las cepas de E. coli que causan infecciones urinarias producen de manera típica hemolisinas, mientras que las cepas que forman parte de la microbiota del aparato digestivo producen o no hemolisinas. B. Proteasas IgA1 La inmunoglobulina A es el anticuerpo secretor de las muco- sas. Tiene dos formas principales, IgA1 e IgA2, que difieren región central o bisagra de las cadenas pesadas de las molécu- las (capítulo 8). La IgA1 posee una serie de aminoácidos en la región bisagra que no existen en la IgA2. Algunas bacterias patógenas producen enzimas, proteasas IgA1, que degradan a la IgA1 en enlaces específicos prolina-treonina o prolina-serina en la región bisagra e inactivan su función de anticuerpo. La pro- teasa IgA1 es un factor importante de virulencia para las bacte- rias patógenas N. gonorrhoeae, N. meningitidis, H. influenzae y S. pneumoniae. También producen estas enzimas algunas cepas de Prevotella melaninogenica, algunos estreptococos que causan enfermedades dentales y otras cepas de especies que a veces cau- san enfermedades. Especies no patógenas de los mismos géne- ros no poseen genes que codifican esta enzima y por lo tanto no la producen. La producción de proteasa IgA1 permite a los microorganismos patógenos inactivar al principal anticuerpo que se encuentra en las mucosas y, por lo tanto, eliminan la pro- tección que le confiere este anticuerpo al hospedador. apter 09_Carroll_4R.indd 162 apter 09_Carroll_4R.indd 162 14/04/16 14/04/16
- 176. CAPÍTULO 9 Patogeniade la infección bacteriana 163 Factores antifagocíticos Muchas bacterias patógenas son aniquiladas con rapidez una vez que las ingieren los polimorfonucleares o los macrófagos. Otras evaden la fagocitosis o los mecanismos microbicidas leu- cocíticos al adsorber componentes del hospedador sano en su superficie celular. Por ejemplo, S. aureus posee una proteína A de superficie que se une a la porción Fc de IgG. Otras bacterias patógenas poseen factores de superficie que impiden la fagoci- tosis, p. ej., S. pneumoniae, N. meningitidis; muchas otras bacte- rias tienen cápsulas de polisacáridos. S. pyogenes (estreptococo del grupo A) posee una proteína M. N. gonorrhoeae (gono- coco) tiene pilosidades. La mayor parte de estas estructuras antifagocíticas de superficie, exhiben una gran heterogeneidad antigénica. Por ejemplo, existen más de 90 tipos de polisa- cáridos capsulares neumocócicos y más de 150 tipos de pro- teína M del estreptococo A. Los anticuerpos contra un tipo del factor antifagocítico (p. ej., polisacárido capsular, proteína M) protegen al hospedador de enfermar por las bacterias de ese tipo antigénico, pero no contra la de otros tipos antigénicos del mismo factor. Unas cuantas bacterias (p. ej., Capnocytophaga y Bor- detella) producen factores solubles o toxinas que inhiben la quimiotaxia de los leucocitos y de esta manera evaden la fago- citosis por un mecanismo distinto. Patogenicidad intracelular Algunas bacterias (p. ej., M. tuberculosis, L. monocytogenes, especies de Brucella y especies de Legionella) viven y crecen en un ambiente hostil dentro de los polimorfonucleares, macrófa- gos o monocitos; lo hacen gracias a una serie de mecanismos: algunas veces evitan la entrada a los fagolisosomas y viven en el citosol del fagocito. Otras veces evitan la fusión del fagosoma con el lisosoma y viven dentro del fagosoma; y otras veces son resistentes a las enzimas lisosómicas y sobreviven dentro del fagolisosoma. Muchas bacterias viven dentro de células no fagocíticas (véase la sección anterior, Invasión de las células y tejidos del hospedador). Heterogeneidad antigénica Las estructuras de superficie de las bacterias (y de muchos otros microorganismos) tienen gran heterogeneidad antigé- nica). Con frecuencia estos antígenos se utilizan como parte de un sistema de clasificación serológica para las bacterias. La clasificación de las 2 000 especies de Salmonellae se basa prin- cipalmente en los tipos de los antígenos O (cadena lateral de lipopolisacáridos) y antígenos H (flagelar). Asimismo, existen más de 150 tipos de E. coli O y más de 100 tipos de E. coli K (capsular). El tipo antigénico de la bacteria en ocasiones indica la virulencia, relacionado con la naturaleza clonal de la bac- teria patógena, aunque en realidad no constituya el factor (o factores) de virulencia. V. cholerae con antígeno O tipo 1 y antígeno O tipo 139, típicamente produce toxina del cólera, pero muy pocos de los otros tipos O producen la toxina. Asi- mismo, muy pocas variedades de estreptococo del grupo A con proteína M se relacionan con una frecuencia elevada de glomerulonefritis posestreptocócica. Los tipos A y C del poli- sacárido capsular N. meningitidis están relacionados con la meningitis epidémica. En los ejemplos antes citados y en otros sistemas de tipificación en los que se utilizan antígenos de superficie para la clasificación serológica, los tipos antigénicos para determinada cepa aislada de la especie permanecen cons- tantes durante la infección y en el subcultivo de la bacteria. Otras bacterias y microorganismos tienen la capacidad de realizar cambios frecuentes en la forma antigénica de sus estructuras de superficie in vitro y quizá in vivo. Un ejemplo conocido es el de Borrelia recurrentis, que causa la fiebre recu- rrente. Otro ejemplo muy estudiado es N. gonorrhoeae (capí- tulo 20). El gonococo posee tres antígenos de superficie que cambian de forma con gran rapidez, cerca de 1 en cada 1000; seis a ocho tipos de lipooligosacáridos; innumerables tipos de pilosidades; y 10 a 12 tipos de Opa para cada cepa. El número de formas antigénicas es tal que cada cepa de N. gonorrhoeae es antigénicamente diferente. El cambio de forma para cada uno de los tres antígenos al parecer es regulado por un mecanismo genético distinto. Supuestamente el cambio frecuente de for- mas antigénicas permite al gonococo evadir al sistema inmuni- tario del hospedador; los gonococos que no son atacados por el sistema inmunológico sobreviven y causan enfermedad. Sistemas de secreción bacterianos Los sistemas de secreción bacterianos son importantes en la patogenia de la infección y son indispensables para la interac- ción entre bacterias y células eucariotas del hospedador. Las bacterias gramnegativas poseen paredes celulares con membra- nas citoplasmáticas y membranas externas; también existe una capa delgada de peptidoglucano. Las bacterias grampositivas tienen una membrana citoplasmática y una capa muy gruesa de peptidoglucano (capítulo 2). Algunas bacterias gramnega- tivas y grampositivas además poseen cápsulas. La complejidad y rigidez de las estructuras de la pared celular requieren meca- nismos para la migración de proteínas a través de las mem- branas. Estos sistemas de secreción participan en las funciones celulares como el transporte de proteínas que forman las pilo- sidades o flagelos y en la secreción de enzimas o toxinas hacia el medio extracelular. Las diferencias en la estructura de la pared celular entre las bacterias gramnegativas y grampositi- vas tienen como resultado ciertas diferencias en los sistemas de secreción. En el capítulo 2 se describen los mecanismos básicos de los distintos sistemas bacterianos de secreción. (Nota: cada sistema de secreción bacteriano se describió en el orden en que fue descubierto, no por su mecanismo de acción.) Tanto bacterias gramnegativas como grampositivas tienen una vía de secreción general, la cual es el principal mecanismo de secreción proteica (Sec). Esta vía participa en la inserción de la mayor parte de proteínas de la membrana bacteriana y pro- porciona la vía principal para que las proteínas atraviesen la membrana citoplasmática bacteriana. Los microorganismos gramnegativos poseen otros seis mecanismos de secreción de proteínas, los sistemas de secreción (SS) 1 a 6 (algunas veces llamados del I a VI). Éstos se subdividen en los dependientes del Sec (tipos 2 y 5) y que no dependen del Sec (tipos 1, 3, 4 y 6). El tipo 2 SS utiliza el Sec general para transportar las pro- teínas al periplasma y crea un canal en la membrana externa apter 09_Carroll_4R.indd 163 apter 09_Carroll_4R.indd 163 14/04/16 14/04/16
- 177. 164 SECCIÓN IIIBacteriología formado por un complejo especial de proteínas formadoras de poros. Este tipo 2 SS se utiliza para secretar porciones de toxinas bacterianas tipos A y B, como toxina del cólera. De manera similar, el tipo 5 SS utiliza el sistema Sec general para exportar un autotransportador al periplasma; de ahí se transporta a sí mismo a través de la membrana externa. Un ejemplo de este tipo de SS son las proteasas secretadas por Haemophilus influenzae contra IgA. Las vías independientes de Sec comprenden al sistema de secreción tipo 1 o sistema de secreción ABC (dominio o casete de unión a ATP) y el sistema de secreción tipo 3. Las vías tipo 1 y 3 no interactúan con las proteínas que han sido transportadas a través de la membrana citoplasmática por el sistema Sec. En su lugar, estos sistemas translocan proteínas a través de las membranas tanto citoplas- mática como externa. El tipo 3, que se activa al contacto con una célula hospedadora eucariota, fomenta el transporte de proteínas directamente desde el interior de la bacteria hasta el interior de la célula hospedadora utilizando una estructura como aguja llamada inyectosoma; cuando se encuentran en el citoplasma de la célula hospedadora, las proteínas transporta- das pueden manipular las funciones de la célula hospedadora. Pseudomonas aeruginosa posee un sistema de secreción de tipo 3 que al ser expresado puede asociarse con enfermedad más grave. El sistema de secreción tipo 4 consiste en un complejo de proteína que forma un “túnel” capaz de transportar direc- tamente proteínas o DNA. El SS más reciente por descubrirse es el SS tipo 6. Este SS participa en la secreción de proteínas de virulencia en V. cholerae y P. aeruginosa entre otros patógenos gramnegativos. Un séptimo SS fue descrito en M. tuberculosis y todavía no se entiende bien. Su función parece ser la trans- portación de proteínas a través de ambas membranas, interna y externa. En el cuadro 9-5 se muestran otros ejemplos de CUADRO 95 Ejemplos de moléculas translocadas por los sistemas de secreción bacteriana y su relevancia para la patogenia Sistema de secreción Género/especie Sustrato/participación en la patogenia Tipo 1 (independiente de Sec) Escherichia coli Proteus vulgares Morganela morganii Bordetella pertussis Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens La hemolisina alfa crea agujeros en las membranas celulares Hemolisina Hemolisina Adenilato ciclasa que cataliza la síntesis de cAMP Proteasa alcalina Zn proteasa que tiene como resultado daño de la célula hospedadora Tipo 2 (dependiente de Sec) Pseudomonas aeruginosa Legionella pneumophila Vibrio cholerae Serratia marcescens Elastasa, exotoxina A, fosfolipasa C, otras Fosfatasa ácida, lipasa, fosfolipasa, proteasa, RNAsa Toxina del cólera Hemolisina Tipo 3 (independiente de Sec; dependiente del contacto) Especies de Yersinia Pseudomonas aeruginosa Especies de Shigella Salmonella enterica Subespecie enterica Serotipos Choleraesuis, Dublín, Paratyphi, Typhi, Typhimurium, etc Escherichia coli Vibrio parahaemolyticus Sistema Ysc-Yop; toxinas que bloquean la fagocitosis e inducen apoptosis Citotoxina Regula las señales, invasión y muerte de las células hospedadoras Efectores de las islas 1 y 2 de patogenicidad de Salmonella (SPI1 y SPI2) que fomentan la adhesión e invasión de las células hospedadoras Enterohemorrágica (EHEC) y enteropatógena (EPEC); rompe las barreras epiteliales y uniones estrechas Poder citotóxico directo Tipo 4 (dependiente de Sec e independiente de Sec) Sustratos de proteínas Sustratos de DNA Bordetella pertussis Helicobacter pylori Neisseria gonorrhoeae Helicobacter pylori Toxina de tosferina Citotoxina Sistema de exportación de DNA Sistema de captación y liberación de DNA Tipo 5 (dependiente de Sec) Neisseria gonorrhoeae Haemophilus influenzae Escherichia coli Shigella flexneri Serratia marscenses Especies de Bordetella Bordetella pertusis Yersinia pestis IgA1 proteasa fragmenta a la IgA1 en la región de la bisagra y destruye su actividad de anticuerpo (que depende de sec) IgA1 proteasa, adhesinas Serina proteasa, adhesinas, Fimbrias tipo 1, Fimbrias-P Serina proteasa Proteasas Adhesinas Hemaglutinina filamentosa Antígeno capsular Tipo 6 (independiente de Sec) Pseudomonas aeruginosa Vibrio cholerae Toxina productora de poros Hcp1 Proteínas de virulencia Tipo 7 (dependiente de Sec) Mycobacterium tuberculosis CFP-10, objetivo antigénico de linfocitos T ESAT-6 CFP, proteínas de 10 kDa presente en el filtrado de cultivo. ESAT-6, proteína blanco antigénica de 6 kDa secretada en forma temprana. apter 09_Carroll_4R.indd 164 apter 09_Carroll_4R.indd 164 14/04/16 14/04/16
- 178. CAPÍTULO 9 Patogeniade la infección bacteriana 165 sistemas de secreción y su participación en la patogenia. Estos ejemplos sólo son una pequeña muestra diseñada para ilus- trar las funciones del gran número de secreciones molecula- res, actividades utilizadas por las bacterias para proporcionar nutrientes y facilitar su patogenia. Necesidades de hierro El hierro es un nutriente esencial para la proliferación y meta- bolismo de casi todos los microorganismos; también es un cofactor esencial de numerosos procesos metabólicos y enzi- máticos. La reserva de hierro en el ser humano para la asimila- ción microbiana es limitada puesto que este elemento es fijado por las proteínas altamente afines que se unen a él, llamadas transferrina en el suero y lactoferrina en las mucosas. La capa- cidad que tiene un microorganismo patógeno de obtener con eficiencia hierro a partir del hospedador es indispensable para causar enfermedad. En el capítulo 5 se describen los requeri- mientos de hierro, la manera como las bacterias lo adquieren y el metabolismo bacteriano del hierro. La reserva de hierro repercute en la virulencia de muchos microorganismos patógenos. Por ejemplo, el hierro constituye un factor esencial de virulencia en Pseudomonas aeruginosa. El uso de modelos animales de infección por Listeria mono- cytogenes han demostrado que la mayor cantidad de hierro tiene como resultado una mayor predisposición a la infección, pero la disminución de hierro provoca una supervivencia pro- longada; el tratamiento con suplemento de hierro aumenta las infecciones mortales. El decremento de hierro disponible es importante en la patogenia. Por ejemplo, el gen de la toxina diftérica reside en un bacteriófago lisógeno y sólo las cepas de C. diphtheriae que posee este bacteriófago son toxígenas. Esto aumenta la produc- ción de toxina diftérica y potencialmente la difteria se agrava. La virulencia de N. meningitidis en ratones aumenta 1000 veces o más cuando las bacterias se cultivan en un ambiente con poco hierro. La deficiencia de hierro en el ser humano también influye en el proceso infeccioso. Varios millones de personas en el mundo sufren de ferropenia. Este problema repercute en numerosos aparatos y sistemas como el inmunológico, provo- cando deficiencia de la inmunidad celular e hipofunción de los polimorfonucleares. Durante una infección activa quizá con- viene retrasar el tratamiento con hierro puesto que muchos microorganismos patógenos pueden utilizar la pequeña canti- dad de hierro suplementario con lo que aumenta su virulencia. Función de las biopelículas bacterianas Una biopelícula es un conglomerado de bacterias interactivas adheridas a una superficie sólida o unas a otras y encerradas dentro de una matriz de exopolisacárido. Difiere de la bac- teria del plancton o de vida libre porque las interacciones de los microorganismos no ocurren de la misma forma. Las biope- lículas forman una capa viscosa sobre las superficies sólidas y existen en toda la naturaleza. Una biopelícula puede estar for- mada por una sola especie de bacterias o por varias especies en conjunto. Algunas veces participan los hongos, incluidas las levaduras. Una vez formada la biopelícula, se acumulan moléculas producidas por la bacteria, lo que modifica la acti- vidad metabólica de la bacteria. En el capítulo 2 se describe la biología básica de la biopelícula de exopolisacárido (glucocá- liz); la detección de moléculas se describe en el capítulo 1. La bacteria en la matriz del exopolisacárido puede pro- teger de los mecanismos inmunitarios del hospedador. Esta matriz también funciona como barrera de difusión para algu- nos antimicrobianos, pero otros se fijan a ésta. Algunas de las bacterias en la biopelícula exhiben gran resistencia a los anti- microbianos frente a la misma cepa de bacterias cultivadas en caldo, lo que ayuda a explicar la razón por la que es tan difícil tratar infecciones ligadas a biopelículas. Las biopelículas son importantes en las infecciones de los seres humanos, que son persistentes y difíciles de tratar. Algu- nos ejemplos son las infecciones del catéter venoso central por Staphylococcus epidermidis y S. aureus, las infecciones ocula- res como las que se producen en los lentes de contacto y en los intraoculares, la placa dental y las de prótesis articulares. Quizá el ejemplo de mayor profundidad de una biopelícula en una infección en el ser humano es la de vías respiratorias por P. aeruginosa en pacientes con fibrosis quística. RESUMEN DEL CAPÍTULO • Los animales y seres humanos están colonizados con abundante microbiota, comensales normales que no gene- ran enfermedad y protegen al hospedador. • Las bacterias virulentas generan enfermedades al elaborar los factores que facilitan la adhesión, persistencia, invasión y toxigenicidad. • Los genes que codifican factores de virulencia se trans- portan en elementos genéticos móviles como plásmidos o bacteriófagos o bien se les encuentra en grandes islas de patogenicidad en los cromosomas bacterianos. • Las pilosidades y fimbrias son estructuras como bastones o pelos, de manera respectiva, que facilitan la adhesión a las células hospedadoras. • La invasión de las células hospedadoras es un mecanismo complejo que comprende la elaboración de proteínas que facilitan la entrada. • Las toxinas bacterianas pueden ser extracelulares (exoto- xinas) o bien formar parte de la membrana celular bacte- riana (endotoxina, LPS) y se encuentran entre las toxinas más potentes en la naturaleza (p. ej., toxina botulínica). • Otro mecanismo importante para la supervivencia y viru- lencia bacteriana son las enzimas que degradan tejidos, los factores antifagocíticos, las proteasas de IgA, la heteroge- neidad antigénica y la capacidad para quelar hierro. • Existen cuando menos siete sistemas de secreción bacte- riana, complejos proteínicos o canales que aseguran el trans- porte de las proteínas estructurales y toxigénicas a través de la célula bacteriana después de la traducción. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. Mujer de 22 años de edad que trabaja en un vivero y manifiesta antecedentes de fiebre y tos de dos meses de duración. En este periodo ha bajado 5 kg de peso. La radiografía de tórax muestra apter 09_Carroll_4R.indd 165 apter 09_Carroll_4R.indd 165 14/04/16 14/04/16
- 179. 166 SECCIÓN IIIBacteriología infiltrados bilaterales en los lóbulos superiores con cavidades. La tinción del esputo revela bacilos acidorresistentes. Esto significa que probablemente la paciente adquirió la infección por: (A) Actividad sexual (B) Ingerir los microorganismos en los alimentos (C) Utilizar el pasamanos del transporte público (D) Manipular tierra para macetas (E) Respirar la secreción en aerosol que contiene el micro- organismo 2. Durante la pandemia de una enfermedad bien caracterizada, un grupo de 175 pasajeros voló de Lima, Perú a Los Ángeles. La comida del avión incluyó ensalada de cangrejo, que comió 66% de los pasajeros. Después de aterrizar en Los Ángeles, varios pasa- jeros se transfirieron a otros vuelos con destino a otras partes de California y otros estados occidentales. Dos de los pasajeros que permanecieron en Los Ángeles manifestaron diarrea líquida intensa. El estado de los demás pasajeros se desconoce. La causa más probable de la diarrea de estos dos pasajeros es: (A) Escherichia coli O157:H7 (lipopolisacárido O antígeno 157; antígeno flagelar 7) (B) Vibrio cholerae tipo O139 (lipopolisacárido O antígeno 139) (C) Shigella dysenteriae tipo 1 (D) Campylobacter yeyuni (E) Entamoeba histolytica 3. Una mujer de 65 años de edad tiene un catéter venoso central como tratamiento intravenoso permente. Presenta fiebre y posterior- mente varios hemocultivos positivos para S. epidermidis. Todas las cepas tienen la misma morfología de las colonias y patrón de susceptibilidad antimicrobiana, lo que sugiere que son iguales. Se cree que en el catéter existe una biopelícula de Staphylococcus epidermidis. ¿Cuál de las afirmaciones siguientes es correcta? (A) La biopelícula que contiene S. epidermidis probablemente se desprenderá del catéter (B) La producción de un polisacárido extracelular inhibe el cre- cimiento de S. epidermidis, limitando la infección (C) El S. epidermidis en la biopelícula probablemente es más sen- sible al tratamiento antimicrobiano puesto que el metabo- lismo de estas bacterias es reducido (D) La detección proteínica de Staphylococcus epidermidis aumen- ta la sensibilidad al tratamiento antimicrobiano (E) Las complejas interacciones moleculares dentro de la bio- película dificultan el tratamiento antimicrobiano efectivo y probablemente sea necesario extraer el catéter para curar la infección 4. El primer microorganismo que cumplió con los postulados de Koch (a finales del siglo xix) fue: (A) Treponema pallidum (B) Stenotrophomonas maltophilia (C) Mycobacterium leprae (D) Bacillus anthracis (E) Neisseria gonorrhoeae 5. ¿Cuál de las afirmaciones siguientes acerca del lipopolisacárido es correcta? (A) Interactúa con macrófagos y monocitos lo que provoca libe- ración de citocinas (B) El componente tóxico es la cadena lateral O (C) Forma agujeros en las membranas celulares de los eritrocitos lo que genera hemólisis (D) Causa hipotermia (E) Causa parálisis 6. Un varón de 27 años de edad se sometió a una rinoplastia. Se le colocó un tapón nasal para detener la hemorragia. Ocho horas después manifestó cefalea, mialgias y cólico abdominal con dia- rrea. A continuación apareció un exantema eritematoso (similar a una quemadura por el Sol) en casi todo el cuerpo, incluidas las palmas de las manos y plantas de los pies. Su presión arterial es de 80/50 mmHg. Se dejó el tapón nasal. Las enzimas hepáticas se encontraban elevadas y había datos de insuficiencia renal mode- rada. ¿Cuál es la causa más probable de esta enfermedad? (A) Lipopolisacárido (B) Peptidoglucano (C) Una toxina que es un superantígeno (D) Una toxina con subunidades A y B (E) Lecitinasa (toxina alfa) 7. El microorganismo causal más probable de esta enfermedad (pre- gunta 6) es: (A) Escherichia coli (B) Corynebacterium diphtheriae (C) Clostridium perfringens (D) Neisseria meningitidis (E) Staphylococcus aureus 8. ¿Cuál de los siguientes se relaciona más probablemente con la for- mación de una biopelícula bacteriana? (A) Colonización de las vías respiratorias en un paciente con fibrosis quística y una cepa mucoide (productora de algi- nato) de Pseudomonas aeruginosa (B) Infección urinaria por Escherichia coli (C) Meningitis por Neisseria meningitidis (D) Tétanos (E) Impétigo por Staphylococcus aureus 9. Respecto al sistema de secreción bacteriano tipo III, ¿Cuál de las aseveraciones siguientes es correcta? (A) Suelen encontrarse en bacterias comensales grampositivas (B) Desempeñan una función importante en la patogenia de las enfermedades causadas por toxinas de especies de Clos- tridium, tétanos, botulismo, gangrena gaseosa y colitis seudomembranosa (C) Provocan la liberación de efectores de patogenia hacia el medio extracelular, lo que fomenta la colonización y multi- plicación bacterianas (D) Inyectan directamente proteínas bacterianas en las células hospedadoras a través de las membranas fomentando la patogenia de las infecciones (E) Las mutaciones que evitan la secreción bacteriana tipo III fomentan la patogenia 10. ¿Cuál de los siguientes enunciados es correcto? (A) Los lipopolisacáridos son parte de la pared celular de Esche- richia coli (B) La toxina del cólera se fija a los flagelos de Vibrio cholerae (C) La lecitinasa de Clostridium perfringens causa diarrea (D) La toxina 1 del síndrome de choque tóxico es producida por cepas hemolíticas de Staphylococcus epidermidis 11. Una paciente de 15 años de edad proveniente de Bangladesh manifiesta diarrea acuosa abundante. Las evacuaciones simulan “agua de arroz”. Son abundantes, más de 1 L en los últimos 90 min. No se acompaña de fiebre y por lo demás se encuentra nor- mal con excepción de los efectos de la pérdida de líquidos y elec- trólitos. La causa más probable de su enfermedad es: (A) Enterotoxina de Clostridium difficile (B) Una toxina con subunidades A y B (C) Shigella dysenteriae tipo 1 que produce toxina de Shiga (D) Escherichia coli enterotoxígena que produce toxinas termo- lábiles y termoestables (E) Enterotoxina F estafilocócica apter 09_Carroll_4R.indd 166 apter 09_Carroll_4R.indd 166 14/04/16 14/04/16
- 180. CAPÍTULO 9 Patogeniade la infección bacteriana 167 12. Lo más importante que se puede hacer para tratar a la paciente (pregunta 11) es: (A) Administrarle ciprofloxacina (B) Administrarle un toxoide en vacuna (C) Administrarle la antitoxina correspondiente (D) Administrar líquidos y electrólitos (E) Cultivar las evacuaciones para establecer el diagnóstico correcto y luego administrar el tratamiento específico 13. Una mujer de 23 años de edad tiene antecedente de infecciones urinarias recurrentes, incluido por lo menos un episodio de pie- lonefritis. En el análisis del grupo sanguíneo se observa antígeno P del grupo sanguíneo. ¿Cuál de las siguientes es la causa más probable de sus infecciones? (A) Escherichia coli productora de toxina termoestable (B) Escherichia coli con antígeno K1 (capsular tipo 1) (C) Escherichia coli O139 (lipopolisacárido O antígeno 139) (D) Escherichia coli con pilosidades P (fimbrias) (E) Escherichia coli O157:H7 (lipopolisacárido O antígeno 157; antígeno flagelar 7) 14. Un varón de 55 años de edad manifiesta pérdida de peso progre- siva, dolor abdominal, diarrea y artropatía. Durante la valoración se lleva a cabo una biopsia de intestino delgado. Después de pre- parar y examinar la muestra bajo el microscopio de luz se obser- van cuerpos de inclusión positivos con ácido peryódico-Schiff (PAS) en la pared intestinal. ¿Cuál de los siguientes estudios se debe realizar para confirmar el diagnóstico de enfermedad de Whipple, causada por Tropheryma whipplei? (A) Cultivo en agar (B) Amplificación y secuencia de un segmento adecuado de DNA con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (C) Cocultivo con Escherichia coli (D) Hibridación in situ (E) Prueba directa de anticuerpos fluorescentes 15. ¿Cuál de los siguientes describe mejor el mecanismo de acción de la toxina diftérica? (A) Forma poros en los eritrocitos provocando hemólisis (B) Degradalalecitinaenlasmembranasdelascélulaseucariotas (C) Provoca la liberación de factor de necrosis tumoral (D) Inhibe al factor de alargamiento 2 (E) Provoca mayor actividad de la adenilato ciclasa Respuestas 1. E 2. B 3. E 4. D 5. A 6. C 7. E 8. A 9. D 10. A 11. B 12. D 13. D 14. B 15. D BIBLIOGRAFÍA Barton LL: Structural and Functional Relationships in Prokaryotes. Springer, 2005. Coburn B, Sekirov, Finlay BB: Type III secretion systems and disease. Clin Microbiol Rev 2007;20:535. Fredricks DN, Relman DA: Sequence-based identification of micro- bial pathogens: a reconsideration of Koch’s postulates. Clin Microbiol Rev 1996;9:18. Götz F: MicroReview: Staphylococcus and biofilms. Mol Microbiol 2002;43:1367. Nickerson CA, Schurr MJ (editors): Molecular Paradigms of Infec- tious Disease: A Bacterial Perspective. Springer, 2006. Ramachandran G. Gram-positive and gram-negative bacterial toxins in sepsis. Virulence 2014;5:213-218. Relman DA, Falkow S: A molecular perspective of microbial patho- genicity. In: Bennett JE, Dolin R, Blaser MJ (editors). Mandell, Douglas and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Dis- eases, 8a. ed. Elsevier, 2015. Schmidt H, Hensel M: Pathogenicity islands in bacterial pathogen- esis. Clin Microbiol Rev 2004;17:14. Schroeder GN, Hilbi H: Molecular pathogenesis of Shigella spp.: controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev 2008;21:134. Sun F, Qu F, Ling Y, et al.: Biofilm-associated infections: antibiotic resistance and novel therapeutic strategies. Future Microbiol 2013;8:877-886. Wilson BA, Salyers AA, Whitt DD, Winkler ME: Bacterial Patho- genesis, 3a. ed. American Society for Microbiology, 2011. apter 09_Carroll_4R.indd 167 apter 09_Carroll_4R.indd 167 14/04/16 14/04/16
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- 182. 169 10 Microbiota normal del cuerpohumano C A P Í T U L O El término “microflora normal” se refiere a la población de microorganismos que habita en la piel y mucosas de las perso- nas sanas. Se calcula que el número de microorganismos que viven dentro del ser humano (ahora llamados microbiota nor- mal) es 10 veces mayor que el número de células somáticas y germinativas. Los genomas de estos simbiontes microbióticos se denominan en conjunto, microbioma. La investigación ha demostrado que la “microbiota normal” proporciona la pri- mera línea de defensa contra los microorganismos patógenos, ayuda a la digestión, participa en la degradación de toxinas y contribuye a la maduración del sistema inmunitario. Los cam- bios en esta microbiota normal, o la inflamación originada por estos comensales, generan enfermedades como la enfermedad intestinal inflamatoria. PROYECTO DEL MICROBIOMA HUMANO En un intento por comprender la participación de los ecosis- temas microbianos residentes en la salud y la enfermedad del ser humano, en el año 2007 los National Institutes of Health lanzaron el Proyecto Microbioma humano (Human Micro- biome Project). Una de las metas principales de este proyecto es entender la amplia diversidad genética y fisiológica humana, el microbioma y los factores que repercuten en la distribución y evolución de los microorganismos que los forman. Uno de los aspectos de este proyecto consiste en contar con varios gru- pos de investigación que emprendan simultáneamente el es- tudio de las comunidades microbianas que viven en la piel y mucosas del ser humano, como la boca, esófago, estómago, colon y vagina, utilizando secuencias genéticas de subunida- des pequeñas (16S) de RNA ribosómico. Entre las interrogan- tes que abordan este proyecto son: ¿Cuál es la estabilidad y resistencia de la microbiota de cada persona a lo largo de un día y en el transcurso de toda su vida? ¿Qué tan similares son los microbiomas entre los integrantes de una familia, de una comunidad, o entre las comunidades en distintos ambientes? ¿Todos los seres humanos tienen un microbioma central identi- ficable y, si lo tienen, cómo se adquiere y transmite? ¿Qué re- percute en la diversidad genética del microbioma y cómo reper- cute esta diversidad en la adaptación de los microorganismos y el hospedador a un estilo de vida distinto y a diversos esta- dos fisiológicos o fisiopatológicos? Ya se han realizado nume- rosas observaciones. Por ejemplo, se ha establecido que exis- ten grandes diferencias entre los individuos en cuanto al número y tipo de especies de microorganismos que habitan en el colon y que la obesidad quizá guarde relación con los tipos de microbios que participan en determinadas vías metabólicas del aparato digestivo. El lector debe advertir que este campo está evolucionando con rapidez y que los conocimientos que se tienen sobre la microbiota humana cambiarán a medida que se obtenga más información sobre las comunidades microbia- nas naturales gracias al Human Microbiome Project. IMPORTANCIA DE LA MICROBIOTA NATURAL La piel y las mucosas siempre albergan diversos microorga- nismos que se pueden clasificar en dos grupos: 1) la micro- biota natural que consta de variedades relativamente fijas de microorganismos que suelen encontrarse en determinada región y a determinada edad; si se altera, de inmediato se res- tablece; y 2) la microbiota transitoria, que consta de microor- ganismos apatógenos o potencialmente patógenos que habitan en la piel o las mucosas durante varias horas, días o semanas. Esta microbiota transitoria es consecuencia del ambiente, no genera enfermedades ni se establece de manera permanente en la superficie. Los miembros de la microflora transitoria por lo general tienen poca importancia siempre y cuando la micro- flora natural normal permanezca intacta. No obstante, si la microbiota natural se altera, los microorganismos transitorios colonizan, proliferan y generan enfermedades. Los microorganismos encontrados con mayor frecuen- cia en las muestras obtenidas de diversas partes del cuerpo humano, consideradas microbiota normal, se enumeran en el cuadro 10-1. En el capítulo 21 se describe la clasificación de la microflora bacteriana anaerobia normal. Es probable que los microorganismos que se cultivan en el laboratorio representen sólo una fracción de los que forman la microbiota natural o transitoria. Cuando se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa de amplio espectro (PCR, polyme- rase chain reaction) para amplificar el rDNA 16S bacteriano, es posible identificar numerosas bacterias antes no detectadas, como sucede en las secreciones de las pacientes con vagino- sis bacteriana. Se ha demostrado que el número de especies que forman la microbiota normal es mucho mayor de lo que se sabía. Por lo tanto, los conocimientos sobre la microbiota normal se encuentran en transición. Como ya se mencionó, es probable que cambie la relación entre los microorganismos antes no identificados, que potencialmente forman parte de la microbiota normal, y la enfermedad. Los microorganismos con presencia constante en las superficies corporales a menudo se describen como comensales apter 10_Carroll_4R.indd 169 apter 10_Carroll_4R.indd 169 14/04/16 14/04/16
- 183. 170 SECCIÓN IIIBacteriología CUADRO 101 Microbiota bacteriana normal Piel Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus (pequeña cantidad) Especies de Micrococcus Estreptococo α-hemolítico y no hemolítico (p. ej., Streptococcus mitis) Especies de Corynebacterium Especies de Propionibacterium Especies de Peptostreptococcus Especies de Acinetobacter Pequeñas cantidades de otros microorganismos (especies de Candida, Pseudomonas aeruginosa, etc.) Nasofaringe Cualquier cantidad de los siguientes: difteroides, especies no patógenas de Neisseria, estreptococo hemolítico ; S. epidermidis, estreptococo no hemolítico, anaerobios (muchas especies para enumerarlas; distintas cantidades de especies de Prevotella, cocos anaerobios, especies de Fusobacterium, etc.) Menor cantidad de los siguientes cuando se acompaña de los microorganismos antes enumerados: levaduras, especies de Haemophilus, neumococos, S. aureus, bacilos gramnegativos, Neisseria meningitidis Tubo digestivo y recto Diversas Enterobacterias con excepción de Salmonella, Shigella, Yersinia, Vibrio y especies de Campylobacter Bacilos gramnegativos no fermentadores de glucosa Enterococos Estreptococo hemolítico α y no hemolítico Difteroides Pequeñas cantidades de Staphylococcus aureus Pequeñas cantidades de levaduras Grandes cantidades de anaerobios (demasiadas especies para enumerarlas) Genitales Cualquier cantidad de los siguientes: especies de Corynebacterium, especies de Lactobacillus, estreptococo hemolítico α y no hemolítico, especies no patógenas de Neisseria Los siguientes cuando son mixtos y no predominantes: enterococos, Enterobacteriaceae y otros bacilos gramnegativos, Staphylococcus epidermidis, Candida albicans y otras levaduras Anaerobios (demasiados para enumerarlos); los siguientes son importantes cuando crecen en cultivo puro o claramente predominante: especies de Prevotella, Clostridium y especies de Peptostreptococcus (esto es, que uno se beneficia mientras el otro parece no resul- tar afectado). Sin embargo, en algunos sitios (p. ej., el intestino) el mutualismo (es decir, ambos participantes se benefician) puede ser una mejor descripción de tal relación. Su prolifera- ción en determinada área depende de ciertos factores fisiológi- cos como temperatura, humedad, y determinados nutrientes y sustancias inhibidoras. Su existencia no es indispensable para la vida, puesto que es posible criar animales “sin gérmenes” en ausencia completa de microbiota normal. Sin embargo, la microflora natural de ciertas áreas tiene una función deter- minante en la conservación de la salud y la función normal. Los miembros de la microbiota natural del aparato digestivo sintetizan vitamina K y ayudan a la absorción de nutrientes. En las mucosas y piel, la microbiota natural impide la coloniza- ción por microorganismos patógenos y quizá las enfermedades a través de la “interferencia bacteriana”. Es probable que el mecanismo de la interferencia bacteriana consista en la compe- tencia por los receptores o sitios de unión en las células hospe- dadoras, competencia por los nutrientes, inhibición mutua por medio de productos metabólicos o tóxicos, inhibición mutua por medio de materiales antibióticos o bacteriocinas o en otros mecanismos. La supresión de la microbiota normal evidente- mente crea un vacío local parcial que tiende a ser llenado por microorganismos del ambiente o de otras regiones del cuerpo. Estos microorganismos se comportan como oportunistas y se pueden convertir en patógenos. Por otro lado, los miembros de la flora normal generan enfermedades en ciertas circunstancias. Estos microorganis- mos se han adaptado a la forma no invasora de vida defini- da por las limitaciones del ambiente. Si se les separa forzada- mente de las limitaciones de ese entorno y se les introduce en la circulación sanguínea o los tejidos, estos microorganismos pueden volverse patógenos. Por ejemplo, los estreptococos del grupo viridans son los microorganismos naturales más comunes de las vías respiratorias altas. Si se introduce un gran número de ellos en el torrente sanguíneo (p. ej., después de una extracción dental o una intervención quirúgica bucal), pueden alojarse en las válvulas cardiacas deformadas o prótesis val- vulares y generar endocarditis infecciosa. Con traumatismos menores (limpieza dental o cepillado vigoroso), un pequeño número de estos microorganismos aparece transitoriamente en la circulación. Las especies de Bacteroides son las bacte- rias naturales más frecuentes del intestino grueso y son ino- cuas en ese lugar. Sin embargo, si se introducen en la cavidad peritoneal o los tejidos pélvicos junto con otras bacterias como resultado de un traumatismo, provocan supuración y bacterie- mia. Hay muchos otros ejemplos, pero lo importante es que la microflora natural normal es inocua e incluso favorable en su ubicación normal dentro del hospedador y en ausencia de otras anomalías; causan enfermedades cuando un gran número se introduce en otra ubicación siempre y cuando existan factores predisponentes. apter 10_Carroll_4R.indd 170 apter 10_Carroll_4R.indd 170 14/04/16 14/04/16
- 184. CAPÍTULO 10 Microbiotanormal del cuerpo humano 171 MICROBIOTA NORMAL DE LA PIEL La piel es el órgano más grande del cuerpo humano, coloni- zada por una amplia variedad de microorganismos, la mayor parte de los cuales son inofensivos o incluso beneficiosos para el hospedador. La piel, al estar expuesta de manera constante al ambiente y en contacto con el mismo, es un medio idóneo para contener microorganismos transitorios. Sin embargo, hospeda a una flora natural constante y definida que es modificada en distintas regiones anatómicas por las secreciones, el uso habi- tual de prendas de vestir o la proximidad a las mucosas (boca, nariz y región perineal) (figura 10-1). Los microorganismos predominantes de la piel son bacilos difteroides aerobios y anaerobios (p. ej., Corynebacterium, Pro- pionibacterium); estafilococo no hemolítico tanto aerobio como anaerobio (S. epidermidis y otros estafilococos coagulasa-nega- tivos, en ocasiones Staphylococcus aureus y especies de Peptos- treptococcus); bacilos grampositivos, aerobios y formadores de esporas ubicuos en aire, agua y tierra; estreptococo hemolítico α (estreptococo viridans) y enterococos (especies de Enterococ- cus); y bacilos coliformes gramnegativos y Acinetobacter. En los pliegues cutáneos con frecuencia existen hongos y levaduras; en las áreas donde abundan las secreciones sebáceas (genitales, oído externo) existen micobacterias no patógenas. Los principales factores para eliminar a los microorganis- mos extraños de la piel son el pH bajo, los ácidos grasos de las secreciones sebáceas y la presencia de lisozimas. Ni la sudora- ción profusa ni el hecho de lavarse las manos o bañarse elimina o modifica de manera considerable la microflora natural nor- mal. Se puede reducir el número de microorganismos superfi- ciales si se frota diaria y vigorosamente con jabón que contenga hexaclorofeno o algún otro desinfectante, pero la microflora se restituye rápidamente a partir de las glándulas sebáceas y sudoríparas, incluso cuando se excluye por completo el con- tacto con otras áreas de la piel o con el ambiente. La aplica- ción de un apósito oclusivo en la piel tiende a provocar un gran aumento de la población total de microorganismos y también genera alteraciones cualitativas de la microflora. Las bacterias tanto anaerobias como aerobias a menudo se unen y producen infecciones sinérgicas (gangrena, fascitis necrosante, celulitis) de la piel y tejidos blandos. Con frecuen- cia las bacterias forman parte de la flora microbiana normal. Casi siempre es difícil señalar el microorganismo específico que causa la lesión progresiva, puesto que por lo general parti- cipan mezclas de microorganismos. Además de ser una barrera física, la piel es una barrera inmunológica. Los queratinocitos comprueban continuamente la microbiota que coloniza la superficie cutánea por medio de receptores de reconocimiento de patrones (p. ej., recepto- res tipo Toll, receptores de manosa, receptores tipo NOD). La activación de los receptores de reconocimiento de patrones de los queratinocitos a través de los patrones moleculares del microorganismo patógeno, desencadena una respuesta inmu- nitaria innata, que tiene como resultado la secreción de pép- tidos antimicrobianos, citocinas y quimiocinas. A pesar de estar constantemente expuesta a un gran número de microor- ganismos, la piel puede distinguir entre comensales inocuos y microorganismos patógenos nocivos. El mecanismo para lograr esta selectividad se desconoce. MICROBIOTA NORMAL DE LA BOCA Y VÍAS RESPIRATORIAS ALTAS La flora de la nariz consta de corinebacterias, estafilococos (S. epidermidis, S. aureus) y estreptococos importantes. A diferencia de las comunidades altamente diferenciadas de las madres, los recién nacidos albergaban comunidades bac- terianas indiferenciadas en los diversos hábitats del organismo, sin importar la vía del nacimiento. Por lo tanto, durante la pri- mera etapa del desarrollo de comunidades (< 5 min después del parto), la microbiota humana se distribuye de manera homogé- nea en el cuerpo. Los lactantes que nacen por vía vaginal alber- gan comunidades bacterianas (en todos los hábitats del cuerpo) con una composición muy similar a las comunidades vaginales de las madres; los recién nacidos que nacen por cesárea care- cen de bacterias de la comunidad vaginal (p. ej., Lactobacillus, Prevotella, Atopoboium y especies de Sneathia ). Los neonatos que nacen por cesárea albergan comunidades bacterianas (en todos los hábitats del cuerpo) que son más similares a las co- munidades cutáneas de la madre (p. ej., Staphylococcus, Cory- nebacterium o especies de Propionibacterium). En las primeras 4 a 12 h después del nacimiento, los estrep- tococos viridans se establecen como el integrante principal de la flora normal y lo sigue siendo toda la vida. Estos microorga- nismos probablemente se originan en el aparato respiratorio de la madre y las personas que la atendieron. Muy pronto se agre- gan estafilococos aerobios y anaerobios, diplococos gramnega- tivos (Neisseria, Moraxella catarrhalis), difteroides y algunos lactobacilos. Cuando emergen los dientes se establecen espiro- quetas anaerobias, especies de Prevotella (en especial Prevotella melaninogenica), especies de Fusobacterium, especies de Rothia y de Capnocytophaga (véase más adelante), además de algu- nos vibrios anaerobios y lactobacilos. Normalmente hay espe- cies de Actinomyces en el tejido amigdalino y las encías de los adultos, que algunas veces se acompañan de diversos proto- zoarios. En la boca existen levaduras (especies de Candida). En la tráquea y faringe se establece una microflora simi- lar, pero en los bronquios normales se encuentran muy pocas bacterias. Los bronquios pequeños y los alvéolos normalmente son estériles. Los microorganismos que predominan en las vías respiratorias altas, en especial la faringe, son estreptococos no hemolíticos y hemolíticos-α y Neisserias. También se observan estafilococos, difteroides, Haemophylus, neumococos, micos- plasmas y Prevotella. Se han descrito más de 600 especies en la cavidad bucal del ser humano, pero existe muy poca información sobre la microbiota normal de las personas sanas. El microbioma bucal humano, representado por el microbioma salival, se estudió en fecha reciente en muestras obtenidas de 120 individuos sanos de 12 regiones del mundo por medio de secuencias de rRNA 16S. El microbioma salival posee una diversidad considerable, tanto dentro de un mismo individuo como entre un individuo y otro; sin embargo, no varía mucho en el mundo. Las secuencias rRNA 16S pudieron asignarse a 101 géneros de bacterias cono- cidas, de los cuales 39 no habían sido notificados previamente en la cavidad bucal del ser humano; el análisis filogenético sugiere que también existen otros 64 géneros desconocidos. Las infecciones de la boca y el aparato respiratorio por lo general son causadas por la flora buconasal mixta, incluidos apter 10_Carroll_4R.indd 171 apter 10_Carroll_4R.indd 171 14/04/16 14/04/16
- 185. 172 SECCIÓN IIIBacteriología Glabella Pliegue alar Conducto auditivo externo Narinas Manubrio Cúpula axilar Fosa cubital anterior Cara volar del antebrazo Porción hipotenar de la palma de la mano Espacio interdigital Pliegue inguinal Ombligo Espacios interdigitales de los pies Pliegue retroauricular Occipucio Espalda Nalgas Pliegue glúteo Fosa poplítea Talón Sebáceas Húmeda Secas Actinobacterias Bacteroidetes Proteobacterias Divisiones que contribuyen a menos de 1% Sin clasificar Cyanobacteria Firmicutes Corynebacteriaceae Propionibacteriaceae Micrococciaceae Otras actninobacterias Otros firmicutes Staphylococcaceae FIGURA 101 Distribución topográfica de las bacterias en las regiones cutáneas. El microbioma cutáneo depende en gran parte del microambiente de la región de donde se obtiene la muestra. Se señala la clasificación a nivel de familias de las bacterias que colonizan a un sujeto con la fila en negritas. Las regiones seleccionadas fueron las que exhibían cierta predilección por las infecciones cutáneas bacterianas y se agrupan en sebáceas o grasas (círculos azules); húmedas (típicamente los pliegues cutáneos; círculos verdes) y superficies secas u opacas (círculos rojos). Las regiones sebáceas son la glabela (entre las cejas), el pliegue alar (a los lados de las narinas); el conducto auditivo externo [dentro del oído]), el plieque retroauricular (detrás del pabellón auricular), el occipucio (detrás de la cabeza), el pliegue cubital anterior (cara interna del codo), los pliegues interdigitales (entre los dedos medio y anular), el pliegue inguinal (dentro de la ingle), el pliegue glúteo (la parte superior del pliegue entre los glúteos), la fosa poplítea (detrás de la rodilla), el talón plantar (porción inferior del talón del pie), espacios interdigitales de los pies y ombligo. Las regiones secas son la cara volar del antebrazo (cara interna del antebrazo), porción hipotenar de la palma (porción de la palma proximal al dedo meñique) y glúteo. (Reimpresa con autorización de Macmillan Publishers Ltd.: Grice EA, Segre JA, The Skin microbiome. Nat Rev Microbiol 2011;9:244-253. Copyright © 2011.) apter 10_Carroll_4R.indd 172 apter 10_Carroll_4R.indd 172 14/04/16 14/04/16
- 186. CAPÍTULO 10 Microbiotanormal del cuerpo humano 173 anaerobios. Las infecciones periodontales, abscesos peribu- cales, sinusitis y mastoiditis por lo general son causados por P. melaninogenica, Fusobacteria y Peptostreptococci. La aspira- ción de la saliva (que contiene hasta 102 de estos microorganis- mos aerobios) genera neumonía necrosante, absceso pulmonar y empiema. Importancia de la microbiota bucal normal en la placa bacteriana y caries dental La placa bacteriana, que se ha considerado y tratado como una biopelícula compleja, se define de manera sencilla como el depósito dental adherente que se forma en la superficie de los dientes y se compone casi por completo de bacterias deri- vadas de la microflora normal de la boca (figura 10-2). La placa bacteriana es la biopelícula más frecuente y densa en el ser humano. Las ventajas para los microorganismos de la biope- lículaincluyenproteccióndelospeligrosambientales(incluidos los antimicrobianos) y optimización de la disposición espacial, lo que aumenta al máximo la energía mediante el movimiento de nutrientes. Los microorganismos de la biopelícula interac- túan de manera dinámica en muchos niveles tanto metabóli- cos como moleculares. La biopelícula inicialmente se forma en relación con la película dental, que es una capa orgánica delgada y fisiológica que cubre la superficie mineralizada del diente y está formada por proteínas y glucoproteínas derivadas de la saliva y otras secreciones bucales (figura 10-2). La placa crece en relación con la película y no sobre el diente minerali- zado mismo. La placa se forma en etapas y capas en dos niveles. El primero es la ubicación anatómica de la placa en relación con la línea gingival. La placa más incipiente es supragingival y luego se extiende hacia la región subgingival. El segundo nivel es la formación de capas dentro de la misma placa, las espe- cies de bacterias albergadas y los mecanismos de unión entre bacterias-película y bacterias-bacterias. Los microorganismos iniciales son principalmente bacterias grampositivas que uti- lizan interacciones iónicas e hidrofóbicas específicas además de estructuras superficiales como lectina para adherirse a la película y a otras bacterias. El colonizador prototipo inicial es Streptococcus sanguis, pero casi siempre existen otros estrep- tococos (S. mutans, S. mitis, S. salivarius, S. oralis, S. gordo- nii), lactobacilos y especies de Actinomyces. Los pobladores tardíos aparecen en la biopelícula de dos a cuatro días después y constan principalmente de anaerobios gramnegativos (p. ej., Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, especies de Veillo- nella) incluidas espiroquetas anaerobias (p. ej., Treponema den- ticola) y más especies de Actinomyces. Estas bacterias utilizan mecanismos similares para fijarse a los pobladores iniciales y a otras bacterias. Sintetizan polímeros de glucano extracelular de alto peso molecular, que actúan como cemento que une a las capas de la placa. Los polímeros de carbohidrato (glucanos) son producidos principalmente por estreptococos (Strepto- coccus mutans), quizá en combinación con especies de Acti- nomyces. En total se cree que hay entre 300 y 400 especies de bacterias en una placa dental madura. La caries es una desintegración de los dientes que empieza en la superficie y avanza hacia el interior. Primero se desmine- raliza el esmalte superficial, que carece de células. Este fenó- meno se atribuye al efecto que tienen los productos ácidos de la actividad metabólica glucolítica cuando las bacterias de la placa se alimentan con el sustrato correcto. La descomposición ulterior de la dentina y el cemento de la superficie expuesta de la raíz comprende la digestión bacteriana de la matriz proteí- nica. Se considera que el microorganismo dominante al prin- cipio de la caries es S. mutans; sin embargo, muchos miembros de la biopelícula participan en la evolución de estas lesiones. Estos comprenden a otros estreptococos (S. salivarius, S. san- guis, S. sobrinus), lactobacilos (L. acidophilus, L. casei) y acti- nomicetos (A. viscosis, A. naeslundii). La causa fundamental de las caries es la gran cantidad de productos ácidos orgánicos producidos a partir de los carbohidratos por la interacción de S. mutans con estas otras especies de la placa. La acumulación de estos productos ácidos provoca el descenso del pH de la placa lo suficiente como para reaccionar con la hidroxiapatita del esmalte desmineralizándolo hasta formar calcio soluble y iones fosfato. La producción de ácido y el pH bajo se mantie- nen hasta que se agota el sustrato, después de lo cual el pH de la placa vuelve a una cifra más neutra de reposo y se produce cierta recuperación. Los monosacáridos de la alimentación (p. ej., glucosa, fructuosa) y disacáridos (p. ej., sacarosa, lactosa y maltosa) ofrecen un sustrato adecuado para la glucólisis bacteriana (capítulo 6) y la producción de ácido que genera desmineraliza- ción del diente. Los alimentos con un alto contenido de azúcar, principalmente sacarosa, que se adhiere al diente y se elimina en un tiempo más prolongado, son más cariógenos que los ali- mentos con menos retención, como los líquidos que contienen azúcar. Una ventaja posible de S. mutans es su capacidad de metabolizar sacarosa de manera más eficiente que otras bac- terias bucales. Otro factor es que también se necesita sacarosa para sintetizar poliglicanos extracelulares como dextranos y levanos a través de las enzimas transferasas en la superficie celular bacteriana. La producción de poliglicanos contribuye a la agregación y acumulación de S. mutans en la superficie den- tal y además sirve como depósito extracelular de sustrato para otras bacterias de la placa. Las bolsas periodontales de las encías son fuentes especial- mente abundantes de microorganismos, incluidos anaerobios, que rara vez se encuentran en otros sitios. La enfermedad perio- dontal inducida por la placa comprende dos trastornos distin- tos, gingivitis y periodontitis crónica. Ambos trastornos son causados por las bacterias de la placa bacteriana subgingival encontradas dentro del surco gingival o el surco que rodea al cuello dental. La periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica inducida por una biopelícula que afecta los tejidos que dan sustento a la dentadura. Aunque la biopelícula asociada a la dentadura participa de manera determinante en el inicio y progresión de la periodontitis, es primariamente la respuesta inflamatoria del hospedador la que propicia el daño periodon- tal, lo cual desemboca en pérdida de dientes en algunos casos. Se ha propuesto la hipótesis de que Porphyromonas gingivalis deteriora la inmunidad innata en formas que alteran el creci- miento y desarrollo de la biopelícula completa, lo que desenca- dena un rompimiento de la interacción homeostática normal entre hospedador y microbiota en el periodonto. Si bien con- tribuyen a la enfermedad periodontal y destrucción del tejido, llaman más la atención cuando se implantan en otros sitios (p. ej., cuando causan endocarditis infecciosa o bacteriemia en apter 10_Carroll_4R.indd 173 apter 10_Carroll_4R.indd 173 14/04/16 14/04/16
- 187. 174 SECCIÓN IIIBacteriología Estaterina Fragmento de una célula bacteriana Mucinas siálicas Amilasa α Aglutinina salival Fragmento de una célula bacteriana Proteína rica en prolina Proteína rica en prolina Fragmento de célula bacteriana Superficie dental Película adquirida del esmalte Streptococcus gordonii Streptococcus oralis Streptococcus gordonii Colonizadores tardíos Colonizadores precoces A c t i n o m y c e s n a e s l u n d i i Porphyromonas gingivalis Veillonella atypica T r e p o n e m a s p p . Fusobacterium nucleatum Propionibacterium acnes Actinobacillus actinomycetemcomitans H a e m o p h i l u s p a r a i n f l u e n z a e Streptococcus cralis Streptococcus mitis Streptococcus sanguis FIGURA 102 Biopelícula de la placa dental. Se muestran las etapas de la formación de la bioplaca bacteriana denominada placa dental. Los primeros pobladores se adhieren a la película y los pobladores tardíos se adhieren a las otras bacterias. (Reimpresa con autorización de Willey J, Sherwood L, Woolverton C, [editores). Prescott’s Principles of Microbiology. McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) un hospedador granulocitopénico). Dos ejemplos son las espe- cies de Capnocytophaga y Rothia dentocariosa. Las especies de Capnocytophaga son anaerobios deslizantes fusiformes gram- negativos; las especies de Rothia son bacilos pleomorfos, aero- bios, grampositivos. En los pacientes inmunodeprimidos con granulocitopenia, este fenómeno puede generar lesiones opor- tunistas graves en otros órganos. Para detener la caries es necesario extirpar la placa, redu- cir el consumo de sacarosa, alimentarse bien con un consumo suficiente de proteínas y reducir la producción de ácido en la boca con la disminución de los carbohidratos disponibles y la limpieza frecuente. La aplicación de flúor en los dientes o su ingestión en el agua mejora la resistencia ácida del esmalte. Para detener la enfermedad periodontal es necesario extirpar apter 10_Carroll_4R.indd 174 apter 10_Carroll_4R.indd 174 14/04/16 14/04/16
- 188. CAPÍTULO 10 Microbiotanormal del cuerpo humano 175 los cálculos (depósitos calcificados) y tener una buena higiene bucal. Microbiota normal del intestino El aparato digestivo del ser humano se divide en secciones, que permiten separar la digestión y absorción de nutrientes en la región proximal de la gran cantidad de poblaciones microbia- nas presentes en el intestino grueso. Al nacer, el intestino es estéril, pero poco después se introducen microorganismos con el alimento. El ambiente (p. ej., la microbiota vaginal materna, la fecal o la cutánea) constituye un factor fundamental para establecer el perfil microbiano inicial. En muchos de los prime- ros estudios se publicaba que en la microbiota intestinal de los lactantes alimentados con leche materna predominaba Bifido- bacteria. Sin embargo, estudios más recientes con técnicas de micromatriz y PCR cuantitativa indicaron que en la mayoría de los recién nacidos la Bifidobacteria no aparecía sino hasta varios meses después del nacimiento y de ahí en adelante per- sistía en el menor número de los casos. En los niños alimenta- dos con biberón, hay una flora más mixta en el intestino y los lactobacilos son menos predominantes. Conforme los hábitos alimenticios adquieren el patrón del adulto, la microflora intes- tinal cambia. La alimentación repercute de manera significa- tiva en la composición relativa de la microflora tanto intestinal como fecal. Por ejemplo, se ha demostrado que los individuos que consumen una dieta basada en productos animales tienen una mayor abundancia de microorganismos tolerantes a la bilis (Alistipes, Bilophilia y Bacteroides) y menores concentraciones de Firmicutes que metabolizan los polisacáridos de verduras de la dieta (Roseburia, Eubacterium rectale y Ruminococcus bro- mii). El intestino del recién nacido en cuidados intensivos tiende a estar colonizado por Enterobacteriaceae como Kleb- siella, Citrobacter y Enterobacter. En el adulto sano, el esófago contiene microorganismos que llegan con la saliva y los alimentos. La acidez del estómago mantiene a los microorganismos en un mínimo (102 a 103 /ml de contenido) a menos que la obstrucción del píloro facilite la pro- liferación de cocos y bacilos grampositivos. De los cientos de filotipos detectados en el estómago humano, sólo Helicobacter pylori persiste en este ambiente. El pH normalmente ácido del estómago lo protege contra la infección por diversos microor- ganismos intestinales patógenos (p. ej., Vibrio cholerae). La administración de antiácidos, antagonistas de los receptores de H2 e inhibidores de la bomba de protones para la úlcera péptica y el reflujo gastroesofágico aumenta de manera considerable la flora microbiana del estómago, incluidos diversos microorga- nismos que por lo general están en las heces fecales. A medida que el pH del contenido intestinal se alcaliniza, la flora resi- dente aumenta de manera gradual. En el duodeno del adulto hay 103 a 104 bacterias/ml de líquido emitido; con poblaciones más altas en el yeyuno, 104 a 105 bacterias/ml, e íleo, 108 bacte- rias/ml; y en el ciego y colon transverso, 1011 a 1012 bacterias/ml, que es la cifra más alta registrada en cualquier hábitat micro- biano. En la parte alta del intestino, la población bacteriana de la mucosa comprende al filum Bacteriodetes y miembros de Clostridiales y en la luz se observan miembros de Enterobac- teriales y enterococos. En el colon sigmoides y recto, las bac- terias constituyen cerca del 60% de la masa fecal. El número de anaerobios es 1000 veces mayor que los microorganismos facultativos. Durante la diarrea, el contenido bacteriano dis- minuye de manera considerable, pero en la estasis intestinal la cuenta aumenta. En el colon del adulto sano, entre 96 y 99% de la flora bacteriana consta de anaerobios. Predominan seis filas prin- cipales; éstas son Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Verrucomicrobiota, Fusobacteria y Proteobacteria. La flora fecal normal contiene más de 100 tipos distintos de microorga- nismos, que se pueden cultivar en los laboratorios. Las Archae están representadas sobre todo por el productor de metano Methanobrevibacter smithii, un microorganismo poco abun- dante que participa de manera importante en la estabilización de comunidades microbianas en el intestino. Quizá existen más de 500 especies de bacterias en el colon y muchas más que probablemente se desconocen. Además de Bacteria y Archae hay otros microorganismos como protozoarios y hongos cuyas funciones son menos conocidas. En el colon son muy frecuen- tes los virus, principalmente bacteriófagos cuyos hospedadores son miembros importantes de la microbiota. Un traumatismo menor (p. ej., sigmoidoscopia, enema opaco) induce una bacte- riemia transitoria en 10% de los procedimientos. Las funciones importantes de la microbiota intestinal se dividen en tres categorías principales (véase la revisión de O’Hara y Shanagan, 2006). Las primeras son funciones pro- tectoras, en las que las bacterias desplazan e inhiben a los microorganismos patógenos potenciales en forma indirecta al competir por los nutrientes y receptores o bien directamente al producir factores antimicrobianos como bacteriocinas y ácido láctico. En segundo lugar, los microorganismos comen- sales son importantes para la formación y función del sistema inmunitario de las mucosas. Inducen la secreción de IgA, esti- mulan el desarrollo del sistema inmunitario humoral intes- tinal y modulan las respuestas locales de linfocitos T y los perfiles de citocinas. La tercera categoría consta de una gran variedad de funciones metabólicas. La microbiota del intestino delgado contribuye a las necesidades de aminoácidos del hos- pedador cuando no los obtiene de la alimentación. Las bacte- rias intestinales producen ácidos grasos de cadena corta que regulan la diferenciación de las células epiteliales intestinales. Sintetizan vitamina K, biotina y folato, y fomentan la absorción de iones. Algunas bacterias metabolizan carcinógenos alimen- ticios y ayudan con la fermentación del residuo alimenticio que no se digiere. Ahora se sabe que las bacterias intestinales pue- den influir en el depósito de grasa del hospedador y provocar obesidad. Las archae metanógenos son componentes de menor importancia de la microbiota del intestino. Sin embargo, su capacidad de reducir los compuestos orgánicos pequeños (p. ej., CO2 , ácido acético, ácido fórmico y metanol) en metano en presencia de H2 , tiene consecuencias significativas debido a que la eliminación de exceso de hidrógeno por metanogénesis impide la inhibición de deshidrogenasa de NADH bacteriana. Esto, a su vez, conducirá a un incremento de la producción de ATP por el metabolismo bacteriano (capítulo 6) y una mayor obtención de energía de la dieta. En el ser humano, los antimicrobianos que se adminis- tran por vía oral suprimen en forma temporal los componen- tes sensibles a los fármacos de la microflora fecal. Los efectos apter 10_Carroll_4R.indd 175 apter 10_Carroll_4R.indd 175 14/04/16 14/04/16
- 189. 176 SECCIÓN IIIBacteriología inmediatos del tratamiento antimicrobiano sobre la microbiota intestinal natural van desde una diarrea que se resuelve en forma espontánea hasta una colitis pseudomembranosa grave. La supresión intencional de la microflora fecal casi siempre se lleva a cabo con la administración preoperatoria de fármacos insolubles por vía oral. Por ejemplo, la neomicina con eritro- micina suprime en uno o dos días una parte de la microflora intestinal, en especial a los aerobios. El metronidazol tiene la misma función pero con anaerobios. Si se lleva a cabo una operación de la porción final del intestino cuando el recuento de microorganismos es menor, es posible proteger contra las infecciones por un derrame accidental. Sin embargo, poco des- pués el recuento de la microflora fecal aumenta hasta alcan- zar la cifra normal o incluso una cifra mayor, principalmente de microorganismos seleccionados por su resistencia relativa a los fármacos utilizados. Los microorganismos sensibles al fármaco son sustituidos por microorganismos resistentes, en especial estafilococos, enterobacterias, enterococos, proteus, pseudomonas, Clostridium difficile y levaduras. El consumo de grandes cantidades de Lactobacillus aci- dophilus permite el establecimiento temporal de este microor- ganismo en el intestino y la supresión parcial concomitante de otra microflora intestinal. El trasplante de microbiota fecal (FMT, fecal microbiota transplantation), también conocido como trasplante de heces, es el proceso de trasplantar bacterias fecales de un individuo sano a un receptor. Se ha utilizado con éxito como tratamiento de pacientes con infección por C. difficile (capítulo 11). La hipótesis que sustenta el éxito del FMT se apoya en el concepto de interfe- rencia bacteriana, es decir, el uso de bacterias inofensivas para desplazar bacterias patógenas. El FMT restablece la microbiota colónica a su estado natural mediante la sustitución de especies de Bacteroides y Firmicutes perdidos. Sin embargo, estudios recientes sugieren que pueden ser importantes otros factores. La flora anaerobia del colon, incluidos B. fragilis, clostri- dios y peptoestreptococos, participa en la formación de los abscesos que se originan durante la perforación intestinal. Prevotella bivia y Prevotella disiens son importantes en los abscesos de la pelvis que se forman en los órganos genitales femeninos. Al igual que B. fragilis, estas especies son resisten- tes a la penicilina; por lo tanto, se debe utilizar otro fármaco. Si bien la microbiota intestinal normalmente es una ven- taja para el hospedador, en los individuos con predisposición genética a algunos de los componentes de la flora generan enfermedades. Por ejemplo, se cree que las enfermedades intes- tinales inflamatorias están relacionadas con la falta de toleran- cia inmunitaria a los antígenos bacterianos. Esto provoca una inflamación intensa por una respuesta inmunitaria exagerada. Mecanismos similares quizá sean importantes en el cáncer intestinal como el de colon. MICROBIOTA NORMAL DE LA URETRA La porción anterior de la uretra en ambos sexos contiene un pequeño número del mismo tipo de microorganismos encon- trados en la piel y perineo. La micción normal de orina contiene aproximadamente 102 a 104 /ml de estos microorganismos. MICROBIOTA NORMAL DE LA VAGINA Poco después del nacimiento, aparecen lactobacilos aerobios en la vagina y persisten siempre y cuando el pH permanezca ácido (varias semanas). Cuando el pH se neutraliza (perma- nece así hasta la pubertad) hay una flora mixta de cocos y baci- los. Durante la pubertad, reaparecen los lactobacilos aerobios y anaerobios en gran cantidad y contribuyen a mantener el pH ácido al producir ácido a partir de carbohidratos, en especial glucógeno. Parece que este es un mecanismo importante que impide el establecimiento de otros microorganismos poten- cialmente nocivos en la vagina. Cuando los lactobacilos se suprimen con la administración de antimicrobianos, aumenta el número de levaduras u otras bacterias, lo que causa irritación e inflamación. La vaginosis bacteriana es un síndrome carac- terizado por cambios drásticos en el tipo y proporción relativa de la microbiota vaginal cuando el ecosistema vaginal se trans- forma de un medio sano, caracterizado por la presencia de lac- tobacilos, a un medio enfermo, caracterizado por la presencia de microorganismos que pertenecen a filotaxa como Actino- bacteria y especies de Bacteroidetes. En un estudio reciente sobre el microbioma vaginal de 396 mujeres en edad repro- ductiva asintomáticas se observaron variaciones en el pH vagi- nal y microbioma vaginal de grupos étnicos diferentes (p. ej., blancas, negras, hispanas y asiáticas), lo cual sugiere la necesi- dad de considerar el origen étnico como un factor importante cuando se valora la flora normal o anormal. Después de la menopausia, el número de lactobacilos disminuye de nuevo y se restablece una flora mixta. La flora vaginal normal comprende estreptococos del grupo B hasta en 25% de las mujeres en edad reproductiva. Durante el parto, el producto puede adquirir el estreptococo del grupo B, que luego podría generar septicemia neonatal y meningitis. La flora vagi- nal normal también comprende con frecuencia estreptococo α-hemolítico, estreptococos anaerobios (peptoestreptococos), especies de Prevotella, clostridios, Gardnerella vaginalis, Urea- plasma urealyticum, y en ocasiones especies de Listeria o Mobiluncus. El moco cervical posee actividad antibacteriana y contiene lisozimas. En algunas mujeres, el introito vaginal contiene una microflora abundante similar a la del periné y el área perineal. Quizá este es un factor predisponente en las infecciones urinarias recurrentes. Los microorganismos vagi- nales en el momento del parto infectan en ocasiones al recién nacido (p. ej., estreptococo del grupo B). MICROBIOTA NORMAL DE LA CONJUNTIVA Los microorganismos que predominan en la conjuntiva son difteroides, S. epidermidis y estreptococos no hemolíticos. Con frecuencia también existen Neisseria y bacilos gramnegativos similares a Haemophilus (especies de Moraxella). La microflora conjuntival normalmente es regulada por la circulación de lágrimas, que contienen lisozima antibacteriana. apter 10_Carroll_4R.indd 176 apter 10_Carroll_4R.indd 176 14/04/16 14/04/16
- 190. CAPÍTULO 10 Microbiotanormal del cuerpo humano 177 RESUMEN DEL CAPÍTULO • La microbiota normal consta de la población de microor- ganismos que habitan la piel y mucosas de las personas sanas. La microbiota normal proporciona una primera línea de defensa contra los microorganismos patógenos, ayudan a la digestión y contribuyen a la maduración del sistema inmunitario. • La piel y mucosas albergan constantemente gran variedad de microorganismos que se dividen en 1) microbiota natu- ral, que comprende variedades fijas de microorganismos encontrados en determinada región a determinada edad y que, si se alteran, se restablecen de inmediato por sí solas y 2) microbiota transitoria, que comprende microorganis- mos apatógenos o potencialmente patógenos que habitan la piel y mucosas durante varias horas, días o semanas. • Las diversas regiones de la piel o mucosas son ambientes particulares con una microbiota característica. • Los resultados del Human Microbiome Project revelan que la microbiota es mucho más compleja de lo que se pensaba. • La placa bacteriana es una biopelícula compleja formada por microbiota normal. El metabolismo de los carbohi- dratos que realizan los microorganismos de la placa bacte- riana como Streptococcus mutans es la causa de las caries. • En el colon se han identificado más de 500 especies de bac- terias. El número de anaerobios es mil veces mayor que el de microorganismos facultativos en el colon. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. Una mujer de 26 años de edad acude con su médico por una secreción vaginal anormal. En la exploración física el médico observa una secreción homogénea, poco espesa y de color blanco grisácea adherida a la pared vaginal. El pH de la secreción es de 5.5 (normal: < 4.3). En la tinción de Gram se observan nume- rosas células epiteliales cubiertas por bacilos gram-variables. Se diagnostica vaginosis bacteriana. ¿Cuál de los microorganismos que forman parte normal de la flora genital disminuye en forma considerable en la vaginosis bacteriana? (A) Especies de Corynebacterium (B) Staphylococcus epidermidis (C) Especies de Prevotella (D) Candida albicans (E) Especies de Lactobacillus 2. Algunos microorganismos no se consideran miembros de la microflora normal. Siempre se les considera patógenos. ¿Cuál de los siguientes microorganismos pertenece a esta categoría? (A) Streptococcus pneumoniae (B) Escherichia coli (C) Mycobacterium tuberculosis (D) Staphylococcus aureus (E) Neisseria meningitidis 3. Una niña de nueve años de edad presenta fiebre y dolor intenso en el lado derecho de la tráquea. En la exploración física se observa enrojecimiento y edema del área periamigdalina derecha. Se diagnostica un absceso periamigdalino. Los microorganismos que probablemente se cultivarán son: (A) S. aureus (B) S. pneumoniae (C) Especies de Corynebacterium y Prevotella melaninogenica (D) Microflora bucal y nasal normal (E) Estreptococo viridans y Candida albicans 4. Un varón de 70 años de edad con antecedente de diverticulosis del colon sigmoides sufre repentinamente dolor abdominal en el cuadrante inferior izquierdo. Se acompaña de fiebre. El dolor cede gradualmente y es sustituido por un dolor sordo constante y dolor abdominal a la palpación. Se establece el diagnóstico de probable divertículo roto y el paciente es llevado al quirófano. Se confirma el diagnóstico de divertículo roto y se encuentra un absceso cerca del colon sigmoides. La bacteria más probable en el absceso es: (A) Flora gastrointestinal normal mixta (B) Sólo Bacteroides fragilis (C) Sólo E. coli (D) Sólo Clostridium perfringens (E) Sólo especies de Enterococcus 5. El tratamiento antimicrobiano reduce la cantidad de flora intesti- nal sensible y permite la proliferación de flora del colon relativa- mente resistente. ¿Cuál de las siguientes especies puede proliferar y producir una toxina que causa diarrea? (A) Especies de Enterococcus (B) S. epidermidis (C) Pseudomonas aeruginosa (D) Clostridium difficile (E) B. fragilis 6. ¿Cuál de los siguientes microorganismos puede formar parte de la microflora vaginal normal y causar meningitis en el recién nacido? (A) C. albicans (B) Especies de Corynebacterium (C) S. epidermidis (D) Ureaplasma urealyticum (E) Estreptococo del grupo B 7. ¿La placa bacteriana y la enfermedad periodontal se pueden con- siderar como un continuo de qué tipo de procesos fisiológico? (A) Formación de biopelícula (B) Envejecimiento normal (C) Digestión anormal (D) Respuesta inmunitaria exagerada (E) Goma de mascar 8. ¿Cuál de los siguientes microorganismos se encuentra muy rela- cionado con la caries dental? (A) C. albicans (B) Streptococcus mutans (C) P. melaninogenica (D) Neisseria subflava (E) S. epidermidis 9. El colon sigmoides contiene bacterias anaerobias como B. fragi- lis en una concentración aproximada de 1011 /g de heces fecales. ¿A qué concentración aparecen microorganismos facultativos como E. coli? (A) 1011 /g (B) 1010 /g (C) 109 /g (D) 108 /g (E) 107 /g 10. Streptococcus pneumoniae forma parte de la microflora normal de 5 a 40% de las personas. ¿En qué sitio anatómico se puede encontrar? (A) Conjuntiva (B) Nasofaringe (C) Colon apter 10_Carroll_4R.indd 177 apter 10_Carroll_4R.indd 177 14/04/16 14/04/16
- 191. 178 SECCIÓN IIIBacteriología (D) Uretra (E) Vagina 11. Se han identificado cientos de filotipos en el estómago humano; sin embargo, el único microorganismo que se ha demostrado que persiste es: (A) Lactobacillus casei (B) Lactobacillus acidophilus (C) E. coli (D) Helicobacter pylori (E) Bifidobacteria 12. Existe flora residente normalmente en: (A) Hígado (B) Uretra (C) Riñones (D) Glándulas salivales (E) Vesícula biliar 13. No existe microflora natural en: (A) Faringe (B) Pulmones (C) Intestino delgado (D) Líquido sinovial (E) Conjuntiva 14. Una mujer de 65 años de edad fue hospitalizada con carcinoma epidermoide de cuello uterino. Fue sometida a una cirugía gine- cológica extensa y durante el posoperatorio se le administraron antibióticos de amplio espectro por vía intravenosa. El día de la cirugía se colocó un catéter venoso central a la paciente. Desde el tercer día del posoperatorio la paciente empezó con fiebre. Al octavo día se obtuvieron muestras para hemocultivo y de la punta del catéter central que demostraron microorganismos gramposi- tivos con forma ovoide y que se reproducían por gemación. ¿Cuál de los siguientes microorganismos es la causa más probable del problema de la paciente? (A) S. aureus (B) S. epidermidis (C) Enterococcus faecalis (D) C. albicans (E) Saccharomyces cerevisae 15. La vía de entrada más probable del microorganismo de la pre- gunta 14 es: (A) Durante la cirugía ginecológica (B) Aspiración (C) Durante la colocación del catéter central (D) Durante la colocación del catéter IV para administrar antibióticos (E) Intubación bajo anestesia Respuestas 1. E 2. C 3. D 4. A Dethlefsen L, Huse S, Sogin ML, Relman DA: The pervasive affects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing. PLoS Biol 2008;6:2383. 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- 192. 179 11 Bacilos grampositivos formadores deesporas: Bacillus y Clostridium C A P Í T U L O Los bacilos grampositivos formadores de esporas son bacterias de los géneros de Bacillus y Clostridium. Estos bacilos son uni- versales y, debido a su capacidad para formar esporas, pueden vivir en el ambiente por varios años. Los géneros de Bacillus son aerobio y, los de Clostridium son anaerobio (capítulo 21). De las muchas especies de Bacillus y géneros afines que aún no se han clasificado bien en la microbiología médica, la mayoría no causa enfermedades. Sin embargo, existen algu- nas especies que generan enfermedades importantes en seres humanos. Bacillus anthracis origina el carbunco, enfermedad clásica en la historia de la microbiología; este padecimiento sigue siendo importante en animales y, en ocasiones, en seres humanos. Debido a sus toxinas tan potentes, B. anthracis es un microorganismo potencialmente importante para el bioterro- rismo y la guerra biológica. Bacillus cereus y Bacillus thurin- giensis causan intoxicación alimentaria y a veces infecciones oculares y de otro tipo. El género Clostridium es en extremo heterogéneo y se han descrito más de 200 especies. La lista de microorganismos pató- genos ha seguido creciendo y las cepas más recientes obtenidas de heces fecales humanas tienen un potencial patógeno que aún no se ha establecido. Los clostridios causan diversas e impor- tantes enfermedades mediadas por toxina, incluidas tétanos (Clostridium tetani), botulismo (Clostridium botulinum), gan- grena gaseosa (Clostridium perfringens) y diarrea vinculada con antibióticos y colitis seudomembranosa (Clostridium difficile). También se conocen otros clostridios en las infecciones anaero- bias mixtas que afectan al ser humano (capítulo 21). BACILLUS Este género incluye aerobios grandes: bacilos grampositivos que se organizan en cadenas. Los miembros de este género tienen relación estrecha, pero difieren tanto desde una pers- pectiva fenotípica como en términos de patogenia. Las especies patógenas tienen plásmidos de virulencia. La mayor parte de los miembros de este género es saprófita y vive en la tierra, el agua y el aire, así como en la vegetación (p. ej., Bacillus sub- tilis). Algunos son patógenos para los insectos, como B. thu- ringiensis. Este microorganismo también afecta al ser humano. B. cereus se reproduce en los alimentos y da lugar a una intoxi- cación alimentaria al producir una enterotoxina (diarrea) o una toxina emética (vómito). A veces, tanto B. cereus como B. thu- ringiensis pueden generar entidades patológicas en pacientes inmunodeprimidos (p. ej., meningitis, endocarditis, endoftal- mitis, conjuntivitis o gastroenteritis aguda). B. anthracis, que causa el carbunco, es el principal microorganismo patógeno del género. Morfología e identificación A. Microorganismos típicos Las células típicas miden 1 × 3 a 4 μm, poseen extremos cua- drados y se disponen en forma de cadenas largas; las esporas se ubican en el centro de los bacilos. B. Cultivo Las colonias de B. anthracis son redondas y tienen aspecto de “vidrio esmerilado” bajo la luz. La hemólisis es inusual con B. anthracis, pero frecuente con B. cereus y los bacilos sapró- fitos. Las colonias disuelven la gelatina y su crecimiento en los cultivos en agar mediante inoculación con aguja es similar a un abeto invertido. C. Características de crecimiento Los bacilos saprófitos utilizan fuentes simples de nitrógeno y carbono para obtener energía y proliferar. Las esporas son resistentes a los cambios ambientales, soportan el calor seco y algunos desinfectantes químicos durante periodos breves y persisten varios años en la tierra seca. Los productos anima- les contaminados con esporas de carbunco (p. ej., piel, cerdas, pelo, lana, hueso) se pueden esterilizar con autoclave. BACILLUS ANTHRACIS Patogenia El carbunco es sobre todo una enfermedad de los herbívoros: cabras, ovejas, ganado vacuno, caballos, etc.; los demás ani- males (p. ej., ratas) son relativamente resistentes a la infección. El carbunco es endémico entre las sociedades agrícolas de los países desarrollados en África, Medio Oriente y América Cen- tral. La Organización Mundial de la Salud tiene un sitio en internet que proporciona información actualizada sobre esta enfermedad en animales y se menciona en las referencias de este capítulo. El ser humano se infecta de manera incidental al tener contacto con los animales o sus productos infectados. En animales, la vía de entrada es la boca y el aparato digestivo. Las esporas provenientes de la tierra contaminada penetran con facilidad cuando se ingieren con plantas espinosas o irri- tantes. En las personas, la infección casi siempre se adquiere cuando las esporas penetran a través de la piel lesionada (car- bunco cutáneo) o rara vez por las mucosas (carbunco del tubo apter 11_Carroll_4R.indd 179 apter 11_Carroll_4R.indd 179 14/04/16 14/04/16
- 193. 180 SECCIÓN IIIBacteriología digestivo) o por la entrada de las esporas hacia los pulmones (carbunco por inhalación). Una cuarta categoría de la enferme- dad, el carbunco por inyección, ha afectado a personas que se inyectan heroína contaminada con esporas de carbunco. Estas últimas germinan en el tejido del sitio de entrada y la prolifera- ción de los microorganismos vegetativos tiene como resultado la formación de edema gelatinoso y congestión. Los bacilos se extienden a través de los vasos linfáticos hasta la circulación sanguínea y se multiplican libremente en la sangre y los tejidos poco antes y después de la muerte del animal. El B. anthracis aislado (figura 11-1) que no produce una cáp- sula no son virulentas y tampoco causan carbunco en animales de laboratorio. La cápsula de ácido poli-γ-d-glutámico es antifa- gocítica. El gen de la cápsula se ubica en el plásmido pXO2. La toxina del carbunco consta de tres proteínas: antígeno protector (PA, protective antigen), factor de edema (EF, edema factor) y factor letal (LF, lethal factor). El PA se fija a determi- nados receptores celulares y después de su activación forma un conducto de membrana que permite la entrada de EF y LF en la célula. El EF es una adenil ciclasa que, en combinación con el PA, forma una toxina conocida como toxina de edema. El LF con el PA constituyen la toxina letal, que corresponde al principal fac- tor de virulencia y provoca la muerte de los animales y seres humanos infectados. Cuando se inyecta en animales de labora- torio (p. ej., en ratas), la toxina letal puede matarlos con rapidez al deteriorar tanto la inmunidad innata como la adaptativa, de manera que permite la proliferación de microorganismos y la muerte celular. Los genes de la toxina del carbunco se ubican en otro plásmido, PXO1. En el carbunco pulmonar (enfermedad del esquilador de ovejas), se inhalan las esporas provenientes de la pelusa de la lana, el pelo o la piel, se depositan en los alveolos y son fagocitadas por los macrófagos, luego se transportan por los conductos linfáticos hasta los ganglios linfáticos mediastí- nicos, donde germinan. Después hay producción de toxinas, lo cual genera mediastinitis hemorrágica y septicemia, que por lo general provocan la muerte con prontitud. En la septicemia por carbunco, el número de microorganismos en la sangre excede 107 /ml poco antes del fallecimiento. En el brote de carbunco pulmonar de Sverdlovsk en 1979 y en los casos de inhalación por bioterrorismo en el 2001, la patogenia fue similar a la del carbunco por inhalación de productos animales. Patología En animales y seres humanos susceptibles, los microorganis- mos proliferan en el sitio de entrada. Las cápsulas permanecen íntegras y los microorganismos se rodean de gran cantidad de líquido proteináceo que contiene unos cuantos leucocitos, a partir de los cuales se diseminan con rapidez y alcanzan la circulación sanguínea. En los animales resistentes, los microorganismos prolife- ran durante unas cuantas horas y en ese lapso hay una acu- mulación masiva de leucocitos. Las cápsulas se desintegran y desaparecen de forma gradual. Los microorganismos perma- necen circunscritos. Manifestaciones clínicas En el ser humano, cerca de 95% de los casos corresponde a carbunco cutáneo y 5% a carbunco pulmonar. El carbunco del tubo digestivo (ántrax de td) es poco común; sólo se ha descrito en África, Asia y Estados Unidos cuando las personas han con- sumido carne de animales infectados. Los episodios bioterroristas ocurridos en otoño del 2001 tuvieron como resultado 22 casos de carbunco: 11 por inhala- ción y 11 cutáneos. Cinco pacientes con la variedad inhalada murieron; todos los demás sobrevivieron. El carbunco cutáneo casi siempre aparece en superficies expuestas de brazos o manos, seguidas, en orden de frecuencia, de cara y cuello. Entre uno y siete días después de la penetra- ción de microorganismos o esporas a través de un rasguño, aparece una pápula pruriginosa. Al principio ésta es similar a la mordedura de un insecto. Sin embargo, la pápula se trans- forma muy pronto en vesícula o un anillo pequeño de vesículas que se unen formando una úlcera necrótica. Las lesiones miden entre 1 y 3 cm de diámetro y poseen una escara negra central A B FIGURA 111 A: Bacillus anthracis en caldo de cultivo (amplificación original ×1000). B: En tejido (amplificación original ×400) (Cortesía de PS Brachman). apter 11_Carroll_4R.indd 180 apter 11_Carroll_4R.indd 180 14/04/16 14/04/16
- 194. CAPÍTULO 11 Bacilosgrampositivos formadores de esporas: Bacillus y Clostridium 181 característica. Se acompañan de edema pronunciado. Algunas veces también existe linfangitis y linfadenopatía, además de signos y síntomas generales, como fiebre, malestar general y cefalea. Después de 7 a 10 días, la escara alcanza su máximo desarrollo. Por último se seca, debilita y desprende. La cica- trización se lleva a cabo por granulación y deja una cicatriz. Algunas veces la lesión tarda varias semanas en cicatrizar y el edema el mismo tiempo en desaparecer. Al parecer la antibio- ticoterapia no modifica la evolución natural de la enfermedad, pero previene su diseminación. Hasta en 20% de los pacientes, el carbunco cutáneo genera septicemia, las consecuencias de una infección generalizada, incluida meningitis, y la muerte. El periodo de incubación del carbunco pulmonar puede ser hasta de seis semanas. Las primeras manifestaciones clínicas son las de necrosis hemorrágica pronunciada y edema medias- tínico. Algunas veces predomina el dolor retroesternal y se acompaña de ensanchamiento pronunciado del mediastino en la radiografía de tórax. Una vez que se extiende a la pleura, apa- recen derrames pleurales hemorrágicos; la tos es secundaria a sus efectos sobre la tráquea. Lo siguiente es la septicemia, con diseminación del micoorganismo por vía hematógena hacia el aparato digestivo, lo cual provoca úlceras intestinales, o hacia las meninges, situación que causa meningitis hemorrágica. La mortalidad del carbunco pulmonar es alta cuando ha existido un contacto previo; es mayor si el diagnóstico no se sospecha desde el principio. Los animales adquieren el carbunco al ingerir esporas y la diseminación ulterior está dada por los microorganismos desde el aparato digestivo. Esto es inusual en el ser humano y el carbunco del tubo digestivo es muy poco frecuente. Algu- nos signos clínicos abarcan dolor abdominal, vómito y diarrea hemorrágica. El carbunco por inyección se caracteriza por edema extenso, indoloro, subcutáneo y ausencia notable de las costras clásicas del carbunco cutáneo. Los pacientes pueden evolucio- nar a inestabilidad hemodinámica debido a la septicemia. Pruebas diagnósticas de laboratorio Las muestras que se examinan son líquido o pus de las lesiones locales, sangre, y líquidos pleural y cefalorraquídeo en el car- bunco pulmonar, acompañados de septicemia y heces fecales u otros contenidos intestinales en el caso del carbunco digestivo. Los frotis teñidos de la lesión circunscrita o la sangre de ani- males muertos a menudo muestran cadenas de grandes baci- los grampositivos. El carbunco se identifica en frotis secos por medio de técnicas de tinción inmunofluorescente. Cuando se cultivan en placas de agar sangre, los microor- ganismos producen colonias no hemolíticas de color gris o blanco, con una textura rugosa y aspecto de vidrio esmerilado. Algunas veces producen prolongaciones con forma de coma (“cabeza de Medusa”) en la colonia. Para demostrar la presencia de una cápsula es necesario cultivarlas en un medio de cultivo con bicarbonato en dióxido de carbono al 5 a 7%. La tinción de Gram permite observar los bacilos grampositivos grandes. La fermentación de carbohidratos es inútil. En medio semisó- lido, los bacilos del carbunco son inmóviles mientras que los microorganismos afines (p. ej., B. cereus) presentan movilidad por “amontonamiento”. Cuando un laboratorio clínico obtiene bacilos grampositivos grandes en sangre, líquido cefalorraquí- deo o lesiones cutáneas sospechosas, cuyo fenotipo concuerda con la descripción de B. anthracis, es necesario ponerse en con- tacto de inmediato con el laboratorio de salud pública y enviar el microorganismo para su confirmación. La identificación definitiva requiere de lisis con un bacteriófago-γ específico para carbunco, detección de la cápsula por medio de anticuer- pos fluorescentes o identificación de los genes de la toxina por medio de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, poly- merase chain reaction). Estas pruebas se realizan en casi todos los laboratorios de salud pública. La Food and Drug Administration (FDA) de Estados Uni- dos diseñó un enzimoinmunoanálisis (ELISA, enzyme–linked immunoassay) para medir los anticuerpos totales contra el PA, pero el resultado no es positivo al principio de la enfermedad. Resistencia e inmunidad La vacunación para prevenir el carbunco se basa en los expe- rimentos clásicos de Louis Pasteur. En 1881, este científico demostró que los cultivos en caldo de 42 a 52 °C, durante varios meses, pierden gran parte de su virulencia y se pueden inyectar en ganado vacuno o bovino sin generar la enfermedad. Tiempo después se comprobó que estos animales eran inmunes. Tam- bién es posible inducir inmunidad activa al carbunco en ani- males susceptibles al vacunarlos con bacilos vivos atenuados, suspensiones de esporas o PA proveniente de filtrados de culti- vos. Los animales que pastan en zonas donde se sabe que pre- valece el carbunco deben vacunarse cada año. En Estados Unidos, la vacuna aprobada por la FDA (va- cuna adsorbida contra carbunco [AVA, anthrax vaccine adsor- bed]) se elabora con sobrenadante de un cultivo de células libres de una cepa no encapsulada pero toxígena de B. anthracis, que contiene PA adsorbido a hidróxido de aluminio. La posología es de 0.5 ml administrados por vía intramuscular las semanas 0 y 4, y después a los seis, 12 y 18 meses seguidos de refuerzos anuales. Esta vacuna se encuentra disponible de forma exclu- siva para el Department of Defense de Estados Unidos y para las personas con riesgo de tener contactos repetidos con B. anthracis. Dado que las vacunas actuales contra el carbunco proporcionan inmunidad de corta duración y, por lo tanto, se requieren vacunaciones repetidas, se ha perfeccionado una cantidad de vacunas con PA recombinante (rPA, recombinant PA) nuevas. Se ha demostrado que dichas vacunas novedosas se toleran bien y tienen alta inmunogenicidad (véase descripción en Tratamiento). Tratamiento En seres humanos, muchos antibióticos son eficaces para tratar el carbunco pero deben iniciarse cuanto antes. Para este último, se recomienda ciprofloxacina; otros fármacos con actividad incluyen penicilina G, desoxiciclina, eritromicina y vancomi- cina. En el contexto de la exposición potencial a B. anthracis como un arma de guerra biológica, la profilaxia con ciprofloxa- cina o doxiciclina debe administrarse durante 60 días y tres dosis de AVA. La FDA aprobó el raxibacumab, un anticuerpo mono- clonal recombinante de ser humano, a finales de 2012 para tratamiento y profilaxia contra el carbunco pulmonar. El apter 11_Carroll_4R.indd 181 apter 11_Carroll_4R.indd 181 14/04/16 14/04/16
- 195. 182 SECCIÓN IIIBacteriología mecanismo de acción es impedir la unión de PA a sus recepto- res en células hospedadoras. El fármaco se utiliza en combina- ción con los antibióticos apropiados. La FDA no ha aprobado la inmunoglobulina intravenosa del carbunco (AIGIV, anthrax immune globulin intravenous), pero quizá se encuentre disponible en los Centers for Disease Control and Prevention. La AIGIV es un antisuero policlonal humano que también inhibe la unión de PA a sus receptores. Como el raxibacumab, se utiliza combinada con antimicrobia- nos para tratar formas de carbunco grave. Epidemiología, prevención y control La tierra se contamina con esporas de carbunco provenientes de los cuerpos de animales muertos. Estas esporas permanecen viables por varias décadas. Las esporas germinan en la tierra a un pH de 6.5 cuando la temperatura es adecuada. Los animales que pastan y que se infectan a través de las mucosas lesiona- das sirven para perpetuar la cadena de infección. El contacto con animales infectados o con su piel, pelo y cerdas constituye el origen de la enfermedad en el ser humano. Algunas medi- das de control son: 1) eliminación de los cadáveres de anima- les por cremación o al enterrarlos en pozos de cal profundos; 2) descontaminación (casi siempre por medio de autoclave) de los productos animales; 3) uso de ropa protectora y guantes al manipular materiales con posibilidad de estar infectados, y 4) inmunización de animales domésticos con vacunas de baci- los vivos atenuados. Las personas con un riesgo laboral alto deben vacunarse. BACILLUS CEREUS La intoxicación alimenticia por B. cereus es de dos tipos: la variedad emética, desencadenada por ingerir arroz frito, y la modalidad diarreica, por ingerir platillos con carne y sal- sas. B. cereus produce toxinas que generan una enfermedad que es más una intoxicación que una infección transmitida por los alimentos. La variedad emética se manifiesta por náusea, vómito, cólicos abdominales y, en ocasiones, diarrea, y remite de manera espontánea con recuperación dentro de las prime- ras 24 h. Esta modalidad empieza entre 1 y 5 h después de inge- rir arroz y algunas veces platillos a base de pasta. B. cereus es un microorganismo de la tierra que contamina con frecuencia el arroz. Cuando se cocinan grandes cantidades de este grano y se dejan enfriar con lentitud, las esporas de B. cereus ger- minan y las células vegetativas producen la toxina durante la fase de proliferación logarítmica o en el curso de la esporula- ción. El periodo de incubación de la variedad diarreica es de 1 a 24 h y se manifiesta por diarrea abundante con dolor y cóli- cos abdominales; rara vez se acompaña de fiebre y vómito. En este síndrome, las esporas ingeridas que se desarrollan en célu- las vegetativas de B. cereus secretan una de tres enterotoxinas posibles que causan acumulación de líquido y otras respues- tas fisiológicas en el intestino delgado. La presencia de B. cereus en las heces del paciente no es suficiente para establecer un diagnóstico de enfermedad por B. cereus debido a que las bac- terias pueden presentarse en muestras normales de heces, una concentración de 105 bacterias o más por gramo de alimento se considera diagnóstica. B. cereus es una causa importante de infecciones ocula- res, como la queratitis grave y la endoftalmitis. Los microor- ganismos se introducen de manera típica en el ojo mediante cuerpos extraños relacionados con traumatismos, aunque las infecciones también surgen después de una cirugía. Asimismo, B. cereus se ha vinculado con infecciones circunscritas, como las de heridas, y con infecciones sistémicas, incluidas endocar- ditis, bacteriemia asociada con catéter, infecciones del sistema nervioso central, osteomielitis y neumonía; la presencia de un dispositivo médico o el uso de fármaco intravenoso predispone a tales infecciones. Se han informado brotes de bacteriemia en unidades de cuidados intensivos neonatales y otras unidades hospitalarias durante su construcción en instalaciones de aten- ción de la salud. B. cereus es resistente a diversos antibióticos, incluidas penicilinas y cefalosporinas. Las infecciones graves que no se transmiten por alimentos deben tratarse con vanco- micina o clindamicina con o sin un aminoglucósido. La cipro- floxacina ha sido útil en las infecciones de heridas. Verificación de conceptos • El género de Bacillus constituye un grupo grande de micro- organismos saprófitos, aerobios y formadores de esporas que habitan en la tierra. • El principal agente patógeno del género Bacillus es B. an- thracis, microorganismo virulento y tóxico de gran impor- tancia histórica. • El ser humano se infecta a partir de las esporas inoculadas por el contacto con animales o productos animales, como pieles. • B. anthracis es la causa de tres categorías de enfermedades en el ser humano, según sea la vía de entrada de las espo- ras: cutánea (95%), pulmonar (5%) y digestiva (rara). • El PA se combina con dos factores, el EF y el LF, para for- mar toxinas poderosas, la del edema y la letal, respecti- vamente, las cuales poseen efectos tanto citotóxicos como inmunomoduladores. Estas toxinas son las causas del edema, la destrucción de los tejidos y la hemorragia carac- terística del carbunco. • B. cereus y B. thuringiensis producen intoxicación ali- mentaria e infecciones oportunistas en los pacientes con inmunodepresión. • B. cereus se puede distinguir de B. anthracis con base en las características morfológicas de la colonia, la hemó- lisis β, la motilidad y los patrones de susceptibilidad antimicrobiana. CLOSTRIDIUM Los clostridios son grandes bacilos anaerobios, grampositivos, móviles. Muchos de ellos descomponen proteínas o forman toxinas y algunos llevan a cabo ambas acciones. Su hábitat es la tierra o el intestino de animales y seres humanos, donde viven como saprófitos. El número de especies nuevas de clos- tridios descubiertas continúa en aumento; varias especies se han secuenciado. Hay 19 conglomerados basados en análisis de secuencia génica de 16SrRNA. La mayor parte de las especies relacionadas desde el punto de vista clínico están en el conglo- merado I de RNA. Algunos de los clostridios patógenos son los apter 11_Carroll_4R.indd 182 apter 11_Carroll_4R.indd 182 14/04/16 14/04/16
- 196. CAPÍTULO 11 Bacilosgrampositivos formadores de esporas: Bacillus y Clostridium 183 que generan botulismo, tétanos, gangrena gaseosa y colitis seudomembranosa. Morfología e identificación A. Microorganismos típicos Por lo general, las esporas de los clostridios son más amplias que el diámetro de los bacilos a partir de los cuales se forman. En las diversas especies, la espora tiene una ubicación central, subterminal o terminal. La mayor parte de los clostridios es móvil y posee flagelos perítricos. En la figura 11-2, se muestran clostridios con esporas terminales. B. Cultivo Los clostridios son anaerobios y proliferan en un ambiente anaerobio; muy pocas especies son aerotolerantes y crecen en el aire ambiental. En el capítulo 21, se describen las caracterís- ticas del cultivo anaerobio. En general, los clostridios crecen mejor en medios enriquecidos con sangre u otras sustancias utilizadas para cultivar anaerobios. C. Formas de colonias Algunos clostridios producen grandes colonias en relieve (p. ej., C. perfringens); otros generan colonias más pequeñas (p. ej., C. tetani). Ciertos clostridios forman colonias que se diseminan en la superficie de agar (Clostridium septicum). Muchos clos- tridios producen una zona de hemólisis β en agar sangre. C. perfringens da origen a una zona doble característica de la hemólisis β alrededor de las colonias. D. Características de crecimiento Los clostridios pueden fermentar diversos carbohidratos (saca- rolíticos) y muchos pueden digerir proteínas (proteolíticos); algunas especies tienen ambas propiedades. Tales caracterís- ticas metabólicas se utilizan para dividirlos en grupos. Unos tornan ácida la leche, otros la digieren y un tercer grupo le pro- voca la llamada “fermentación turbulenta” al romper grumos con gas (p. ej., C. perfringens). Diferentes especies producen varias enzimas. Clostridium genera más toxinas que cualquier otro grupo de bacterias (véase más adelante). CLOSTRIDIUM BOTULINUM Este microorganismo, que causa el botulismo, tiene una dis- tribución mundial. Habita en la tierra y, a veces, en las heces fecales de algunos animales. Las variedades de C. botulinum se distinguen por el tipo antigénico de la toxina que producen. Las esporas de este microorganismo son muy resistentes al calor y soportan hasta 100 °C durante varias horas. Su termorresistencia disminuye con un pH ácido o una concentración alta de sal. Toxinas Durante la proliferación de C. botulinum y en la autólisis de la bacteria, se liberan toxinas hacia el ambiente. Se conocen siete variedades antigénicas de la toxina (serotipos A-G). Las princi- pales causas de enfermedad en el ser humano son los tipos A, B, E y F. Las variedades A y B se han vinculado con gran diversi- dad de alimentos y, el tipo E, principalmente con los productos de la pesca. El tipo C es el botulismo de las aves; el tipo D causa botulismo en mamíferos. La variedad G no es patógena. Las toxinas botulínicas tienen tres dominios. Dos de ellos facilitan la unión y el ingreso de la toxina a la célula nerviosa. El tercer dominio es la toxina constituida por una proteína de 150 kDa que se fractura en una cadena pesada (H, 100 kDa) y una cadena ligera (L, 50 kDa), unidas por un enlace disulfuro. La toxina botulínica se absorbe del intestino, entra en la circulación san- guínea y se une a receptores de las membranas presinápticas de las neuronas motoras del sistema nervioso periférico y los pares craneales. No cruza la barrera hematoencefálica ni afecta el sistema nervioso central. La proteólisis (por la cadena L de la toxina botulínica) de las proteínas destinatarias de SNARE (proteína de unión del factor sensible a la N-etilmaleimida soluble), en las neuronas, inhibe la liberación de acetilcolina en la sinapsis, lo cual resulta en ausencia de contracción muscu- lar y en parálisis. Las proteínas de SNARE son sinaptobrevinas (también conocidas como proteínas de membrana asociadas a vesícula [VAMP, vesicle-associated membrane protein]), pro- teína de unión a NSF soluble 25 (SNAP, soluble NSF attachment protein 25) y sintaxina. Las toxinas de C. botulinum tipos A, C y E fracturan a la SNAP 25 de 25 000 kDa. La de tipo C también rompe la sintaxina. Las toxinas tipos B, D, F y G fracturan sólo a la sinaptobrevina. Las toxinas de C. botulinum se encuentran entre las sustancias más toxicas conocidas: la dosis letal para un ser humano es quizá de alrededor de 1 a 2 μg/kg. Las toxi- nas se destruyen con calor aplicado durante 20 min a 100 °C. Se ha demostrado que cepas raras de Clostridium butyricum y Clostridium baratii producen neurotoxina botulínica y causan botulismo en personas. Las cepas productoras de toxinas A, B o F se asocian con botulismo de la infancia. Rossetto et al. FIGURA 112 Tinción de Gram de Clostridium. Se observan algunos bacilos grampositivos. Muchos de ellos forman cadenas. Algunos tienen esporas que no se tiñen o adquieren forma ovalada y son transparentes (flechas). apter 11_Carroll_4R.indd 183 apter 11_Carroll_4R.indd 183 14/04/16 14/04/16
- 197. 184 SECCIÓN IIIBacteriología (véase Referencias) proporcionan detalles adicionales sobre la producción y la función de la toxina. Patogenia Recientemente en Estados Unidos, el Reino Unido y Alemania, resurgió el botulismo relacionado con heridas por las toxinas tipo A o B y por la inyección en la piel de heroína de “alquitrán negro”. Sin embargo, la mayor parte de los casos de botulismo se debe a intoxicación por el consumo de alimentos en los que C. botulinum se multiplicó y generó toxina. Las procedencias más frecuentes son alimentos alcalinos condimentados, ahu- mados, empacados al vacío o enlatados que se consumen sin cocinar. En esta comida, germinan las esporas de C. botulinum; en un ambiente anaerobio, las formas vegetativas proliferan y producen toxina. En el botulismo infantil, el vehículo más frecuente de la infección es la miel. La patogenia difiere de la manera como el adulto contrae la enfermedad. El lactante ingiere las esporas de C. botulinum (o C. butyricum o C. baratii) y las esporas germi- nan en el intestino. Las células vegetativas producen toxinas conforme se multiplican y la neurotoxina se absorbe hacia la circulación. En casos raros, los adultos con malformaciones gastroin- testinales o trastornos funcionales pueden contraer “botu- lismo de la infancia”. El botulismo por heridas resulta de la contaminación de tejido con esporas y se observa sobre todo en usuarios de dro- gas inyectables. Es muy infrecuente el botulismo pulmonar cuando la toxina ingresa por vías respiratorias. La toxina actúa al bloquear la liberación de acetilcolina en las sinapsis y las uniones neuromusculares (véase la descripción anterior). El resultado es una parálisis flácida. Tanto la electro- miografía como las pruebas de fuerza con edrofonio son típicas. Manifestaciones clínicas Los síntomas empiezan 18 a 24 h después de ingerir el alimento tóxico, con alteraciones visuales (falta de coordinación de los músculos oculares, diplopía), incapacidad para deglutir y difi- cultad para hablar. Los signos de parálisis bulbar son progre- sivos y la muerte es resultado de parálisis respiratoria o paro cardiaco. Los síntomas digestivos por lo general son irrele- vantes. Tampoco hay fiebre. El paciente permanece consciente hasta poco antes de morir. La mortalidad es alta. Las personas que se recuperan no generan antitoxina en sangre. En Estados Unidos, el botulismo infantil es tan frecuente o más que la variedad clásica de botulismo paralítico producido por la ingestión de alimentos contaminados con la toxina. En los primeros meses de vida, los lactantes manifiestan alimenta- ción deficiente, debilidad y signos de parálisis (lactante hipotó- nico). En ocasiones, el botulismo infantil es causa de síndrome de muerte súbita infantil. C. botulinum y la toxina del botu- lismo se identifican en las heces fecales, pero no en el suero. Pruebas diagnósticas de laboratorio Los especialistas que sospechan un caso de botulismo deben establecer contacto con las autoridades de salud pública apro- piadas antes de enviar muestas al laboratorio. El requisito para establecer el diagnóstico es la detección de la toxina y no del microorganismo. La presencia de la toxina a menudo puede demostrarse en suero, secreciones gástricas o heces del paciente y es posible descubrirla en los residuos de alimentos. Los pali- llos con puntas de algodón para uso clínico u otras muestras obtenidas del paciente deben transportarse mediante contene- dores anaerobios. Hay que mantener en sus recipientes origina- les los alimentos presuntamente contaminados. Los ratones a los que se inyecta por vía intraperitoneal este tipo de muestras mueren con rapidez. La variedad antigénica de la toxina se iden- tifica por medio de neutralización con una toxina específica en ratones. Este bioanálisis en ratones es la prueba de elección para confirmar el botulismo. C. botulinum se puede cultivar a partir de los restos del alimento para probar la producción de toxina, pero rara vez se lleva a cabo y su importancia es cuestionable. En el botulismo infantil, se puede demostrar la presencia de C. botulinum y la toxina en el contenido intestinal, pero no en el suero. Otros métodos utilizados para detectar la toxina son ELISA y PCR; esta última permite hallar microorganismos que son portadores del gen, pero no expresan la toxina. Tratamiento El tratamiento de sostén, en especial el cuidado intensivo, es fundamental en la atención de los pacientes con botulismo. La respiración adecuada debe mantenerse por ventilación mecá- nica si es necesario y, en casos graves, quizá sea necesario pre- servarla hasta por ocho semanas. Tales medidas han reducido la mortalidad de 65 a menos de 25%. En caballos, se han pre- parado antitoxinas potentes para tres tipos de botulismo. Dado que el tipo causal para un caso individual casi siempre se des- conoce, la antitoxina trivalente (A, B, E) debe administrarse de manera expedita por vía intravenosa (IV) con las precau- ciones habituales. La antitoxina no revierte la parálisis, pero si se administra cuanto antes, puede evitar su avance. Aunque la mayoría de lactantes con botulismo se recupera sólo con apoyo, es recomendable proporcionar inmunoglobulina botulínica (BIG, botulinum immune globulin) derivada de ser humano. Epidemiología, prevención y control Puesto que las esporas de C. botulinum se distribuyen amplia- mente en la tierra, a menudo contaminan vegetales, frutas y otros materiales. Hubo un gran brote generado en un restau- rante cuya causa fue el consumo de cebollas salteadas. Cuando este tipo de alimento se enlata o conserva de otra manera, se debe calentar lo suficiente como para asegurar la destrucción de las esporas, o bien, se debe hervir 20 min antes de consu- mirlo. Los reglamentos estrictos para el enlatado comercial han reducido de forma considerable el peligro de los brotes, pero algunos alimentos comerciales han causado muertes. Uno de los factores de riesgo principales del botulismo son los alimentos enlatados en casa, en especial ejotes, maíz, pimien- tos, aceitunas, chícharos, pescado ahumado o pescado fresco empacado al vacío en bolsas de plástico. Algunas veces los ali- mentos tóxicos se encuentran descompuestos y rancios y las latas se “hinchan” o su aspecto parece inofensivo. El riesgo de los alimentos enlatados en el hogar se reduce si el alimento se hierve durante más de 20 min antes de su consumo. apter 11_Carroll_4R.indd 184 apter 11_Carroll_4R.indd 184 14/04/16 14/04/16
- 198. CAPÍTULO 11 Bacilosgrampositivos formadores de esporas: Bacillus y Clostridium 185 La toxina botulínica se considera una sustancia muy importante para el bioterrorismo y la guerra biológica. CLOSTRIDIUM TETANI C. tetani, el agente causal del tétanos, tiene distribución mun- dial y se encuentra en la tierra y las heces fecales de los caba- llos y otros animales. Es posible distinguir varios tipos de este microorganismo por medio de antígenos flagelares específicos. Todos ellos comparten un antígeno O (somático), que puede estar enmascarado, y todos producen el mismo tipo antigénico de neurotoxina: la tetanoespasmina. Toxina Las células vegetativas de C. tetani producen la toxina tetanoes- pasmina (150 kDa) que es fragmentada por una proteasa bac- teriana hasta formar dos péptidos (50 y 100 kDa) unidos por un puente disulfuro. Al principio, la toxina se fija a los recep- tores de las membranas presinápticas de las neuronas motoras. Luego emigran por el sistema de transporte axonal retrógrado hasta los cuerpos celulares de estas neuronas, la médula espi- nal y el tallo encefálico. El péptido más pequeño degrada la sinaptobrevina (también llamada VAMP2, véase antes en el apartado Toxina de C. botulinum), una proteína que se requiere para cercenar vesículas de neurotransmisor en la membrana presináptica. La liberación de la glicina inhibidora y GABA se bloquean, y las neuronas motoras no se inhiben. El resultado es hiperreflexia, espasmos musculares y parálisis espástica. Una cantidad mínima de toxina es letal para el ser humano. Patogenia C. tetani no es un microorganismo invasor. La infección per- manece circunscrita en el área de tejido desvitalizado (herida, quemadura, lesión, muñón umbilical, sutura quirúrgica) donde se han introducido las esporas. El volumen del tejido infectado es pequeño y la enfermedad es casi por completo una toxemia. La germinación de la espora y la proliferación de microorga- nismos vegetativos que producen toxina se facilitan por: 1) el tejido necrótico; 2) las sales de calcio, y 3) otras infecciones pió- genas concomitantes, todo lo cual ayuda al establecimiento de un potencial reducido de oxidorreducción. La toxina liberada a partir de las células vegetativas llega al sistema nervioso central y se fija con rapidez a los receptores de la médula espinal y el tallo encefálico y lleva a cabo las acciones descritas. Manifestaciones clínicas El periodo de incubación varía de cuatro a cinco días hasta varias semanas. La enfermedad se caracteriza por contrac- ción tónica de los músculos voluntarios. Con frecuencia los espasmos musculares abarcan primero el área de la lesión e infección y, a continuación, los músculos de la mandíbula (trismo), se contraen de manera tal que es imposible abrir la boca. De modo gradual, se afectan otros músculos voluntarios, lo cual genera espasmos tónicos. Cualquier estímulo externo puede precipitar un espasmo muscular generalizado tetánico. El paciente se encuentra consciente y el dolor en ocasiones es intenso. La muerte casi siempre es secundaria a la interferencia con la mecánica de la respiración. La mortalidad por tétanos generalizado es muy alta. Diagnóstico El diagnóstico depende de las manifestaciones clínicas y el antecedente de una lesión, aunque sólo 50% de los pacientes con tétanos tiene una anomalía que le ha obligado a buscar atención médica. El diagnóstico diferencial principal del téta- nos es la intoxicación con estricnina. El cultivo anaerobio del tejido tomado de la herida contaminada muestra algunas veces C. tetani, pero no se debe diferir la antitoxina preventiva o tera- péutica en espera de esta demostración. La confirmación de C. tetani depende de la producción de toxina y su neutraliza- ción a través de una antitoxina específica. Prevención y tratamiento Los resultados del tratamiento del tétanos son poco convin- centes. Por lo tanto, lo más importante es la prevención. La prevención del tétanos depende de: 1) vacunación activa con toxoide; 2) atención adecuada de las heridas contaminadas con tierra; 3) uso profiláctico de antitoxina, y 4) administra- ción de penicilina. La aplicación intramuscular de 250 a 500 U de antitoxina humana (inmunoglobulina tetánica) ofrece una protección generalizada adecuada (0.01 U/ml de suero o más) durante dos a cuatro semanas. Esto neutraliza a la toxina que no se ha fijado al tejido nervioso. La profilaxia con antitoxina se debe acompa- ñar de vacunación activa con toxoide tetánico. Los pacientes que manifiestan síntomas de tétanos deben recibir relajantes musculares, sedantes y respiración asistida. Algunas veces se les administran dosis muy altas de antito- xina (3000 a 10000 U de inmunoglobulina tetánica) por vía IV con el fin de neutralizar la toxina que no se ha fijado al tejido nervioso. Sin embargo, la eficacia de la antitoxina para el tra- tamiento es incierta con excepción del tétanos neonatal, en el cual muchas veces salva la vida. La desbridación quirúrgica es indispensable puesto que elimina el tejido necrótico necesario para la proliferación del microorganismo. No se ha comprobado que el oxígeno hiper- bárico sea de utilidad. La penicilina inhibe con eficacia la proliferación de C. tetani y detiene la producción ulterior de toxina. Los antibióti- cos también ayudan a regular las infecciones piógenas conco- mitantes. Cuando una persona previamente vacunada sufre una herida potencialmente peligrosa, se debe inyectar otra dosis de toxoide para estimular de nuevo la producción de antitoxina. Esta inyección de “recordatorio” de toxoide, se acompaña de una dosis de antitoxina cuando no se ha vacunado al paciente recientemente, no ha recibido refuerzos o si se desconocen las vacunas previas. Control El tétanos es una enfermedad por completo prevenible. La vacunación activa universal con toxoide tetánico debe ser obli- gatoria. Este último se produce mediante desintoxicación de apter 11_Carroll_4R.indd 185 apter 11_Carroll_4R.indd 185 14/04/16 14/04/16
- 199. 186 SECCIÓN IIIBacteriología la toxina con formalina y luego concentrándola. Se utilizan toxoides adsorbidos con sales de aluminio. El régimen inicial de vacunación comprende tres inyecciones, seguidas de otra dosis alrededor de un año después. Todos los niños se deben vacunar por primera vez en el primer año de vida. Al ingresar a la escuela, se les debe administrar un “refuerzo”. Posterior- mente, los refuerzos se aplican cada 10 años para mantener una concentración sérica de antitoxina mayor de 0.01 U/ml. En niños pequeños, el toxoide tetánico suele combinarse con toxoide diftérico y vacuna acelular contra tos ferina. Es imposible llevar a cabo medidas de control ambiental por la gran diseminación del microorganismo en la tierra y la supervivencia tan prolongada de sus esporas. CLOSTRIDIOS QUE CAUSAN INFECCIONES INVASORAS Numerosos clostridios productores de toxinas (C. perfringens y clostridios afines) (figura 11-3) causan infecciones invasoras (incluidas mionecrosis y gangrena gaseosa) cuando se intro- ducen en el tejido lesionado. Casi 30 especies de clostridios tienen este efecto, pero la más frecuente en las enfermedades invasoras es C. perfringens (90%). Una causa común de intoxi- cación por alimentos es la enterotoxina de C. perfringens. Toxinas Los clostridios invasores producen gran variedad de toxinas y enzimas que permiten la diseminación de la infección. Muchas de estas toxinas tienen propiedades letales, necrosantes y hemo- líticas. En ciertos casos, tales propiedades son distintas en una misma sustancia; en otros, éstas se pueden atribuir a diferen- tes entidades químicas. La toxina α de C. perfringens tipo A es una lecitinasa y su acción letal es directamente proporcional a la velocidad con la que fragmenta a la lecitina (componente importante en las membranas celulares) para generar fosforil- colina y diglicérido. La toxina α también produce agregación plaquetaria, de manera que propicia la formación de trombos en vasos sanguíneos pequeños, lo cual se suma al riego hístico deficiente y, por lo tanto, se amplían las consecuencias de la anaerobiosis, en particular, la destrucción de tejido viable (gan- grena gaseosa). La toxina θ tiene efectos hemolíticos y necro- santes similares, pero no es una lecitinasa; es un miembro de las citolisinas dependientes de colesterol que actúan mediante formación de poros en las membranas celulares. La toxina ε es una proteína que causa edema y hemorragia intensa. Los clos- tridios también producen DNasa y hialuronidasa, una colage- nasa que digiere colágena del tejido subcutáneo y el músculo. Algunas cepas de C. perfringens producen una enteroto- xina potente: la enterotoxina de C. perfringes (CPE, C. perfrin- gens enterotoxin), en especial cuando prolifera en platillos a base de carne. Cuando se ingieren más de 108 células vegeta- tivas y éstas esporulan en el intestino, se forma enterotoxina. La CPE (35 kDa) es una proteína que no forma parte esencial del revestimiento de la espora; es distinta a las demás toxinas de clostridios; causa diarrea intensa en 7 a 30 h. La acción de la CPE comprende hipersecreción pronunciada en yeyuno e íleon, con eliminación de líquidos y electrólitos en la diarrea. Otros síntomas menos frecuentes abarcan náusea, vómito y fiebre. Esta enfermedad es similar a la que genera B. cereus y tiende a involucionar de forma espontánea. Las cepas de C. perfringens productoras de enterotoxinas quizá también paticipan en la diarrea por antibióticos y la enterocolitis necro- sante en lactantes. Patogenia En las infecciones invasoras por clostridios, las esporas alcan- zan los tejidos por contaminación de las áreas traumatizadas (tierra, heces fecales) o a partir del aparato digestivo. Las espo- ras germinan a un potencial de oxidorreducción bajo; las células vegetativas se multiplican, fermentan los carbohidratos existen- tes en los tejidos y producen gas. La distensión de los tejidos y su interferencia con el riego sanguíneo, además de la secreción de toxina necrosante y hialuronidasa, favorecen la disemina- ción de la infección. La necrosis hística se extiende, proporcio- nando una oportunidad para incrementar la proliferación bac- teriana, la anemia hemolítica y, por último, la toxemia grave y la muerte. En la gangrena gaseosa (mionecrosis por clostridios), la infección es mixta. Además de clostridios tóxicos, existen clos- tridios proteolíticos y diversos cocos y microorganismos gram- negativos. C. perfringens habita en el aparato genital de 5% de las mujeres. Antes de legalizar el aborto en Estados Unidos, se producían infecciones uterinas por clostridios después de los abortos instrumentales. Clostridium sordellii tiene muchas de las propiedades de C. perfringens. Se ha informado C. sorde- llii como la causa del síndrome de choque tóxico después del aborto médico con mifepristona y misoprostol intravaginal. Se ha relacionado la infección endometrial con este microor- ganismo. La bacteriemia por clostridios, en especial la que es producida por C. septicum, es frecuente en los pacientes con neoplasias. En Nueva Guinea, C. perfringens tipo C origina FIGURA 113 Bacilo de la gangrena gaseosa. Clostridium perfringens no suele formar esporas cuando se cultiva en medios de laboratorio. apter 11_Carroll_4R.indd 186 apter 11_Carroll_4R.indd 186 14/04/16 14/04/16
- 200. CAPÍTULO 11 Bacilosgrampositivos formadores de esporas: Bacillus y Clostridium 187 una enteritis necrosante (que en los niños tiene una mortali- dad alta). Al parecer la vacunación con toxoide tipo C es útil para prevenirla. Manifestaciones clínicas Desde una herida contaminada (es decir, fractura compuesta, útero puerperal), la infección se disemina en uno a tres días hasta provocar crepitación en tejido subcutáneo y músculo, una secreción fétida, necrosis rápidamente progresiva, fiebre, hemólisis, toxemia, choque y muerte. El tratamiento se lleva a cabo al efectuar una cirugía lo más pronto posible (ampu- tación) y con antibióticos. Hasta la llegada de un tratamiento específico, el único recurso terapéutico era la amputación inmediata. Algunas veces la infección provoca sólo una fascitis anaerobia o celulitis. La intoxicación alimentaria por C. perfringens casi siem- pre se produce al ingerir gran cantidad de clostridios que han proliferado en comida caliente a base de carne. La toxina se forma cuando los microorganismos esporulan en el intestino y la diarrea comienza, casi siempre sin vómito ni fiebre, en un lapso de 7 a 30 h. La duración de esta enfermedad es de uno a dos días. Pruebas diagnósticas de laboratorio Las muestras comprenden material de las heridas, pus y tejido. La presencia de bacilos grampositivos grandes en los frotis tratados con tinción de Gram sugiere clostridios de gangrena gaseosa; no suele haber esporas. El material se inocula en un medio con carne picada y glucosa y un medio de tioglicolato, así como en placas de agar sangre y se incuba de forma anaerobia. Una vez que se obtie- nen cultivos puros al seleccionar las colonias de placas de agar sangre incubadas de manera anaerobia, se identifican por medio de reacciones bioquímicas (diversos carbohidratos en el tioglicolato, acción sobre la leche), hemólisis y características morfológicas de las colonias. Se valora la actividad de la leciti- nasa por el precipitado que se forma alrededor de las colonias en un medio con yema de huevo. La espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción-ionización de láser asistida con matriz (MALDI-TOF MS, matrix-assisted laser desorp- tion/ionization time-of-fligt mass spectrometry) es un método rápido y sensible para identificar especies invasoras de Clos- tridium obtenidas por cultivo. C. perfringens rara vez produce esporas cuando se cultiva en agar en el laboratorio. Tratamiento El aspecto más importante del tratamiento es la desbridación quirúrgica inmediata y extensa del área afectada y la extir- pación de todo el tejido desvitalizado, donde los microorga- nismos tienden a proliferar. Al mismo tiempo se empiezan a administrar antimicrobianos, en especial penicilina. El oxí- geno hiperbárico tiene cierta utilidad en el tratamiento médico de las infecciones hísticas por clostridios. Se dice que “desin- toxica” a los pacientes con rapidez. Se cuenta con antitoxinas contra las toxinas de C. perfrin- gens, Clostridium novyi, Clostridium histolyticum y Clostri- dium septicum, por lo general en forma de inmunoglobulinas concentradas. También se ha utilizado la antitoxina polivalente que contiene anticuerpos contra varias toxinas. Si bien en oca- siones esta antitoxina se administra en personas con heridas contaminadas que contienen abundante tejido desvitalizado, no se ha demostrado que sea eficaz. La intoxicación alimenta- ria por la enterotoxina de C. perfringens casi siempre requiere sólo de cuidados paliativos. Prevención y control Las mejores medidas preventivas existentes son limpieza inme- diata y adecuada de las heridas contaminadas y desbridación quirúrgica, combinadas con la administración de antibióticos contra clostridios (p. ej., penicilina). No se debe confiar en las antitoxinas. A pesar de que se han preparado toxoides para la vacunación activa, no se han utilizado en la práctica. CLOSTRIDIUM DIFFICILE Y ENFERMEDADES DIARREICAS Colitis seudomembranosa Esta entidad patológica se diagnostica al detectar una o ambas toxinas de C. difficile en las heces fecales y al observar, por medio de endoscopia, seudomembranas o microabscesos en los pacientes con diarrea que han recibido antibióticos. Las pla- cas y los microabscesos a menudo se circunscriben a un área del intestino. La diarrea puede ser líquida o hemorrágica y con frecuencia el paciente manifiesta cólicos abdominales, leucoci- tosis y fiebre. Numerosos antibióticos se han vinculado con la colitis seudomembranosa, pero los más frecuentes son ampi- cilina y clindamicina y, de modo más reciente, las fluoroqui- nolonas. La enfermedad se trata al interrumpir la utilización del antibiótico lesivo y con la administración de metronidazol, vancomicina o fidaxomicina por vía oral. El trasplante fecal se ha convertido en un método exitoso y sistemático para tra- tar la enfermedad recurrente y resistente. De manera habitual, esto conlleva el uso de las heces donadas por un pariente sano mediante colonoscopia o, de forma menos común, con una sonda nasogástrica en el tubo digestivo del paciente. La administración de antibióticos provoca la proliferación de C. difficile farmacorresistente que produce dos toxinas. La toxina A, una enterotoxina potente que también tiene alguna actividad citotóxica, se une a las membranas con borde en cepillo del intestino en los sitios receptores. La toxina B es una citotoxina poderosa. Las toxinas de C. difficile tienen actividad de glucosiltransferasa y actúan al modificar moléculas de seña- lización que controlan varias funciones celulares. Esto resulta en apoptosis, exudado capilar, estimulación con citocina y otras consecuencias que desembocan en colitis. Ambas toxinas se encuentran casi siempre en las heces de pacientes con colitis seudomembranosa. Sin embargo, se han descrito las infeccio- nes por toxinas negativas a A y positivas a B. No todas las cepas de C. difficile producen las toxinas y los genes de la toxina se encuentran en un islote de patogenicidad cromosómico grande junto con otros tres genes que regulan la expresión de toxina. El diagnóstico es clínico y se sustenta al comprobar la pre- sencia de la toxina en las heces por medio de diversos métodos queincluyencultivotoxígenoanaerobio,inmunoenzimoanálisis apter 11_Carroll_4R.indd 187 apter 11_Carroll_4R.indd 187 14/04/16 14/04/16
- 201. 188 SECCIÓN IIIBacteriología y pruebas moleculares que detectan los genes que codifican las toxinas A o B. Para obtener descripciones más completas sobre el diagnóstico de C. difficile, se recomienda ir a la referencia de Burnham. La oleada de infecciones por C. difficile desde el comienzo del siglo xxi se cree tiene relación con una combinación de fac- tores del hospedador y del microorganismo. Los factores cau- sales del hospedador incluyen envejecimiento de la población, aumento de la supervivencia de individuos susceptibles inmu- nodeprimidos e incremento de la administración de antibió- ticos y fármacos supresores de ácido gástrico. Los factores del microorganismo se relacionan sobre todo con el surgimiento de ciertos tipos de cepas que son más virulentos debido a muta- ciones en el locus de la patogenicidad. Diarrea por antibióticos Con frecuencia la administración de antibióticos provoca una diarrea leve a moderada que se denomina diarrea por anti- bióticos. Por lo general, esta enfermedad es más leve que la forma clásica de colitis seudomembranosa. C. difficile pro- duce hasta 25% de los casos de diarrea por antibióticos. Otros clostridios, como C. perfringens y C. sordelli también se han considerado como causas. Estos últimos no originan colitis seudomembranosa. Verificación de conceptos • Los clostridios son bacilos grampositivos anaerobios, grandes y formadores de esporas que se encuentran en el ambiente y el aparato digestivo de muchos animales y seres humanos. • Los clostridios se clasifican según su capacidad para fer- mentar carbohidratos y digerir proteínas. • Las toxinas producidas por los clostridios patógenos son la causa de diversas enfermedades graves, como botulismo, tétanos y gangrena gaseosa. • C. botulinum produce toxina botulínica, una de las neuro- toxinas más potentes del planeta, que origina el botulismo, enfermedad caracterizada por parálisis flácida. • C. tetani también produce una neurotoxina, la tetanoespas- mina, que bloquea la liberación de los neurotransmisores inhibidores cuyo resultado es el tétanos, entidad patológica caracterizada por parálisis espástica. • Otros clostridios generan infecciones invasoras de las heridas (gangrena), septicemia, diarrea por antibióticos e intoxicación alimentaria según sean las circunstan- cias epidemiológicas y los tipos de enzimas o las toxinas elaboradas. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. Una mujer que vive en una granja pequeña es llevada a urgencias por diplopía y dificultad para hablar. En las dos últimas horas, advirtió xerostomía y debilidad generalizada. La noche previa sirvió, como parte de la comida, ejotes envasados en casa. Probó los ejotes antes de hervirlos. Ningún otro miembro de la familia enfermó. En la exploración física, se observa parálisis descen- dente simétrica de los pares craneales, extremidades superiores y tronco. ¿Cuál de los siguientes es el diagnóstico correcto? (A) Tétanos (B) Intoxicación por estricnina (C) Botulismo (D) Sobredosis de morfina (E) Intoxicación por ricino 2. ¿Cuál de los siguientes constituye un factor de virulencia impor- tante de Bacillus anthracis? (A) Antígeno protector (B) Lipopolisacárido (C) Pilosidades (D) Toxina que inhibe al factor EF-2 de alargamiento de la cadena peptídica (E) Lecitinasa 3. Un varón joven sufre una lesión importante de tejidos blandos y una fractura abierta de la pierna derecha después de un accidente en una motocicleta. Un día después su temperatura es de 38 °C, la frecuencia cardiaca está aumentada, y hay diaforesis e inquietud. En la exploración física, la pierna se observa edematosa y tensa, y de las heridas drena un material líquido seroso y oscuro. La piel de la extremidad inferior fría, pálida, blanca y brillante. Se percibe crepitación. Su hematocrito es de 20% (~ 50% del normal) y la hemoglobina circulante es normal. En el suero hay hemoglo- bina libre. ¿Cuál de los microorganismos siguientes constituye la causa más probable de esta infección? (A) Clostridiun tetani (B) Staphylococcus aureus (C) Escherichia coli (D) Bacillus anthracis (E) Clostridium perfringens 4. Para el paciente descrito en la pregunta 3, ¿cuál de las siguientes opciones probablemente causa la hemólisis? (A) Factor de elongación (B) Tetanoespasmina (C) Lecitinasa (D) Estreptolisina O (E) Toxina B 5. El periodo de incubación notificado del carbunco pulmonar (por inhalación) es de: (A) 2 días (B) 10 días (C) 3 semanas (D) 6 semanas (E) 6 meses 6. Un alimento que con frecuencia causa intoxicación alimentaria por Bacillus cereus es: (A) Arroz frito (B) Papa al horno (C) Arroz cocinado recientemente al vapor (D) Ejotes (E) Miel 7. La toxina tetánica (tetanoespasmina) se difunde hacia las termi- nales de las células inhibidoras en la médula espinal y tallo ence- fálico y bloquea a cuál de las siguientes: (A) Liberación de acetilcolina (B) Fragmentación de proteínas SNARE (C) Liberación de glicina inhibidora y ácido aminobutírico γ (D) Liberación de antígeno protector (E) Activación de acetilcolina esterasa 8. Un varón de 45 años de edad que emigró a Estados Unidos hace cinco años sufrió una lesión por punción en el tercio inferior de la pierna derecha cuando su podadora lanzó una astilla. Seis días después, advirtió espasmos en los músculos de la pierna derecha; apter 11_Carroll_4R.indd 188 apter 11_Carroll_4R.indd 188 14/04/16 14/04/16
- 202. CAPÍTULO 11 Bacilosgrampositivos formadores de esporas: Bacillus y Clostridium 189 al séptimo día, los espasmos aumentaron. El día de hoy (octavo día) manifiesta espasmos musculares generalizados, sobre todo en los músculos de la mandíbula, la cual, no pudo abrirla y acu- dió al servicio de urgencias. Ahí, el sujeto se encuentra alerta y yace tranquilo en la cama. Una puerta en el pasillo se azota y el paciente manifiesta de forma repentina un espasmo muscular generalizado y su espalda se arquea. ¿Cuál de los siguientes es el diagnóstico correcto? (A) Botulismo (B) Carbunco (C) Gangrena gaseosa (D) Tétanos (E) Síndrome de choque tóxico 9. ¿Cuál de las aseveraciones siguientes sobre el tétanos y el toxoide tetánico es correcta? (A) La toxina tetánica mata neuronas (B) La vacunación con toxoide tetánico tiene una tasa de fracaso de 10% (C) La mortalidad del tétanos generalizado es menor de 1% (D) Con frecuencia el primer signo de tétanos es diplopía (E) La toxina tetánica actúa sobre las sinapsis interneuronales inhibidoras 10. Un varón de 67 años de edad tuvo una cirugía por rotura de un divertículo del colon sigmoides con un absceso. Se realizó una reparación y el absceso se drenó. Se le administró tratamiento con gentamicina y ampicilina intravenosas. Cuatro y diez días después de su egreso hospitalario, el paciente presentó malestar general, fiebre y cólicos abdominales. Tuvo varios episodios de diarrea. Las evacuaciones mostraron una prueba positiva de san- gre oculta y presencia de polimorfonucleares. La sigmoidoscopia reveló mucosa eritematosa e inflamada y placas amarillentas de 4 a 8 mm de diámetro. ¿Cuál de las siguientes opciones constituye el problema más probable de este paciente? (A) Enterotoxina de Staphylococcus aureus (B) Toxina de Bacillus cereus (C) Toxinas de Clostridium difficile (D) Toxina de Clostridium perfringens (E) Escherichia coli enterohemorrágica 11. El botulismo infantil se ha vinculado con los siguientes clostri- dios, excepto: (A) Clostridium baratii (B) Clostridium septicum (C) Clostridium butyricum (D) Clostridium botulinum 12. ¿Cuál de los siguientes alimentos se relaciona con más frecuencia con el botulismo infantil? (A) Jarabe de maíz (B) Leche en polvo enlatada (C) Multivitaminas líquidas (D) Miel (E) Alimento infantil envasado en frascos 13. LassiguientessoncaracterísticasdeBacillusanthracis,EXCEPTO: (A) Movilidad en la preparación en fresco (B) Colonias con forma de “cabeza de Medusa” (C) Cápsula de ácido poli-d-glutámico (D) Sensibilidad in vitro a la penicilina (E) Ausencia de hemólisis en agar sangre de carnero al 5% 14. ¿Cuál de las siguientes aseveraciones sobre la vacuna contra Baci- llus anthracis es correcta? (A) Se encuentra disponible de forma constante para cualquier ciudadano de Estados Unidos (B) Los estudios clínicos sobre vacuna recombinante han demostrado que es segura y eficaz (C) La vacuna actual se tolera bien (D) Una sola dosis basta después del contacto con esporas (E) La vacuna en animales carece de utilidad 15. Las aseveraciones siguientes sobre Clostridium perfringens son correctas, EXCEPTO: (A) Produce una enterotoxina (B) Genera una zona doble de hemólisis β cuando se cultiva en agar sangre (C) Algunas cepas son aerotolerantes (D) Constituye la causa más frecuente de diarrea por antibióticos (E) En ocasiones, causa hemólisis intravascular Respuestas 1. C 2. A 3. E 4. C 5. D 6. A 7. C 8. D 9. E 10. C 11. B 12. D 13. A 14. B 15. D BIBLIOGRAFÍA Abbara A, Brooks T, Taylor GP, et al.: Lessons for control of heroin- associated anthrax in Europe from 2009-2010 outbreak case studies, London, UK. Emerg Infect Dis 2014;20:1115-1122. 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- 204. 191 12 Bacilos grampositivos aerobios noesporulantes: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix, Nocardia y patógenos relacionados C A P Í T U L O Los bacilos grampositivos no esporulantes constituyen un grupo diverso de bacterias aerobias y anaerobias. En este capí- tulo se revisan los miembros aerobios de este grupo. Los baci- los grampositivos anaerobios que no forman esporas como especies de Propionibacterium y de Actinomyces se describen en el capítulo 21 dentro de las infecciones anaerobias. Géne- ros específicos de los dos grupos, es decir, especies del género Corynebacterium y especies del género Propionibacterium, son miembros de la microbiota normal de la piel y las mucosas del ser humano y, como tales, a menudo son contaminantes de muestras clínicas que se remiten para valoración diag- nóstica. Sin embargo, entre los bacilos grampositivos aero- bios se encuentran microorganismos patógenos importantes como Corynebacterium diphtheriae, un microorganismo que produce una potente exotoxina que causa la difteria en el ser humano, y Mycobacterium tuberculosis (capítulo 23), el micro- organismo causante de la tuberculosis. Listeria monocytogenes y Erysipelothrix rhusiopathiae se localizan principalmente en animales y a veces producen enfermedades graves en el ser humano. Las de especies de Nocardia y Rhodococcus se localizan en el suelo y son patógenos importantes en pacientes inmunodeprimidos. Las especies del género Corynebacterium y bacterias rela- cionadas por lo común tienen una forma irregular o en palillo de tambor; aunque no todas las cepas tienen las formas irregu- lares, los términos bacterias corineformes o difteroides son convenientes para designar este grupo amplio. Estas bacterias tienen un alto contenido de guanosina más citosina y compren- den los géneros Corynebacterium, Arcanobacterium, Mycobac- terium y otros más (cuadro 12-1). Los géneros Actinomyces y Propionibacterium se clasifican como anaerobios, pero algunas cepas se desarrollan bien en medios aerobios (aerotolerantes) y se deben diferenciar de las bacterias corineformes aerobias. Otros bacilos grampositivos no esporulantes tienen formas más regulares y un contenido más bajo de guanosina más citosina. Los géneros comprenden Listeria y Erysipelothrix; estas bacterias están relacionadas en forma más estrecha con las especies anaerobias del género Lactobacillus, que a veces se desarrollan bien en aire, y con las especies formadoras de esporas de los géneros Bacillus y Clostridium (y con los cocos grampositivos de las especies de los géneros Staphylococcus y Streptococcus) que con las bacterias corineformes. En el cuadro 12-1 se enumeran los géneros de bacilos grampositivos aero- bios de importancia médica. En el capítulo 21 se describen las bacterias anaerobias. No hay método unificado para identificar los bacilos gram- positivos. Algunos laboratorios tienen equipos para cuantificar el contenido de guanosina más citosina. El crecimiento sólo en condiciones anaerobias implica que la cepa es un anaerobio, pero muchas cepas de los géneros Lactobacillus, Actinomyces y Propionibacterium, entre otras son aerotolerantes. La mayor parte de las cepas del género Mycobacterium, Nocardia y Rho- dococcus, son acidorresistentes y, por lo tanto, se diferencian con facilidad de las bacterias corineformes. Muchos géneros de Bacillus y Clostridium producen esporas y la presencia de éstas distingue con facilidad a la cepa aislada de las bacterias corine- formes, cuando existen. Para determinar que una cepa es un Lactobacillus (o Propionibacterium) puede ser necesaria la cro- matografía de gas líquido para medir los productos metabóli- cos del ácido láctico (o ácido propiónico), pero esto en general no es práctico. Otras pruebas que se utilizan para tratar de identificar una cepa de bacilos grampositivos no esporulantes como miembro de un género o especie son la producción de catalasa, la producción de indol, la reducción de nitrato y la fermentación de carbohidratos, entre otras. En muchos labo- ratorios clínicos se han desarrollado técnicas de secuenciación dirigidas al gen de rRNA 16S u otros blancos génicos para la identificación de muchos de estos microorganismos, pero sobre todo de especies de los géneros Mycobacterium y Nocardia ais- ladas de especímenes clínicos. Una tecnología relativamente nueva introducida recientemente en los laboratorios de micro- biología comprende la aplicación de la espectroscopia de masas de tiempo de vuelo con ionización-desorción de matriz asistida con láser (MALDI-TOF MS, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectroscopy) que permite valorar a las proteínas ribosomales cuyos patrones espectrales son lo suficientemente singulares como para identificar a los micro- organismos a nivel de especie. Esta tecnología funciona bien para identificar una amplia gama de bacterias como corine- bacterias y anaerobios, aunque hay menos datos para bacterias más complejas, por ejemplo especies de Mycobacterium. Esta tecnología se describe con mayor detalle en el capítulo 47. apter 12_Carroll_4R.indd 191 apter 12_Carroll_4R.indd 191 14/04/16 14/04/16
- 205. 192 SECCIÓN IIIBacteriología CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE Morfología e identificación Las corinebacterias tienen un diámetro de 0.5 a 1 μm y varios micrómetros de longitud. Es característico que posean tume- facciones irregulares en un extremo que les da el aspecto de “forma en palillo de tambor” (figura 12-1). Con una distri- CUADRO 121 Bacilos grampositivos aerobios comunes y sus asociaciones con enfermedades Microorganismo Características generales Asociaciones con enfermedades Corynebacterium Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium ulcerans Corynebacteriumpseudotuberculosis Corynebacterium striatum Corynebacterium urealyticum Corynebacterium jeikeium Bacilos claviformes que forman gránulos metacromáticos; colonias negras en medios de cultivo de telurita Colonias blancas grisáceas; ureasapositivas Colonias blancas amarillentas; ureasapositivas Produce urea; resistente a muchos fármacos Colonias blancas grisáceas; resistentes a muchos fármacos Cepas toxígenas: difteria Cepas no toxígenas: bacteriemia, endocarditis Las cepas toxígenas pueden causar difteria Las cepas toxígenas pueden causar difteria Infecciones hospitalarias, especialmente de vías respiratorias inferiores Cistitis y pielitis incrustadas Bacteriemia y otras infecciones en hospedadores inmunodeprimidos Arcanobacterium hemolyticum Cocobacilos catalasa negativos; hemolíticos β Faringitis; infecciones de heridas; septicemia Rothia Rothia dentocariosa Rothia mucilaginosa Ramificaciones filamentosas Morfología cocoide; colonias blanquecinas Abscesos; endocarditis Bacteriemia, endocarditis en usuarios de drogas intravenosas y pacientes inmunodeprimidos Listeria monocytogenes Bacilos grampositivos cortos y finos; motilidad catalasa positiva, no forma espora; muestra hemólisis β Gastroenteritis por alimentos en hospedadores inmunosuprimidos; septicemia y meningitis neonatales; infecciones posparto; pacientes con meningoencefalitis, bacteriemia y septicemia en pacientes inmunodeprimidos Erysipelathrix rhusiopathiae Aparece únicamente como cadenas cortas o ramificaciones filamentosas; hemolítico α en agar de sangre; produce H2 S Erisipeloide; bacteriemia; endocarditis Nocardia Nocardia brasiliensis Nocardia abscessus Nocardia nova complex Nocardia transvalensis complex Nocardia farcinica Nocardia asteroides Nocardia cyriacigeorgica Bacilos positivos acidorresistentes modificados, finos, ramificados y con forma de microesfera; colonias rugosas amarillentas Bacilos positivos acidorresistentes modificados, finos, ramificados y con forma de microesfera Bacilos positivos acidorresistentes modificados, finos, ramificados y con forma de microesfera Bacilos positivos acidorresistentes modificados, finos, ramificados y con forma de microesfera Bacilos positivos acidorresistentes modificados, finos, ramificados y con forma de microesfera; colonias lisas que se vuelven color naranja Bacilos positivos acidorresistentes modificados, finos, ramificados y con forma de microesfera; colonias blancas gredosas Bacilos positivos acidorresistentes modificados, finos, ramificados y con forma de microesfera; colonias empolvadas con hifas elevadas Lesiones cutáneas relacionadas con traumatismo, incluyen micetoma Abscesos pulmonares y cerebrales Varias especies de este complejo asociadas con una gama amplia de síndromes clínicos Abscesos pulmonares y cerebrales Entre las especies más resistenes de Nocardia, este patógeno causa enfermedad diseminada, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos Causa no frecuente de infecciones La especie de Nocardia más común en material clínico; infecciones respiratorias, heridas, absceso cerebral Rhodococcus equi Microorganismos cocoides que son positivos acidorresistentes modificados; colonias lisas color rosa salmón Neumonía, a menudo con formación de cavidad en pacientes inmunodeprimidos Actinomadura Actinomadura madurae Actinomadura pelletieri Filamentos finos, cortos ramificados; tienen apariencia de granos en tejido; las colonias son rugosas y pueden tener color Filamentos ramificados cortos; tienen apariencia de granos en tejido; las colonias son rugosas y pueden tener color Micetoma (micetoma del pie) Micetoma Streptomyces somaliensis Negativos acidorresistentes; las colonias tienen apariencia rugosa con hifas elevadas Micetoma bución irregular dentro del bacilo (a menudo cerca de los polos) se encuentran los gránulos que se tiñen profundamente con colorantes de anilina (gránulos metacromáticos) que le confie- ren al bacilo un aspecto de microesfera. Las corinebacterias individuales en frotis teñidos tienden a acomodarse en forma paralela o en ángulos agudos entre sí. Pocas veces se observan verdaderas ramificaciones en los cultivos. apter 12_Carroll_4R.indd 192 apter 12_Carroll_4R.indd 192 14/04/16 14/04/16
- 206. CAPÍTULO 12 Bacilosgrampositivos aerobios no esporulantes 193 FIGURA 121 Corynebacterium diphtheriae de un medio de Pai teñido con azul de metileno. Es característico que tengan un diámetro de 0.5 a 1 × 3 a 4 μm. Algunas de las bacterias tienen extremos en palillo de tambor (amplificación original × 1000). En agar sangre, las colonias de C. diphtheriae son peque- ñas, granulosas y grises, con bordes irregulares y pueden tener pequeñas zonas de hemólisis. En telurita de potasio que con- tiene agar, las colonias son de color pardo a negro con un halo negro pardusco debido a que la telurita se reduce dentro de la célula (estafilococos y estreptococos también producen colo- nias de color negro). Se han reconocido ampliamente cuatro biotipos de C. diphtheriae; cada uno produce una exotoxina potente: gravis, mitis, intermedius y belfanti. Estas variantes se clasificaron con base en las características de crecimiento tales como morfología de la colonia, reacciones bioquímicas y grave- dad de la enfermedad producida por la infección. Existen muy pocos laboratorios de referencia equipados con los métodos necesarios para ofrecer una clasificación confiable del biotipo. La frecuencia de la difteria ha disminuido de manera conside- rable y ya no es importante la relación entre la gravedad de la enfermedad y la biovariedad para el tratamiento médico ni para el control de los casos o brotes por parte de salud pública. Si es necesario en el contexto de un brote epidémico, se pueden utilizar métodos inmunoquímicos y moleculares para tipificar C. diphtheriae. C. diphtheriae y otras corinebacterias proliferan en medio aerobio en casi todos los medios de laboratorio ordinarios. En el suero de Loeffler, las corinebacterias proliferan con mayor rapidez que otros microorganismos respiratorios y las carac- terísticas morfológicas de los microorganismos son típicas en los frotis obtenidos de estas colonias. Las corinebacterias tienden al pleomorfismo en la mor- fología microscópica y de colonias. Cuando algunos micro- organismos de la difteria no toxígenos son infectados con bacteriófago de determinados bacilos de la difteria coccígenos, la progenie de las bacterias expuestas son lisógenas y toxíge- nas; este rasgo después se hereda. Cuando los bacilos de difte- ria toxígenos son subcultivados en serie en antisuero específico contra el bacteriófago moderado que portan, tienden a volverse no toxígenos. Por consiguiente, la adquisición del bacteriófago conduce a la toxigenicidad (conversión lisógena). La produc- ción eficaz de la toxina ocurre tal vez sólo cuando el probacte- riófago de C. diphtheriae lisógeno se activa y produce lisis. Si bien la toxigenicidad está controlada por el gen del bacteriófago, la invasividad está sujeta al control de genes bacterianos. Patogenia El principal microorganismo patógeno en el ser humano del género Corynebacterium es C. diphtheriae, el microorganismo que produce la difteria respiratoria o cutánea. En la natura- leza, C. diphtheriae se observa en el sistema respiratorio, en heridas o en la piel de personas infectadas o portadores sanos. Se disemina por las gotitas de secreciones respiratorias o por el contacto con individuos susceptibles; los bacilos luego se desarrollan en las mucosas o en abrasiones en la piel y los que son toxígenos comienzan a producir toxina. Todos los microorganismos de la especie C. diphtheriae toxígena son capaces de elaborar la misma exotoxina produc- tora de la enfermedad. La producción in vitro de esta toxina depende en gran parte de la concentración de hierro. La pro- ducción de toxina es óptima a 0.14 μg de hierro por mililitro de medio pero prácticamente se suprime a una concentración de 0.5 μg/ml. Otros factores que influyen en la producción de toxina in vitro son presión osmótica, concentración de amino- ácidos, pH y disponibilidad de fuentes adecuadas de carbono y nitrógeno. Los factores que controlan la producción de toxina in vitro aún no se comprenden bien. La toxina de la difteria es un polipéptido termolábil, monocatenario, de tres dominios polipeptídicos (62 kDa) que puede ser letal a una dosis de 0.1 μg/kg de peso corporal. Si se rompen los puentes de disulfuro, la molécula puede divi- dirse en dos fragmentos. El fragmento B (38 kDa), que no tiene actividad independiente, se divide funcionalmente en un dominio de receptor y un dominio de translocación. La unión del dominio de receptor a las proteínas de membrana de la célula hospedadora CD-9 y al precursor parecido al factor de crecimiento epidérmico fijador de heparina (HB-EGF, hep- arin-binding epidermal growth factor), desencadena la entrada de la toxina en la célula a través de la endocitosis mediada por el receptor. La acidificación del dominio de translocación den- tro de un endosoma en desarrollo conduce a la creación de un canal de proteína que facilita el desplazamiento del fragmento A hacia el citoplasma de la célula hospedadora. El fragmento A inhibe la elongación de la cadena polipéptidica, siempre y cuando esté presente un dinucleótido de nicotinamida y ade- nina (NAD, nicotinamide–adenine dinucleotide), al inactivar el factor de elongación EF-2. Este factor es necesario para la translocación del RNA de transporte de polipeptidil desde el sitio aceptador al donante en el ribosoma eucariótico. El frag- mento A de la toxina inactiva EF-2 al catalizar una reacción que produce nicotinamida libre más complejo de adenosina difosfato-ribosa-EF-2 inactivo (ADP-ribosilación). Se cree que el cese brusco de la síntesis de proteína es la causa de los efectos necrosantes y neurotóxicos de la toxina de la difteria. Cepas de Pseudomonas aeruginosa pueden producir una exotoxina mediante un mecanismo de acción similar. apter 12_Carroll_4R.indd 193 apter 12_Carroll_4R.indd 193 14/04/16 14/04/16
- 207. 194 SECCIÓN IIIBacteriología Anatomía patológica La toxina de la difteria se absorbe hacia las mucosas y produce destrucción del epitelio y una respuesta inflamatoria superfi- cial. El epitelio necrótico queda embebido en la fibrina exuda- tiva y los eritrocitos y leucocitos, de manera que se forma una “seudomembrana” grisácea, por lo general sobre amígdalas, faringe o laringe. Cualquier tentativa de eliminar la seudo- membrana expone y desgarra los capilares y por lo tanto pro- duce hemorragia. Los ganglios linfáticos del cuello aumentan de tamaño y algunas veces se produce edema acentuado en todo el cuello con distorsión de las vías respiratorias, a menudo llamado “cuello proconsular”. Los bacilos de la difteria en la membrana continúan produciendo toxina en forma activa. Ésta se absorbe y el resultado es una lesión tóxica a distancia, prin- cipalmente degeneración parenquimatosa, infiltración grasa y necrosis en el músculo cardiaco (miocarditis), hígado, riñones (necrosis tubular) y glándulas suprarrenales, acompañada en ocasiones de hemorragia macroscópica. La toxina además pro- voca lesión de los nervios (desmielinización), cuyo resultado es a menudo parálisis del paladar blando, músculos oculares o extremidades. La difteria cutánea o de heridas es más frecuente en los trópicos, aunque también se han descrito algunos casos en climas templados entre alcohólicos, indigentes y otros gru- pos empobrecidos. Se forma una membrana sobre una herida infectada que no logra cicatrizar. Sin embargo, la absorción de toxina suele ser leve y los efectos sistémicos insignificantes. La pequeña cantidad de toxina que se absorbe durante la infec- ción cutánea favorece el desarrollo de anticuerpos antitoxina. La “virulencia” de los bacilos diftéricos se debe a su capacidad para establecer la infección, su proliferación rápida y luego su pronta elaboración de toxina que se absorbe de manera eficaz. C. diphtheriae no tiene que ser toxígeno para establecer una infección localizada (p. ej., en la nasofaringe o la piel) pero las cepas antitoxígenas no producen efectos tóxicos localiza- dos o sistémicos. C. diphtheriae no invade activamente tejidos profundos y prácticamente nunca entra en la circulación san- guínea. Sin embargo, es notable que en el transcurso de los últimos dos decenios han aumentado los informes sobre infec- ciones invasivas como la endocarditis y septicemia debida a C. diphtheriae no toxígena. Manifestaciones clínicas Cuando la inflamación diftérica empieza en el aparato res- piratorio, casi siempre se acompaña de dolor de garganta y febrícula. La postración y la disnea se presentan poco después por la obstrucción causada por la membrana. Esta obstruc- ción puede incluso ocasionar asfixia si no se trata con rapidez mediante intubación o traqueostomía. Las irregularidades del ritmo cardiaco indican lesión del corazón. Más tarde, puede haber dificultades visuales, de lenguaje, de la deglución o del movimiento de los brazos o las piernas. Todas estas manifesta- ciones tienden a desaparecer en forma espontánea. En general, la variedad gravis tiende a producir una enfer- medad más grave que la variedad mitis, pero todos los tipos pueden producir enfermedad similar. Pruebas diagnósticas de laboratorio Son útiles para confirmar la impresión clínica y tienen impor- tancia epidemiológica. Nota: El tratamiento específico nunca debe demorarse por los resultados de laboratorio si el cuadro clínico es muy sugestivo de difteria. Los médicos deben noti- ficar al laboratorio clínico antes de obtener o remitir muestras para cultivo. Antes de la administración de fármacos antimicrobianos deben obtenerse frotis de dacrón de la nariz, la faringe o de otras lesiones sospechosas. El frotis debe obtenerse por debajo de cualquier membrana visible. El frotis luego debe colocarse en medios de transporte semisólidos como Amies. Los frotis teñidos con azul de metileno alcalino o con tinción de Gram muestran bacilos con forma de microesferas con una dis- posición característica. Las muestras deben ser inoculadas en una placa de agar con sangre (para descartar la posibilidad de estreptococo hemolítico), y un medio selectivo como placa de telurita (p. ej., agar con sangre y cistina-telurita [CTBA, cystine-tellurite blood agar] o un medio modificado de Tinsdale) e incubado a 37 °C en CO2 al 5%. Las placas se examinan de 18 a 24 h. En 36 a 48 h, las colonias en medio de telurita son lo suficientemente definidas para el reconocimiento de C. diphtheriae. En el agar de cistina con telurita, las colonias son negras con un halo café. Una cepa presuntiva de C. diphtheriae debe someterse a pruebas de toxigenicidad. Tales pruebas se realizan sólo en la- boratorios de salud pública de referencia. Existen varios méto- dos, a saber: 1. El método de Elek modificado descrito por la Unidad de Referencia de Difteria de la OMS. Un disco de papel de filtro que contiene antitoxina (10 UI/disco) se coloca en una placa de agar. Los cultivos en los que se debe comprobar la toxigenicidad se inocu- lan (cuando menos se eligen 10 colonias) de 7 a 9 mm del disco. Después de 48 h de incubación, la antitoxina que se difunde desde el disco de papel ha precipitado la toxina que se difunde desde los cultivos toxígenos y ha produ- cido bandas de precipitina entre el disco y el crecimiento bacteriano. 2. Se han descrito los métodos con base en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reac- tion) para la detección del gen de la toxina diftérica (tox). Los análisis de PCR para tox también se pueden utilizar directamente en los especímenes de los pacientes antes que se disponga de los resultados de cultivo. Un cultivo positivo confirma un análisis de PCR positivo. Un cultivo negati- vo después de la antibioticoterapia junto con un análisis de PCR positivo indica que el paciente probablemente tiene difteria. 3. Se pueden emplear enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA, enzyme–linked immunosorbent assay) para detec- tar toxina diftérica de cepas de C. diphtheriae clínicas. 4. Un análisis de tira inmunocromográfica permite detectar toxinas de la difteria en cuestión de horas. Este análisis es muy sensible. Los últimos dos estudios no se llevan a cabo en todos los lugares. apter 12_Carroll_4R.indd 194 apter 12_Carroll_4R.indd 194 14/04/16 14/04/16
- 208. CAPÍTULO 12 Bacilosgrampositivos aerobios no esporulantes 195 Resistencia e inmunidad Puesto que la difteria es principalmente resultado de la acción de la toxina formada por el microorganismo más que de la inva- sión por el mismo, la resistencia a la enfermedad depende en gran parte de la disponibilidad de la antitoxina neutralizante específica en el torrente sanguíneo y en los tejidos. En general es verdad que la difteria ocurre sólo en las personas que no poseenanticuerposdeantitoxina(IgG)(omenosde0.01UI/ml). La mejor manera de valorar la inmunidad a la toxina de la dif- teria en pacientes individuales es mediante el análisis de las inmunizaciones con toxoide diftérico documentadas y si es necesaria la inmunización primaria o de refuerzo. Tratamiento El tratamiento de la difteria se basa en gran parte en la supre- sión rápida de las bacterias productoras de toxina por los fárma- cos antimicrobianos y la administración inicial de la antitoxina específica contra la toxina formada por los microorganismos en su lugar de entrada y multiplicación. La antitoxina de la difteria se produce en diversos animales (caballos, corderos, cabras y conejos) mediante la inyección repetida de toxoide purificado y concentrado. El tratamiento con antitoxina es indispensable cuando hay sospecha clínica importante de difteria. Se inyectan entre 20000 y 120000 unidades por vía intramuscular o intrave- nosa, dependiendo de la duración de los síntomas y la gravedad de la enfermedad, después de haber tomado las precauciones correspondientes (prueba cutánea) para descartar hipersensibi- lidad al suero animal. La antitoxina se administra por vía intra- venosa el día que se confirma el diagnóstico clínico de difteria y no es necesario repetirla. En los casos leves es posible utilizar la inyección intramuscular. La antitoxina de difteria neutralizará sólo toxina circulante que no se une a tejido. Los antimicrobianos (penicilina, macrólidos) inhiben el crecimiento de bacilos de difteria. Aunque tales fármacos care- cen prácticamente de efectos sobre el proceso de la enfermedad, pueden detener la producción de toxina, además sirven de apoyo para los esfuerzos de los programas de salud pública. También ayudan a eliminar estreptococos coexistentes y C. diphtheriae de las vías respiratorias de pacientes o portadores. La resistencia antimicrobiana a tales agentes es rara. Epidemiología, prevención y control Antes de la inmunización artificial, la difteria era principal- mente una enfermedad de niños pequeños. La infección ocu- rría en forma sintomática o asintomática en una etapa inicial y producía la propagación de la antitoxina en la población. Una infección asintomática durante la adolescencia y la edad adulta servía de estímulo para el mantenimiento de altas concentra- ciones de antitoxina. Por consiguiente, casi todos los miembros de la población, excepto los niños, eran inmunes. Casi 75% de los niños entre seis y ocho años que viven en países en vías de desarrollo donde las infecciones cutáneas por C. diphtheriae son frecuentes tienen concentraciones séricas de antitoxina protectoras. La absorción de pequeñas cantidades de toxina de la difteria de la infección en la piel al parecer pro- porciona el estímulo antigénico para la respuesta inmunitaria; la cantidad de toxina que se absorbe no produce enfermedad. A finales del siglo xx, la mayor parte de los países desarro- llados anunciaron la eliminación de la difteria como resultado de estrategias de vacunación infantil exitosas. Sin embargo, entre 1990 y 1998, tuvo lugar un resurgimiento de difteria epi- démica, principalmente en adultos, en la Federación Rusa y los estados recientemente independizados de la ex Unión Sovié- tica. Esto probablemente fue resultado de la reducida cobertura de las campañas de vacunación, entre otros factores sociales. Dicho resurgimiento resalta con claridad la importancia de mantener la inmunización en todo el mundo. La inmunización activa en la infancia con toxoide de la dif- teria genera concentraciones de antitoxina que por lo general son adecuadas hasta la edad adulta. Los adultos jóvenes deben recibir refuerzos del toxoide, porque los bacilos de la difteria toxígenos no tienen suficiente prevalencia en la población de muchos países desarrollados para proporcionar el estímulo de la infección asintomática con la estimulación de la resis- tencia. Las concentraciones de antitoxina disminuyen con el tiempo, y muchas personas de edad avanzada tienen cantida- des insuficientes de antitoxina circulante para protegerlas con- tra la difteria. Los principales objetivos de la prevención son limitar la distribución de los bacilos diftéricos toxígenos en la población y mantener un alto grado de inmunización activa posible. Para limitar el contacto con los bacilos diftéricos a un mínimo, se debe aislar a los pacientes con difteria. Sin trata- miento, un gran porcentaje de las personas infectadas con- tinúan eliminando los bacilos de la difteria durante semanas o meses después del restablecimiento (portadores convalecien- tes). Este peligro puede reducirse bastante mediante el trata- miento activo inicial con antibióticos. Los toxoides diftéricos se combinan por lo general con to- xoide tetánico (Td) y con vacuna de tosferina acelular (DaPT) como inyección sola para inmunización de niños (tres dosis: la primera antes de los 12 meses, la segunda entre los 15 a 18 meses y la tercera entre los cuatro y seis años de edad). Para la inyección de refuerzo en los adultos, sólo se utilizan toxoides Td o toxoides Td combinados con vacuna contra la tos ferina acelular (Tdap) (para una inyección única en las personas que recibieron la vacuna contra la tos ferina de célula entera durante la infancia); éstas combinan una dosis completa del toxoide tetánico con una dosis más pequeña diez veces mayor del toxoide de la difteria a fin de disminuir la posibilidad de reacciones adversas. Todos los niños deben recibir un ciclo inicial de inmuni- zaciones y refuerzos. Los refuerzos periódicos con Td son muy importantes en los adultos que viajan a los países en vías de desarrollo, donde la frecuencia de la difteria clínica puede ser 1000 veces mayor que en los países desarrollados, donde la inmunización es general. OTRAS BACTERIAS CORINEFORMES Se han identificado más de 88 especies del género Corynebacte- rium, 53 de ellas se han obtenido de infecciones en seres huma- nos. Las bacterias corineformes se clasifican en no lipófilas o lipófilas según su crecimiento al agregar lípidos al medio de cultivo. Las corinebacterias lipófilas crecen lentamente en agar apter 12_Carroll_4R.indd 195 apter 12_Carroll_4R.indd 195 14/04/16 14/04/16
- 209. 196 SECCIÓN IIIBacteriología con sangre de oveja, generando colonias menores de 0.5 mm de diámetro después de 24 h de incubación. Las reacciones clave adicionales para la clasificación de las bacterias corine- formes comprenden, pero no están limitadas, a las siguientes pruebas: metabolismo fermentativo u oxidativo, producción de catalasa, motilidad, reducción de nitrato, producción de ureasa e hidrólisis en esculina. Las especies del género Corynebacte- rium suelen ser inmóviles y productoras de catalasa. Las bacte- rias corineformes son residentes normales de las mucosas de la piel, las vías respiratorias, el sistema urinario y las conjuntivas. Corinebacterias no lipófilas El grupo de corinebacterias no lipófilas comprende múltiples especies que pueden diferenciarse con base en el metabolismo fermentativo u oxidativo. Corynebacterium ulcerans y Cory- nebacterium pseudotuberculosis están relacionados en forma estrecha con C. diphtheriae y pueden portar el gen tox de la difteria. Mientras C. ulcerans toxigénica produce una enferme- dad similar a la difteria, C. tuberculosis rara vez es patógena para el ser humano. En fecha reciente, se han obtenido informes esporádicos de mascotas portadoras de C. ulcerans toxígena, lo cual aumenta el interés acerca de un nuevo reservorio de trans- misión de difteria a personas. Otras especies en el grupo no lipófilo fermentativo incluyen Corynebacterium xerosis, Cory- nebacterium striatum, Corynebacterium minutissimum y Co- rynebacterium amycolatum. Éstas son las bacterias corinefor- mes aisladas con más frecuencia de material hospitalario. Hay pocos casos bien documentados de enfermedad causada por C. minutissimum, aunque el microorganismo a menudo se aísla de muestras clínicas. Desde el punto de vista histórico, C. xero- sis y C. striatum han causado una variedad de infecciones en seres humanos. C. striatum se ha relacionado con infecciones de vías respiratorias hospitalarias, entre otras. Las corinebacterias no fermentativas, Corynebacterium pseudodiphthericum y Corynebacterium glucuronolyticum, se han relacionado con infecciones del aparato respiratorio y uri- nario, de manera respectiva. Corinebacterias lipófilas Corynebacterium jeikeium es una de las bacterias corineformes que más suelen aislarse en pacientes graves. Puede causar enfermedad en personas inmunodeprimidas y es importante porque produce infecciones, incluida la bacteriemia, que tiene una elevada tasa de mortalidad y porque es resistente a muchos antimicrobianos de uso común. Corynebacterium urealyticum es una especie de desarrollo lento que es multirresistente a anti- bióticos. Como su nombre lo indica, es ureasapositiva. Se ha relacionado con infecciones de vías urinarias agudas o cróni- cas incrustadas en pacientes con factores predisponentes como cateterismo vesical prolongado, manipulaciones urológicas y tratamiento antimicrobiano de amplio espectro por tiempo prolongado. Desde el punto de vista clínico, la infección se manifiesta por pH urinario alcalino y formación de cristales, a menudo con obstrucción renal o vesical. El tratamiento con- siste en retirar los cálculos obstructores y prescribir antibióti- cos glucopeptídicos. Otros géneros corineformes Existen muchos otros géneros y especies de bacterias corine- formes. Arcanobacterium haemolyticum produce hemólisis β en el agar con sangre. A veces produce faringitis en adoles- centes y adultos, y puede cultivarse en medios selectivos para estreptococos. A. haemolyticum no produce catalasa, al igual que los estreptococos del grupo A y se debe diferenciar por la morfología en la tinción de Gram (bastones frente a cocos) y las características bioquímicas. A. haemolyticum también se relaciona con infecciones de heridas y septicemia. La mayoría de las bacterias corineformes en los otros géneros son causas poco comunes de enfermedad y no suelen identificarse en el laboratorio clínico. Rothia dentocariosa es un bacilo grampositivo que forma filamentos ramificantes. Se ha relacionado con abscesos y endo- carditis, posiblemente después de entrar en la sangre desde la boca. El coco grampositivo, Stomatococcus mucilaginosus, se ha cambiado al género Rothia (Rothia mucilaginosa); es un residente frecuente de la cavidad bucal y se ha relacionado con bacteriemia en hospedadores graves y endocarditis en usuarios de drogas intravenosas. Verificación de conceptos • El grupo de bacilos aerobios grampositivos comprende un gran número de especies que van desde microbiota nor- mal hasta microorganismos patógenos virulentos. • El género Corynebacterium incluye al microorganismo patógeno C. diphtheriae, que es patógeno puesto que ela- bora una exotoxina potente, la toxina diftérica, que inhibe la síntesis de proteínas. • La toxina diftérica se encuentra codificada en un bac- teriófago lisógeno y es la causa de las manifestaciones circunscritas (por lo general faringitis membranosa) o generalizadas, como miocarditis e insuficiencia renal. • En países desarrollados, la difteria es rara en la medida que se previene con programas de vacunación primaria y de refuerzo sostenidos; se ha visto su recurrencia en forma epidémica en intervalos de vacunación primaria. LISTERIA MONOCYTOGENES Existen varias especies del género Listeria. De éstas, L. mono- cytogenes es importante como causa de un amplio espectro de enfermedades en animales y seres humanos. L. monocytogenes es capaz de crecer y sobrevivir en una amplia gama de condi- ciones ambientales. Puede sobrevivir a temperaturas de refrige- rador (4°C), bajo condiciones de pH bajo y condiciones de alto contenido de sal. Por lo tanto, puede superar la preserva- ción de alimentos y las barreras de seguridad de manera que es un microorganismo patógeno importante transmitido en los alimentos. La información más reciente de los Centers for Dis- ease Control and Prevention (CDC) indican que la listeriosis transmitida por alimentos va en descenso. No obstante, uno de los brotes más grandes y mortales de listeriosis en Estados Unidos (147 casos en 28 estados y más de 33 muertes) ocurri- dos en el año 2011 en melones contaminados provenientes de una empacadora en Colorado. Este brote subraya la naturaleza apter 12_Carroll_4R.indd 196 apter 12_Carroll_4R.indd 196 14/04/16 14/04/16
- 210. CAPÍTULO 12 Bacilosgrampositivos aerobios no esporulantes 197 FIGURA 122 Tinción de Gram del bacilo grampositivo Listeria monocytogenes en un hemocultivo. Amplificación original × 1000. Los eritrocitos están presentes en el fondo. La Listeria que se cultiva en muestra clínica a menudo exhibe variaciones de longitud y forma. Es característico que tengan un diámetro de 0.4 a 0.5 μm y una longitud de 0.5 a 2 μm. (Cortesía de H. Tran.) universal de este microorganismo y su potencial para contami- nar con facilidad gran variedad de alimentos durante cualquier etapa de su producción. Características morfológicas e identificación L. monocytogenes es un bacilo corto, grampositivo, no forma- dor de esporas (figura 12-2). Produce catalasa y tiene una moti- lidad de extremo a extremo tambaleante a una temperatura de 22 a 28 °C pero no de 37 °C; la prueba de motilidad rápida- mente diferencia a la Listeria de los difteroides que son miem- bros de la microbiota normal de la piel. Características de cultivo y crecimiento Listeria crece bien en medios como agar con sangre de cor- dero al 5% en el cual muestra la pequeña zona característica de hemólisis alrededor de las colonias y por debajo de las mismas. El microorganismo es un anaerobio facultativo y produce cata- lasa, hidrólisis de esculina y es móvil. Listeria produce ácido pero no gas por la utilización de diversos carbohidratos. La motilidad a una temperatura ambiental y la producción de hemolisina son características primordiales que ayudan a diferenciar Listeria de las bacterias corineformes. Clasificación antigénica La clasificación serológica se lleva a cabo sólo en los laborato- rios de referencia y se utiliza principalmente para los estudios epidemiológicos. Existen 13 serovariantes conocidas basa- das en antígenos O (somáticos) y H (flagelares). Los serotipos 1/2a, 1/2b y 4b constituyen más de 95% de las cepas de seres humanos. El serotipo 4b produce la mayor parte de los brotes epidémicos transmitidos en los alimentos. Se han desarrollado métodos basados en la genómica, mucho más rápidos por su menor laboriosidad, aunque la serotipificación persiste como el criterio de referencia. Patogenia e inmunidad L. monocytogenes entra en el cuerpo a través del aparato diges- tivo tras la ingestión de alimentos contaminados como quesos, frutas o verduras. El microorganismo tiene varias proteínas de adhesina (Ami, Fbp A y flagelina) que facilitan la fijación de las bacterias a las células hospedadoras y que contribuyen a la virulencia. Posee proteínas de superficie de la pared celular llamadas internalinas A y B que actúan de manera recíproca con la cadherina E, receptor de las células epiteliales, lo que fomenta su fagocitosis en las células epiteliales. Después de la fagocitosis, la bacteria es envuelta en un fagolisosoma, donde es activada por el pH bajo para producir listeriolisina O. Esta enzima produce lisis de la membrana del fagolisosoma y per- mite que las listerias escapen hacia el citoplasma de la célula epitelial. Los microorganismos proliferan y ActA, otra pro- teína de superficie de la listeria, activa la polimerización de la actina de la célula hospedadora, lo cual las impulsa hacia la membrana celular. Al empujar la membrana de la célula hospedadora, produce la formación de protrusiones elongadas denominadas filópodos, que son ingeridos por células epitelia- les adyacentes, macrófagos y hepatocitos, las listerias son libe- radas y el ciclo comienza de nuevo. L. monocytogenes se puede mover de una célula a otra sin estar expuesta a anticuerpos, complemento o células polimorfonucleares. Shigella flexneri y rickettsias también usurpan la actina y el sistema contráctil de las células hospedadoras para diseminar sus infecciones. El hierro es un factor de virulencia importante. La listeria produce sideróforos y puede obtener hierro de la transferrina. La inmunidad para L. monocytogenes es mediada prin- cipalmente por células, según se demuestra por la ubicación intracelular de la infección y por la notable relación de la infec- ción con los estados que cursan con alteración de la inmuni- dad mediada por células como el embarazo, edad avanzada, sida, linfoma y trasplante de órganos. La inmunidad puede ser transferida por los linfocitos sensibilizados, pero no por los anticuerpos. Manifestaciones clínicas Existen dos formas de listeriosis humana perinatal. El sín- drome de instauración inicial (granulomatosis infantisép- tica) es el resultado de la infección in utero y es una forma diseminada de la enfermedad que se caracteriza por septice- mia neonatal, lesiones pustulosas y granulomas que contienen L. monocytogenes en múltiples órganos. La muerte puede ocu- rrir antes o después del parto. El síndrome de inicio tardío pro- duce la aparición de meningitis entre el nacimiento y la tercera semana de vida; a menudo es causada por el serotipo 4b y tiene una tasa de mortalidad importante. Las personas sanas expuestas a L. monocytogenes en ali- mentos pueden no enfermar o desarrollar una gastroenteritis febril leve que se autolimita en uno a tres días. Ésta se desarrolla después de un periodo de incubación de 6 a 48 h. Los síntomas apter 12_Carroll_4R.indd 197 apter 12_Carroll_4R.indd 197 14/04/16 14/04/16
- 211. 198 SECCIÓN IIIBacteriología incluyen fiebre, escalofrío, cefalea, mialgias, dolor abdominal y diarrea. Los individuos inmunodeprimidos pueden desa- rrollar meningoencefalitis por Listeria, bacteriemia y (raras veces) infecciones focales. La listeriosis es una de las causas más comunes de meningitis en este grupo de pacientes. La pre- sentación clínica de la meningitis por Listeria varía de gradual a fulminante y es no específica. Por lo común, los laboratorios clínicos no efectúan un cultivo sistemático de Listeria a partir de muestras fecales y sistemáticas. El diagnóstico de listeriosis sistemática se basa en el aislamiento del microorganismo en hemocultivos y líquido cefalorraquídeo. La infección espontánea ocurre en muchos animales domésticos y salvajes. En los rumiantes (p. ej., las ovejas) la Lis- teria puede causar meningoencefalitis con o sin bacteriemia. En animales más pequeños (p. ej., conejos y gallinas) ocurre septicemia con abscesos focales en el hígado y en músculo car- diaco, así como una monocitosis intensa. Muchos antimicrobianos inhiben a la Listeria in vitro. Se han obtenido curaciones clínicas con ampicilina, eritromicina o con trimetoprim-sulfametoxazol administrado por vía intra- venosa. Las cefalosporinas y las fluoroquinolonas no son acti- vas contra L. monocytogenes. La ampicilina más la gentamicina suele recomendarse para el tratamiento, pero la gentamicina no entra en las células hospedadoras y puede no ser útil para tratar la infección por Listeria. El fármaco de elección para las infec- ciones del sistema nervioso central en pacientes que son alérgi- cos a la penicilina es el trimetoprim-sulfametoxazol. ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE Erysipelothrix rhusiopathiae es un bacilo grampositivo que produce pequeñas colonias transparentes de aspecto brillante. Puede ser hemolítico α en agar con sangre. En las tinciones de Gram, a veces muestran aspecto gramnegativo porque se decolora con facilidad. Las bacterias pueden aparecer en forma individual, en cadenas cortas, distribuidas al azar o en fila- mentos largos no ramificantes. La morfología de la colonia y el aspecto en la tinción de Gram varían dependiendo del medio de crecimiento, la temperatura de incubación y el pH. Ery- sipelothrix no produce catalasa, oxidasa ni indol. Cuando se cultiva Erysipelothrix en agar con hierro y triple glúcido (TSI, triple sugar iron), se produce sulfuro de hidrógeno (H2 S), y hace que el TSI adopte un color negro. E. rhusiopathiae debe diferenciarse de L. monocytogenes, Trueperella y A. haemolyticum, pero estas tres especies son hemolíticas β y no producen H2 S cuando se cultivan en medio de TSI. Es más difícil diferenciar E. rhusiopathiae de lactobaci- los aerotolerantes; los dos pueden ser hemolíticos α. No pro- ducen catalasa y son resistentes a la vancomicina (80% de los lactobacilos). Además, algunas cepas de lactobacilos producen H2 S de una forma muy parecida a E. rhusiopathiae. E. rhusiopathiae se distribuye en animales de tierra y mar en todo el mundo, lo que comprende diversos vertebrados e invertebrados. Es causa de enfermedad en cerdos domésticos, pavos, patos y ovejas, pero no en peces. Las repercusiones más importantes aparecen en los cerdos, en los que produce eri- sipela. En el ser humano, la erisipela se origina por estreptoco- cos hemolíticos β del grupo A y es muy diferente de la erisipela porcina. Las personas adquieren la infección por E. rhusiopa- thiae por la inoculación directa de animales o productos ani- males. Las personas con máximo riesgo son pescadores, perso- nas que manipulan pescado, trabajadores de rastros, carniceros y otras personas que tienen contacto con productos animales. La infección por E. rhusiopathiae más frecuente en el ser humano se denomina erisipeloide. Por lo general ocurre en los dedos por la inoculación directa en el lugar de una herida o una abrasión (y se ha denominado “dedo de foca” y “dedo de ballena”). Después de la incubación de dos a siete días, ocurre dolor (que llega a ser intenso) y edema. La lesión está elevada, bien circunscrita y es de color violáceo. No suele haber pus en el lugar de la infección, lo que ayuda a distinguirla de las infecciones cutáneas estafilocócicas y estreptocócicas. La eri- sipeloide puede resolverse después de tres a cuatro semanas o con más rapidez mediante antibioticoterapia. Las formas clíni- cas adicionales de la infección (ambas poco comunes) son una forma cutánea difusa y la bacteriemia con o sin endocarditis. También se ha informado artritis séptica. Erysipelothrix es muy susceptible a la penicilina G, el fármaco de elección para las infecciones graves. El microorganismo es intrínsecamente resistente a la vancomicina. Verificación de conceptos • Tanto L. monocytogenes como E. rhusiopathiae están dis- tribuidas ampliamente en la naturaleza y generan enfer- medades importantes en el ser humano. • L. monocytogenes suele transmitirse por el consumo de alimentos preparados contaminados, como carnes frías o frutas y vegetales. • Una vez ingerido, el microorganismo manipula su propia fagocitosis a través de diversos tipos de células y puede vivir dentro de otras células, además de diseminarse, pro- vocando bacteriemia y meningitis en los pacientes con una inmunidad celular deficiente. • Erysipelothrix por lo general se adquiere por inoculación directa a partir de una fuente contaminada como escamas de pescado, lo que resulta en erisipeloide, que es una varie- dad nodular de celulitis. • E. rhusiopathiae es singular entre los bacilos grampositi- vos en el sentido de que produce H2 S en la prueba con TSI. • Ambos patógenos son susceptibles a la penicilina, el trata- miento de elección. ACTINOMYCETES AEROBIOS COMPLEJOS Los actinomycetes aerobios (no deben confundirse con el género Actinomyces) forman un grupo grande y diverso de ba- cilos grampositivos con una tendencia a formar cadenas o fila- mentos. Incluyen las corinebaterias comentadas al comienzo del capítulo y múltiples géneros más complejos como Strepto- myces saprofítico y el Mycobacterium de importancia clínica (capítulo 23). A medida que crecen los bacilos, las células se mantienen unidas tras la división para formar cadenas alarga- das de bacterias (1 μm de amplitud) con ramas ocasionales. La magnitud de este proceso varía en diferentes taxones. Es rudi- mentaria en algunos actinomicetos, las cadenas son cortas, se apter 12_Carroll_4R.indd 198 apter 12_Carroll_4R.indd 198 14/04/16 14/04/16
- 212. CAPÍTULO 12 Bacilosgrampositivos aerobios no esporulantes 199 rompen y se separan después de la formación; otras presentan sustrato extenso o filamentos aeriales (o ambos); o se fragmen- tan en formas cocobacilares. Los miembros de actinomicetos aerobios pueden clasificarse basándose en la tinción acidorresis- tente. Las micobacterias son microorganismos acidorresistentes verdaderamente positivos; los géneros débilmente positivos comprenden Nocardia, Rhodococcus y algunos otros de impor- tancia clínica. Streptomyces y Actinomadura, dos compuestos que producen micetomas actinomicóticos, son negativos para la tinción acidorresistente. Rhodococcus equi parece ser un bacilo después de algunas horas de incubación en caldo, pero con la incubación adicional se convierte en una forma cocoide. Esta especie de Rhodococcus a menudo también produce colonias pigmentadas después de 24 h de incubación que van desde el color rosa salmón hasta el rojo.Losmicroorganismosporlogeneralsondébilmenteacidor- resistentes positivos cuando se tiñen por el método de Kin- youn modificado. R. equi a veces produce infecciones como neumonía necrosante en pacientes inmunodeprimidos con in- munidad anómala mediada por células (p. ej., pacientes con VIH o sometidos a trasplante de órganos). R. equi está presente en la tierra y en excremento de herbívoros. El microorganismo es una causa esporádica de enfermedad en ganado vacuno, cor- deros y cerdos, y puede ser causa de infecciones pulmonares graves en potros. Otras especies del género diverso Rhodococ- cus están presentes en el medio ambiente pero raras veces pro- ducen enfermedad en el ser humano. NOCARDIOSIS El género Nocardia sigue experimentando considerable recla- sificacióntaxonómica.Continúanreconociéndosenuevasespe- cies y se han implicado por lo menos 30 especies como causas de infecciones humanas. En el cuadro 12-1 se enumeran las especies que con mayor frecuencia se vinculan con la mayor parte de los casos de infec- ciones en el ser humano. Cada una de estas especies es causa de una amplia gama de enfermedades y cada especie o complejo tiene patrones de susceptibilidad a fármacos singulares. Las nocardias patógenas, como muchas especies no patógenas de Nocardia, se encuentran en todo el mundo en la tierra y el agua. La nocardiosis se inicia por la inhalación de estas bacterias. El cuadro clínico habitual es una infección pulmonar subaguda a crónica que puede diseminarse a otros órganos, por lo general el cerebro o la piel. Las nocardias no se transmiten de persona a persona. Morfología e identificación Las especies del género Nocardia son aerobias y se cultivan en diversos medios. En muestras clínicas, las nocardias apa- recen, microscópicamente, como microorganismos filamento- sos con ramificaciones hifoides. En los medios de laboratorio habituales, después de incubación a 35 a 37 °C por varios días, se desarrollan colonias serosas amontonadas e irregulares. La pigmentación de las cepas varía de blanco a naranja y rojo. Tales bacterias son grampositivas y catalasa positivas; pro- ducen ureasa. Las nocardias forman sustratos ramificantes extensos y filamentos aeriales que se fragmentan después de la formación; emergen como células cocobacilares. Las paredes celulares contienen ácidos micólicos que son de cadena más corta que las de las micobacterias. Se les considera débilmente acidorresistentes, esto es, se tiñen con el reactivo acidorresis- tente habitual (carbol-fucsina) y conservan este colorante des- pués del tratamiento con ácido sulfúrico del 1 a 4% en lugar de utilizar el decolorante más potente ácido-alcohol. Las espe- cies de Nocardia se identifican principalmente por medio de métodos moleculares como secuencias de genes rRNA 16S y el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, restriction fragment length polymorphisms), y fragmentos de genes amplificados como hsp o secA. Patogenia y manifestaciones clínicas Casi en todos los casos, la nocardiosis es una infección opor- tunista relacionada con varios factores de riesgo, la mayor parte de los cuales alteran las respuestas inmunitarias mediadas por células, incluyendo el tratamiento con corticosteroides, la inmunodepresión, el trasplante de órganos, el sida y el alcoholis- mo. La nocardosis pulmonar es la presentación clínica princi- pal, dado que la inhalación es la vía primaria de exposición a la bacteria. Puede tener lugar una variedad de síntomas, inclui- dos fiebre, sudor nocturno, pérdida de peso, dolor torácico, tos con o sin producción de esputo y disnea. Las manifestaciones clínicas no son distintivas y remedan tuberculosis y otras infec- ciones. Asimismo, las radiografías torácicas pueden mostrar infiltrados focales, nódulos multifocales incluso formación de cavidad. Las consolidaciones pulmonares pueden desarrollar- se, pero son raras la formación de granuloma y la caseifica- ción. El proceso patológico usual es la formación de absceso (inflamación por neutrófilos). La diseminación hematógena desde el pulmón a menudo involucra al sistema nervioso cen- tral, donde los abscesos se desarrollan en el cerebro, lo que se traduce en una variedad de presentaciones clínicas. Algunos pacientes tienen afectación pulmonar subclínica y se presentan con lesiones cerebrales. También puede ocurrir diseminación a piel, riñones, ojos u otros sitios. Nocardia brasiliensis se relaciona con la mayor parte de infecciones cutáneas primarias que por lo general resultan de traumatismo. Tales infecciones raramente se diseminan. Pruebas de laboratorio diagnósticas Las muestras consisten en esputo, pus, líquido cefalorraquídeo y material de biopsia. Los frotis con tinción de Gram revelan bacilos grampositivos, células cocobacilares y filamentos rami- ficados. Con la tinción acidorresistente modificada, la mayor parte de las cepas serán acidorresistentes. Las bacterias del género Nocardia se desarrollan en casi todos los medios de laboratorio. Las pruebas serológicas no son útiles. Se necesi- tan métodos moleculares para identificarlos a nivel de espe- cie, lo que es necesario para fines tanto epidemiológicos como terapéuticos. Tratamiento El tratamiento de elección es trimetoprim-sulfametoxazol. Cuando los pacientes no responden, utilizan otros antibióticos diversos con éxito, como amicacina, imipenem, meropenem, apter 12_Carroll_4R.indd 199 apter 12_Carroll_4R.indd 199 14/04/16 14/04/16
- 213. 200 SECCIÓN IIIBacteriología fluoroquinolonas, minociclina, linezolida y cefotaxima. Sin embargo, puesto que los patrones de sensibilidad varían según la especie, es necesario realizar pruebas de sensibilidad para guiar el método terapéutico. Además de tratamiento antimi- crobiano por lo general prolongado, puede ser necesario el dre- naje quirúrgico o bien la resección. Verificación de conceptos • Varios miembros del amplio grupo de actinomicetos aero- bios son acidorresistentes modificados, principalmente Nocardia y R. equi. • Las especies de Nocardia son bacilos grampositivos rami- ficados, con forma de microesferas, encontradas en la tierra y otros ecosistemas que producen una enfermedad gene- ralizada principalmente en personas inmunodeprimidas. • Las especies de Nocardia son las mejor identificadas después de su recuperación por medios de cultivo habitua- les con uso de métodos moleculares como secuenciación del gen rRNA 16S u otros blancos génicos. • El fármaco de elección para el tratamiento de las infeccio- nes por Nocardia es el trimetoprim-sulfametoxazol. El uso de otros medicamentos dependerá de los resultados de las pruebas de sensibilidad. ACTINOMICETOMA El micetoma (pie de Madura) es una infección crónica, circuns- crita, lentamente progresiva que comienza en el tejido subcu- táneo y se disemina a los tejidos adyacentes; es destructiva y a menudo indolora. En muchos casos, la causa es un hongo de la tierra que se ha implantado en el tejido subcutáneo por traumatismos leves. Esta forma de micetomas se describe en el capítulo 45. Un actinomicetoma se produce por bacterias rami- ficantes filamentosas. El gránulo de actinomicetoma consta de elementos de tejido y bacilos grampositivos y cadenas baci- laresofilamentos(1μmdediámetro).Lascausasmásfrecuentes de actinomicetomas son Actinomadura madurae, Streptomyces somaliensis, Actinomadura pelletieri, Nocardia asteroides y Nocardia brasiliensisy. Estos y otros actinomicetos patógenos se diferencian por las pruebas bioquímicas y por el análisis cro- matográfico de los componentes de la pared celular, y técnicas moleculares. Los actinomicetomas responden bien a diver- sas combinaciones de estreptomicina, trimetoprim-sulfame- toxazol y dapsona si el tratamiento se comienza en las primeras etapas antes de que haya ocurrido una lesión considerable. En la enfermedad avanzada puede requerirse la amputación. Muchos de los estudiantes se confunden con los térmi- nos “actinomicetos” y “actinomicosis”. Los primeros ya se describieron antes; la actinomicosis es una infección causada por miembros del género grampositivo anaerobio Actinomy- ces. Los hongos del género Actinomyces y la enfermedad acti- nomicosis se describen con más detalle en el capítulo 21. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. Hace tres meses una mujer de 53 años de edad fue sometida a una intervención quirúrgica y recibió quimioterapia por cáncer de mama. Hace cuatro semanas presentó una tos esporádicamente productiva de esputo purulento. Hace dos semanas, observó debi- lidad leve pero progresiva en el brazo izquierdo y en la pierna. En la exploración del tórax, se auscultaron estertores sobre la parte superior e izquierda de la espalda cuando la paciente respiraba profundamente. La exploración neurológica confirmó la debi- lidad del brazo y la pierna del lado izquierdo. La radiografía de tórax mostró un infiltrado en el lóbulo superior izquierdo. La tomografía computarizada (CT, computed tomography) intensi- ficada con medio de contraste demostró dos lesiones en el hemis- ferio derecho. La tinción de Gram de un espécimen de esputo purulento demostró bacilos grampositivos ramificantes que eran parcialmente acidorresistentes. ¿Cuál de los siguientes microor- ganismos es la causa del padecimiento actual de esta paciente? (A) Actinomyces israelii (B) Corynebacterium pseudodiphtheriticum (C) Aspergillus fumigatus (D) Nocardia farcinica (E) Erysipelothrix rhusiopathiae 2. El fármaco de elección para tratar la infección de la paciente (pre- gunta 1) es: (A) Penicilina G (B) Trimetoprim-sulfametoxazol (C) Gentamicina (D) Anfotericina B (E) Una cefalosporina de tercera generación 3. Es muy difícil diferenciar Erysipelothrix rhusiopathiae de: (A) Corynebacterium diphtheriae (B) Bacillus cereus (C) Actinomyces israelii (D) Nocardia asteroides (E) Bacterias del género Lactobacillus 4. El movimiento de Listeria monocytogenes en el interior de las células hospedadoras es causado por: (A) La activación de la polimerización de la actina en la célula hospedadora (B) La formación de pilosidades (fimbria) en la superficie de las listerias (C) Formación de seudópodos (D) El movimiento de flagelos de las listerias (E) Motilidad tambaleante 5. Un niño de ocho años de edad, que recientemente llegó a Estados Unidos, desarrolla dolor de garganta grave. En la exploración, se observa exudado grisáceo (seudomembrana) sobre las amígda- las y la faringe. El diagnóstico diferencial de la faringitis grave como ésta comprende infección por estreptococos del grupo A, infección por el virus de Epstein-Barr (EBV), faringitis por Neis- seria gonorrhoeae y difteria. La causa de la faringitis del niño muy posiblemente es: (A) Un bacilo gramnegativo (B) Un virus de RNA monocatenario de polaridad positiva (C) Un coco grampositivo productor de catalasa que se desa- rrolla en racimos (D) Un bacilo grampositivo de forma de bastón (E) Un virus de RNA bicatenario 6. El mecanismo principal en la patogenia de la enfermedad del niño (pregunta 5) es: (A) Un incremento neto del monofosfato de adenosina cíclico intracelular (B) La acción de una exotoxina pirógena (un súper antígeno) (C) Inactivación de la acetilcolina esterasa (D) Acción de la enterotoxina A (E) Inactivación del factor de elongación 2 apter 12_Carroll_4R.indd 200 apter 12_Carroll_4R.indd 200 14/04/16 14/04/16
- 214. CAPÍTULO 12 Bacilosgrampositivos aerobios no esporulantes 201 7. Corynebacterium jeikeium es (A) Catalasa negativa (B) Gramnegativo (C) A menudo resistente a los antibióticos usuales (D) Móvil (E) Frecuente pero clínicamente no importante 8. ¿Cuál de los siguientes bacilos grampositivos aerobios es acido- rresistente positivo modificado? (A) Nocardia brasiliensis (B) Lactobacillus acidophilus (C) Erysipelothrix rhusiopathiae (D) Listeria monocytogenes 9. La difteria cutánea se presenta en los niños en zonas tropicales que por lo general: (A) No ocurre en niños que se han inmunizado con toxoide diftérico (B) Es clínicamente diferente de las infecciones cutáneas (pio- dermia, impétigo) causadas por Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus (C) También es frecuente en las latitudes del Norte (D) Produce concentraciones de antitoxina protectora en casi todos los niños entre los seis y ocho años de edad (E) Produce miocardiopatía mediada por toxinas 10. Un pescador de 45 años de edad se ensartó un anzuelo en el dedo medio derecho. Los retiró y no buscó tratamiento médico inmediato. Cinco días después, presentó fiebre, dolor intenso y una tumefacción nodular en el dedo. Buscó atención médica. Se aspiró el nódulo violáceo y después de 48 h de incubación, se observaron colonias de un bacilo grampositivo que producía pigmentación verdosa del agar y formaba ligamentos largos en el caldo de cultivo. La causa más probable de esta infección es: (A) Lactobacillus acidophilus (B) Erysipelothrix rhusiopathiae (C) Listeria monocytogenes (D) Rhodococcus equi (E) Nocardia brasiliensis 11. Una reacción bioquímica que es útil para identificar el microor- ganismo causal de la infección de la pregunta 10 es: (A) Catalasa positiva (B) Acido-resistencia utilizando la tinción de Kinyoun modi- ficada (C) Hidrólisis de esculina (D) Motilidad tambaleante (E) Producción de H2 S 12. Listeria monocytogenes es a menudo un microorganismo pató- geno transmitido por alimentos puesto que: (A) Puede sobrevivir a 4 °C (B) Sobrevive en un ambiente con un pH bajo (C) Sobrevive en presencia de una concentración elevada de sal (D) Todas las anteriores son correctas 13. Una vez que se obtiene en el medio de cultivo de laboratorio, los Actinomicetos aerobios se identifican mejor por medio de: (A) Un sistema automatizado en el laboratorio (B) Los estudios bioquímicos clásicos (C) Pruebas de detección de antígenos como ELISA (D) Métodos moleculares como secuencia de genes rRNA 16S 14. ¿Cuál de las afirmaciones siguientes sobre Rhodococcus equi es correcta? (A) Se transmite de persona a persona (B) Produce tuberculosis en el ganado (C) Es una causa rara de infección pulmonar en el hombre (D) Produce un pigmento negro en el agar con sangre de oveja 15. Un paciente hospitalizado con sonda de Foley manifiesta fiebre, escalofrío, dolor suprapúbico y dificultad para orinar 48 h después de extraer la sonda. Su vejiga parece obstruida y en el examen general de orina exhibe leucocitos y bacterias. La cistoscopia revela un gran cálculo vesical y en el urocultivo crecen más de 10000 CFU/ml de un bacilo grampositivo corto e irregular. El microorganismo más probable es: (A) Corynebacterium urealyticum (B) Nocardia brasiliensis (C) Actinomadura (D) Erysipelothrix rhusiopathiae (E) Lactobacillus acidophilus Respuestas BIBLIOGRAFÍA Bernard K: The genus Corynebacterium and other medically relevant coryneforms-like bacteria. J Clin Microbiol 2012;50: 3152-3158. Brown-Elliott BA, Brown JM, Conville PS, Wallace RJ Jr: Clinical and laboratory features of the Nocardia spp. based on current molecular taxonomy. Clin Microbiol Rev 2006;9:259-282. 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- 216. 203 13 Estafilococos C A PÍ T U L O Los estafilococos son células esféricas grampositivas por lo general dispuestas en racimos irregulares parecidos a las uvas. Se desarrollan con rapidez en muchos tipos de medios y tienen actividad metabólica, fermentan carbohidratos y producen pigmentos que van desde un color blanco hasta un amarillo intenso. Algunos son miembros de la microbiota normal de la piel y mucosas del ser humano; otros causan supuración, for- mación de abscesos, diversas infecciones piógenas e incluso septicemia letal. Los estafilococos patógenos suelen producir hemólisis, coagular el plasma y producir diversas enzimas y toxinas extracelulares. El tipo de intoxicación alimentaria más frecuente se debe a una enterotoxina estafilocócica termoes- table. Los estafilococos desarrollan con rapidez resistencia a muchos antimicrobianos y pueden plantear problemas tera- péuticos difíciles. El género Staphylococcus tiene por lo menos 45 espe- cies. Las cuatro especies encontradas con mayor frecuencia y las más importantes en términos clínicos son Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdu- nensis y Staphylococcus saprophyticus. S. aureus es coagulasa positivo, lo cual lo distingue de otras especies. S. aureus es un patógeno importante en el ser humano. Casi todas las personas presentarán algún tipo de infección por S. aureus durante su vida, la cual fluctúa en gravedad desde una intoxicación ali- mentaria o infecciones cutáneas leves hasta infecciones graves que ponen en riesgo la vida. Los estafilococos coagulasa nega- tivos son microbiota humana normal y a veces causan infec- ciones, a menudo relacionadas con dispositivos implantados, como prótesis articulares, derivaciones y catéteres intravascu- lares, sobre todo en los niños muy pequeños, en los ancianos y en los pacientes inmunodeprimidos. Alrededor de 75% de estas infecciones causadas por estafilococos coagulasa negativos se deben a S. epidermidis; las infecciones debidas a Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis y otras especies son menos frecuentes. S. saprophyticus es una causa relativamente frecuente de infecciones urinarias en mu- jeres jóvenes, aunque pocas veces produce infecciones en pa- cientes hospitalizados. Otras especies son importantes en medi- cina veterinaria. Morfología e identificación A. Microorganismos típicos Los estafilococos son bacterias esféricas de casi 1 μm de diá- metro dispuestas en racimos irregulares (figura 13-1). También se observan cocos individuales, pares, tétradas y cadenas en medios de cultivo líquidos. Los cocos jóvenes son intensamente grampositivos; al envejecer, muchas células se vuelven gram- negativas. Los estafilococos no son móviles y no forman espo- ras. Bajo la acción de ciertos fármacos como penicilina, los estafilococos se lisan. Las especies del género Micrococcus suelen parecerse a los estafilococos. Viven libremente en el ambiente y forman paquetes regulares de cuatro (tétradas) u ocho cocos. Sus colo- nias pueden ser de color amarillo, rojo o naranja. Los microco- cos pocas veces producen enfermedad. B. Cultivo Los estafilococos crecen con rapidez en casi todos los medios bacteriológicos bajo condiciones aerobias o microaerofílicas. Se desarrollan con más rapidez a una temperatura de 37 °C, pero forman pigmento mejor a una temperatura ambiente (20 a 25 °C). Las colonias en medios sólidos son redondas, lisas, elevadas y brillantes (figura 13-2). S. aureus suele formar colo- nias de color gris a amarillo dorado profundo. Las colonias de S. epidermidis por lo general son grises a blancas en el aisla- miento primario; muchas colonias forman pigmento sólo tras una incubación prolongada. No se produce pigmento en condi- ciones anaerobias o en caldo. S. aureus produce diversos grados de hemólisis y a veces otras especies también. Las especies de los géneros Peptostreptococcus y especies de Peptoniphilus, que son cocos anaerobios, a menudo se parecen a los estafilococos en sus características morfológicas. El género Staphylococcus contiene dos especies, S. saccharolyticus y S. aureus subespe- cie anaerobius, que al principio se desarrollan sólo bajo condi- ciones anaerobias, pero que se vuelven más aerotolerantes en los subcultivos. Esto también se observa rara vez con algunas cepas de S. epidermidis. C. Características de crecimiento Los estafilococos producen catalasa, lo cual los distingue de los estreptococos. Los estafilococos fermentan con lentitud muchos carbohidratos y producen ácido láctico pero no gas. La actividad proteolítica varía mucho de una cepa a otra. Los estafilococos patógenos producen muchas sustancias extrace- lulares, toxinas y enzimas, las cuales se describen más adelante. Los estafilococos son relativamente resistentes a la dese- cación, al calor (resisten una temperatura de 50 °C durante 30 min) y al cloruro de sodio al 10%, pero son inhibidos con facili- dad por determinadas sustancias químicas, por ejemplo, hexa- clorofeno al 3 por ciento. Losestafilococostienenunasensibilidadvariableamuchos antimicrobianos. La resistencia es secundaria a varios meca- nismos: apter 13_Carroll_4R.indd 203 apter 13_Carroll_4R.indd 203 14/04/16 14/04/16
- 217. 204 SECCIÓN IIIBacteriología 1. La producción de lactamasa β es frecuente, está sujeta a control por plásmidos y hace que los microorganismos sean resistentes a muchas penicilinas (penicilina G, ampi- cilina, ticarcilina, piperacilina y fármacos afines). Los plásmidos son transmitidos mediante transducción y tal vez también mediante conjugación. 2. La resistencia a la nafcilina (y a la meticilina y la oxaci- lina) es independiente de la producción de lactamasa β. La resistencia a la nafcilina es codificada y regulada por una serie de genes que se encuentran en una región del cromosoma denominada cromosomas en casete estafilo- cócicos mec (SCCmec, staphylococcal cassette chromosome mec). De manera específica, el gen mecA y el recién des- crito gen mecC en este locus codifican una proteína fija- dora de penicilina (PBP2a, penicillin binding protein) de baja afinidad que es la encargada de la resistencia. Hay 12 tipos diferentes de SCCmec. Los tipo I, II, III, VI y VIII se relacionan con infecciones intrahospitalarias y pue- den contener genes que codifican la resistencia también a otros antimicrobianos. SCCmec tipo IV se ha encontrado principalmente en S. aureus extrahospitalario resistente a meticilina (CA-MRSA, community-acquired methici- llin-resistant S. aureus) y tiende a ser menos resistente, más contagioso y ha producido brotes en la última década en Estados Unidos y algunos países de Europa. Los tipos IX y X se relacionan con animales (MRSA asociado a ganado [livestock-associated MRSA, LA-MRSA]; de ellos el IX con- tiene mecC. Los demás tipos se limitan a diversas regiones geográficas del mundo. 3. En Estados Unidos, S. aureus y S. lugdunensis se conside- ran sensibles a la vancomicina cuando la concentración inhibidora mínima (MIC) es de 2 μg/mL o menos; de sen- sibilidad intermedia cuando la MIC es de 4 a 8 μg/mL; y resistentes cuando la MIC es de 16 μg/mL o más. Las cepas de S. aureus con sensiblidad intermedia a la vancomicina se han aislado en Japón, Estados Unidos y varios otros países. A menudo se conocen como S. aureus con resis- tencia intermedia a vancomicina (VISA, vancomycin-in- termediate S. aureus). Por lo general se han aislado de pacientes con infecciones complejas que han recibido tra- tamiento prolongado con vancomicina. A menudo el trata- miento con vancomicina ha sido ineficaz. El mecanismo de la resistencia se relaciona con un incremento en la sín- tesis de pared celular y alteraciones de la misma y no se debe a los genes van que se encuentran en los enteroco- cos. Las cepas de S. aureus de sensibilidad intermedia a la vancomicina por lo general son resistentes a nafcilina, pero generalmente son sensibles a las oxazolidinonas y a quinupristina/dalfopristina. 4. Desde 2002, se aislaron varias cepas de S. aureus resistente a vancomicina (VRSA, vancomycin-resistant S. aureus) en pacientes estadounidenses. Las cepas contenían el gen de la resistencia a vancomicina vanA de los enterococos (capítulo 14) y el gen de resistencia a nafcilina mecA (véase antes). Las dos cepas iniciales de VRSA eran sensibles a los otros antibióticos. La resistencia de S. aureus a vancomi- cina es un problema importante en todo el mundo. 5. La resistencia mediada por plásmido a tetraciclinas, eri- tromicina, aminoglucósidos y otros fármacos es frecuente en los estafilococos. 6. La “tolerancia” implica que los estafilococos son inhibi- dos por un fármaco pero no destruidos por el mismo; es decir, hay una gran diferencia entre las concentraciones mínimas inhibidoras y las concentraciones mínimas leta- les de un antimicrobiano. Los pacientes con endocarditis causada por un S. aureus tolerante pueden tener una evo- lución clínica prolongada en comparación con los indi- viduos que tienen endocarditis causada por un S. aureus FIGURA 131 Tinción de Gram de Staphylococcus aureus que muestra cocos grampositivos dispuestos en pares, tétradas y racimos. Amplificación original ×1000. (Cortesía de L. Ching.) FIGURA 132 Colonias de Staphylococcus aureus en una placa de agar sangre después de la incubación durante 24 h. Las colonias de color gris amarillo tienen 3 a 4 mm de diámetro en la placa de 10 cm. Las colonias están rodeadas por zonas claras de hemólisis de casi 1 cm de diámetro. (Cortesía de H. Reyes.) apter 13_Carroll_4R.indd 204 apter 13_Carroll_4R.indd 204 14/04/16 14/04/16
- 218. CAPÍTULO 13 Estafilococos205 completamente sensible. La tolerancia a veces puede atri- buirse a la falta de activación de enzimas autolíticas en la pared celular. D. Variación Un cultivo de estafilococos contiene algunas bacterias que difieren de la mayor parte de la población en su expresión de características de la colonia (tamaño de la colonia, pigmento, hemólisis), en la elaboración de enzimas, en la resistencia a fármacos y en su patogenicidad. In vitro, la expresión de estas características está sujeta a la influencia de las condiciones de desarrollo: cuando se incuba S. aureus resistente a nafcilina a una temperatura de 37 °C en agar sangre, uno de cada 107 microorganismos expresa resistencia a nafcilina; cuando se incuba a una temperatura de 30 °C en agar que contiene cloruro de sodio al 2 a 5%, uno de cada 103 microorganismos expresa resistencia a nafcilina. Algunas cepas pueden desarrollar alte- raciones fenotípicas, como un tamaño más pequeño (colonias puntiformes) y pérdida de hemólisis. A éstas se les denomina variantes de colonias pequeñas (SCV, small colony variants) y las variaciones de las características fenotípicas permiten una mejor supervivencia bajo condiciones intracelulares, lo cual facilita la persistencia y conduce a infecciones crónicas. Estructura antigénica S. aureus tiene una sorprendente capacidad adaptativa. La secuenciación del genoma completo de numerosas cepas (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/154) ha aclarado la evolución de varias estructuras, toxinas y enzimas que este microorganismo ha desarrollado con el transcurso del tiempo. S. aureus ha adquirido muchos elementos genéticos móviles (p. ej., secuencias de inserción, transposones, etc.) que deter- minan tanto su patogenicidad como su resistencia antimicro- biana (véase Regulación de los determinantes de virulencia). Los estafilococos contienen polisacáridos antigénicos y proteínas, al igual que otras sustancias importantes en la estructura de la pared celular. El peptidoglucano, un polímero polisacárido grueso que contiene subunidades vinculadas, da rigidez al exoesqueleto de la pared celular y ancla las adhesinas (véase luego). El peptidoglucano se destruye con acidez potente o exposición a lisozima. Es importante en la patogenia de la infección: induce la producción de interleucina 1 (pirógeno endógeno) y anticuerpos opsónicos por monocitos, y puede ser un factor quimiotáctico para los leucocitos polimorfonuclea- res, tienen actividad endotoxinoide y activan el complemento. El ensamble de peptidoglucanos es blanco de β lactámicos y antimicrobianos glucopeptídicos. Los ácidos teicoicos, que son polímeros de fosfato de poli- rribitol, están vinculados por entrecruzamiento con el pep- tidoglucano y pueden ser antigénicos. Son importantes en el metabolismo de la pared celular. Los anticuerpos de ácido anti- teicoico detectables por difusión en gel pueden encontrarse en pacientes con endocarditis activa causada por S. aureus. La proteína A es un componente de la pared celular de las cepas de S. aureus y es una proteína de la superficie bacteriana que se ha descrito de entre un grupo de adhesinas denomina- das componentes microbianos superficiales reconocedores de moléculas de adhesión de la matriz (MSCRAMMS, microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). La adhesión bacteriana a las células anfitrionas es mediada por MSCRAMMS y estos son factores de virulencia importantes. La proteína A se une a la porción Fc de las moléculas de IgG excepto IgG3 . La porción Fab de la IgG unida a la proteína A está libre para combinarse con un antígeno específico. La pro- teína A se ha convertido en un reactivo importante en inmuno- logía y en tecnología de laboratorio diagnóstico; por ejemplo, la proteína A con las moléculas de IgG adheridas dirigidas contra un antígeno bacteriano específico aglutinarán bacterias que tienen ese antígeno (“coaglutinación”). Otro MSCRAMM importante es el factor de aglutinación que se encuentra en la superficie de la pared celular; este factor aglutinador se une en forma no enzimática al fibrinógeno y las plaquetas, lo que pro- voca la aglutinación de las bacterias. Las MSCRAMM restan- tes, demasiado numerosas como para mencionarlas aquí (véase la bibliografía), son importantes para la colonización e invasión de S. aureus en infecciones importantes como la endocarditis. La mayor parte de las cepas de S. aureus que tienen impor- tancia clínica tiene cápsulas de polisacáridos, que inhiben la fagocitosis por medio de leucocitos polimorfonucleares a menos que existan anticuerpos específicos. Se han identificado cuando menos 11 serotipos, pero la mayor parte de las infeccio- nes es producto de los tipos 5 y 8. Estos tipos de cápsulas son los sitios efectores de la vacuna conjugada. Las pruebas seroló- gicas tienen una escasa utilidad para identificar estafilococos. Enzimas y toxinas Los estafilococos pueden producir enfermedad por su capaci- dad para multiplicarse y diseminarse ampliamente en los teji- dos y por su producción de muchas sustancias extracelulares. Algunas de estas sustancias son enzimas; otras se consideran toxinas, aunque pueden funcionar como enzimas. Muchas de las toxinas están sujetas al control genético de los plásmidos; algunas pueden estar sujetas a control cromosómico y extra- cromosómico; en el caso de otras no está bien definido el meca- nismo de control genético. A. Catalasa Los estafilococos producen catalasa, la cual convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. La prueba de cata- lasa permite distinguir entre los estafilococos, que son positi- vos, y los estreptococos, que son negativos. B. Coagulasa y factor de aglutinación S. aureus produce coagulasa, una proteína semejante a una enzima que coagula el plasma oxalado o citratado. La coa- gulasa se une a la protrombina; en conjunto pueden volverse enzimáticamente activas e iniciar la polimerización de fibrina. La coagulasa puede depositar fibrina en la superficie de los estafilococos, lo que tal vez altere su ingestión por las células fagocíticas o su destrucción en el interior de tales células. La producción de coagulasa se considera sinónimo del potencial patógeno invasor. El factor aglutinante está confinado por una pared celu- lar y es otro ejemplo de un MSCRAMM (véase antes) que se encarga de que los microorganismos se adhieran al fibrinógeno y la fibrina. Cuando se mezcla con el plasma, S. aureus forma apter 13_Carroll_4R.indd 205 apter 13_Carroll_4R.indd 205 14/04/16 14/04/16
- 219. 206 SECCIÓN IIIBacteriología grumos. El factor de aglutinación es distinto a la coagulasa. Puesto que el factor de aglutinación desencadena una respuesta inmunógena potente en el hospedador, ha sido el centro de esfuerzos para desarrollar una vacuna. Sin embargo, hasta la fecha no existen vacunas para el ser humano contra este factor. C. Otras enzimas Otras enzimas producidas por estafilococos incluyen una hia- luronidasa, o factor de propagación; una estafilocinasa que produce fibrinólisis pero que tiene una acción mucho más lenta que la estreptocinasa, proteinasas, lipasas y lactamasa β. D. Hemolisinas S. aureus tiene cuatro hemolisinas que están reguladas por agr (véase Regulación de los determinantes de virulencia). La α hemolisina es una proteína heterogénea que actúa sobre un gran espectro de membranas de células eucariotas. La toxina β degrada esfingomielina y, por lo tanto, es tóxica para muchas clases de células, incluidos los eritrocitos humanos. La toxina δ es heterogénea y se disocia en subunidades en detergentes no iónicos. Destruye membranas biológicas y participa en las enfermedades diarreicas por S. aureus. La hemolisina γ es una leucocidina que lisa leucocitos y está formada por dos proteínas llamadas S y F. La hemolisina γ actúa de manera recíproca con dos proteínas que comprenden la leucocidina Panton-Valentine (PVL, véase más adelante) para formar seis toxinas potencia- les de dos componentes. Las seis toxinas proteínicas pueden lisar de manera eficiente a los leucocitos al causar la forma- ción de poros en las membranas celulares que incrementan la permeabilidad a los cationes. Esto desencadena la liberación masiva de mediadores inflamatorios como IL-8, leucotrienos e histamina que intervienen en la necrosis y la inflamación grave. E. Leucocidina de Panton-Valentine Esta toxina de S. aureus tiene dos componentes y, a diferencia de la hemolisina codificada en forma cromosómica antes men- cionada, la PVL se codifica en un fago móvil. Puede aniquilar leucocitos de seres humanos y conejos. Los dos componen- tes designados como S y F tienen una acción sinérgica sobre la membrana de los leucocitos como la descrita antes para la toxina γ. Esta toxina es un factor importante de virulencia en las infecciones por CA-MRSA. F. Toxinas exfoliativas Estas toxinas epidermolíticas de S. aureus son dos proteínas distintas que tienen el mismo peso molecular. La toxina A exfoliativa es codificada por eta situado en un fago y es ter- moestable (resiste la ebullición durante 20 min). La toxina B exfoliativa es gobernada por plásmidos y termolábil. Estas toxinas epidermolíticas producen la descamación generalizada de la epidermólisis estafilocócica aguda al disolver la matriz de mucopolisacárido de la epidermis. Las toxinas son superantí- genos (capítulo 8). G. Toxina del síndrome de choque tóxico La mayor parte de las cepas de S. aureus que se aíslan en pacientes con el síndrome de choque tóxico produce una toxina denominada toxina-1 del síndrome del choque tóxico (TSST-1, toxic shock syndrome toxin-1), que es la misma que la enterotoxina F. La TSST-1 es el superantígeno prototipo (capí- tulo 9). La TSST-1 se une a moléculas de clase de histocompati- bilidad mayor (MHC, major histocompatibility) clase II, lo que ocasiona la estimulación de linfocitos T, que favorece las mani- festaciones diversas del síndrome de choque tóxico. La toxina produce fiebre, choque y lesión de órganos múltiples, lo que comprende un exantema descamativo. El gen de la TSST-1 se detecta en casi 20% de las cepas de S. aureus, incluido MRSA. H. Enterotoxinas Hay 15 enterotoxinas (A-E, G-P) que, de manera similar a TSST-1, son superantígenos. Cerca de 50% de las cepas de S. aureus puede producir una o más de ellas. Las enterotoxi- nas son termoestables y resistentes a la acción de las enzimas intestinales. Las enterotoxinas, que son causas importantes de intoxicación alimentaria, se producen cuando S. aureus se desarrolla en alimentos que contienen hidratos de carbono y proteínas. La ingestión de 25 μg de enterotoxina B produce vómito y diarrea (el efecto vomitivo de la enterotoxina proba- blemente sea resultado de la estimulación del sistema nervioso central (centro del vómito) después de que la toxina actúa en los receptores neurales del intestino. Las toxinas exfoliativas, TSST-1 y los genes de la enteroto- xina se encuentran en un elemento cromosómico denominado isla de patogenicidad. Interactúa con elementos genéticos com- plementarios (bacteriófagos) para producir las toxinas. Patogenia Los estafilococos, sobre todo S. epidermidis, son miembros de la microbiota normal de la piel humana y del aparato res- piratorio y digestivo. De 20 a 50% de los seres humanos son portadores nasales de S. aureus. Los estafilococos también se detectan con regularidad en ropa, ropa de cama y otros fómites en ambientes humanos. La capacidad patógena de una determinada cepa de S. au- reus es el efecto combinado de factores extracelulares y toxinas junto con las propiedades invasivas de la cepa. En un extremo de la gama de la enfermedad está la intoxicación alimentaria estafilocócica, que se atribuye únicamente a la ingestión de la enterotoxina preformada; en el otro extremo están la bacte- riemia estafilocócica y los abscesos diseminados en todos los órganos. S. aureus patógeno invasivo produce coagulasa y tiende a producir un pigmento amarillo y a ser hemolítico. Los esta- filococos no patógenos y no invasivos como S. epidermidis son coagulasa-negativos y tienden a ser no hemolíticos. Tales microorganismos pocas veces producen supuración, pero pueden infectar prótesis ortopédicas o cardiovasculares o ser causa de enfermedades en las personas inmunodeprimidas. Pueden ser resistentes al tratamiento debido a la formación de biopelículas. S. lugdunensis ha surgido como microorganismo virulento con un espectro de enfermedades similar al de S. au- reus, con el que comparte ciertas características fenotípicas como factores de hemólisis y de aglutinación. S. saprophyticus suele ser no pigmentado, resistente a novobiocina y no hemolí- tico; produce infecciones de vías urinarias en mujeres jóvenes. apter 13_Carroll_4R.indd 206 apter 13_Carroll_4R.indd 206 14/04/16 14/04/16
- 220. CAPÍTULO 13 Estafilococos207 Regulación de los factores que determinan la virulencia La expresión de los factores estafilocócicos determinantes de la virulencia es regulada por varios sistemas que son sensibles a las señales ambientales. El primero de estos sistemas consta de dos proteínas (sistemas de dos componentes), un ejemplo de ello es el regulador accesorio de genes (agr). Los otros dos sis- temas consisten en proteínas de unión al DNA (p. ej., proteí- nas Sar) y RNA reguladores pequeños, respectivamente (p. ej., RNAIII), el último de los cuales ha adquirido más valor por tener funciones más importantes en la regulación de la expre- sión génica. La unión de sensores a ligandos extracelulares específicos o a un receptor tiene como resultado una secuen- cia de fosforilación que conduce hacia la unión del regulador con secuencias específicas de DNA. Esto finalmente provoca la activación de funciones reguladoras de la transcripción. S. aureus contiene varios sistemas reguladores de dos compo- nentes bien descritos. Éstos comprenden agr, el mejor descrito, sae RS, srrAB, arlSR y lytRS. A continuación se describe en forma breve la manera como estos sistemas interactúan. El regulador del gen accesorio (agr) es esencial en el con- trol de percepción de quórum de la expresión génica. Controla la expresión preferente de adhesinas de superficie (proteína A, coa- gulasa y proteína fijadora de fibronectina), así como la produc- ción de exoproteínas (toxinas como TSST-1), lo que depende de la fase del crecimiento (y, por lo tanto, de la densidad bacteriana). A una baja densidad celular, el promotor P2 es inactivado y hay disminución de las transcripciones de proteína transmem- brana, AgrB, precursor de péptido, AgrD, sensor transmembra- na, AgrC y regulador de transcripción, AgrA. A medida que aumenta la densidad celular durante la fase de crecimiento esta- cionario, el sensor AgrC activa el regulador AgrA. AgrA es una proteína fijadora de DNA que activa al promotor P2 y al pro- motor P3. Este último inicia la transcripción de δ hemolisina y un efector denominado RNAIII, que disminuye la expresión de las adhesinas de superficie y activa la secreción de exoproteínas tanto a nivel de transcripción como de traducción. Agr también es controlado positivamente por una proteína fijadora de DNA denominada SarA (codificada por sar) y posiblemente por otros sistemas reguladores. Se ha demostrado que por lo menos cuatro sistemas regu- ladores adicionales de dos componentes modifican la expresión del gen de virulencia. Estos se denominan sae, exoproteínas de S. aureus; srrAB, respuesta respiratoria estafilocócica; arlS, sensor de locus relacionado con autólisis y lytRS. Sae regula la expresión génica a nivel de transcripción y es esencial para producir toxina α, β hemolisinas y coagulasa. Su actividad es independiente a la de agr. SsrAB es importante para la regula- ción de la expresión del factor de virulencia que está influido por el oxígeno ambiental. El locus arlSR es importante para el control de la autólisis y disminuye la activación del locus agr. El locus lytSR también interviene en la autólisis. En la obra de Que y Moreillon pueden encontrarse análisis más detallados sobre la regulación de la patogenia. Anatomía patológica El prototipo de una lesión estafilocócica es el forúnculo u otro absceso circunscrito. Grupos de S. aureus establecidos en un folículo piloso producen necrosis del tejido (factor dermone- crótico). Se produce coagulasa y coagula la fibrina alrededor de la lesión y dentro de los linfáticos, lo que da por resultado la formación de una pared que limita el proceso y es reforzada por la acumulación de células inflamatorias y, más tarde, de tejido fibroso. En el centro de la lesión ocurre la licuefacción del tejido necrótico (intensificada por la hipersensibilidad tar- día) y el absceso “apunta” hacia la dirección de menos resisten- cia. Después del drenaje del tejido necrótico del centro líquido, la cavidad se llena lentamente con tejido de granulación y des- pués se cicatriza. La supuración focal (absceso) es característica de la infec- ción estafilocócica. Desde cualquier foco, los microorganismos pueden diseminarse por los linfáticos y la circulación sanguí- nea a otras partes del organismo. La supuración dentro de las venas, asociada a la trombosis, es una característica frecuente de tal diseminación. En la osteomielitis, el centro primario del crecimiento de S. aureus suele ser un vaso sanguíneo terminal de la metáfisis de un hueso largo, lo que desencadena necro- sis del hueso y supuración crónica. S. aureus puede ser causa de neumonía, meningitis, empiema, endocarditis o septicemia con formación de pus en cualquier órgano. Los estafilococos de baja invasividad intervienen en muchas infecciones cutáneas (p. ej., acné, piodermia o impétigo). Los cocos anaerobios (Peptostrep- tococcus) participan en las infecciones anaerobias mixtas. Los estafilococos también causan enfermedad mediante la elaboración de toxinas, sin una infección invasiva manifiesta. La exfoliación ampollosa, el síndrome de epidermólisis estafi- locócica aguda, es causada por la producción de toxinas exfo- liativas. El síndrome de choque tóxico se relaciona con TSST-1. Manifestaciones clínicas Una infección estafilocócica circunscrita aparece como un “grano”, infección del folículo piloso o absceso. Suele haber una reacción inflamatoria intensa, circunscrita y dolorosa que supura del centro y que cicatriza con rapidez cuando se drena el pus. La pared de fibrina y las células alrededor del centro del absceso tienden a impedir la diseminación de los microorganis- mos y no debe destruirse con manipulaciones o traumatismo. La infección por S. aureus también se debe a la contami- nación directa de una herida, por ejemplo, infección de una herida posoperatoria por estafilococos o infección después de un traumatismo (osteomielitis crónica subsiguiente a una frac- tura abierta, meningitis consecutiva a una fractura del cráneo). Si S. aureus se disemina y sobreviene bacteriemia, es posi- ble que se presente endocarditis, osteomielitis hematógena aguda, meningitis o infección pulmonar. Los cuadros clínicos se parecen a los observados en otras infecciones del torrente sanguíneo. La localización secundaria en un órgano o sistema se acompaña de signos y síntomas de disfunción orgánica y supuración focal intensa. La intoxicación alimentaria debida a enterotoxina esta- filocócica se caracteriza por un periodo de incubación breve (1 a 8 h), náusea y vómito intensos, así como diarrea y una rápida convalecencia. No hay fiebre. El síndrome de choque tóxico se manifiesta por el inicio repentino de fiebre alta, vómito, diarrea, mialgias, un exan- tema escarlatiniforme e hipotensión con insuficiencia cardiaca apter 13_Carroll_4R.indd 207 apter 13_Carroll_4R.indd 207 14/04/16 14/04/16
- 221. 208 SECCIÓN IIIBacteriología y renal en los casos más graves. A menudo empieza en los pri- meros cinco días después de iniciada la menstruación en muje- res jóvenes que utilizan tampones de alta absorbencia, pero también se observa en niños y varones con infección en una herida por estafilococo. El síndrome puede experimentar reci- diva. S. aureus relacionado con el síndrome de choque tóxico puede encontrarse en la vagina, en tampones, en heridas o en otras infecciones circunscritas, o en la faringe, pero práctica- mente nunca en la circulación sanguínea. Pruebas diagnósticas de laboratorio A. Muestras Todas las siguientes constituyen muestras apropiadas para rea- lizar pruebas, según la localización del proceso: pus en frotis superficial o aspirado de un absceso, sangre, aspirado endo- nasotraqueal, esputo expectorado o líquido raquídeo para cul- tivo. Con frecuencia se frota un hisopo en la porción anterior de las narinas para establecer si existe colonización nasal, ya sea por medio de cultivo o por pruebas de amplificación de áci- dos nucleicos, para fines epidemiológicos. B. Frotis Los estafilococos característicos aparecen como cocos gram- positivos en racimos en frotis de pus o de esputo teñidos con la técnica de Gram. No es posible distinguir entre microorganis- mos no aureus (p. ej., S. epidermidis) y los patógenos S. aureus en los frotis. C. Cultivo Las muestras sembradas en placas de agar sangre originan colonias características en un término de 18 h a una tempe- ratura de 37 °C, pero es posible que no haya hemólisis ni pro- ducción de pigmentos hasta varios días después y son óptimos a una temperatura ambiente. S. aureus fermenta manitol, pero ningún otro estafilococo lo hace. Las muestras contaminadas con una microbiota mixta pueden cultivarse en medios que contienen NaCl al 7.5%; la sal inhibe la mayor parte de la demás microbiota normal pero no a S. aureus. El agar de sal y manitol o los medios cromógenos disponibles en el comercio se utilizan para detectar portadores nasales de S. aureus y pacientes con fibrosis quística. D. Prueba de la catalasa Esta prueba se utiliza para detectar la presencia de enzimas citocromo oxidasa. Se coloca una gota de una solución de peróxido de hidrógeno al 3% en un portaobjetos y se aplica una pequeña cantidad del crecimiento bacteriano en la solución. La formación de burbujas (liberación de oxígeno) indica una prueba positiva. E. Prueba de la coagulasa El plasma de conejo (o humano) citratado diluido a 1:5 se mezcla con un volumen igual de caldo de cultivo o del cultivo proveniente de colonias crecidas en agar y se incuba a una tem- peratura de 37 °C. Se incluye como control un tubo de ensayo con plasma mezclado con caldo estéril. Si se forman coágulos en un lapso de 1 a 4 h, la prueba es positiva. Las pruebas de látex rápidas y los análisis de aglutinación son más oportunos y en algunos casos más sensibles para distinguir entre S. aureus y CoNS. Tales análisis detectan proteína A y factor de aglu- tinación, y algunos tienen anticuerpos monoclonares contra polisacáridos capsulares. Los estafilococos productores de coagulasa se consideran patógenos para el ser humano; sin embargo, los estafilococos productores de coagulasa de los perros (Staphylococcus inter- medius) y los delfines (Staphylococcus delphini) en algunas oca- siones producen enfermedad en el ser humano. Las infecciones de dispositivos protésicos pueden deberse a microorganismos del grupo de S. epidermidis coagulasa negativo. F. Pruebas de sensibilidad Los laboratorios clínicos adoptan métodos recomendados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) o el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) para la realización de pruebas de sensibilidad de estafilococos. La microdilución en caldo que utiliza métodos manuales o comerciales automatizados o la prueba de sensi- bilidad de difusión en disco deben realizarse en forma siste- mática en cepas de estafilococos procedentes de infecciones de importancia clínica. La resistencia a la penicilina G puede pronosticarse por un resultado positivo de la prueba de β lac- tamasa; alrededor de 90% de S. aureus produce β lactamasa. La resistencia a la nafcilina (y oxacilina y meticilina) se pre- senta en alrededor de 65% de los cultivos de S. aureus y alrede- dor de 75% de los de S. epidermidis. La resistencia a nafcilina guarda relación con la presencia de mecA o mecC, los genes que codifican una proteína de unión a la penicilina (PBP2a, penicillin-binding protein) no afectados por tales fármacos. Estos genes pueden ser detectados con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otra prueba de amplificación de ácido nucleico. Varios sistemas autorizados por la FDA combinan la identificación y la detección del marcador de resistencia mecA directamente de hemocultivos positivos. Los análisis Veri- gene® (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) y BioFire FilmA- rray® BCID (BioFire Diagnostics, Inc., Salt Lake City, UT) son dos ejemplos de tales pruebas, pero muchos más se encuentran en desarrollo. También hay un análisis para el producto génico mecA, PBP2a, que se encuentra a la venta en el comercio y es mucho más rápido que la PCR para mecA o que la prueba de resistencia con los métodos fenotípicos tradicionales. Cuando se utiliza la difusión en disco para detectar la resistencia a nafcilina, se recomienda la prueba de disco de cefoxitina para la prueba de S. aureus, S. lugdunensis y S. sapro- phyticus. Si la zona tiene un tamaño < 22 mm indica resisten- cia. En la microdilución en caldo se puede usar oxacilina o cefoxitina para detectar la resistencia a oxacilina. Si se prueba el último fármaco, entonces se añade NaCl al 2% al medio de cultivo y la prueba debe incubarse por 24 h completas a 35 °C. Un microorganismo que es positivo para mecA o mecC o que fenotípicamente es resistente a nafcilina, oxacilina o meti- cilina también es resistente a todas las penicilinas de amplio espectro, fármacos carbapenémicos y cefalosporinas, con la excepción de ceftarolina, una nueva cefalosporina con activi- dad contra MRSA. apter 13_Carroll_4R.indd 208 apter 13_Carroll_4R.indd 208 14/04/16 14/04/16
- 222. CAPÍTULO 13 Estafilococos209 G. Pruebas serológicas y de tipificación Las pruebas serológicas para el diagnóstico de las infecciones por S. aureus tienen escasa utilidad práctica. Los patrones de sensibilidad a antibióticos ayudan a detec- tar infecciones por S. aureus y a determinar si múltiples cepas de S. epidermidis provenientes de hemocultivos representan bacteriemia debida a la misma cepa, diseminada por un nido de infección. Se han utilizado las técnicas de tipificación molecular para documentar la diseminación de clones de S. aureus que produ- cen enfermedad epidémica. La electroforesis en gel de campo pulsado y la tipificación de secuencia multilocus son muy dis- criminatorias. La tipificación de Spa es menos específica, pero más fácil de realizar. Tratamiento La mayoría de las personas alberga estafilococos en la piel y en la nariz o en la faringe. Aun cuando la piel pueda liberarse de estafilococos (p. ej., en el eccema), la reinfección por las go- tículas ocurrirá casi de inmediato. Puesto que los microorga- nismos patógenos suelen diseminarse de una lesión (p. ej., un forúnculo) a otra zona de la piel por los dedos y las prendas de vestir, es importante la antisepsia local meticulosa para contro- lar la forunculosis recidivante. Las múltiples infecciones cutáneas importantes (acné, forunculosis) ocurren muy a menudo en los adolescentes. Hay infecciones cutáneas similares que se presentan en pacientes que reciben ciclos prolongados de corticoesteroides. En el acné, las lipasas de estafilococos y corinebacterias liberan ácidos grasos provenientes de lípidos y, por lo tanto, producen irritación del tejido. Se utilizan tetraciclinas para el tratamiento de largo plazo. Los abscesos y otras lesiones purulentas cerradas se tratan mediante drenaje, el cual es esencial, y tratamiento antimicro- biano. Muchos antimicrobianos tienen algún efecto contra los estafilococos in vitro. Sin embargo, es difícil erradicar los esta- filococos patógenos en personas infectadas, pues los microor- ganismos rápidamente desarrollan resistencia a muchos anti- microbianos y los fármacos no pueden ejercer su acción en la porción necrótica central de una lesión supurativa. También puede ser difícil erradicar el estado portador nasal de S. aureus. Se ha informado de cierto éxito con la admi- nistración de mupirocina intranasal en individuos coloniza- dos. En la literatura médica se encuentran éxitos demostrados de reducción de infecciones de heridas posquirúrgicas y pre- vención de bacteriemia con la administración de mupirocina a pacientes hospitalizados identificados durante cinco días, con o sin baño de clorhexidina, un antiséptico tópico. La osteomielitis hematógena aguda responde bien a los antimicrobianos. En la osteomielitis crónica y recurrente, el drenaje quirúrgico y la resección del tejido óseo necrótico se acompaña de la administración a largo plazo de fármacos apro- piados, pero es difícil erradicar los estafilococos infectantes. El oxígeno hiperbárico y la aplicación de colgajos miocutáneos vascularizados han ayudado a la cicatrización en la osteomie- litis crónica. La bacteriemia, la endocarditis, la neumonía y otras infec- ciones graves por S. aureus necesitan tratamiento intravenoso prolongado con una penicilina resistente a lactamasa β. La vancomicina suele reservarse para utilizarse contra los estafilo- cocos resistentes a nafcilina. En los últimos años, el incremento de las MIC para la vancomicina en muchas cepas de MRSA tomadas de pacientes hospitalizados ha hecho que los médicos busquen otros tratamientos. Entre los fármacos alternativos para tratar la bacteriemia por MRSA y la endocarditis están los antimicrobianos más recientes como daptomicina, line- zolida, quinupristina-dalfopristina (capítulo 28). Asimismo, estos compuestos pueden ser bactericidas y ofrecen alternati- vas cuando las alergias impiden el empleo de otros compuestos o cuando la infección del paciente parece estar cediendo en tér- minos clínicos. Sin embargo, el empleo de estos fármacos debe analizarse con los infectólogos o los farmacólogos porque los efectos secundarios y la farmacocinética de cada uno son muy singulares. En fecha reciente se aprobó el uso de una cefalos- porina nueva llamada ceftarolina, activa contra MRSA y otras bacterias tanto grampositivas como gramnegativas, para el tra- tamiento de las infecciones de piel y tejidos blandos, así como de la neumonía extrahospitalaria. Este fármaco todavía no está indicado para la bacteriemia. Si se encuentra que la infección se debe a S. aureus no productor de lactamasa β, la penicilina G es el fármaco de elección, pero pocas veces se detectan estas cepas de S. aureus. Las infecciones por S. epidermidis son difíciles de curar en virtud de que ocurren en dispositivos protésicos donde las bac- terias pueden aislarse en una biopelícula. S. epidermidis suele ser más resistente a los antimicrobianos que S. aureus; cerca de 75% de las cepas de S. epidermidis es resistente a nafcilina. La FDA autorizó en fecha reciente varios fármacos más nove- dosos para el tratamiento de piel e infecciones de la estructura cutánea que tienen actividad contra CoNS, MSSA y MRSA. Son dalbavancina, un lipoglucopéptido intravenoso de acción prolongada; fosfato de tedizolida, una oxazolidinona con pre- sentaciones intravenosa y bucal, similar a la linezolida, y orita- vancina, un glucopéptido semisintético. Dada la frecuencia de cepas resistentes, las cepas de estafi- lococos importantes deben analizarse para determinar su sen- sibilidad a antimicrobianos y facilitar la selección de fármacos sistémicos. La resistencia a los fármacos del grupo de la eritro- micina tiende a surgir con tanta rapidez que estos antimicro- bianos no deben administrarse solos para tratar la infección crónica. La resistencia a los fármacos (penicilinas, tetracicli- nas, aminoglucósidos, eritromicinas, etc.) determinada por plásmidos puede transmitirse entre los estafilococos mediante transducción y tal vez por conjugación. Las cepas de S. aureus resistentes a la penicilina G prove- nientes de infecciones clínicas siempre producen penicilinasa. Constituyen más de 95% de las cepas aisladas de S. aureus en las comunidades de Estados Unidos. A menudo son sensibles a penicilinas resistentes a la lactamasa β, cefalosporinas o vanco- micina. La resistencia a la nafcilina depende de la producción de lactamasa β y su incidencia clínica varía mucho en diferen- tes países y en diferentes épocas. Es posible que la presión de la selección de los antimicrobianos resistentes a la lactamasa β no sea el único factor determinante de la resistencia a estos fárma- cos. Por ejemplo, en Dinamarca, S. aureus resistente a nafcilina comprendía 40% de las cepas en 1970 y sólo 10% en 1980, sin cambios notables en el empleo de nafcilina o fármacos afines. En Estados Unidos, S. aureus resistente a nafcilina representaba apter 13_Carroll_4R.indd 209 apter 13_Carroll_4R.indd 209 14/04/16 14/04/16
- 223. 210 SECCIÓN IIIBacteriología sólo 0.1% de las cepas en 1970, pero en la década de 1990, cons- tituyó 20 a 30% de las cepas aisladas de infecciones en algunos hospitales. En la actualidad, alrededor de 60% de los pacientes bajo cuidado intensivo con infección por S. aureus intrahospi- talaria en Estados Unidos es resistente a nafcilina. Por suerte, las cepas de S. aureus de sensibilidad intermedia a la vanco- micina han sido relativamente infrecuentes y ha sido raro el aislamiento de cepas resistentes a la vancomicina. Epidemiología y control Los estafilococos son parásitos humanos ubicuos. Las principa- lesfuentesdeinfecciónsonlesioneshumanasquelosdiseminan, fómites contaminados de tales lesiones y el aparato respiratorio y la piel del ser humano. La propagación de la infección por con- tacto ha asumido mayor importancia en hospitales, donde una gran proporción del personal y de los pacientes es portadora de estafilococos resistentes a antibióticos en la cavidad nasal o en la piel. Aunque la limpieza, la higiene y el tratamiento aséptico de las lesiones permiten controlar la propagación de los estafiloco- cos de las lesiones, se dispone de pocos métodos para prevenir la diseminación generalizada de estafilococos de portadores. Los aerosoles (p. ej., glicoles) y la radiación ultravioleta del aire han tenido poco efecto. En los hospitales, las zonas de máximo riesgo para las infecciones estafilocócicas graves son las salas de recién naci- dos, las unidades de cuidados intensivos, los quirófanos y las salas de quimioterapia para cáncer. La introducción masiva de S. aureus patógeno “epidémico” en estas áreas puede provocar enfermedad clínica importante. El personal con lesiones acti- vas por S. aureus y los portadores tienen que excluirse de estas áreas. En tales personas, la aplicación de antisépticos tópicos como mupirocina en los lugares de portación nasal o perineal puede reducir la diseminación de microorganismos peligrosos. La rifampicina junto con un segundo fármaco antiestafilocó- cico oral a veces ofrece supresión de largo plazo y posiblemente la cura del portador nasal; esta forma de tratamiento suele reservarse para los principales problemas de la portación de estafilococos, pues éstos rápidamente pueden desarrollar resis- tencia a la rifampicina. Para disminuir la transmisión en el ámbito hospitalario, los pacientes con alto riesgo, como los que están internados en las unidades de cuidados intensivos y los que son transfe- ridos desde unidades de atención crónica donde la prevalencia es alta, a menudo se valoran para determinar si tienen coloni- zación en las narinas. Los enfermos con pruebas positivas de cultivo o PCR se someten a las precauciones de contacto para reducir al mínimo la propagación en las manos del personal de atención a la salud. El personal debe apegarse estrictamente a las políticas de control de infecciones, utilizar guantes y lavar- se las manos antes y después del contacto con el paciente. Hasta hace relativamente poco tiempo, S. aureus resis- tente a meticilina estaba confinado principalmente al ámbito hospitalario. La diseminación mundial de algunos clones dis- tintivos de CA-MRSA, y ahora de LA-MRSA, ha producido un incremento de las infecciones de la piel y tejidos blandos y de la neumonía necrosante, sobre todo en pacientes más jóvenes sin factores de riesgo conocidos para la adquisición de MRSA. Estas cepas al parecer son más virulentas. Las cepas de CA-MRSA se caracterizan por la presencia de la leucocidina de Panton- Valentine (PVL) y la presencia del casete cromosómico esta- filocócico mec tipo IV (véanse comentarios antes en “Carac- terísticas del crecimiento”), lo cual puede explicar la mayor sensibilidad a otros antimicrobianos en comparación con las cepas de MRSA relacionadas con la atención de la salud. RESUMEN DEL CAPÍTULO • Los estafilococos son microorganismos grampositivos y catalasa positivos que crecen en forma de racimos y cons- tituyen un comensal frecuente de la piel y mucosas del ser humano y los animales. • Los estafilococos patógenos, principalmente S. aureus, hemolizan la sangre, coagulan el plasma y producen una serie de enzimas extracelulares y toxinas que les confieren su virulencia. • S. aureus posee sistemas reguladores complejos que res- ponden a los estímulos ambientales para regular la expre- sión de sus diversos genes de virulencia codificados en islas de patogenicidad. • S. aureus provoca gran variedad de enfermedades invasivas y toxígenas; el CoNS es menos virulento y muy a menudo acompaña a infecciones oportunistas (S. epidermidis) o síndromes específicos como infecciones por S. saprophy- ticus o infecciones de vías urinarias. • La resistencia antimicrobiana entre los estafilococos es extensa y es codificada por una gran variedad de meca- nismos como producción de lactamasa β, mecA cromosó- mico y otros factores de resistencia. PREGUNTAS DE REVISIÓN 1. Una mujer de 54 años de edad presenta un absceso en el hombro derecho con una cepa de Staphylococcus aureus que es resistente a nafcilina. Se trató con un esquema de vancomicina intravenosa durante dos semanas y mejoró. Tres semanas después (semana 5) hubo recidiva de la infección y recibió vancomicina intravenosa durante dos semanas más y de nuevo mejoró. Cuatro semanas después (semana 11), la infección recurrió y de nuevo comenzó con vancomicina intravenosa. Las MIC de la vancomicina para las cepas de S. aureus fueron las siguientes: cepa inicial (día 1), 1 μg/ml; semana 5, 2 μg/ml; y semana 11, 8 μg/ml. La paciente no mejoró con el tercer ciclo de vancomicina y se administró otro tratamiento. El mecanismo que explica mejor la resistencia rela- tiva de esta cepa de S. aureus a la vancomicina es: (A) Adquisición del gen van A de otro microorganismo (B) Transporte activo de la vancomicina fuera de la célula de S. aureus (C) Acción de la β lactamasa (D) Incremento de la síntesis de la pared celular y alteraciones de la estructura de la pared celular (E) Fosforilación e inactivación resultante de la vancomicina 2. Un niño de 11 años de edad presenta fiebre leve y dolor en la parte superior del brazo. La radiografía del brazo muestra una lesión lítica (disolución) en la parte superior del húmero con elevación del periostio sobre la lesión. El paciente se somete a una interven- ción quirúrgica en la cual se efectúa desbridamiento de la lesión (se reseca el hueso necrótico y se elimina el pus). El cultivo de la lesión revela cocos grampositivos. Una prueba muestra que el apter 13_Carroll_4R.indd 210 apter 13_Carroll_4R.indd 210 14/04/16 14/04/16
- 224. CAPÍTULO 13 Estafilococos211 microorganismo es un estafilococo y no un estreptococo. Con base en esta información, se sabe que el microorganismo es: (A) Sensible a la nafcilina (B) Positivo para β lactamasa (C) Productor de proteína A (D) Encapsulado (E) Catalasa positivo 3. Un varón de 36 años de edad tiene un absceso por una cepa de S. aureus que es β lactamasa positiva. Esto indica que el microor- ganismo es resistente a cuál de los siguientes antibióticos: (A) Penicilina G, ampicilina y piperacilina (B) Trimetoprim-sulfametoxazol (C) Eritromicina, claritromicina y azitromicina (D) Vancomicina (E) Cefazolina y ceftriaxona 4. Hace siete días, una estudiante de medicina de 27 años de edad regresó de Centroamérica, donde había pasado el verano traba- jando en una clínica para indígenas. Hace cuatro días, la paciente presentó un exantema eritematoso parecido a una quemadura solar. También había tenido cefaleas, mialgias y cólicos abdo- minales con diarrea. Su presión arterial era 70/40 mm Hg. La exploración ginecológica muestra que se encuentra cursando su periodo menstrual y tiene colocado un tampón; por lo demás, la exploración ginecológica es normal. Sus pruebas de función renal (nitrógeno ureico sanguíneo y creatinina) son anormales, lo que indica insuficiencia renal leve. Un frotis sanguíneo para el palu- dismo es negativo. ¿Es posible que su enfermedad sea causada por cuál de los siguientes? (A) Una toxina que produce concentraciones muy altas de monofosfato de adenosina cíclico intracelular (cAMP) (B) Una toxina que degrada esfingomielina (C) Una toxina que se une al complejo de histocompatibilidad mayor clase II (MHC) de una célula presentadora de antí- geno y la región Vβ de un linfocito T (D) Una toxina de dos componentes que forma poros en los leu- cocitos e incrementa la permeabilidad a los cationes (E) Una toxina que bloquea el factor de elongación 2 (EF2) 5. Durante un periodo de tres semanas, un total de cinco pacientes en la sala de recién nacidos del hospital presentó infecciones por Staphylococcus aureus y bacteriemia por este microorganismo. Todas las cepas aisladas tenían las mismas características morfo- lógicas de la colonia y propiedades hemolíticas, así como patro- nes de sensibilidad a antimicrobianos idénticos, lo que indicaba que eran las mismas. (Los métodos moleculares que se utilizaron después demostraron que las cepas eran idénticas). ¿Qué es lo que debe hacerse ahora? (A) Tratamiento profiláctico de todos los recién nacidos con vancomicina intravenosa (B) Aislamiento protector de todos los recién nacidos (C) Cierre de la sala de recién nacidos y envío de las mujeres embarazadas a otro hospital (D) Contratar a nuevo personal para la sala de recién nacidos del hospital (E) Realizar cultivo con agar sal y manitol de la parte anterior de las narinas de los médicos, las enfermeras y otro personal que haya atendido a los lactantes infectados 6. Las toxinas exfoliativas, TSST-1, y las enterotoxinas son todas superantígenos. Los genes para estas toxinas: (A) Están presentes en todas las cepas de Staphylococcus aureus (B) Tienen una distribución amplia en el cromosoma estafilo- cócico (C) Están presentes en el cromosoma estafilocócico (toxinas TSST-1 y exfoliativa) y en los plásmidos (enterotoxinas) (D) Están presentes en el cromosoma estafilocócico en una isla de patogenicidad (E) Están en los plásmidos 7. Un paciente de 16 años de edad sometido a un trasplante de médula ósea tiene un catéter central que fue colocado hace dos semanas. Asimismo, tiene una sonda en las vías urinarias, la cual fue colocada hace dos semanas también. Presenta fiebre cuando sus cifras de leucocitos son muy bajas y antes de implantar el injerto. Se llevan a cabo tres hemocultivos y todos demuestran Staphylococcus epidermidis. ¿Cuál de las siguientes declaraciones es correcta? (A) Los microorganismos de la especie Staphylococcus epidermi- dis posiblemente son sensibles a la penicilina G (B) Staphylococcus epidermidis posiblementeprovienedelasuper- ficie de la sonda en las vías urinarias (C) Staphylococcus epidermidis posiblemente es resistente a van- comicina (D) Los microorganismos de la especie Staphylococcus epidermi- dis posiblemente provienen de una fuente cutánea (E) Los microorganismos de la especie Staphylococcus epidermi- dis posiblemente se hallan en una biopelícula en la superficie del catéter venoso central 8. Un varón de 65 años de edad presenta un absceso en la parte pos- terior del cuello. En el cultivo se detecta Staphylococcus aureus. Se evalúa la cepa y es positiva para el gen mecA, lo cual significa que: (A) La cepa es sensible a vancomicina (B) La cepa es resistente a vancomicina (C) La cepa es sensible a nafcilina (D) La cepa es resistente a nafcilina (E) La cepa es sensible a clindamicina (F) La cepa es resistente a clindamicina 9. La resistencia a antimicrobianos se ha convertido en un problema importante. ¿Cuál de los siguientes constituye un problema prin- cipal en todo el mundo? (A) La resistencia de Staphylococcus aureus a la nafcilina (B) La resistencia de Streptococcus pneumoniae a la penicilina (C) La resistencia de Neisseria gonorrhoeae a la penicilina (D) La resistencia de Staphylococcus aureus a la vancomicina (E) La resistencia de Escherichia coli a la tobramicina 10. Un grupo de seis niños menores de ocho años de edad vive en un país semitropical. Todos los niños tienen varias lesiones cutá- neas exudativas y encostradas de impétigo (piodermia). Las lesio- nes predominan en los brazos y la cara. ¿Cuál de los siguientes microorganismos es la causa probable de las lesiones? (A) Escherichia coli (B) Chlamydia trachomatis (C) Staphylococcus aureus (D) Streptococcus pneumoniae (E) Bacillus anthracis 11. ¿Cuál de las siguientes aseveraciones en torno a la participación de la proteína A en la patogenia de las infecciones causadas por Staphylococcus aureus es correcta? (A) Es la causa del exantema en el síndrome de choque tóxico (B) Convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno (C) Es una enterotoxina potente (D) Es la causa directa de la lisis de neutrófilos (E) Es una proteína de la superficie bacteriana que se une a la porción Fc de la IgG1 12. ¿Cuál de los siguientes microorganismos estafilocócicos produce coagulasa y se ha implicado en las infecciones que se presentan tras una mordedura de perro? (A) Staphylococcus intermedius apter 13_Carroll_4R.indd 211 apter 13_Carroll_4R.indd 211 14/04/16 14/04/16
- 225. 212 SECCIÓN IIIBacteriología Respuestas 1. D 2. E 3. A 4. C 5. E 6. D 7. E 8. D 9. D 10. C 11. E 12. A 13. D 14. C 15. D (B) Staphylococcus epidermidis (C) Staphylococcus saprophyticus (D) Staphylococcus hominis (E) Staphylococcus hemolyticus 13. Todas las siguientes aseveraciones con relación a la leucocidina de Panton-Valentine son correctas, excepto: (A) Es una toxina de dos componentes (B) Suele ser producida por cepas extrahospitalarias de MRSA (C) Es un factor de virulencia importante (D) Es idéntica a una de las enterotoxinas estafilocócicas (E) Forma poros en las membranas de los leucocitos 14. ¿Cuál de las siguientes aseveraciones describe mejor la función del regulador del gen accesorio en Staphylococcus aureus? (A) Regula la producción de β hemolisinas (B) Está sujeto a la influencia del oxígeno ambiental (C) Controla la expresión preferente de las adhesinas de superficie (D) Es importante en el control de la autólisis 15. Todas las siguientes son estrategias importantes para el control de la infección para contener la diseminación de MRSA en los hospitales, excepto: (A) Higiene meticulosa de las manos (B) Vigilancia sistemática de la colonización nasal en personas con alto riesgo (C) Aislamiento de contacto para los pacientes que están coloni- zados o infectados por MRSA (D) Profilaxis antimicrobiana sistemática en todos los pacientes hospitalizados por más de 48 h (E) Tratamiento aséptico de las lesiones cutáneas BIBLIOGRAFÍA Becker K, Ballhausen B, Kock R, Kriegeskorte A: Methicillin resis- tance in Staphylococcus isolates: the “mec alphabet” with specific consideration of mec, C a mec homolog associated with S. aureus lineages. Int J Med Microbiol 2014;304:794. Que YA, Moreillon P: Chapter 196, Staphylococcus aureus (includ- ing staphylococcal toxic shock). In Bennett JE, Dolin R, Blaser MJ (editors). Mandell, Douglas and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 8a. ed. Churchill Livingstone, Elsevier, 2015. Winn WC, Allen SD, Janda WM, et al. (editors): Gram-positive cocci, Part I: staphylococci and related gram-positive cocci. En: Winn WC Jr, Allen SD, Janda WM, et al. (editors). Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6a. ed. Lip- pincott Williams and Wilkins, 2006, p. 623. apter 13_Carroll_4R.indd 212 apter 13_Carroll_4R.indd 212 14/04/16 14/04/16
- 226. 213 14 Estreptococos, enterococos y génerosrelacionados C A P Í T U L O Los estreptococos, enterococos y microorganismos relaciona- dos son bacterias esféricas que forman los característicos pares o cadenas cuando crecen. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza. Algunos son miembros de las microbiotas normales del ser humano, en tanto que otros ocasionan graves enfermeda- des atribuibles a los efectos directos de la infección causada por ellos, o en otros casos, a la respuesta inmunitaria contra ellos. Los estreptococos elaboran sustancias extracelulares y enzimas. Los estreptococos constituyen un gran grupo heterogéneo de bacterias y no basta un solo sistema de clasificación para abarcarlos. Sin embargo, conocer su taxonomía es esencial para comprender su importancia en medicina. CLASIFICACIÓN DE LOS ESTREPTOCOCOS La clasificación de los estreptococos en grandes categorías se ha basado en una serie de observaciones acumuladas durante muchos años: 1) morfología de las colonias y reacciones hemo- líticas en agar sangre; 2) especificidad serológica de la sustancia de la pared celular específica de grupo (antígenos de Lancefield) y otros antígenos parietales o capsulares; 3) reacciones bioquí- micas y resistencia a factores físicos y químicos y 4) caracte- rísticas ecológicas. En fecha reciente, la genética molecular reemplazó métodos fenotípicos en la asignación taxonómica de tales microorganismos. En el cuadro 14-1 se muestra resumida la clasificación de estreptococos de importancia médica. A. Hemólisis Muchos estreptococos pueden producir hemólisis de los eri- trocitos in vitro en grados variables. La destrucción completa de los eritrocitos con el aclaramiento de la sangre alrededor del crecimiento bacteriano se denomina hemólisis β. La lisis incompleta de los eritrocitos con reducción de hemoglobina y la formación de pigmento verde se llama hemólisis α. Otros estreptococos no son hemolíticos (a veces se les denomina hemólisis γ [gamma]). En el cuadro 14-1 se muestran los patrones de hemólisis de los estreptococos que tienen importancia médica para el ser humano. Se utiliza la clasificación de los patrones hemolíticos principalmente con los estreptococos y no con otras bacte- rias que producen enfermedad y que suelen producir diversas hemolisinas. B. Sustancia específica de grupo (clasificación de Lancefield) Este hidrato de carbono está contenido en la pared celular de muchos estreptococos y constituye la base del agrupamiento serológico en los grupos de Lancefield A a H y K a U. La especificidad serológica del hidrato de carbono específico de grupo está determinada por un aminoglúcido. En caso de estreptococos del grupo A, ésta es la ramnosa-N-acetilglucosa- mina; en el caso del grupo B, es un polisacárido de ramnosa- glucosamina; para el grupo C, es la ramnosa-N-acetilgalac- tosamina; para el grupo D, es el ácido teicoico de glicerol que contiene d-alanina y glucosa; y para el grupo F, es una gluco- piranosil-N-acetilgalactosamina. Se preparan extractos de antígeno específico para el agru- pamiento de los estreptococos por diversos métodos: extrac- ción del cultivo centrifugado tratado con ácido clorhídrico caliente, ácido nitroso o formamida; mediante lisis enzimá- tica de células estreptocócicas (p. ej., con pepsina o tripsina); o mediante autoclave de suspensiones celulares. Estos extractos contienen el carbohidrato de la sustancia específica de grupo que produce antisueros específicos para reacciones de la pre- cipitina; ello permite clasificar a los estreptococos en grupos A a H y K a U. La tipificación por lo regular se hace sólo en los grupos A, B, C, F y G (cuadro 14-1), que causan enfermedad en seres humanos, y para los cuales se cuenta con reactivos que permiten tipificarlos por medio de reacciones sencillas de aglu- tinación o colorimétricas. C. Polisacáridos capsulares La especificidad antigénica de los polisacáridos capsulares per- mite clasificar S. pneumoniae en más de 90 tipos y tipificar los estreptococos del grupo B (S. agalactiae). D. Reacciones bioquímicas Las pruebas bioquímicas comprenden reacciones de fermen- tación de carbohidratos, pruebas para determinar la presencia de enzimas y pruebas de susceptibilidad o resistencia a deter- minados compuestos químicos. Las pruebas bioquímicas sir- ven muy a menudo para clasificar estreptococos después del desarrollo de la colonia y de observar las características hemo- líticas. Se utilizan las pruebas bioquímicas para especies que por lo general no reaccionan con las preparaciones de anti- cuerpos que suelen usarse para las sustancias específicas, de los grupos A, B, C, F y G. Por ejemplo, los estreptococos viridans son α hemolíticos o no hemolíticos y no reaccionan con los anticuerpos que suelen utilizarse para la clasificación de Lan- cefield. Para determinar las especies de estreptococos viridans se necesita una serie de pruebas bioquímicas. Véase el cuadro 14-1. Sin embargo, las reacciones bioquímicas son laboriosas y generan resultados poco confiables, por lo que los laborato- rios que practican técnicas moleculares, como la secuenciación apter 14_Carroll_4R.indd 213 apter 14_Carroll_4R.indd 213 14/04/16 14/04/16
- 227. 214 SECCIÓN IIIBacteriología CUADRO 141 Características de estreptococos de importancia médica Nombre Sustancia específica de grupoa Hemólisisb Hábitat Criterios de laboratorio importantes Enfermedades comunes e importantes Estreptococus piógenos Streptococcus pyogenes A β Garganta, piel Colonias grandes (> 0.5 mm), positivos a prueba de PYRc , inhibidos por bacitracina Faringitis, impétigo, infecciones profundas de tejidos blandos; bacteriemia; fiebre reumática, glomerulonefritis, choque tóxico Streptococcus agalactiae B β Vías genitourinarias, tubo digestivo bajo Hidrólisis de hipurato, positivo a factor de CAMPd Sepsis neonatal y meningitis; bacteriemia, UTIe , meningitis en adultos Streptococcus dysgalactiae subespecie equisimilis; otros C, G β (infecciones en seres humanos), α, ninguno Garganta Colonias grandes (> 0.5 mm) Faringitis, infecciones piógenas parecidas a las de estreptococos del grupo A Estreptococos viridans Grupo de Streptococcus bovis D Ninguno Colon, árbol biliar Crecimiento en presencia de bilis, hidrólisis de esculina, ausencia de crecimiento en NaCl al 6.5%, degradación de almidón Endocarditis, aislado de sangre común en cáncer de colon, enfermedad biliar Grupo de Streptococcus anginosus (S. anginosus, Streptococcus intermedius, Streptococcus constellatus) F (A, C, G) y no tipificable α, β, ninguno Faringe, colon, aparato genitourinario Variantes de colonias pequeñas