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Aula de Clonagem e Vetores e bibliotecas de DNA
- 1. CLONAGEM PROFª DRª PRISCILAL. MELLO ELABORADO POR: PROFª DRª MARTA F. BASTOS
- 2. CLONAGEM • Originada dapalavra grega Kólon, que designa forma de reprodução assexuada, ou seja, geração de indivíduos idênticos ao doador do DNA; • Ocorre naturalmente em organismos unicelulares e plantas; • Atualmente o termo clonagem é utilizado mais para a produção de organismos idênticos derivados de um ancestral comum.
- 3. TIPOS DE CLONAGEM Reprodutiva -Técnica de transferência nuclear utilizada pela primeira vez com sucesso em mamíferos na geração da ovelha Dolly em 1997. - A célula de um indivíduo adulto é fundida com um óvulo sem núcleo, de forma que o "embrião" gerado possui o conteúdo genético da pessoa que doou a célula.
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- 6. Tipos de Clonagem Terapêutica - Aprimoramento das técnicas hoje existentes para culturas de tecidos, que são realizadas há décadas. - É feita a transferência do núcleo de uma célula de uma pessoa para um óvulo sem núcleo, que ao dividir-se gera, em laboratório, células potencialmente capazes de produzir qualquer tecido.
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- 9. • Clonagem Molecular -É o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante. - Sinônimos: Engenharia Genética, Manipulação gênica, Clonagem gênica, Tecnologia do DNA recombinante, Modificação genética e Nova genética Tipos de Clonagem
- 10. CLONAGEM MOLECULAR Estudosgenômicos Estudos de expressão de mRNAs Expressão de proteínas (Proteínas recombinantes) Vacinas de DNA Produção de organismo transgênicos Terapia Gênica Estudos de interação DNA-proteína ou Proteína-proteína Estudos de mutação sítio-dirigida de proteínas
- 11. CLONAGEM MOLECULAR OBJETIVO:Gerar grande número de cópias de um determinado DNA. - Inserção de fragmentos de DNA em vetores; - Replicação de vetores contendo o inserto dentro de células hospedeiras - Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores.
- 12. CLONAGEM MOLECULAR Vetores:veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados, sejam introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada. Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido e constituição genética bem conhecida (ex: bactérias, leveduras, células de cultura de tecidos de mamíferos e insetos).
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- 15. VETORES MOLECULARES Sãomoléculas de DNA dupla fita, circular , auto-replicativas e que são passados de geração para geração; Características -Origem de replicação (Ori): multiplicar-se de maneira independente - Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC): Sítios para várias enzimas de restrição - Gene marcador (AmpR)
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- 17. VETORES MOLECULARES- TIPOS •Dependendo do tamanho do inserto de DNA e da finalidade do experimento, muitos tipos diferentes de vetores de clonagem podem ser utilizados para geração de moléculas recombinantes. -Plasmídeos – clonagem de até 15.000 pb - Fagos - clonagem de até 23.000 pb
- 18. Vetores Moleculares Clonagem Expressão Permitea multiplicar as moléculas de DNA de interesse.
- 19. Vetores de Clonagem(plasmídios)
- 20. - Permite expressaruma proteína - Indução da expressão - Proteína pode ser purificada Vetores Moleculares Clonagem Expressão
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- 24. • DNA ligase:Ligar fragmentos de DNA recombinantes Clonagem Molecular
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- 27. FORMAS DE COLOCARDNA RECOMBINANTE DENTRO DAS CÉLULAS COMPETENTES (HOST CELLS) • Transformação bacteriana • Transfecção (transformação em células eucariontes) • Eletroporação (choque) • Microinjeção • Infecção viral
- 30. CaCl2: íons Ca²+neutraliza carga – dos fosfolípideos da membrana e do DNA recombinante Choque térmico: mudança brusca de temperatura atraem a molécula de DNA recombinante para dentro da célula hospedeira Transformação
- 31. Meio de culturaenriquecido e incubação a 37ºC para promover recuperação das células hospedeira Seleção das bactérias transformadas por cultivo em meio de cultura contendo ampicilina. Transformação
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- 34. BIBLIOTECAS MOLECULARES • Conjuntode todos os genes de uma determinada espécie armazenados na forma de moléculas de DNA recombinante.
- 35. BIBLIOTECAS MOLECULARES Bibliotecas Genômicas -Formadas a partir de DNA genômico - DNA genômico pode ser quebrado mecanicamente ou enzimaticamente em pedaços menores - Clonados em fagos e plasmídios.
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- 37. Bibliotecas Moleculares BibliotecascDNA (DNA complementar) - Representa o conteúdo de mRNA de uma célula/tecido- Transcriptoma - Clonagem apenas das mensagens dos genes. - É mais seletiva - Isolamento de genes específicos
- 38. Bibliotecas de cDNA •Dependente da síntese de um cDNA a partir de um mRNA - Transcriptase reversa Extração de RNA total
- 39. Bibliotecas de cDNA RNAtotal Purificação do mRNA
- 40. DNA Genômico xcDNA