metodos de cromatografia metodos de aula basicas.pptx

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Cromatografia:
É um método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura, realizada através da
distribuição desses componentes em duas fases. Uma
das fases permanece estacionária, enquanto outra se
move através dela.
Durante a passagem da fase móvel sobre a estacionária, os
componentes da mistura são distribuídos pelas duas fase de
tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase
estacionária, resultando em migrações diferenciais desses
compostos.
Introdução

3
Cromatografia:
Chrom = cor + graphe = escrever
O processo não é totalmente dependente da cor, mas em
alguns casos pode basear a identificação dos constituintes
separados.
Separação Identificação
Quantificação
Introdução

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Cromatografia – Breve Histórico
O botânico russo Mikhael Tswett em 1906
utilizou o termo cromatografia pela primeira
vez, para descrever a separação de um
extrato vegetal, utilizando colunas de vidro
recheadas com partículas sólidas,
arrastando os componentes com éter de
petróleo.
A época moderna da cromatografia iniciou
em 1930, quando Kuhn e Lederer,
aperfeiçoaram as experiências do botânico
russo, separando e identificando as
xantófitas da gema do ovo, usando coluna
preenchida com carbonato de cálcio
pulverizado com fase estacionária e éter de
petróleo com fase móvel.
Introdução

5
1938 – Izmailov e Schraiber reintroduziram a CCD em análises de
produtos farmacêuticos, contudo permaneceu subutilizada, até o
desenvolvimento do método de aderir sólido ao suporte, atribuido a
Kirchner, e do método de preparar placas, descrito por Stahl.
1941 - Martin e Synge desenvolveram a cromatografia por partição
(líquido-líquido), que fundamentou o surgimento da CLAE e CG. Eles
receberam em 1962 prêmio Nobel de química pelo método
desenvolvido.
1941 – Hesse e colaboradores desenvolveram a cromatografia gás-
sólido, a partir da separação de dois ácidos graxos sob valor de 100
°C, arrastando sobre a sílica com dióxido de carbono.
Introdução

6
1952- Martin e James descreveram a cromatografia gás líquido;
1954 – Ray desenvolve o detector por condutividade térmica;
1958 – Pretorius e colaborares, juntamente com McWilliams e Dewar,
desenvolveram o detector de ionização em chama;
1958 – Golay introdiziu as colunas capilares em análises por
cromatografia de alta eficiência;
“Estes avanços ampliaram o poder analítico da cromatografia, tornando-
a o método analítico de separação e determinação mais usado do mundo”
Introdução

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Classificações da Cromatografia:
1. Quanto a forma física:
1.1. Fase estacionária depositada em uma superfície planar
1.2.1 Cromatografia planar
1.2. Fase estacionária depositada em um tubo
cilíndrico
1.1.1. Cromatografia em coluna
Tipos Tamanho
Preparativa 6-50 mm
Analíticas 2-6 mm
Microdiâmetro 1-2 mm
Capilares < 1 mm
Introdução

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2. Quanto a fase móvel:
2.1. Gás inerte: cromatografia gasosa
2.2. Líquido: cromatografia líquida
2.3. Vapor pressurizado: cromatografia supercrítica
2.2.1. Cromatográfica líquida em coluna
 Clássica: em colunas de vidro, onde a fase móvel e
deslocada sobre a fase estacionaria pela força da
gravidade;
 Alta eficiência: em colunas metálicas, onde a fase móvel é
deslocada por pressões elevadas, obtidas com auxilio de
uma bomba de alta pressão.
Introdução

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3. Quanto a polaridade das fases:
3.1. Cromatografia gasosa: fase móvel inerte, separação
ocorre devido às interações das molécula da amostra com a
fase estacionária;
3.2. Cromatografia líquida (planar e coluna);
3.2.1. Cromatografia de fase normal: fase estacionária é
mais polar do que a fase móvel
3.2.2. Cromatografia de fase reversa: fase móvel é mais
polar do que a fase estacionária.
Introdução

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Mecanismo de interação:
Adsorção: CDD, CGS, CLS, CSS
Interação entre o sólido e fase móvel, devido a presença de
grupos ativos em sua superfície. A dessorção do soluto
ocorre por volatilidade (CG) ou solubilidade na fase móvel
(CL ou CSS)
Introdução

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Absorção: CP, CGL, CLL
Fase estacionária é um líquido ocorre por absorção ou
partição e baseia-se nas diferentes solubilidades dos
componente da amostra na fase estacionária. A volta dos
componentes a fase móvel depende de sua volatilidade (fase
móvel gasosa) ou de sua solubilidade (fase móvel líquida)
Introdução

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Troca iônica:
A fase estacionária é constituída por um suporte onde são adicionados
grupos ionizáveis: Grupos carregados positivamente, retendo ânions e
grupos carregados negativamente retendo cátion. A fase móvel é uma
solução iônica com propriedades tamponantes compatível.
Introdução

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Bioafinidade:
Grupos com especificidade
biológica, quimicamente ligados
ao suporte. Podem ser antígenos,
substratos ou lectinas, que
retiram da fase móvel somente
os componente complementares,
os anticorpos, enzimas ou
açúcares, respectivamente.
Introdução

15
Exclusão:
Introdução

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 Técnica simples;
 Pequena quantidade de amostra;
 Boa capacidade de resolução,
 Separação e identificação de compostos polares, como
antibióticos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e íons
metálicos.
Cromatografia de Papel

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 É classificada como de partição líquido-líquido;
 Separação e distribuição depende da
solubilidade;
 Geralmente água é utilizada como fase móvel e
papel (celulose) como fase estacionária.

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 A forma mais simples de CP é a cromatografia
ascendente (por capilaridade).

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 Mistura de componentes coloridos;
 Misturas incolores.

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 Procedimento

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 A análise qualitativa de uma substância realiza-se
através da cor da mancha e de seu fator de
retardamento, Rf, determinado através da expressão:
Rf = da/ds
Rf= fator de retenção;
da= distância (cm, mm) percorrida pela substância;
ds= distância (cm, mm) percorrida pela fase móvel.

CROMATOGRAFIA
EM CAMADA
DELGADA (CCD)
24

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Histórico
 1889, Beyerinck - sólidos em camada delgada sobre
vidro;
 1938, Izmailov e Schraiber - análise de produtos
farmacêuticos;
 1956, Stahl – preparação de placas com
reprodutibilidade.
Definição:
Método físico-químico de separação dos componentes de uma
mistura através da distribuição destes entre duas fases
(móvel e estacionária).
Cromatografia em Camada Delgada -CCD

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 Fase estacionária sólida e fase móvel líquida;
 A fase estacionária é constituída de sílica G (fase
normal) ou sílica C18 (fase reversa);
 A fase móvel é constituída de solventes polares,
apolares ou mistura de ambos (ex: água, etanol,
metanol, clorofórmio, diclorometano, hexano, etc.)
Fase Normal:
polaridade da FE > FM
Fase Reversa:
polaridade da FE< FM
Tammy

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 As placas utilizadas podem ser de folha de alumínio
(manufaturadas na indústria) ou de vidro (preparadas no
próprio laboratório);
 É necessário ativá-las em estufa antes da aplicação, afim de
remover água e interferentes.
Vantagens:
• Uniformes e
homogêneas;
• Promovem
melhor
separação dos
componentes.
Vantagens:
• Baixo custo;
• Fácil preparo.

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Como ocorre:
 Durante a corrida, os componentes da mistura são distribuídos entre a
FM e a FE e cada um deles é retido seletivamente pela FE, conforme a
velocidade com que passam pela mesma. Isso resulta em alturas
diferentes para cada componente.
 A cuba deve estar saturada com vapores da fase móvel, para que ocorra
boa migração dos componentes da mistura.

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Fator de retenção (Rf):
 Partindo do princípio de que um composto percorre
sempre a mesma distância em relação a frente do
solvente, o fator de retenção é a razão entre estes
deslocamentos.
 É utilizado para auxiliar a identificação de
substâncias, comparando o Rf obtido com o Rf padrão.

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Revelação do cromatograma:
 É necessário proceder esta etapa quando os
componentes migrados são incolores. Para tal, utiliza-
se alguns reagentes para torná-los visíveis.
 Podem ser utilizados reveladores físicos, químicos ou
biológicos.
Físicos:
Luz UV
Químicos:
Dragendorff
(alcalóides)
NP-PEG
(flavonóides)
FeCL3 (comp
fenólicos)
Rev. Universal
(vapor de iodo)
Biológicos:
Enzimas,
Antibióticos e
Substratos.

31
Exemplos:

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Aplicações:
 Estudos preliminares dos componentes de um extrato
orgânico;
 Investigação de casos de envenenamento e ingestão de
estimulantes por atletas;
 Estudos de reações químicas quanto à presença de
intermediários estáveis;
 Análise da pureza de compostos;
 Análise da eficiência de processos de destilação e
cristalização.

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Vantagens:
 Fácil execução;
 Rapidez;
 Menor trajeto da fase móvel ;
 Baixo custo;
 Versatilidade.
Desvantagens:
 Difícil reprodutibilidade;
 Difícil determinação precisa do Rf.

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CROMATOGRAFIA EM COLUNA
 Citada como o mais
antigo procedimento
cromatográfico
 Utilizada para
Isolamento de produtos
naturais
• Purificação de produtos
de reações químicas
 Fundamenta-se
basicamente na
polaridade relativa das
moléculas envolvidas.

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CLÁSSICA
 Consiste em uma coluna de
vidro, metal ou plástico, de
diâmetros variados;
 possuem uma torneira em
sua extremidade inferior.
 Esses cilindros são
preenchidos por um
adsorvente
 colocado na coluna
diretamente ou suspendido
em um solvente adequado.

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ADSORVENTES MAIS UTILIZADOS
Sílica e alumina
Suporte para fase estacionária
líquida
Líquida: separação por adsorção
Sólida: separação por partição

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CROMATOGRAFIA EM COLUNA
 A fase estacionária é mantida
em um tubo estreito e a fase
móvel, forçada através do tubo
sob pressão ou por gravidade.
 A substância a ser separada
ou analisada é colocada na
coluna parte superior e o
eluente é vertido após.
 A adição de sílica deve ser
feita com a torneira semi-
aberta.
 O adsorvente é adicionado
lentamente à coluna fixada na
posição vertical de modo a se
obter uma compactação
uniforme.

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CROMATOGRAFIA DE COLUNA
 A velocidade na qual um
composto passa pela coluna
depende da polaridade da
fase estacionária
 solvente utilizado como
eluente.
 Se o composto é mais atraído
pela fase estacionária do que
pelo solvente, ele migrará
mais lentamente da coluna.
 composto tiver maior
afinidade pelo solvente ele
migrará mais rapidamente
da coluna

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O ÊXITO DA CROMATOGRAFIA DE
COLUNA
 solvente adequado
 É possível visualizar a
separação dos componentes
de uma mistura observando
o desenvolvimento de
manchas diferentes na
coluna
 Através da luz ultravioleta
 necessário o
acompanhamento da
separação dos componentes
pela técnica de
cromatografia em coluna
delgada (CCD).

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APLICABILIDADE
Quais misturas podem ser separadas por CG?
Para uma substância qualquer poder ser
“arrastada” por um fluxo de um gás ela deve ser
dissolver pelo menos parcialmente nesse gás.
Misturas cujos volumes sejam voláteis e
termicamente estável.
Cromatografia Gasosa

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CROMATÓGRAFO A GÁS

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INSTRUMENTAÇÃO
GÁS DE ARRASTE
Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra
apenas a carrega através da coluna.
Requisitos:
INERTE - Não deve reagir com a amostra, fase
estacionária ou superfícies do instrumento.
PURO - Deve ser isento de impurezas que possam
degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
 H2O, O2 (oxida / hidrolisa algumas FE; incompatíveis
com DCE)
 Hidrocarbonetos (ruído no sinal de DIC)

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INSTRUMENTAÇÃO
INJETORES
 Parte do cromatógrafo a gás onde a amostra é
introduzida
― Vaporiza amostra (solvente + compostos alvo)
― Mistura vapor com fase móvel (gás de arraste)
― Transfere vapor para dentro da coluna
 Dispositivos de Injeção
― Injetores para colunas empacotadas
― Injetores capilares
― Válvulas de amostragem de gás

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INSTRUMENTAÇÃO
INJETORES
1. Septo (silicone)
2. Alimentação de gás de
arraste
3. Bloco metálico aquecido
4. Ponta da coluna
cromatográfica

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COLUNAS: DEFINIÇÕES BÁSICAS
 A coluna é a essência do sistema
cromatográfico, pois é nela que ocorrerá a
separação dos componentes da amostra.
 Fase estacionária (suporte sólido e fase
líquida)
 Tubo (material, comprimento e diâmetro)
 Colunas empacotadas e capilares

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Vantagens Desvantagens
Empacotadas
• Mais econômica
• Maior capacidade de carga
• Maior quantidade de amostra
• Se o material de enchimento
não for colocado na coluna de
forma compacta e uniforme, os
espaços vazios resultantes
funcionarão como câmaras de
diluição da amostra.
• Menor eficiência
• Análise mais lenta
Capilares
• Maior comprimento => maior
eficiência
• Separação de misturas complexas
• Análise mais rápida
• Maior separação
• Capacidade de processamento
da amostra inferior. Satura
rapidamente.
• Menor quantidade de amostra

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TEMPERATURA DA COLUNA
Analises isotérmicas
 Amostras com PE elevado não eluem
 Primeiros picos: agudos, pouco resolvidos
 Posteriores: baixos, largos, muito resolvidos

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TEMPERATURA DA COLUNA
Analises com Programação de Temperatura
 Determinação das condições de analise, inclusive isotérmicas
 Tempo de analise reduzido
 Limite de detecção e precisão da medida do pico são melhorados
 Velocidade de injeção não precisa ser tão rápida
 Transformações químicas dos componentes instáveis são minimizadas

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PRINCIPAIS DETECTORES UTILIZADOS
EM CG
1. Detector de condutividade térmica (TCD): universal
Medida baseada na condutividade térmica de um filamento de W
― Não é destrutivo
― Não compatível com gases oxidantes
― Menos sensível
― Importante para substâncias que não geram sinal em outros
detectores, como CO2

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PRINCIPAIS DETECTORES
UTILIZADOS EM CG
2. Detector por ionização em chama (FID): seletivo –
universal
Medida baseada na variação de uma corrente devido à influência de
íons e elétrons formados numa chama de H2/ar
― Destrutivo
― Resposta apenas a compostos orgânicos

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PRINCIPAIS DETECTORES
UTILIZADOS EM CG
3. Detector de captura eletrônica (ECD): seletivo
― Não destrutivo
― Medida baseada na variação de uma corrente de “elétrons lentos”
devido à afinidade dos organohalogenados por elétrons.
Provenientes da interação de uma fonte radioativa com o gás
carregador (3H ou 63Ni)
Elétrons são capturados pelos sítios halogenados
- APLICAÇÃO IMPORTANTE: determinação de resíduos de
pesticidas

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ANÁLISE QUALITATIVA
Aplicações qualitativas
Fontes de Informações Qualitativas
 Retenção – uso de dados de retenção para sua
identificação
 Detecção – detectores que fornecem
informações estruturais sobre as substâncias
eluidas.
Identificação individual das
espécies contidas na
amostra
Determinação da identidade
da amostra propriamente
dita

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CG: CONSIDERAÇÕES
CG - TÉCNICA RELATIVAMENTE SIMPLES MAS:
 Exige escolha cuidadosa da configuração instrumental
(injetor, coluna, detector);
 Condições instrumentais devem ser otimizadas (vazão
do gás, temperatura, ...).
USANDO DETECTORES NÃO DESTRUTIVOS:
 O eluato ainda pode ser reanalisado
 acopla-se à saída do detector um outro instrumento
 Ex: GC-MS (Espectrômetro de massas como “detector”)
 Medida baseada na razão massa-carga das substâncias
que saem da coluna → confirmação de resultados e
aumento da sensibilidade.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE
ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
Do inglês: High
Performance/Pressure Liquide
Chromatography (HPLC)
57

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Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
É uma técnica utilizada para separar e determinar espécies em uma grande
variedade de materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos.
Como funciona?
É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas
de materiais especialmente preparados e uma fase móvel (solvente) que é eluída
sobre altas pressões.
O que é?
“Ela tem a capacidade de realizar separações e análises
quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em
vários tipos de amostras, com alta resolução, eficiência e
sensibilidade”.

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APLICAÇÕES
Química Forense
(metabólitos de drogas)
Bioquímica (proteínas,
aminoácidos, esteroides)
Ciências ambientais
Alimentos (corantes
artificiais, aflatoxicinas,
aditivos, antioxidantes)
Farmacologia (fármacos)
Toxicologia (pesticidas)

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F.E. é constituída de partículas sólidas empacotadas em
uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel por alta
Mecanismo Requer somente que
a amostra seja
solúvel na F.M.
Juliana

61
FASE
MÓVEL
F.E
Esquema do CLAE
Juliana

62
F. E. (poder de retenção): sílica > amino > diol >
ciano
Coluna (Fase estacionária)
-Aço inoxidável 316 tratado;
-Na CLAE emprega-se um coluna
fechada, reaproveitável; portanto,
até centenas de separações
individuais podem ser realizadas
com a mesma coluna.
-O comprimento das colunas
variam de 10-30 cm;
Colunas curtas e com paredes espessas
a fim de evitar deformidades com a
alta P

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Coluna (Fase estacionária)
Classificação pela polaridade:
Cromatografia
em
FASE
NORMAL:
A fase estacionária é
muito polar.
Cromatografia
em
FASE
REVERSA:
A fase estacionária é
de baixa polaridade
Sílica gel
Sílica ligada a C18
Juliana

64
Cromatografia em FASE
NORMAL:
Polaridade

65
Pré-coluna (Guard column)
Instalada entre o injetor e a coluna;
(Devem ser substituídas regularmente)
Função:
-Remover partículas;
-Remover substâncias que teriam forte interação com a coluna;
-Remover substâncias que possam precipitar quando em contato
com a F.M. e F.E.;
De forma geral, AUMENTAM A VIDA ÚTIL DAS COLUNAS.
Juliana

66
Cuidados com a coluna
(F.E.)
 Manter a coluna sempre tampada;
Evitar choques de pressão, térmicos e mecânicos;
 Usar pré-coluna (guard column);
 Usar solventes ultrafiltrados;
 Pré-tratamento das amostras deve considerar eliminação de
partículas e impurezas que possam ser adsorvidos;
 Obedecer faixa de pH em que a F.E. é estável;
 Eliminar sais, tampões e aditivos de F.M. antes de armazenar
a coluna.

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Bombas de alta pressão
Permitem vencer a resistência à passagem da F.M.
exercida pelas partículas da F.E.
‐ Função: proporcionar fluxo constante e
reprodutível de F.M. a todo o sistema.
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS:
‐ Fluxo precisos e exatos, vazão contínua e livre de pulsações;
‐ Resposta rápida a alterações no fluxo e composição da F.M.
‐ Pressão máxima: 700 atm (6.000 psi - libras/polegadas quadradas)
‐ Maior parte construída em aço inox 316; outros materiais: titânio, peek, teflon
‐ Inércia química a solventes comuns, resistência a corrosão;
‐ manutenção simples.
Juliana

68
Solventes (Fase móvel)

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 Eluição
Isocrática:
Mesma composição de fase móvel durante a eluição. Único solvente na
F.M.
Ex: Metanol/água 80:20 (v/v)
Gradiente:
Composição da fase móvel varia durante a eluição. É uma mistura de
solventes ou a mudança de solvente com o tempo.
Utilizado na separação de misturas complexas com diferentes funções
químicas ou na padronização.

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Sistemas de Introdução de Amostras
(INJETORES)
O método mais empregado de introdução da amostra em cromatografia
líquida é baseado em um sistema com alça de amostragem.
Frequentemente as alças intercambiáveis estão disponíveis para
permitir a escolha do volume da amostra de 5 a 500 µL.
válvula de 6 pórticos (orifícios)

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Detectores
O detector deve ser
pequeno e compatível
com a vazão de
líquido.
O detector a ser
empregado vai
depender da natureza
da amostra.
Função do detector: identificar a presença de substâncias de interesse que
estejam eluindo da coluna cromatográfica, proporcionando uma identificação e
quantificação continua dos componentes da amostra.
Característica desejáveis:
- alta sensibilidade e baixo limite de detecção
- ampla faixa de linearidade
- confiável e reprodutível
-fácil de operar e manter
-informação qualitativa e quantitativa
-não destruição do soluto
-insensibilidade a mudanças na FM e de T
- resposta rápida e cte a alterações das [ ] dos
solutos
-baixo nível de ruído
Juliana

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Tipos de detectores
-Detectores baseados na absorção de luz UV/VIS (mais amplamente
empregados - radiação ultravioleta (190 - 400 nm) ou visível (400 - 800 nm);
-Detector no UV/VIS com arranjo de fotodiodos (DAD) (a bsorbância de
uma amostra pode ser determinada em todos os λ de modo Simultâneo)
-Detectores baseados na fluorescência (> sensibilidade UV )
-Detectores baseados no espalhamento da luz
-Detectores baseados no índice de refração
-Detectores eletroquímicos (+utilizado para fluídos corpóreos e produtos
naturais)
-Espectrômetro de massas (HPLC MS/MS)
‐
Juliana

73
Tipos de
CLAE
 Cromatografia de alta eficiência por partição (a fase
estacionária é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase
móvel)
Cromatografia líquido-líquido
Cromatografia líquida com fase ligada Diferença entre as duas
está na forma com a
qual a fase estacionária
é imobilizada nas
partículas de suporte do
recheio
O líquido é imobilizado por adsorção física
Retido por meio de ligações químicas
 Cromatografia de alta eficiência por adsorção
A fase estacionária, nesse caso, é a superfície de um sólido polar finamente
dividido.

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Tipos de
CLAE
Cromatografia por troca iônica
Cromatografia por exclusão e por tamanho
Cromatografia por afinidade
Cromatografia quiral

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F.E. é utilizada várias vezes
Versatilidade
Tempo reduzido de análise
Alta resolução
Análise qualitativa
Resultados quantitativos
Detectabilidade
Automação
Alto Custo do equipamento
Alto custo de manutenção do
equipamento
Necessita de experiência do
operador
Vantagens x Desvantagens

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