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Elisa
Este documento descreve os principais tipos de teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), incluindo suas características, aplicações e interpretação dos resultados. O ELISA é um teste imunológico sensível que detecta antígenos ou anticorpos através da ligação enzimática. Existem quatro principais tipos: indireto, sanduíche, competição e de captura. O ELISA é amplamente utilizado no diagnóstico de doenças humanas e veterinárias.
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- 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DABAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045ELISA (enzyme-linkedimmunosorbentassay)http://www.elisa-development.com/Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Ludmilla Soares Sena sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
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- 3. CARACTERÍSTICAS BÁSICASTeste utilizadopara detectar a presença de antígenos (Ag) ou anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes de cultura.
- 4. Une aespecificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de quantidades mínimas de uma substância em particular e com grande confiabilidade.
- 5. Uma enzima,covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da concentração de Ag/Ac pesquisados.CARACTERÍSTICAS BÁSICAS Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.
- 6. É ummétodo tanto qualitativo quanto quantitativo.CARACTERÍSTICAS BÁSICAS Elementos necessários para a realização:
- 7. Ag purificado (casodeseje-se detectar ou quantificar Ac)
- 8. Ac purificado (casodeseje-se detectar ou quantificar Ag)
- 9. Controles (Positivo,Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos
- 10. Padrões (soluçõescom concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios quantitativos
- 11. Amostras aserem testadas
- 12. Placa depoliestireno
- 13. Tampão delavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes
- 14. Conjugado: Acou Ag ligados covalentemente a uma enzima
- 15. Cromógeno: substânciaincolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática, produz cor
- 16. Leitora deELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica - DO) CARACTERÍSTICAS BÁSICAS Elementos necessários para a realização:http://www.dellta.com.br/detalhes.php?prod_id=89http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.htmlPlacas de ELISAhttp://www.laborlifescience.com.br/equipamentos_elisa.htmlLeitoras de ELISAhttp://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p4ae04e96cbc7f/placa_elisa.jpg
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- 18. Teste comalta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.
- 19. Teste comalta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos.
- 20. Permite quevárias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.
- 21. Realização relativamenterápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.CARACTERÍSTICAS BÁSICASDesvantagens
- 22. Necessidade de mãode obraespecializada.
- 23. Algunsreagentespodemdegradar-se com facilidade,com exposição à luz do sol ou a elevadastemperaturas.
- 24. Por ser umatécnicaaltamentesensívele específica, é muitosusceptível a erros de pipetagem, variaçõesnos tempos de incubação e lavagens, e alteraçõesnosreagentes.PRINCIPAIS TIPOShttp://www.elisa-development.com/
- 25. PRINCIPAIS TIPOS INDIRETO:detecta principalmente Ac
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- 27. COMPETIÇÃO: detectaAgcom baixo peso molecular (monovalentes)
- 28. CAPTURA: detecçãode Acs (principalmente IgM, evitando a ação do fator reumatóide)ELISA INDIRETO1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poçosYYYYYYYYY2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços 3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos AgsYYY4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos AgsYYYY5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos AcsY6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de corAntígenoConjugadoYAnticorpoCromógeno
- 29. ELISA INDIRETOInterpretação dosresultados:
- 30. A intensidadeda cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da amostra pesquisada.
- 31. Para determinarquais indivíduos são positivos ou negativos para a doença pesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio. Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo os negativos.Contr. Negativo ->Cut-off->Contr. Positivo->http://www.labimuno.org.br/ensino.cfm?load=aulas O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.ELISA INDIRETOAplicações na medicina humana e veterinária:
- 32. Diagnóstico sorológicode doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa.
- 33. Exemplos naMedicina Humana: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS.
- 34. Exemplos naMedicina Veterinária: diagnóstico da LinfadeniteCaseosa e da Leishmaniose.
- 35. OBS: Nãodeve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação do fator reumatóide. O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.AÇÃO DO FATOR REUMATÓIDE NO ELISA INDIRETO PARA IgMYYYYYY1) O Ag específico é adicionado á placa, e em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do excesso não ligado2) Adiciona-se a amostra do paciente, que contém o Ac IgM pesquisado e o Fator Reumatóide. O Fator Reumatóide pode estar ligado a Acs IgG específicos para o Ag presente na placa, formando imunocomplexos que se ligam a este Ag 3) Adiciona-se o conjugado anti-IgM4) Adiciona-se o cromógeno e o substrato, desenvolvendo-se cor. Devido ao Fator Reumatóide unido à IgG específica, tem-se um resultado superestimado da quantidade de IgM pesquisada, podendo levar até a resultados falsos-positivos YYYYYYAntígenoConjugado anti-IgMAcIgG.........YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYAcIgMespecí-fico pesquisadoCromógenoFator Reumatóide
- 36. ELISA SANDUÍCHEYYYYYYYYY1) UmAc conhecido é adicionado à placa e se liga à sua superfície2) Lavagens são feitas para retirar os Ac livres3) Adiciona-se a solução com o Ag a ser pesquisado e este, caso presente, se liga aos Ac nos poçosYYYYY4) Realiza-se lavagens para retirar o Ag não capturadoYY5) Adiciona-se conjugado específico para o Ag procuradoY6) Novas lavagens retiram o conjugado livre7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de corAntígenoConjugadoYAnticorpoCromógeno
- 37. ELISA DIRETO OUSANDUÍCHEInterpretação dos resultados:
- 38. A intensidadeda cor é diretamente proporcional à concentração de Ag da amostra pesquisada.
- 39. Para esteteste se tornar quantitativo, é necessária a construção de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir da reação de padrões com concentrações conhecidas do antígeno a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste. Curva Padrão (exemplo)Absorvância (450/620)Concentração de IgEhttp://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm
- 40. ELISA DIRETO OUSANDUÍCHEAplicações na medicina humana e veterinária:
- 41. Muito usadopara a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina e em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.
- 42. Exemplos naMedicina Humana: Teste de Gravidez (teste de detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).
- 43. Exemplos naMedicina Veterinária: Triagem na indústria de alimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nos alimentos).ELISA POR COMPETIÇÃO1) Adição do Ac específico aos poços da placa2) Lavagem para retirar os Ac livres3) Adição da solução com o Ag a ser pesquisado e de uma outra solução contendo Ag marcado (conjugado) no mesmo poço. Os Ags competem entre si pelo sítio de ligação do Ac e aquele que estiver em maior concentração, se ligará a mais AcYYYYYY4) Lavagem para retirar os Ag não capturadosY5) Adiciona-se o cromógeno e o substrato. Caso o conjugado tenha se ligado aos Ac da placa, ocorrerá reação enzimática e o cromógeno será oxidado, havendo desenvolvimento de corAntígenoConjugadoYAnticorpoCromógeno
- 44. ELISA POR COMPETIÇÃOInterpretaçãodos resultados:
- 45. A intensidadeda cor é INVERSAMENTE proporcional à concentração de ag da amostra pesquisada, ou seja, quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor emitida.ELISA POR COMPETIÇÃOAplicações na Medicina Humana e Veterinária:
- 46. Dosagem dehormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas. Diagnóstico sorológico de algumas doenças.
- 47. Exemplo naMedicina Humana: dosagem de T3, T4, testosterona, estradiol, progesterona.
- 48. Exemplo naMedicina Veterinária: detecção sorológica de Herpesvírus Bovino tipo I.ELISA DE CAPTURA1) Adição de Ac IgG monoclonal contra IgM aos poços da placa2) Lavagem para retirar os Ac livres3) Adição da solução com Ac IgM específico a ser pesquisadoYY4) Lavagem para retirar o Ac não capturadoYYY5) Adiciona-se Ag específico marcado com uma enzima (conjugado) para o Ac pesquisadoYYY6) Lavagem7) Adição de cromógeno e de substrato. Se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de corAntígenoAnticorpo IgM........YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYAnticorpo IgGCromógenoConjugado
- 49. ELISA DE CAPTURAInterpretação dos resultados
- 50. Intensidade dacor diretamente proporcional à concentração de Acs.
- 51. Por serum ELISA muito utilizado para a detecção de IgM, é capaz de identificar infecções na fase aguda.ELISA DE CAPTURA Aplicações na Medicina Humana e Veterinária
- 52. Principalmenteusado para a detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários) em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento. Apesar de ser mais utilizado para a detecção de IgM, o ELISA de Captura também pode ser utilizado para a dosagem de outros Acs.
- 53. Exemplos naMedicina Humana: diagnóstico de rubéola, toxoplasmose, herpesvírus e citomegalia, em suas fases agudas, da gestante (complexo TORCH).
- 54. Exemplo naMedicina Veterinária: diagnóstico da Diarréia Bovina Viral (DVB).REFERÊNCIAShttp://www.msd-brazil.com/msd43/m_manual/mm_sec22_243.htm
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