Técnica citometria de flujo

Técnica
Descripción y funciones de los componentes del aparato

Conceptos esenciales
 Fluorocromo: Molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud
de onda).
 Fluoróforo: Parte del fluorocromo responsable de la emisión de fluorescencia.
 Marcador fluorescente o sonda fluorescente: Fluorocromo diseñado para unirse a una región
específica de una muestra biológica o responder a un determinado estímulo.
 Longitud de onda de excitación: Longitud de onda a la que un fluorocromo puede absorber fotones.
 Longitud de onda de emisión: Longitud de onda a la que un fluorocromo emite fotones de
fluorescencia.

MARCAJE DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES
 Se utilizan generalmente inmunoglobulinas monoclonales de rata contra antígenos concretos en la
supercicie de las células
 Marcadas con colorantes fluorescentes verde (fluoresceina) y/o rojo (picoeritrina).
 El anticuerpo es enfrentado a las células durante media hora, luego se lava y se procesa por el
citómetro de flujo.

RUIDO CUANTICO
 Al analizar los resultados, siempre nos vamos a encontrar con una fluorescencia
inespecífica que se produce por adsorción de algunas moléculas de anticuerpo a
la superficie celular sin mediar un reconocimiento antígeno anticuerpo.
 Es preciso hacer un control negativo.
 Las muestras deben ser tratadas con un anticuerpo del mismo animal que el
utilizado para los marcajes, marcado con el mismo colorante pero que no es
específico. Se unirá por un mecanismo distinto de la unión antígeno anticuerpo
 Permite cuantificar y poder establecer el umbral por encima del cual se
considere que el resultado no se debe a inespecificidad sino a la fijación del
anticuerpo.

TECNICAS BASICAS DE MARCAJE CELULAR
ANTICUERPOS DIRECTOS.
Se utilizan anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos concretos que vienen ya marcados con el
fluorocromo en su presentación comercial.
1.- En un tubo seco colocar 100 µl de una solución celular de 10 Mc/ml (1 Mc).
2.- Controles: Añadir el anticuerpo marcado generalmente se ponen 20 µl excepto para los de ruido de
fondo que son uso 1:40 en 15 µl.
3.- Colocar los tubos en hielo picado y trasladar a nevera, incubar 30 minutos.
4.- Extraer las muestras del frio, añadir 3,5 ml de solución de Hanks.
5.-Centrifugar a 1800 rpm, descartar el sobrenadante, resuspender y añadir 500 µl de solución de Hanks.

Partes del citometro
 Sistema combinado de flujo, óptica y electrónica.
 El sistema de flujo introduce y restringe a las células
para su análisis individual.
 El sistema óptico excita la muestra y colecta las señales
de luz provenientes de la misma.
 El sistema electrónico convierte la señal óptica en una
señal electrónica y la digitaliza para el análisis en
computadora.

Sistema de flujo
 El sistema de flujo del FACS posee un capilar a través del
cual se hace pasar un líquido isotónico, a manera de una
funda, con una velocidad y presión constante
 Se hace pasar la suspensión celular, con aproximadamente
de 5 x 105 a 2 x 107 células/mL y a una presión mayor que
la del flujo acarreador.

Sistema óptico
 La fluorescencia y la luz dispersada se producen
cuando una célula contenida en el líquido
inyectado pasa por el rayo enfocado de un láser.
 La luz dispersada hacia el frente es colectada
por un detector que capta la luz difractada
entre 1 y 10º arriba o abajo del punto de
incidencia del láser.
 La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia
son colectadas por un lente que está a 90º del
eje de incidencia del láser.

 Los colorantes más utilizados:
 Fluoresceína con excitación máxima a
495 nm y emisión máxima a 520nm.
 Picoeritrina con excitación a 495 y
emisión a 576nm
 Sus características permiten utilizarlos
simultáneamente con un laser de
488nm.

Sistema eléctrico
 Para la obtención física de las poblaciones celulares, es
necesario que las células vayan en gotas aisladas para distinguir
y separar una población de otra.
 Célula atraviesa el rayo láser, se ilumina por varios
microsegundos y durante ese tiempo emite un pulso
fluorescente.
 Si este pulso cae en los límites de amplitud predeterminados, se
genera eléctricamente un pulso cargado.
 Toma en cuenta la demora que hay entre el evento de la célula
estando incidida por el láser y el lugar donde debe formarse la
gota.
 Este pulso llega a un cristal piezoeléctrico
 Se expande y contrae ligeramente cuando se aplica un voltaje y
este movimiento guía a un oscilador que hace vibrar la
estructura por donde pasa el capilar.

¿Cómo funciona?
 La suspensión celular se inyecta al flujo laminar donde las células pasan una
después de la otra a través de un capilar y llegan hasta un rayo láser.
 Cuando este rayo incide en una célula, la luz de excitación sale hacia
delante y hacia los lados de la célula y esto genera información.
 La luz dispersada hacia delante provee información sobre el tamaño de la
célula.
 La luz dispersada hacia los lados provee información sobre la granularidad,
tamaño y morfología celular.

Diseño del título y del contenido con SmartArt
 Si la célula va marcada con un fluoróforo, la luz fluorescente se procesa, a través
del fotomultiplicador.
 Los resultados son analizados por el software del citómetro.
 El FACS posee una unidad de “sorteo”
 Las células se cargan eléctricamente y las gotas resultantes se desvían al pasar a
través de un campo eléctrico.

Obtención de los datos e interpretación
 La computadora produce un histograma o un despliegue de dos parámetros a
partir de la luz dispersada por las células o a partir de la fluorescencia.

Técnica citometria de flujo

En este documento