CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO

APLICADO A INDÚSTRIA
FARMACÊUTICA/COSMÉTICOS
ASPECTOS INFORMATIVOS PARA CONHECIMENTO

Antony V. Leeuwenhoek (1632)

Robert Hooke
Pai da Microbiologia
(descobrimento das células)
(microscópico caseiro)
ATRIBUIÇÕES DO CONTROLE DE QUALIDADE
1. Desenvolver, estabelecer, modificar e treinar metodologias analíticas e operações de laboratório baseadas em referências farmacopeicas,
códex ou outras fontes de consultas, oficialmente reconhecidas, bem como em estudos internos de validação de métodos.

2. Monitorar cuidados especiais de todos os aparelhos do estabelecimento (calibrações, aferições, históricos de manutenção, métodos de
operação).

3. Determinar especificações escritas para:

- matérias-primas
- materiais de embalagem
- produtos intermediários (semi-acabados)
- produtos acabados

4. Autorizar/rejeitar o uso dos materiais do item 3 pela avaliação de todos os aspectos relativos às suas qualidades intrínsecas, manipulação,
limpeza, higiene e sanitização, bem como a conservação, identificação e armazenamento das formulações.

5. Emitir Certificados de Análise e Laudos Analíticos, bem como conferir os provenientes de fornecedores, observando sua clareza, conjunto
de dados, assinatura e identificação do responsável técnico com o respectivo número de inscrição no Conselho Profissional correspondente
(Integridade de dados).

6. Desenvolver e aplicar programas internos de auditoria, documentação e organizacionais.

ATRIBUIÇÕES DO CONTROLE DE QUALIDADE

➢ O controle de qualidade microbiológico está envolvido em todas as decisões relacionadas

a qualidade do produto; ou seja atua especificando normas, colaborando com os setores
produtivos, compra de materiais e desenvolvimento de novos produtos.

➢ A análise do controle de qualidade microbiológico dos medicamentos é de fundamental

importância, pois esse medicamento na maioria das vezes é consumido por pessoas
debilitadas e imunodeprimidas.
REGULAMENTAÇÕES
➢ Orgão Regulador: ANVISA/ Visa Local

➢ RDC 301, de 21 de Agosto de 2019 –Diretrizes Gerais de Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos.

➢ RDC 79, de 11 de Abril 2003 – Dispõe que na ausência de monografia oficial/métodos gerais inscrito na
Farmacopéia Brasileira poderá ser adotada a última edição das seguintes compêndios internacionais.

➢ Farmacopéia Alemã, Farmacopéia America (USP), Farmacopéia Britânica , Farmacopéia Européia,

Farmacopéia Francesa, Farmacopéia Japonesa e Farmacopeía Mexicana.

➢ RDC 169, de 21 de Agosto de 2006 – Incluiu a Farmacopéia Portuguesa.

➢ RE 166, de 24 de Julho de 2017 – Validação de Métodos Analíticos (Não inclui métodos

Microbiológicos).
NORMAS AUXILIARES E GUIAS
➢ Guia da Qualidade para Sistema de Tratamento de Ar e
Monitoramento Ambiental na Indústria Farmacêutica
(ANVISA).

➢ ISO 14644 – Classificação para Áreas Limpas

➢ GUIA nº 25, Laboratórios Analíticos versão 1, de 15 de

agosto de 2019 (BPL).

➢ ISO 11133 – Meios de Cultura

ATENÇÃO!!!!!!!
Na microbiologia os resultados fidedignos é algo complexo, os testes
farmacopeicos são bastante manuais e dependem muito da performance do
analista, por isso é necessário que os analistas estejam devidamente
treinados e preparados para a realização das análises.

Outro fator primordial é a amostragem que deve ser feita de forma a garantir a
representabilidade da amostra.

Por isso deve-se realizar teste e estudos para que se possa prevenir falsos
resultados negativos e/ou positivos.
TESTES PRECONIZADOS X FORMAS FARMACÊUTICA

➢ Produtos Estéreis : Teste de Esterilidade.

➢ Produtos Injetáveis: Teste de Esterilidade e Endotoxina Bacteriana.

➢ Produtos de uso nasal , oral e tópicas: Teste de Contagem de microrganismos totais

e pesquisa de patógenos.

➢ Produtos de uso oral, tópico, estéril ou injetável, com antibióticos ou vitaminas que o teor
do ativo seja analisado microbiologicamente: Doseamento microbiológico.
CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO
SETOR MICROBIOLÓGICO

ESTERILIZAÇÃO/
PREPARAÇÃO DE MEIOS DESCONTAMINAÇÃO E DOCUMENTAÇÃO
BA CTERIOTECA TESTES DE ROTINA VALIDAÇÃO
DE CULTURA /SOLUÇÕES ORGANIZAÇÃO DE TÉCNICA
MATERIAIS

MANUTENÇÃO DE CEPAS PREPARAÇÃO DE VALIDAÇÕES DE TODOS

CONTAGEM INTEGR IDADE DE D ADOS OS TESTES DO
PARA ANÁLISES D E ÁGUA MATERIAIS PARA
MICROBIANA LAB OR ATÓRIO
ROTINA ESTERILIZAÇÃO

VALIDAÇÕES GERAIS
PES QUIS A DE CONTAGEM MATERIAIS PARA INVESTIGAÇÃO (ROA/RIL) VALIDAÇÕES GERAIS
(CONTAGEM/PES QUIS A/
PATÓGENOS MICROBIANA DESCONTAMINAÇÃO
ESTERILIDADE

LOGBOOK, REGISTROS, CRIAÇ ÃO DE

PROMOÇÃO DE ENDOTOXINA PES QUIS A DE ORGANIZAÇÃO GERAL DO
ALIMENTAÇ ÃO DE ESPECIFICAÇÕES/
CRESCIMENTO BACTERIANA PATÓGENOS SETOR
PLANILHAS MÉTODOS

FERTILIDADE E
DESCARTE DE GESTOR DA QUALIDADE
ESTERILIDADE DOS ESTERILIDADE ESTERILIDADE
MEDIC AMENTOS
MEIOS

DOSEAMENTO MONITORAM ENTO REVISÃO D E POP

TEOR
MICROBIOLÓGICO AMBIENTAL

BIOB URD EN DOSEAMENTO

EFICÁCIA DE
CONSERVANTES
MEIOS DE CULTURA
 MEIOS DE CULTURA
Associações equilibrada de agentes químicos (nutriente, pH, etc) e físicos (temperatura,
viscosidade, atmosfera, etc) que permitem o cultivo de microrganismos fora do seu
“habitat” natural.
Geralmente é utilizado meio desidratado, preparado conforme orientações do fabricante.
Associações equilibrada de agentes químicos (nutriente, pH, etc) e físicos (temperatura,
viscosidade, atmosfera, etc) que permitem o cultivo de microrganismos fora do seu
“habitat” natural.
Geralmente é utilizado meio desidratado, preparado conforme orientações do fabricante.

Meios Enriquecimento, Passagem, Seletivos e Não Seletivos.

Forma líquida, semi-sólida ou sólida

PREPARO DE MEIO DE CULTURA

A água e o meio de cultura são os principais insumos para as análises do controle de

qualidade microbiológico, portanto a qualidade de ambos é essencial.
MEIO DE CULTURA – CLASSIFICAÇÃO PELA CONSISTÊNCIA
➢ Meios de cultura líquido: meios de cultura compostos constituidos por solução
aquosa em um ou mais de seus constituintes, (Ex: Caldo Macconkey) – também
chamado de Caldo.

➢ Meios de cultura semi-sólidos e sólidos: meios de cultura líquido contendo materiais

sólidos (ex: Ágar e gelatina) em diferentes concentrações. – também chamados de
placas, quando acondicionados em Placas de Petri; também chamados de tubos
inclinados.
CLASSIFICAÇÃO PELO MÉTODO DE PREPARAÇÃO
➢ Meios prontos para uso: meios de cultura em frascos prontos para o uso
(placas de Petri ou outros frascos).

Observação: Deve ser realizado a promoção/esterilidade a cada lote recebido.

CLASSIFICAÇÃO PELO MÉTODO DE PREPARAÇÃO
➢Meios de cultura preparados a partir de formulações desidratadas: meios
que devem ser re-hidratados para o uso.
MEIOS PRONTOS OU DESIDRATADOS
➢ Documentação a ser solicitada ao fabricante:
➢ Nome do meio, composição qualitativa e quantitativa, com seus respectivos
códigos;
➢ Número do lote;
➢ Valores de pH antes do uso;
➢ Condições de armazenamento;
➢ Prazo de validade;
➢ Organismo teste;
➢ Laudo de controle de qualidade;
➢ Laudo de segurança (Ficha Técnica);
➢ Duplo check (pesagem e pH).
MEIOS PRONTOS OU DESIDRATADOS
O laboratório deverá ter o seu próprio check list para o recebimento
de cada novo lote de meio de cultura. Deverá conter, no mínimo:

➢ Nome do meio de cultura;

➢ Número de lote;

➢ Data de validade (validação 30 dias / 60 dias);

➢ Condições de armazenamento.
MEIOS PRONTOS OU DESIDRATADOS
Para os meios de cultura adquiridos prontos para o uso ou a serem re-hidratados, algumas
informações adicionais devem ser monitoradas:

➢ Data da última análise de controle do meio;

➢ Etiqueta com Data da primeira vez em que o recipiente foi aberto;
➢ Inspeção visual a cada abertura do frasco.

Qualquer alteração no aspecto,

homogeneidade, mudança de cor, pH,
esterilidade ou consistência o meio deverá ser
descartado.
MEIOS PRONTOS OU DESIDRATADOS
Meios de cultura desidratados
• Água
Deverá ser utilizado água destilada ou equivalente
PREPARAÇÃO DE MEIOS

➢ Meios desidratados necessitam de uma rápida dispersão, com agitação, em alguns casos.

➢ Se o meio conter Ágar devem ser agitados por vários minutos.

➢ Para meios preparados através de componentes individuais, cada componente deve ser
adicionado separadamente e dissolvido antes de completar o volume.

➢ Observar a instrução de preparo (aquecimento, pH, autoclavação, filtração).

➢ Determinar um período após aberto de utilização (Ex: 1 ano).

PREPARAÇÃO DE MEIOS
➢ Verificação e ajuste de pH
Cada meio de cultura tem o seu valor de pH próprio;

➢Utilizar soluções:
Hidróxido de sódio 1M (Aumentar)
Ácido clorídrico 1 M (reduzir).

➢ Preparação de meios em placa de petri

No mínimo 2 mm de meio, para placas de 90 mm de diâmetro
(utilizar aproximadamente 15 mL a 20mL de meio).
PREPARAÇÃO DE MEIOS
Os meios de cultura deverão ser esterilizados
• Autoclavação. (Temperatura ou F0).

•Filtração

Membranas ou filtros com porosidade de 0,22 µm.

Os aparatos, bem como as membranas, deverão ser autoclavadas a 121 ºC, por 15 minutos
 PREPARAÇÃO DE MEIOS
➢ Meios contendo Ágar
- Fundir o meio de cultura, em microondas por aproximadamente 10 minutos.

- Aguarde até o mesmo chegar a temperatura de 45 ± 2,5 ºC.

“Durante a incubação, pode ocorre perda de meio devido a desidratação, cerca de 15% a 30% dependendo do
tipo de meio de cultura”.

(A desidratação deve ser validada conforme sua rotina de trabalho x tempo de transporte e estufas utilizadas).
CAUSAS POSSÍVEIS (ERROS) NA PREPARAÇÃO DE MEIOS
CAUSAS POSSÍVEIS NA PREPARAÇÃO DE MEIOS
PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO/FERTILIDADE MEIO DE CULTURA
PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO/FERTILIDADE MEIO DE CULTURA
PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO/FERTILIDADE MEIO DE CULTURA

Capacidade nutritiva dos meios de cultura

Deve-se inocular uma pequena quantidade de micro-organismo, inferior a 100 UFC.

Usar uma placa ou tubo para cada micro-organismo. Testar cada lote de meio de cultura interno e externo quanto a sua
capacidade nutritiva conforme descrito a seguir:

• Meio de cultura líquido: inocular menos que 100 UFC do micro-organismo teste no meio de cultura indicado. Incubar
à temperatura adequada e observar o crescimento visível comparando com um controle (branco) do mesmo meio de
cultura.

• Meio de cultura sólido: inocular cada placa contendo o meio de cultura indicado com menos que 100 UFC do micro-
organismo teste. Incubar à temperatura adequada e comparar o crescimento obtido que não deve ser inferior a 50% em
relação ao inóculo padronizado.

• Controle negativo - Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas,
na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.
PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO/FERTILIDADE MEIO DE CULTURA

O Laboratório garante a qualidade EVIDENCIANDO que:

➢ Adquir os meios de cultura e suplementos de fabricantes com sistema da gestão da qualidade.

➢ Solicitar a documentação relativa a composição e adição de suplementos; pH; condições de

armazenamento e prazo de validade; dados técnicos; dados sobre segurança e/ou riscos; certificado
de controle de qualidade.

➢ Verificar o produto no momento da recepção.

➢ Tem em atenção as condições de armazenagem e utilização e o prazo de validade.

UTILIZAÇÃO DOS MEIOS APÓS FUNDIDOS

“É ACONSELHAVÉL VALIDAR O TEMPO DE

UTILIZAÇÃO APÓS MEIOS DE CULTURA
SEREM FUNDIDOS, PARA GARANTIR QUE
SEUS COMPONENTES E SUA CAPACIDADE
PROMOTORA ESTÃO ÍNTEGROS”.
CEPAS MICROBIOLÓGICAS
CEPAS MICROBIOLÓGICAS
O termo 'cepa' se aplica igualmente a uma linhagem de
microrganismos (vírus ou bactérias) produzida em laboratório
(pode-se dizer que são clones) com a finalidade de estudos.

A coleção de microrganismos Norte americana (ATCC - American

Type Culture Collection (ATCC) é um centro de recursos biológicos
privado, sem fins lucrativos, cuja missão é voltada para a aquisição,
autenticação, produção, preservação, desenvolvimento e
distribuição de microrganismos padrão de referência, linhagens .
CEPAS MICROBIOLÓGICAS

Fornecedores

• ATCC American Type Culture

Collection http://www.atcc.org
• CIP Collection de l’Institut Pasteur http://www.pasteur.fr/ip/index.jsp
• IMI United Kingdom National Culture Collection (UKNCC) http://www.cabi.org Email:
[email protected]
• INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde Departamento de Microbiologia –
• NCIMB National Collection of Industrial Bacteria http://www.ncimb.com Email:[email protected]
• NBRC NITE Biological Resource Center http://www.nbrc.nite.go.jp Email: [email protected]
NCPF National Collection of Pathogenic Fungi http://www.hpacultures.or.uk Email:
[email protected] NCTC National Collection of Type Cultures http://www.hpacultures.or.uk
Email: [email protected] NCYC National Collection of Yeast Cultures http://www.ncyc.co.uk
Email: [email protected]

5 Passagens
EQUIVALENTE NCTC/NCPF COM OS ATCC (IMPORTANTE NA COMPRA)
MANUTENÇÃO DE CEPAS – CURTO PRAZO
MEIOS COMUMENTE UTILIZADOS

• TSB
• Caldos Nutrientes (BHI, Brucella)
• Água estéril
• Podendo ou não conter crioprotetores.
• Soluções de hidratação.

Subcultivos periódicos: cepas de enterobactérias, staphylococcus spp e Enterococcus

spp, se mantém viáveis por este método por aproximadamente 6 meses.

Óleo Mineral estéril: associado ao meio.

Sorbital para conservação /missanga (criotubo)

Ultra Freezer / Nitrogênio: meio é importante

MANUTENÇÃO DE CEPAS – LONGO PRAZO
• Liofilização
• Temperatura Ultra Baixas
• Crioprotetores – Glicerol e DMSO, 5 a 10% v/v do meio
MANUTENÇÃO DE CEPAS – LONGO PRAZO

• Liofilização
• Temperatura Ultra Baixas
• Crioprotetores – Glicerol e DMSO, 5 a 10% v/v do meio

5 Passagens
MANUSEIOS DE CEPAS - DEFINIÇÕES
➢ Cepas ATCC – subcultivadas para criar as culturas de estoque.

➢ Cultura de estoque – são subcultivadas para criar as culturas de trabalho.

➢ Cultura de trabalho – são mantidas em tubos com meio de cultura para os testes do dia
a dia.

➢ Subcultura – é 1 passagem

➢ Passagem – transferência de bactérias de uma cultura fresca para um novo meio de

cultura .

➢ Observação: Cada transferência é um subcultivo que corresponde a uma passagem.

MANUSEIOS DE CEPAS - DEFINIÇÕES
➢ Uma passagem é definida como o crescimento do microrganismo em um
meio de cutura sólido ou líquido.

➢ Ressucitar um microrganismo congelado ou liofilizado por

descongelamento ou hidratação não é considerado uma passagem.

➢ Subcultivar um microrganismo ATCC congelado ou liofilizado para fazer a

cultura estoque é considerado a primeira passagem. Os Subcultivos
subsequentes são considerados passagens.
MANUSEIOS DE CEPAS DE REFERÊNCIA
MANUSEIOS DE CEPAS DE REFERÊNCIA
MANUSEIOS DE CEPAS DE REFERÊNCIA
MANUSEIOS DE CEPAS DE REFERÊNCIA

• CEPAS ATCC comercializadas por empresas que não a própria ATCC estão em geral, a
1, 2 ou 3 passagens da cepa de referência.

• Verificar cuidadosamente o certificado do produto adquirido. Quanto menor a

passagem maior o valor agregado da cepa.

• SEMPRE verificar se a cepa adquirida foi comprada de um orgão regulado pela

farmacopéia.
IMPORTANTE!

Toda suspeita de contaminação ou mutagênese

a cepa deve ser descartada.

Toda a passagem o ideal e que se confirme a

identificação da cepa.
FONTES DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA
FONTES DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA
Os tipos de microrganismos relevantes para a fabricação e controle
farmacêutico são classificados em três grupos principais: bactérias, fungos e
vírus.

Bactérias e fungos podem existir com células únicas, ou aglomerados de

células com pouca ou nenhuma diferenciação na morfologia, função ou
ambos. Bactérias e fungos têm estrutura para se replicar.

Em contraste, vírus são menores e mais simples e dependem de sistemas

celulares procariotos ou eucariotos para a replicação.
FONTES DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA

Para atingir um bom nível de qualidade microbiana nos

produtos farmacêuticos é fundamental:

➢Que se conheçam as fontes de contaminação

➢Que se conheçam os mecanismos responsáveis por esta

contaminação.
FONTE DE CONTAMINAÇÕES
➢ Matérias primas de origem natural podem conter cargas elevadas.

➢ Instalações inadequadas,

➢ Equipamento com limpeza inadequada;

➢ Processo não validado;

➢ Particularidades de pontos críticos e procedimentos de limpeza ineficaz.

➢ Água utilizado no processo;

➢ Pessoal
FONTE DE CONTAMINAÇÕES
1- Manuseio: Pessoas sem hábitos de higiene adequadas portadores de doenças
infecciosa na linha de produção (Contaminação Pessoal ).

2- Matéria-Prima: De má qualidade, fornecedores não qualificados, empresas não

auditadas. “ A matéria-prima deve ter a qualidade comprovada”.

3- Ar: Na indústria um layout onde não há um fluxo adequado, pode haver um acumulo
de pessoas em determinados locais, portas na planta que dão diretamente em áreas
externas, podem contaminar o ar com esporos de bolores deteriorantes.

4- Uso de água de má qualidade: Pode induzir uma contaminação impactado

diretamente em todos os processos.
CONTAMINAÇÃO MICROBIANA EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS

O limite microbiano de medicamentos e insumos pode se constituir em ausência absoluta

de formas viáveis (estéreis) ou presença em grandezas definidas, restritas ou não a
determinadas cepas microbianas para produtos não estéreis.
CONTAGEM MICROBIANA
CONTAGEM DO NÚMERO TOTAL DE MICRORGANISMOS MESOFÍLICOS

Com esse teste é possível determinar o número total

de bactérias mesófilas e fungos em produtos e
matérias-primas não estéreis e é aplicado para
determinar se o produto satisfaz às exigências
microbiológicas farmacopeicas.
CONTAGEM MICROBIANA

Amostragem: 03 amostras Início processo 04 amostras meio processo 03 amostras fim

processo. “O plano de amostragem utilizado deve ser adequadamente justificado e
baseado em uma abordagem de gerenciamento de risco.”
(NBR5426 AMOSTRAGEM POR ATRIBUTOS DE QUALIDADE 1985).

Alguns produtos necessitam de adição de inativantes específicos durante o preparo

da amostra:
Amoxicilina – Penicinilase
Hidróxido de Alumínio – 0.5% Tiossulfato de Sódio
Agente espessantes, inativantes etc.
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

Transferir 10g ou 10mL da mistura de amostra para 90mL de

solução tampão ou Caldo de Caseína-soja (TSB) , TAT (Tryptone-
Azolectin-Tween) ou outro diluente adequado.

Geralmente a Contagem Microbiana parte da diluição 1/10 , salvo

as exceções para gomas que geralmente parte da diluição de 1/100
devido sua densidade (Exemplo: Gomas).
CONTAGEM MICROBIANA

“O produtos na contagem devem ser validados

conhecendo a sensibilidade dos mesmo, assim
podermos determinar a diluição a ser
empregada, técnica e agentes inativantes
avaliado os parâmetros de toxicidade e
capacidade de recuperação”.
CONTAGEM MICROBIANA
CONTAGEM MICROBIANA (TÉCNICAS)
Incubação

As placas contendo ágar caseína-soja devem ser

incubadas a um temperatura de 32,5 ± 2,5°C durante
3-5 dias e as placas contendo ágar Sabouraud-
dextrose a 22,5 ± 2,5°C durante 5-7 dias para
determinação do número de microrganismos
aeróbicos totais e bolores e leveduras,
respectivamente.
CONTAGEM MICROBIANA – ESPECIFICAÇÕES
CONTAGEM MICROBIANA – ESPECIFICAÇÕES
RESULTADOS
Exemplos de cálculos para liberação:

Diluição validada Colônias Total da contagem UFC/g ou mL

Teste Placa 01 Placa 2 Media x Diluição/Placas Resultado final

1/10 03 0 3 x 10 / 2 15 UFC
1/100 01 03 4 x 100 / 2 200 UFC
1/1000 01 0 1 x 1000 / 2 500 UFC

Observação: Se nenhum crescimento for detectado na

diluição empregada o resultado deve ser expresso menor
que a diluição.
Exemplo: < 100 UFC/g ou mL.
CONTAGEM MICROBIANA – INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
PESQUISA DE PATÓGENOS
PESQUISA DE PATÓGENOS

A pesquisa de patógenos é um método que

possibilita a verificação da presença ou ausência de
microrganismos em meios seletivos proporcionando
segurança as indústrias farmacêuticas e alimentícias
ao fornecer produtos de qualidade e que não
colocam em risco a saúde do consumidor.
PESQUISA DE PATÓGENOS
Pesquisa os microrganismos através de meios seletivos/Provas Bioquímicas:
➢ Pseudomonas aeruginosa
➢ Staphylococcus aureus
➢ Escherichia coli
➢ Salmonella sp.
➢ Candida albicans
➢ Bactéria Gram-negativa bile-tolerante
➢ Clostridium
➢ Microrganismos da Microbiota
PESQUISA DE Pseudomonas aeruginosa
PESQUISA DE S. aureus
PESQUISA DE Salmonella
PESQUISA DE E. coli
PESQUISA DE Candida Albicans
PESQUISA DE Bactérias Bile Tolerantes
PESQUISA DE Clostridium
COLORAÇÃO DE GRAM
COLORAÇÃO DE GRAM
COLORAÇÃO DE GRAM
Diferenças na parede celular

Gram-positivas Gram-negativas
COLORAÇÃO DE GRAM

Gram positivo Gram negativo

IDENTIFICAÇÃO POR PROVA BIOQUÍMICA
IDENTIFICAÇÃO POR PROVA BIOQUÍMICA AUTOMATIZADO

5 horas a 16 horas (candida albicans)

60 testes
1 rack com 10 cartões
IDENTIFICAÇÃO POR PROVA BIOQUÍMICA AUTOMATIZADO
IDENTIFICAÇÃO POR ESPECTOMETRIA DE MASSA

256 testes em aproximadamente duas horas meia (Aproximadamente 1 minuto).

Banco de Dados: De 4000 microrganismos de gêneros diferentes e aproximadamente 9000 entradas
(vários espectros diferentes de cada espécie de Microrganismo.
Podendo aumentar depois do sequenciamento dos microbiota da empresa.
ATIVIDADE DE ÁGUA
ATIVIDADE DE ÁGUA
Enquanto o teor de umidade simplesmente define a quantidade de água nos insumos e produtos, a atividade de água,
em termos práticos, é a água do insumo ou produto que vai reagir com microrganismos (e também participar de outras
reações, como as enzimáticas). Quanto mais elevada for a atividade da água, mais rápido os microrganismos (como
bactérias, leveduras e bolores) serão capazes de crescer; logo a importância da Aw está na sua relação com a conservação
do insumo e produto.
Primeiramente, preciso citar as três formas de apresentação da água nos produtos/alimentos propostas por Labuza
(1970): Água livre (disponível ou não ligada); Água adsorvida (hidratada); Água ligada.
ATIVIDADE DE ÁGUA
O crescimento e a atividade metabólica dos microrganismos precisam
de água em forma disponível. A medida mais comumente empregada
para expressar a estabilidade de um produto é a determinação do nível
de água em sua forma livre, que em alimentos, denomina-se Índice de
Atividade de Água, Aw.
Valores de atividade de água entre 0 e 0,20 indicam que a água está
fortemente ligada, enquanto valores de atividade de água na faixa de
0,70 a 1,00 indicam que a maioria da água encontra-se livre, sendo
esta passível de ser utilizada em reações químicas, enzimáticas e para
o desenvolvimento de microrganismos.
O comportamento microbiano frente à Aw quanto à disponibilidade de
água livre é extremamente variável, sendo as bactérias mais exigentes,
em relação aos fungos e as leveduras. Os alimentos de baixa atividade
de água (< 0,60) são microbiologicamente estáveis.
ATIVIDADE DE ÁGUA
Microrganismo Water Activity (aW) Molds and Yeast Water Activity (aW)

Pseudomonas aeruginosa 0.97 Rhyzopus nigricans 0.93

Bacillus cereus 0.95 Mucor plumbeus 0.92
Clostridium botulinum, Type A 0.95 Rhodotorula mucilaginosa 0.92

Escherichia coli 0.95 Saccharomyces cerevisiae 0.90

Clostridium perfringens 0.95 Paecilomyces variotti 0.84

Lactobacillus viridescens 0.95 Penicillium chrysogenum 0.83
Salmonella spp. 0.95 Aspergillus fumigatus 0.82
Enterobacter aerogenes 0.94 Penicillium glabrum 0.81
Bacillus subtilis 0.90 Aspergillus flavus 0.78
Micrococcus lysodekticus 0.93 Aspergillus niger 0.77

Zygosachharomyces rouxii
Staphylococcus aureus 0.86 0.62
(osmophilic yeast)

Halobacterium halobium(halophilic Xeromyces bisporus

0.75 0.61
bacterium) (xerophilic fungi)
ATIVIDADE DE ÁGUA

Produtos farmacêuticos com atividades de água bem abaixo de 0,75 (por exemplo,
comprimidos de compressão direta, pó e cápsulas cheias de líquido, produtos líquidos não
aquosos, pomadas e supositórios retais) seriam excelentes candidatos para teste de limite
microbiano reduzido para liberação de produto e avaliação de estabilidade. Isso é
especialmente verdadeiro quando os produtos farmacêuticos são feitos de ingredientes de
boa qualidade microbiana, quando os ambientes de fabricação não promovem a
contaminação microbiana, quando há processos que reduzem inerentemente o conteúdo
microbiano, quando a formulação do medicamento tem atividade antimicrobiana e durante
a fabricação as unidades têm um histórico de teste estabelecido de baixa carga biológica
associada a seus produtos.
ATIVIDADE DE ÁGUA
A atividade de água e extremamente importante em todas
as etapas do processo de produção dos
medicamentos/alimentos, passando desde o recebimento,
desenvolvimento Farmacotécnico/analítico, até a
estabilidade final do medicamento (Pois influencia de
forma direta na conservação até a deterioração dos
medicamentos/alimentos.
TESTE DE ESTERILIDADE
.
TESTE DE ESTERILIDADE
.
Os testes de esterilidade aplicam-se a insumos
farmacêuticos, medicamentos e produtos para
saúde que, de acordo com a Farmacopeia,
devem ser estéreis, sendo adequados para
revelar a presença de bactérias e fungos.
TESTE DE ESTERILIDADE - AMOSTRAGEM
TESTE DE ESTERILIDADE - AMOSTRAGEM

Tamanho do lote / volume do frasco / número

de frasco.

Ex. lote > 500un / < 100ml / = 20un

TESTE DE ESTERILIDADE – MÉTODOS DE ANÁLISE

➢ Inoculação Direta

➢ Inoculação Indireta (filtração em membrana)

Sistema Fechado Sistema Aberto

TESTE DE ESTERILIDADE – MÉTODOS DE ANÁLISE
Meios de Cultura :

➢ Caldo Tioglicolato,
➢ Caldo Casoy ( TSB) ,
➢ Fluído A, D ou K

PESQUISA MEIO TEMPERATURA

BACTÉRIAS CALDO TIOGLICOLATO 30 – 35°C
FUNGOS E LEVEDURAS CALDO CASEÍNA SOJA 20-25°C

14 DIAS DE INCUBAÇÃO
TESTE DE ESTERILIDADE – PROMOÇÃO DOS MEIOS
SISTEMA ABERTO
✓ Inoculação direta
Inocula-se a MP ou produto diretamente aos meios de cultura.
5 a 7 dias realiza-se a transferencia de 100uL para outros tubo contendo os meios utilizados.
SISTEMA ABERTO
✓ Filtração por Membrana

Membrana 0.45u estéril

SISTEMA FECHADO

Membrana 0.45µ estéril

 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
➢ Meio límpido após os 14 dias de incubação – Produto estéril

➢ Meio turvo após os 14 dias de incubação – Produto não estéril Investigação / Identificação / Reteste (
dobro de amostras inicial)

➢ Validação Bacteriostase e Fungistase

Para Filtração por Membrana a quantidade de fluido de lavagem utilizada não deve, ser superior a cinco porções
de 200mL.

Observação: Se o crescimento de microrganismo não e obtido na presença da amostra, ou se ele não

visivelmente comparável aquele obtido nos controle positivos, a amostra apresenta atividade antimicrobiana que
não foi satisfatoriamente eliminada. Nesses casos, devem ser feitas modificações no teste para eliminar a
atividade antimicrobiana, tais como diluição, uso de substâncias neutralizantes, aumento do número de lavagens
ou uma combinações delas. O teste de validação deve ser repetido para verificar se atividade antimicrobiana foi
eliminada pela modificação proposta.
FLUXOGRAMA PARA O TESTE DE ESTERILIDADE
MÉTODOS AUTOMATIZADOS PARA TESTE DE ESTERILIDADE

➢ 120 testes
➢ 240 testes
Podendo aumentar dependo da quantidade de gavetas adquiridas
MÉTODOS AUTOMATIZADOS PARA TESTE DE ESTERILIDADE
TESTE DE ENDOTOXINA BACTERIANA
TESTE DE ENDOTOXINA BACTERIANA
Toda primavera, guiados pela lua cheia, centenas de milhares de carangueijos-ferradura se rastejam pelas praias do
Atlântico dos EUA para pôr seus ovos.

Para as empresas farmacêuticas, é um recurso crucial para tornar os medicamentos humanos seguros.

Isso ocorre porque o sangue azul leitoso desses crustáceos fornece a única fonte natural conhecida como lisado de
amebócitos do limulus (LAL), uma substância que detecta um contaminante chamado endotoxina.

“Todas as empresas farmacêuticas ao redor do mundo dependem desses caranguejos. Quando refletimos sobre isso,
nossa cabeça fica abismada com a dependência que temos dessa criatura primitiva”,

Alimentam-se de moluscos, vermes e outros invertebrados. Seu habitat são as águas marinhas costeiras rasas, sobre
fundos arenosos areia e lodosos. Um variante japonês (Tachypleus tridentatus) pode ser encontrado em alguns mares,
mas é considerada uma espécie sob risco de extinção devido à perda do habitat.
TESTE DE ENDOTOXINA
Determinação da presença de endotoxinas bacterianas (bioprodutos
causadores de febre provenientes de bactérias gram-negativas),
obrigatório para produtos injetáveis.
Forma mais simples, rápida e precisa. Usa-se um derivado do lisado de
amebócito do caranguejo Limulus polythemus, conhecido como L.A.L,
específico para determinação qualitativa de endotoxinas.
O método baseia-se na reação entre a endotoxina e um componente protéico
do L.A.L, produzindo um gel opaco facilmente reconhecido
TESTE DE ENDOTOXINA – MÉTODOS DISPONÍVEIS
➢ Métodos disponíveis INVITRO

• Ponto Final de Gelificação

• Ensaio Turbidimétrico

• Teste Colorimétrico

➢ Métodos disponíveis INVIVO

•Coelhos
GEL CLOT
Ponto Final de Gelificação
Mais simples e mais usado, baseia-se na formação de gel em presença de
endotoxina.
Volumes de 0,1ml de Lisado e 0,1ml da diluição da amostra são transferidos
para o tubo teste, e incubado a 37C ± 1,0C durante 60 minutos.
GEL CLOT
Teste de Sensibilidade do LAL

Realizar a cada lote novo.

Realizar em quadruplicata.
Cinco concentrações
Lambda (٨ concentração do LAL) variar 2 ٨ a ¼٨.
Ex. ٨ = 0,125EU/mL
0,50 0,25 0,125 0,06 0,03mL
A sensibilidade do LAL deve estar na metade ou 2 vezes lambda.
GEL CLOT
Interpretação dos Resultados

Formação de Gel – Presença de Endotoxina

Realizar teste de quantificação e reteste.

Não Formação de Gel – Ausência de Endotoxina Bacteriana

MDV (MÁXIMA DILUIÇÃO VÁLIDA)
ENSAIO COLORIMÉTRICO
Teste quantitativo de endotoxina, semelhante ao método turbidimétrico, é baseado
na observação de que concentrações crescentes de endotoxina irão precipitar
proporcionalmente a proteína doreagente L.A.L, formando o coagulogênio, que
será quantificado pelo método colorimétrico.

Alíquotas iguais da amostra e do lisado são misturados e incubados por 1 hora e então
centrifugados 1375 x g por 10 minutos. O sobrenadante é então removido do
precipitado por aspiração a vácuo.

Utiliza-se um espectrofotómetro com leitura a 660nm, para quantificar os resultados

frente a uma curva padrão.
MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – PTS ENDOSAFE
MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – PTS ENDOSAFE

Cartucho PTS
MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – PTS
ENDOSAFE

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

CV = < 25%
CV entre as amostras = < 25%
SPIKE de recuperação = Entre
50% A 200% Tempo de reação.
MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA – TURBIDIMETRIA

Superior a técnica colorimétrica, o mesmo se baseia na medição da turbidez da

amostra.
 MÉTODO AUTOMATIZADO RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE
ENDOTOXINA – BIOTEK

TÉCNICA TURBIDIMÉTRICA - INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

CV Amostra = < 20%

CV Controle Positivo = <
10% Coeficiente de
correlação = > 0,98
% Recuperação Spike = 50 a 200%

“Agora será cobrado a análise de tendência de produto, onde você vai

verificar a tendência de endotoxina ao longo de vida do produto, ou seja o
que esta fora da sua normalidade e não somente do produtos fora da
especificação”.
TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO

O teste´´ in vivo´´ envolve medir o aumento de temperatura retal de coelhos após a injeção
intravenosa do produto em teste.

É usado para produtostolerados por essas cobaias em doses inferiores a 10ml/kg por
período máximo de 10 minutos.

O procedimento descrito na Farmacopéia Brasileira recomenda o uso de coelhos de ambos os

sexos , adultos e sadios.Os animais devem ser mantidos em gaiolas individuais em sala de
temperatura climatizada (20±2C) e livre de pertubações que os possam excitar.

Obtido resultado negativo no teste de pirogênio, pode-se usar o mesmo animal após 48h.

Quando o teste for positivo, não se usam os mesmos animais por duas semanas.
TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO
O ensaio de pirogênio em coelhos, embora seja utilizado
quando a metodologia do LAL não é aplicada, ainda é
mantido porque tem a seu favor a situação do
envolvimento de toda a reação fisiológica do animal,
constituindo um teste de segurança para os produtos
injetáveis, líquidos para infusão e perfusão, materiais
cirúrgicos e descartáveis em geral.
DOSEAMENTO (TEOR) MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO (TEOR) MICROBIOLÓGICO

É a quantificação da substância ativa frente a um padrão biológico de referência.

O ensaio microbiológico para determinação da potência dos antibióticos é indicado para

substâncias ou preparações , em que o seu teor não pode ser definido por métodos
físico-químicos.

“A atividade (potência) dos antibióticos pode ser demonstrada sob condições

específicas através de seu efeito sobre o crescimento de microrganismo-padrão
sensível.”

Ensaios: Turbidimétricos e Difusão em Ágar

DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Dois fenômenos ocorrem simultaneamente:

1. Difusão do antibiótico
2. Crescimento microbiano Resultando na zona de inibição de crescimento
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – RELAÇÃO DOSE RESPOSTA
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – DIFUSÃO EM ÁGAR
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – FATORES DE INFLUÊNCIA

➢ QUANTIDADE DO INÓCULO;
➢ MEIO DE CULTURA – COMPOSIÇÃO E pH;
➢ MEIO DE CULTURA, MICROORGANISMO E
INÓCULO;
➢ FORMA DE APLICAÇÃO;
➢ FORMA DE EXTRAÇÃO;
➢ LEITURA;
➢ PRÉ DIFUSÃO E PRÉ INCUBAÇÃO
➢ TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO;
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – FATORES DE INFLUÊNCIA
ESPESSURA DO ÁGAR

➢ Monocamada: Meio Base

➢ Bicamada: Meio Base mais meio superfície

DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – FATORES DE INFLUÊNCIA
DISPOSITIVO DAS APLICAÇÕES DAS SOLUÇÕES
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – FATORES DE INFLUÊNCIA
DISPOSITIVO DAS APLICAÇÕES DAS SOLUÇÕES
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – FATORES DE INFLUÊNCIA
INCUBAÇÃO – TEMPO E TEMPERATURA
LEITURA DOS HALOS DE INIBIÇÃO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO

É a quantificação da substância ativa frente a um padrão

biológico de referência.
O ensaio microbiológico para determinação da potência
dos antibióticos é indicado para substâncias ou
preparações , em que o seu teor não pode ser definido
por métodos físico-químicos.
Tipos de Ensaios: Turbidimétricos e Difusão em Ágar
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Regressão: Análise de regressão é um método estatístico que permite examinar a relação
entre duas ou mais variáveis. Deste modo, identifica quais têm maior impacto diante de
um tema de interesse.

Linearidade: A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados

linearmente proporcionais à concentração do analito, enquadrados em faixa analítica
especificada.

Paralelismo: O critério adotado é a avaliação do paralelismo entre as curvas relativas ao

analito.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Doseamento 2x2
Ensaio simétrico ou balanceado.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Doseamento 2x2
Ensaio simétrico ou balanceado.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Doseamento 2x2
Ensaio simétrico ou balanceado.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO

Doseamento 2x2
Ensaio simétrico ou balanceado.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Doseamento 3x3
Ensaio simétrico ou balanceado.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Doseamento 3x3
Ensaio simétrico ou balanceado.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Doseamento 3x3
Ensaio simétrico ou balanceado.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Doseamento 3x3
Ensaio simétrico ou balanceado.
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
Na USP utiliza o delineamento 5X1, em que as concentrações do padrão devem
aumentar em progressão geométrica e a mediana servir como de referência
(interpolação em curva padrão).
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO
MONITORAMENTO
AMBIENTAL
MONITORAMENTO AMBIENTAL
➢Objetivos

➢Contaminações

➢Especificações

➢Amostragem

➢Resultados

➢Conduta

➢Treinamento
OBJETIVOS
Avaliar periodicamente as diversas áreas produtivas (estéreis e não estéreis), nas suas rotinas de
limpeza, desinfecção e trabalho, abordando três pilares:

➢Ambiente;
➢Superfície;
➢Pessoas;

A eficiência dos procedimentos e integridade dos sistemas físicos das instalações (ventilação, diferencial
de pressão, etc.).

Através desses dados você verifica a qualidade microbiológica do ambiente se e estável e o nível ou tipos
de organismos no ambiente produtivo, assim se determinar o perfil microbiológico da área, considerando
essencialmente a susceptibilidade de contaminação dos medicamentos nela fabricados.
CONTAMINAÇÃO MICROBIANA

QUE SÃO MICRORGANISMOS?

CONTAMINAÇÃO MICROBIANA
Os Microrganismos são uma forma de vida extremamente pequena que
não pode ser visualizada sem auxílio de um microscópio.
IDENTIDADE DOS MICRORGANISMOS

➢ Só conhecemos em torno de 10% dos microrganismos existentes no planeta!

➢ Grande parte não é sequer detectada pelos métodos atuais.

➢ Fisiologia dos microrganismos (metabolismo e nutrição)

➢ Estudo dos genes/sequenciamento

➢ VBNC: Viáveis e não-cultiváveis

QUAL A PRINCIPAL FONTE?
Podem vir de diversas fontes como o ser humano, água, solo, alimentos, ar, etc.
SER HUMANO!!!!
DADOS DO SERES HUMANOS EM ÁREAS

80 a 90% da contaminação por partícula tem origem dos

profissionais que trabalham ali;

Liberação de células mortas da pele e cabelo;

Cada pessoa libera uma camada completa de células a cada 1 a 2

dias, acima de 5μm.
MONITORAMENTO AMBIENTAL
O QUE MONITORAR:

➢ Partículas viáveis
❖Ar ativo
❖Ar passivo

➢ Placas de Contato (Superfície), chão, parede, bancada, cortina do fluxo.

➢ Swabs (equipamentos).

➢ Luvas e Uniformes.
MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS
Devem ser realizados testes de esterilidade e fertilidade dos
meios para garantir a qualidade dos métodos empregados,
pois influência na capacidade técnica para recuperar
organismos viáveis.
As placas devem possuir embalagens triplas, com sílica.
MEIOS DE CULTURA

Fornecem componentes indispensáveis para o crescimento microbiano, no

Monitoramento Ambiental usamos:

➢TSA (Tryptic Soy Agar): Meio de cultura universal onde diversas formas de
microrganismos se desenvolvem usado para o monitoramento do ar.

➢MCTA (Microbial Content Test Agar): Meio de cultura contendo ou não inativantes de
sanitizantes/produtos usado para o monitoramento de superfícies (chão, parede,
bancadas, (Luvas/Uniformes), etc...
AMOSTRAGEM DO AR
Realizada de duas maneiras:

Amostragem Ativa: Amostrador de ar (Quantitativa);

➢Amostragem Passiva: Placa Exposta (Qualitativa);

ESCOLHA DO SISTEMA DE TRATAMENTO DE AR ADEQUADO

AMBI EN TE DE PR ODUÇÃO
(BPF)

PROTE ÇÃO DOS PROTE ÇÃO DO

PROTE ÇÃO DO PRODUT O
OPERADORE S AMBI ENTE

CONTAMI NAÇÃO PRE VI NE CONT AT O COM

E VIT A DES CAR TE DE PÓS
PRODU TOS/OPERADORE S PÓS

PROTE ÇÃO DO PRODUT O

CON TRA PRE VI NE O CONT AT O E VIT E D ESCART E D E
CONTAMI NAÇÃO COM FU MAÇA FU MAÇA
CRU ZADA

CORRE TAS
CONDIÇÕE S DE E VIT A DES CAR TE DE
TE MPE RATU RAS E
CONFOR TO ACEI TÁVEIS E FLU EN TE S
U MID ADES

SIS TE MAS

VALIDAÇÃO DOS
SIS TE MAS
 AMOSTRAGEM DE SUPERFÍCIE
Swab: para superfícies irregulares ou que entre em contato com o produto, transferindo
possíveis contaminantes de uma superfície para um meio no qual eles possam ser
enumerados.
AMOSTRAGEM DE SUPERFÍCIE
Placas de contato (RODAC): para superfícies planas/lisas que não
entre em contato com o produto.
PESSOAS

Luvas
uniformes

➢Luvas: são amostradas as luvas dos colaboradores durante o processo de fabricação e de todos aqueles que interferirem
no processo produtivo (mecânicos, eletricistas, farmacotécnico, validação, etc.);

➢Os colaboradores devem pressionar LEVEMENTE as pontas dos dedos na superfície do meio de cultura com cuidado para
não sobrepor o toque;
COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÃO
FREQUENCIA DE AMOSTRAGEM
FREQUENCIA DE AMOSTRAGEM
ESPECIFICAÇÕES
INVESTIGAÇÕES E AÇOES CORRETIVAS E PREVENTIVAS (CAPA)

❖ Limite de Alerta e Limite de Ação devem ser estabelecidos.

➢ Limite de Alerta não requer necessáriamente uma ação,

serve para observar que algo está saindo for a da tendência.
Observação: Salas novas considerar 50% para limites de alerta

➢ Limite de Ação requer uma intervenção e ação de imediato para

impedir que a contaminação chegue na especificação.
Observação: Semelhantes as salas pré-existente.
PONTOS DE AMOSTRAGEM
DESENVOLVIMENTO DE UM PROGRAMA DE MONITORAMENTO
AMBIENTAL

❖ Comitê Multidisciplinar :
➢Regulatórios;
➢Garantia da Qualidade;
➢Engenheiro de manutenção;
➢Arquiteto;
➢Produção;
➢Controle de Qualidade;
➢Validação (Pesquisa e Desenvolvimento)
DESENVOLVIMENTO DE UM PROGRAMA DE MONITORAMENTO
AMBIENTAL

Definir itens como:

➢Programação (agendar reuniões mensais, semestrais e anuais);

➢Definição de pontos críticos;
➢Análise de risco (tudo que não é feito tem que ter a análise de risco);
➢Fluxo Operacional;
➢Determinação dos requisitos de espaços;
➢Arquitetura;
➢Sistema ambientais;
➢Aspectos regulatórios;
➢Resultados fora da especificação, etc...
DESENVOLVIMENTO DE UM PROGRAMA DE MONITORAMENTO AMBIENTAL

O uso de um programa formal de análise de risco está se

tornando cada vez mais frequente, no sentido de garantir um
programa de monitoramento seja bem fundamentado.

O uso de avaliação de risco pode ser benéfico na indicação de

locais a serem monitorados e também métodos apropriados para
recuperar potenciais contaminantes.
INCUBAÇÃO E LEITURA

➢Todo o material coletado na produção é levado para o Controle Microbiológico

incubado em estufas durante cinco dias: sendo três dias a 20 à 25°C; dois dias a 30 a
35°C e três dias a 20 à 25°C;

➢Após o período de cinco dias as placas são lidas com auxílio do contador de colônias,
os resultados são anotados no anexo de cada POP .
NÍVEIS DE PROTEÇÃO PARA PRODUTOS NÃO ESTÉREIS EM DIFERENTES
ÁREAS

GERAL
Áreas Gerais com organização e manutenção normais onde não há risco de contaminação do produto.
Ex.: Almoxarifado.

PROTEGIDA
Área protegida na qual são tomadas precauções para proteger as matérias-primas ou produto de
contaminação direta ou indireta ou degradação.
Ex.: Embalagem secundária, primeiro estágio de troca de roupas.

CONTROLADA
Área controlada em que condições ambientais estão definidas, controladas e monitoradas para previnir
contaminação ou degradação de matérias-primas ou produtos.
Ex: Ambientes em que há exposição das matérias-primas, componentes ou produto ao ambiente, assim
como áreas de lavagem de equipamentos que tem contato com o produto.
DESCONTAMINAÇÃO
Todo material gerado no monitoramento após leitura e preparo
devem ser:

Armazenado em sacos Detrilab (sacos exclusivos para

esterilização/descontaminação, não encher mais de 1/4);

Descontaminado em autoclave por calor úmido 121ºC por 15-30

minutos ou até mesmo 1 hora, dependo da validação do
equipamento.
HIGIENE PESSOAL
➢A falta de higiene pessoal é um dos principais fatores de
contaminação;
➢Lavar as mãos várias vezes durante o horário de trabalho;
➢Manter a unhas sempre bem limpas e preferencialmente
curtas;
➢Realizar a troca das luvas sempre que perceberem furos ou
mesmo que íntegras estiverem usando por tempo muito longo;
➢Sanitizar bem as luvas com álcool 70% de tempos em
tempos;
HIGIENE PESSOAL
HIGIENE PESSOAL (LAVAGEM DE MÃOS)
CONDUTA PESSOAL
➢Nunca comer, beber, mascar, fumar nas áreas produtivas;

➢Sempre usar máscaras e óculos de proteção como forma de se proteger e também não
contaminar os produtos;

➢Manter sempre a área limpa e imediatamente após o término do trabalho, ou quantas

vezes determinar o procedimento, o chão, as paredes, o teto e as estruturas auxiliares
devem ser limpos e sanitizados cuidadosamente;

➢As portas de acesso as áreas em contato com os produtos devem ser abertas o mínimo
possível para evitar entrada de “ar sujo”;
EQUIPAMENTOS

➢Devem ser de material resistente, de fácil limpeza e adequado

para cada produto, para que se evite qualquer tipo de
contaminação.

➢Antes do uso para produção os mesmos devem estar

devidamente limpos e identificados.
 LEMBRETE!!!!!!!!!!!

VOCÊ É O GRANDE RESPONSÁVEL

PELA QUALIDADE DOS
MEDICAMENTOS PRODUZIDOS!
REFERÊNCIAS

-GUIA. Qualidade para Sistemas de Tratamento de AR e Monitoramento Ambiental na Indústria Farmacêutica.

Março de 2013.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 301, de 21 de agosto de
2019.
- BRITISH Pharmacopoeia. London: The Stationary Office, 2020.
-EUROPEAN Pharmacopoeia. Council of Europe, 2020.
-ISO14698.Cleanrooms and assoiated controlled environments.
- FARMACOPÉIA Brasileira. 6 ed. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília-DF, Editora Fiocruz, 2019.
Aprovada pela RDC nº 49 de novembro de 2010.
- PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A.F. Controle Biológico de Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos
e Cosméticos. 3ª ed. São Paulo, Atheneu Editora São Paulo Ltda, 2010.
- UNITED States Pharmacopeia. NF 33. Rockville, Maryland, 2020
DÚVIDAS
MICROBIOLOGIA DA ÁGUA
INTRODUÇÃO

A água é, sem dúvida, a matéria-prima de mais

elevado volume empregada, considerando de
forma global a produção farmacêutica, de
biotecnologia, de correlatos e de cosméticos.
INTRODUÇÃO
O processo de purificação da água para uso farmacêutico é baseado na
eliminação de impurezas físico-químicas, biológicas e microbianas até se
obterem níveis preestabelecidos em compêndios oficiais aprovados pelas
autoridades sanitárias.

O controle da contaminação da água para uso farmacêutico é

fundamental, uma vez que a água tem grande susceptibilidade para
agregar compostos diversos e para sofrer recontaminação, mesmo após a
etapa de purificação.
SISTEMA DE TRATAMENTO DE ÁGUA
1. Captação
A água é captada em rios e mananciais, ainda com resquícios de sujeira e bactérias.
2.Adução
Por meio de bombas, leva a água captada até a ETA.
3.Coagulação
Consiste na adição de sulfato de alumínio à água captada. Esse produto favorece a
união das partículas e impurezas da água, facilitando a remoção na decantação
4. Floculação
Etapa na qual a água é submetida à agitação mecânica, para que as impurezas
formem flocos maiores e mais pesados.
5. Decantação
Nos tanques de decantação, os flocos de impureza afundam e são separados do
restante do líquido.
6. Filtragem
Filtros formados por camadas de areia grossa, areia fina, cascalho, pedregulho e
carvão promovem a completa remoção dos últimos flocos de resíduos.
7. Desinfecção
Água recebe adição de cloro, flúor e controle do PH.
8. Reservação
A água filtrada e tratada na ETA é armazenada em reservatórios para ser distribuída
para a empresa/cidade.
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS
➢ A validação dos sistema de água se passa por três fase:

➢ Fase 1: Planos de amostragem / relatório qualificação de desempenho

( Micro e FQ) durante 15 dias.

➢ Fase 2: Planos de amostragem / relatório qualificação de desempenho

( Micro e FQ) durante 15 dias.

➢ Fase 3: Planos de amostragem / relatório qualificação de desempenho

( Micro e FQ) durante 11 meses.

➢ Conclusão: relatório de monitoramento / tendência / análise estatística.

PRÉ TRATAMENTO

➢A água de alimentação tem características e diferenças

regionais;

➢Deve-se conhecer a água de alimentação;

➢Instalação de componentes e acessórios para melhor proteger

o sistema de geração.

➢Toda intervenção deve ser aberto um controle de mudança e

avaliado por comitê multidisciplinar avaliando a necessidade de
requalificação ou não do sistema.
TIPOS DE ÁGUA

➢ Água Potável
➢ Água Purificada (AP ou PW)
➢ Água para injetáveis ( API ou WFI)
➢ Água Ultrapurificada
ÁGUA POTÁVEL

➢ Tipo de água comumente usado pela indústria farmacêutica, cosméticos e de correlatos.

➢ E mencionada na farmacopeia USP para etapas inicias de limpeza de equipamentos;

➢ E utilizada como água de origem para purificação subsequente;

➢ PORTARIA Nº 2.914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011 (REVOGADA)

Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e
seu padrão de potabilidade. “Art. 24. Toda água para consumo humano, fornecida coletivamente, deverá
passar por processo de desinfecção ou cloração”.

Portaria de Consolidação nº 5 DE 28/09/2017

PORTARIA DE CONSOLIDAÇÃO Nº 5 Consolidação das normas sobre as ações e os serviços de saúde do
Sistema Único de Saúde.
ÁGUA POTÁVEL
A boa notícia é que esses padrões não foram alterados. As
normas às quais os especialistas estão acostumados são as
mesmas, e isso mantém o padrão de escalabilidade e
produção a que as empresas estão habituadas.

A mudança mais significativa foi no prazo estipulado para

que as empresas atinjam o valor máximo para filtração da
água. Antes, elas tinham 24 meses para chegar ao valor de
0,5 uT (Unidade de Turbidez) para filtração rápida. Agora,
esse prazo não existe mais.
ÁGUA PURIFICADA
➢ÁGUA PW OU AP

- É produzida a partir da água potável ou da água reagente e

deve atender as especificações estabelecidas em monografia.

- Uso em produtos não parenterais;

- Largamente usada em produtos tópicos e orais, assim como

nos processos de granulação de comprimidos e cápsulas.
ÁGUA PURIFICADA
É obtida por uma combinação de sistemas de
purificação, em uma sequência lógica, tais como
múltipla destilação; troca iônica; osmose reversa;
eletrodeionização; ultra filtração, ou outro processo
capaz de atender, com eficiência desejada, aos
limites especificados para os diversos
contaminantes.
ÁGUA PURIFICADA

Consiste em água com grau de pureza

internacionalmente reconhecido (Farmacopeia USP /
FBVI).

E usada também na obtenção da água para injeção e

vapor limpo grau farmacêuticos. O seu limite de ação
e de 100 UFC/mL.
ÁGUA PURIFICADA

De forma genérica, pode-se dizer que os métodos mais

comuns e confiáveis para obtenção de água purificada (AP
ou PW) são a troca iônica, a osmose reversa e a
ultrafiltração.
ÁGUA PARA INJETÁVEIS

É a água de mais alta qualidade usada pela indústria

farmacêutica.
Utilizada como excipiente na preparação de
produtos farmacêuticos parenterais de pequeno e
grande volume, na fabricação de princípios ativos de
uso parenteral, de produtos estéreis , demais
produtos que requeiram o controle de endotoxinas.
ÁGUA PARA INJETÁVEIS

Para obtenção de água para injetáveis (API

ou WFI) utiliza-se o processo de destilação
ou outro método de tecnologia igual ou
superior a esta. Deve ser fabricada em
tubulação de aço inox AISI 316L, vidro
neutro ou quartzo alternativamente.
ÁGUA PARA INJETÁVEIS

A água para injetáveis deve atender aos ensaios

físicos químicos preconizados para a água
purificada, além dos testes de contagem total de
bactérias < 10 UFC/100mL, esterilidade,
particulados e de endotoxinas bacterianas, cuja o
valor mínimo é de 0,25 UI de endotoxina/mL.
ÁGUA ULTRAPURIFICADA

Á água ultrapurificada possui baixa

concentração iônica, baixa carga
microbiana e baixo nível de COT. Essa
modalidade de água é requerida em
aplicações mais exigentes, principalmente
em laboratórios de ensaios
ÁGUA ULTRAPURIFICADA
É ideal para métodos de análise que exigem mínima
interferência e máxima precisão e exatidão como: análises
de resíduos, dentre eles traços de resíduos de elementos
minerais, endotoxinas, preparações de calibradores,
controles, substâncias química de referência,
espectrofotometria de massas, cromotografia líquida de
alta eficiência (HPLC), métodos de biologia molecular,
cultivo celular etc.
ESPECIFICAÇÕES
ESPECIFICAÇÕES
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS DO SISTEMA

➢ As especificações do sistema de Pré – tratamento dependerão das análises

da água potável.

➢ Histórico analítico de 1 ano dos principais parâmetros;

➢ Melhorar o desempenho dos equipamentos e da qualidade da água gerada;

➢ Início ao combate do BIOFILME.

CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS
SISTEMA ULTRAVIOLETA
➢Comprimento de onda 100 a 400nm

➢Efeito germicida entre UV – B e UV – V ou 254nm –

Ação contra bactérias, fungos, vírus..., Ação direta
sobre o núcleo celular, impede a replicação do DNA.

➢Comprimento de onda 185nm – Nova opção

para remover o cloro. Decomposição de
orgânicos por FOTO-OXIDAÇÃO.
ULTRAVIOLETA
METODOS PARA PURIFICAÇÃO DA ÁGUA

➢Especificação da Qualidade de água;

➢A qualidade de água de alimentação;

➢ Alterações sazonais;

➢A confiabilidade da Robustez;
PONTOS A SEREM CONSIDERADOS

➢Risco de contaminação;

➢O sistema deve permitir a sanitização;

➢Resistência à corrosão

➢Pontos de amostragens.
DESTILAÇÃO

➢Destilação ou osmose reversa;

➢A alimentação deve ser através de um ponto de uso do

anel da água purificada ou direto da geração da água
PW.
DESTILAÇÃO
RECIRCULAÇÃO

➢ Manter o sistema em movimento contínuo.

➢ Manter a qualidade de água gerada.

➢ Válvulas de amostragens sanitárias.

MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

➢ MÉTODOS CONVENCIONAIS – FILTRAÇÃO E POUR PLATE –

RESULTADOS 72 HORAS ( APROXIMADAMENTE 3 DIAS)

➢ MÉTODO RÁPIDO - BIOLUMINESCÊNCIA DO ATP –

FILTRAÇÃO – RESULTADOS EM 16 HORAS

EXEMPLO DE BIOLUMINESCÊNCIA

MÉTODOS CONVENCIONAIS – FILTRAÇÃO E POUR PLATE –

RESULTADOS 72 HORAS

MÉTODO RÁPIDO - BIOLUMINESCÊNCIA DO ATP –

FILTRAÇÃO – RESULTADOS EM 16 HORAS
MÉTODO RÁPIDO
FORMAÇÃO DE BIOFILME

➢PARTÍCULAS

➢BACTÉRIAS

➢RUGOSIDADES NAS SUPERFÍCIES

 TIPOS DE BACTÉRIAS

➢PLANTÔNICAS – FLUTUAM
Seres planctônicos: não possuem órgãos de locomoção ou os têm
rudimentares, sendo arrastados pela correnteza

➢SÉSSEIS - FORMAM BIOFILMES (NÃO DETECTÁVEIS)

As Células sésseis são componentes de microrganismos que se aderem a
uma matriz e resultam em uma comunidade bacteriana fisiologicamente
integrada e aderida à superfície chamada de biofilme.
FORMAÇÃO E ACUMULAÇÃO DE BIOFILMES

❑ PLANTÔNICAS - FLUTUAM

❑ SÉSSEIS - FORMAM BIOFILMES ( NÃO DETECTÁVEIS)

 FORMAÇÃO E ACUMULAÇÃO DE BIOFILMES

1- Adesão inicial: Quando há acúmulo de nutrientes na superfície, esta sofre alterações físico-químicas que favorecem a
colonização e o acúmulo de microrganismos começa a ocorrer no local;

2- Adesão irreversível: Conforme o tempo passa, essa adesão inicial torna-se irreversível devido a interações/ligações mais
fortes com as substâncias previamente acumuladas na superfície – matriz EPS;

3- Desenvolvimento da arquitetura do biofilme: As bactérias formam colônias, pois continuam se multiplicando e formando
matrizes de exopolissacarideos (EPS) que protegem a colônia de ações externas. A formação de EPS contribui para o
fortalecimento da ligação entre a bactéria e o substrato, proporcionando o desenvolvimento da arquitetura do biofilme.

4- Maturação: Nesta fase há formação de estruturas planas ou cônicas que vão se acumulando dependendo da fonte de
nutrientes disponíveis.

5- Dispersão: Com o passar do tempo, esses biofilmes liberam partículas de biomassa que podem contaminar os alimentos
de forma não homogênea ou dar início à formação de um novo biofilme na linha de produção.
BIOFILMES
- Canais de água;

- Entrada de nutrientes;

- Eliminação de resíduos;

- A maioria dos biofilmes são

ligados a um superfície em
contato com o fluido ( células
sésseis);

- Agregados e flutuantes podem

apresentar características de
Biofilme.
BIOFILMES
Essas comunidades microbianas:

- Proteção;

- Resistência à sanitização , antibióticos, radiação

e desidratação;

- MEIO DE DEFESA.
COMUNICAÇÃO ENTRE AS BACTÉRIAS
COMUNICAÇÃO ENTRE AS BACTÉRIAS
Há 40 anos, cientistas descobriram que algumas bactérias enviavam e
recebiam mensagens — na forma de pequenas moléculas — para
células vizinhas e vice-versa. Esse tipo de comunicação, chamada de
percepção de um quorum, permite que as bactérias monitorem sua
densidade populacional e ajustem seu comportamento. Quando, nas
vizinhanças, há células suficientes para criar um quorum, as bactérias
começam a produzir proteínas, conhecidas como fatores de virulência
que fazem seus hospedeiros adoecerem. Elas também podem crescer
em agregados chamados de biofilmes, o que as torna até mil vezes
mais resistentes ao antibióticos.
EXEMPLOS DE BIOFILME
IMPACTOS NEGATIVOS

➢Bio corrosão;

➢Superfícies contaminadas;

➢Infecções crônicas;
COMO EVITAR O BIOFILME

➢ Projeto de instalação;

➢ Garantir a qualidade da água potável;

➢ Superfícies lisas;

➢ Sanitizações adequadas;

➢ Programa de manutenção adequado e consistente;

➢ Após sanitização, drenagem dos pontos.

COMO EVITAR O BIOFILME – MÉTODOS FÍSICOS

➢LIMPEZA - REMOVER DETRITOS , MATÉRIA

ORGÂNICA, RESÍDUOS;MANTER SUPERFÍCIES
SECAS (EQUIPAMENTOS);

➢SANITIZAÇÃO COM CALOR ( >80°C);

➢ SISTEMAS DE ÁGUA - CIRCULAÇÃO DE ÁGUA

PURIFICADA QUENTE É CONSIDERADA AUTO-
SANEAMENTO
COMO EVITAR O BIOFILME

➢ DEVE GARANTIR QUE OS BIOFILMES SÃO DESTRUIDOS E REMOVIDOS;

➢ VARIOS MÉTODOS REDUZEM A BIOCARGA , MAIS NÃO REMOVEM A

MASSA BIOLÓGICA DO BIOFILME;

➢ PRODUTOS QUÍMICOS DEVEM SER CAPAZES DE PENETRAR NA MATRIZ,

E REMOVER AS CÉLULAS MORTAS.
COMO EVITAR O BIOFILME
CONTROLE DE BIOBURDEN E BIOFILMES
AINDA DEPENDEM DE MÉTODOS
TRADIOCIONAIS DE LIMPEZA,
SANITIZAÇÃO/DESINFECÇÃO, E
MANUTENÇÃO DE EQUIPAMENTOS E
INSTALAÇÕES.
* CONTROLE ON-LINE DE CONTAGEM DE
BACTÉRIAS TOTAIS.
SANITIZAÇÃO

➢QUÍMICA - PROXITANE 1512 / GLUTARALDEÍDO

➢ TÉRMICA – MELHORES RESULTADOS – ÁGUA QUENTE
( > 80°C)
➢ TEMPO – LENTA PENETRAÇÃO DO BIOFILME;
➢ VANTAGEM – NÃO DEIXA RESÍDUOS ;
➢ ~ 55°C OCORRE A DESNATURAÇÃO DAS PROTEÍNAS.
REFERÊNCIA
- BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC
nº 310, de 14 de outubro de 2019.
- BRASIL. Portaria de Consolidação Federal nº 5 de 28 de Setembro de 2017.
- BRITISH Pharmacopoeia. London: The Stationary Office, 2013.
- EUROPEAN Pharmacopoeia. Council of Europe, 2013.
-FARMACOPÉIA Brasileira. 6 ed. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília-DF,
Editora Fiocruz, 2019.
- PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A.F. Controle Biológico de Qualidade de
Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos. 3ª ed. São Paulo, Atheneu Editora
São Paulo Ltda, 2010.
- UNITED States Pharmacopeia. 43ed. NF 38. Rockville, Maryland, 2020.