基于高内涵筛选和功能基因网络的信号通路重建研究

### 基于高内涵筛选和功能基因网络的信号通路重建研究 #### 1. 引言 转录的调控与激活是基因表达的关键早期步骤。信号转导级联将信息从细胞表面受体传递到细胞内效应器，最终激活这一过程。近年来，信号转导通路的计算研究备受关注，特别是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，它在细胞发育过程中起着重要作用，能触发多种细胞内反应。然而，以往的计算分析大多仅关注蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）和基因组学数据，这些数据来源并不完整，无法涵盖所有相互作用。 高内涵筛选（HCS）结合自动荧光显微镜技术，为研究细胞过程提供了新途径。通过在不同基因敲低条件下获取细胞图像，分析细胞表型，可将基因按表型和通路分组，构建功能基因网络（FGN）。本文旨在整合HCS和多种基因组数据，构建高覆盖率和高质量的FGN，并从中提取MAPK信号通路。 #### 2. 材料与方法 ##### 2.1 高内涵筛选数据 - **细胞培养与图像采集**：使用dsRNA抑制特定基因及其蛋白质产物的活性。将Kc167细胞置于含有dsRNA的环境中，针对所有已知的果蝇蛋白激酶和磷酸酶进行处理。经过五天的孵育期后，固定细胞并染色，使用Evotec旋转盘共聚焦显微镜自动采集每个孔的三个通道（蓝色、绿色和红色）的十六张图像。 - **细胞图像分割**：采用两步分割程序，先从DNA通道提取细胞核，再从F - 肌动蛋白和α - 微管蛋白通道提取细胞体。通过梯度向量场（GVF）方法检测细胞核中心，然后使用标记控制的分水岭算法完全分割细胞核，以获取详细的细胞核和细胞体形状及边界信息。 - **分割细胞图像的特征提取**：为了识别细胞表型，选择了211个形态特征，包括85个小波特征、10个几何区域特征、48个Zernike矩、14个Haralick纹理特征和54个形状描述符特征。使用无监督特征选择方法，基于k - 最近邻方法进行迭代特征消除，最终选择了12个图像特征来量化分割后的细胞。 - **细胞表型的统计特性**：从荧光标记的细胞中提取各种统计参数，包括每个表型组中细胞数量、面积和周长的平均值，以及单个处理对应的平均细胞数量、面积和周长。共选择18个图像描述符来表示HCS图像中细胞的统计特性。通过计算基因对之间图像描述符的皮尔逊相关系数（PCC）来评分HCS数据，仅保留PCC值大于零的结果。 ##### 2.2 基因组和蛋白质组数据集 为了构建高覆盖率和高质量的FGN，整合了多种基因组和蛋白质组数据集，包括PPI、基因表达微阵列、基因共现、基因组邻域、基因融合、文本挖掘和基因同源性数据。 - **PPI和基因表达谱**：PPI数据可建模为连接图，节点表示蛋白质，边表示物理相互作用。通过计算基因对在微阵列集中的PCC来衡量基因功能的相似性，仅对已知PPI连接的蛋白质产物对应的基因对计算PCC。该数据集包含6772个蛋白质和19372个相互作用。基因表达谱虽不描述直接物理相互作用，但可推断基因功能相似性，整合了来自GEO数据库的四个微阵列实验的数据，涉及73个条件和13046个基因。 - **其他基因组数据**：基因共现、基因组邻域、基因融合、文本挖掘和基因同源性数据表明基因之间的功能相似性。这些数据均来自STRING数据库，每个预测都给出一个范围在[0, 1]的置信分数，直接使用该分数。 ##### 2.3 功能基因网络构建 以往的研究大多仅关注PPI和基因表达谱的整合，而本文提出整合HCS的高质量表型数据、BIND的PPI物理相互作用数据、GEO的微阵列推断信息以及STRING数据库的基因组数据。 使用线性支持向量机（SVM）整合这八个数据源的分数。选择至少存在于一个KEGG通路中的580个基因对作为真阳性金标准（GSP），选择在KEGG中注释但不在同一通路中的580个基因对作为真阴性金标准（GSN）。将GSP和GSN基因对的最终输出分别设置为1和0，用于训练线性SVM。实验结果显示，10折交叉验证的准确率约为87%。训练后的SVM为非GSP和非GSN基因对分配实值分数，并将这些分数归一化到[0, 1]范围，从而构建更准确、覆盖率更高的FGN。 #### 3. 实验与结果 ##### 3.1 提取果蝇MAPK信号通路 以KEGG数据库中果蝇的MAPK信号通路为金标准验证方法。研究了MAPKKK信号通路，该通路从膜蛋白Torso开始，以激活转录因子Tll和Hkb结束。 将[3]中提出的整数线性规划算法（ILP）扩展为带有加权参数α的改进整数线性规划（IILP）算法，用于解决通路检测问题。该算法的目标是在给定起始膜蛋白、结束转录因子和FGN的情况下，找到一条从膜蛋白到转录因子的路径。 IILP模型的数学描述如下： \[ \begin{cases} \arg \min \left(\sum_{i = 1}^{N}\sum_{j = 1}^{N}W_{ij}y_{ij}-\alpha\sum_{i = 1}^{N}\sum_{j = 1}^{N}y_{ij}+\lambda\sum_{i = 1}^{N}x_{i}\right) \\ y_{ij}\leq x_{i}, y_{ij}\leq x_{j} \\ \sum_{j = 1}^{N}y_{ij}\geq 1, \text{ if } x_{i} \text{ is either a starting or ending node in SP} \\ \sum_{i = 1}^{N}y_{ij}\geq 2, \text{ if } x_{i} \text{ is an ordinary node in SP} \\ x_{i} = 1, \text{ if } x_{i} \text{ is a known node in SP} \\ x_{i}\in\{0, 1\}, i = 1,2,\cdots,N \\ y_{ij}\in\{0, 1\}, i,j = 1,2,\cdots,N \end{cases} \] 其中，$x_{i}$表示蛋白质$i$是否为信号通路（SP）的组成部分，$y_{ij}$表示边$(i, j)$是否为SP的一部分，$W_{ij}$是边$(i, j)$的权重，$\lambda$是用于控制边权重分数和SP大小平衡的正参数，$N$是节点总数。 通过以下公式确定参数$\lambda$和$\alpha$： \[ \alpha=\frac{\sum_{i = 1}^{N}\sum_{j = 1}^{N}W_{ij}}{N} \] 最终设置$\lambda$为0.83，$\alpha$为0.90。提取的SP与KEGG数据库中的通路相比，不仅涵盖了MAPKKK SP的所有组件，还发现了一些额外的组件，如蛋白质CG1044（dos）、sev、CG6705（tsl）、CG1034（bcd）、CG9786（hb）、CG5637（nos）等。 使用P值统计和GO术语富集两种测量方法评估预测SP中蛋白质的功能相似性。P值小于0.004，表明具有高度显著性。选择五个与信号转导相关的GO术语进行功能富集分析，结果显示这些值具有良好的一致性和相似的生物学功能，表明该方法适合从FGN中提取信号通路。 | GO术语 | N1（获得的信号网络中注释到特定GO术语的蛋白质数量） | N2（整个果蝇基因组中注释到特定GO术语的蛋白质数量） | PGO值 | | ---- | ---- | ---- | ---- | | GO术语1 | [具体数量1] | [具体数量2] | [具体PGO值1] | | GO术语2 | [具体数量3] | [具体数量4] | [具体PGO值2] | | GO术语3 | [具体数量5] | [具体数量6] | [具体PGO值3] | | GO术语4 | [具体数量7] | [具体数量8] | [具体PGO值4] | | GO术语5 | [具体数量9] | [具体数量10] | [具体PGO值5] | 下面是构建FGN和提取信号通路的流程： ```mermaid graph LR A[高内涵筛选数据] --> B[细胞培养与图像采集] B --> C[细胞图像分割] C --> D[特征提取] D --> E[统计特性分析] F[基因组和蛋白质组数据集] --> G[PPI和基因表达谱分析] F --> H[其他基因组数据分析] E --> I[线性SVM整合数据] G --> I H --> I I --> J[构建功能基因网络（FGN）] J --> K[改进整数线性规划（IILP）算法] K --> L[提取信号通路] ``` 综上所述，本文通过整合高内涵筛选和多种基因组数据，构建了高覆盖率和高质量的功能基因网络，并从中提取了果蝇的MAPK信号通路。验证结果表明，该方法能够发现包含KEGG数据库中MAPK通路主要组件的信号通路，并且发现了一些额外的候选基因，为进一步的实验验证提供了可能。 #### 4. 讨论与结论 信号转导通路在生物过程中处于核心地位，从基础研究和临床应用的角度来看，它正成为一个日益重要的研究领域。随着荧光显微镜成像技术和RNA干扰（RNAi）基因敲低技术的发展，高内涵筛选（HCS）已成为系统识别复杂生物过程各个部分的有力方法。 在本研究中，我们采用了以下步骤来开展工作： 1. **构建功能基因网络**：运用先进的机器学习方法，将高内涵筛选与其他公开可用的多模态基因组数据整合在一起，构建了一个高覆盖率和高质量的功能基因网络。具体操作是使用线性支持向量机（SVM）整合多种数据源的分数，包括HCS的高质量表型数据、BIND的PPI物理相互作用数据、GEO的微阵列推断信息以及STRING数据库的基因组数据。通过选择合适的真阳性金标准（GSP）和真阴性金标准（GSN）训练SVM，为基因对分配实值分数并归一化，从而得到更准确和高覆盖率的FGN。 2. **发现信号通路**：基于改进的整数线性规划算法，提出了一种新颖的计算模型，用于发现果蝇中的MAPK信号通路。该信号通路是构建的功能基因网络中具有最大权重值和最少边数的最优子图。 验证结果显示，我们的方法能够发现包含KEGG数据库中MAPK通路主要组件的信号通路。同时，还发现了一些额外的基因候选者，这使得我们的模型更加完整。这些与MAPK信号通路相关的潜在候选者可用于进一步的实验验证。 以下是本研究的优势总结表格： |优势|具体描述| | ---- | ---- | |数据整合全面|整合了高内涵筛选数据以及多种基因组和蛋白质组数据集，构建了高覆盖率和高质量的功能基因网络| |算法改进有效|改进的整数线性规划算法能够准确发现信号通路，且发现的通路包含KEGG数据库中MAPK通路的主要组件| |发现额外候选基因|找到了一些额外的基因候选者，使模型更完整，为后续研究提供了更多可能| 展望未来，我们可以进一步对这些潜在候选基因进行深入研究，通过实验验证它们在MAPK信号通路中的具体作用。同时，可以尝试将该方法应用于其他生物体系，探索更多生物过程中的信号转导通路。 ```mermaid graph LR A[本研究成果] --> B[验证MAPK通路主要组件] A --> C[发现额外基因候选者] B --> D[确认通路完整性] C --> E[为后续实验提供方向] D --> F[深入理解生物过程] E --> F F --> G[拓展到其他生物体系] ``` 总之，本研究为信号转导通路的研究提供了一种有效的方法，有望在生物医学领域发挥重要作用。