Isolasi dan analisis pigmen dari tumbuhan

Isolasi dan analisis pigmen dari tumbuhan

• 1.
  kwr ‘16 ISOLASI DANANALISIS PIGMEN DARI TUMBUHAN TUJUAN PERCOBAAN  Melakukan isolasi senyawa bahan alam  Melakukan Thin Layer Chromatography (TLC)  Mengoperasikan spektrometer UV-Vis  Melakukan kromatografi kolom DASAR TEORI Pigmen tumbuhan ditemukan dalam plastida dan vakuola. Ada bermacam-macam pigmen tumbuhan, misalnya klorofil (pigmen hijau) di dalam kloroplas dan karotenoid (pigmen kuning-merah) di dalam kromoplas yang tidak mempunyai klorofil atau hanya mengandung sedikit klorofil. Kelompok pigmen lain adalah flavonoid (antosianin dan flavon atau flavonol) yang biasanya terdapat di dalam vakuola, khususnya pada bunga dan buah dengan berbagai warna (Mulyani, 2006). Karotenoid merupakan salah satu kelompok pigmen yang utama selain klorofil dan memiliki warna kuning, orange serta merah. Karotenoid diproduksi oleh berbagai jenis organisme, mulai dari non fototropik prokariot sampai tumbuhan tingkat tinggi, dengan lebih dari 700 struktur berbeda yang teridentifikasi saat ini (Stafsnes, 2010). Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang menggunakan zat penyerap (fase diam) dalam bumbung kaca yang berbentuk buret, fase gerak dituangkan di atas dan menetes di bawah (Pudjaatmaka, 2002). Dalam kromatografi kolom, fase diam ditempatkan dalam kolom yang dilewati fase gerak yang dipengaruhi oleh adanya tekanan gravitasi (Harvey, 2000). Kromatografi lapis tipis berprinsip di mana suatu analit bergerak melintasi lapisan fase diam, di bawah pengaruh fase gerak, yang bergerak melalui fase diam oleh kerja kapiler. Semakin polar suatu senyawa fase gerak, semakin besar mengadsorpsi (partisi ke dalam) fase diam gel silica, semakin sedikit waktu yang dibutuhkan fase gerak untuk bergerak menaiki pelat sehingga semakin pendek jarak tempuh senyawa tersebut menaiki pelat dalam waktu tertentu (Watson, 2005). Sampel diteteskan di dekat salah satu sisi pelat dalam bentuk larutan dengan jumlah kecil. Noda sampel dikeringkan dan sisi plat dicelupkan ke dalam fase gerak yang sesuai. Pelarut bergerak naik di sepanjang lapisan tipis zat padat di atas pelat, dan bersamaan dengan pergerakan pelarut tersebut, zat terlarut sampel dibawa dengan laju yang tergantung pada kelarutan zat terlarut tersebut dalam fase bergerak dan interaksinya dengan zat padat (Day, 1980). Spektrofotometer UV-Visibel digunakan untuk mengukur absorbansi pada spectrum daerah UV dan visible. Instrument ini merupakan bentuk colorimeter yang dapat menyediakan cahaya monokromatis. Prisma akan memecah cahaya menjadi komponen
• 2.
  kwr ‘16 warnanya dandapat langsung menjadi cahaya monokromatis dari larutan sampel yang dianalisis. Sorotan cahaya mengandung kekuatan foton. Saat foton mengenai molekul analit, analit akan mengadsorp foton, sehingga jumlah foton berkurang (Nair, 2007). METODE PERCOBAAN  ALAT DAN BAHAN Alat-alat yang dibutuhkan pada percobaan ini meliputi gelas beker, cawan porselin, gelas Erlenmeyer, corong gelas, pipa kapiler, gelas ukur 10 ml, tabung reaksi, eppendorft, plat KLT (TLC), pipet pasteur, pipet tetes, dan pengaduk gelas. Sementara bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini meliputi daun bayam, aseton, n-heksana, Na2SO4 anhidrat, akuades, dan kapas.  CARA KERJA Pada proses ekstraksi pigmen, 3 gram daun bayam dimasukkan ke dalam cawan porselen dan ditambah 10 ml aseton serta dilumat sampai halus. Ekstrak lalu disaring dengan corong gelas yang ujungnya diberi kapas dan diisi dengan Na2SO4 anhidrat. Ekstrak kemudian diukur volumenya menggunakan gelas ukur. Pada penentuan konsentrasi pigmen, ekstrak aseton diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 661,6 nm. Sebagai larutan blanko digunakan kuvet yang diisi aseton. Pada pemisahan dan penentuan pigmen dengan TLC, 10 ml larutan n- heksana/aseton (7/3) dimasukkan ke gelas beker. Plat TLC diberi tanda garis dengan pensil, 1,5 cm dan 1 cm dari masing-masing ujungnya. Kemudian ekstrak aseton diteteskan pada garis yang berjarak 1,5 cm dari ujung dengan menggunakan pipa kapiler yang diruncingkan ujungnya dan plat TLC lalu dimasukkan ke dalam gelas beker. Gelas beker ditutup dan fase gerak TLC dibiarkan bergerak di sepanjang plat. Pergerakan fase gerak dihentikan jika sudah mencapai garis di ujung atas plat dan plat diambil dari gelas beker. Plat TLC dibiarkan kering dan noda pada plat TLC diamati dengan menggunakan alat UV dan noda ditandai. Pada pemisahan pigmen dengan kromatografi kolom, ekstrak aseton yang sebelumnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 6 ml n-heksana dan 6 ml akuades, lalu larutan dikocok. Pada larutan kemudian diambil fase organik (bagian atas) menggunakan pipet tetes. Larutan lalu disaring dengan corong gelas yang ujungnya diberi kapas dan diisi dengan Na2SO4 anhidrat dan kemudian dicuci dengan 3ml n-heksana. Larutan lalu diuapkan dengan rotari evaporator dan residunya lalu dilarutkan dalam 1 ml n-heksana. Kolom disiapkan dengan memasukkan 1,25 g alumina ke dalam pipet pasteur yang sudah diberi kapas ujungnya, dan diketuk-ketuk agar kolom tertata dengan baik. Kolom diisi dengan 3 ml n-heksana, saat pelarut hampir rata dengan ujung atas pelarut lalu dimasukkan 0,25 ml sampel pigmen diikuti penambahan 1 ml n-heksana.
• 3.
  kwr ‘16 Kolom dielusidengan 4 ml n-heksana, 4 ml n-heksana/aseton (70/30) dan 4 ml aseton/metanol (80/20). Setiap eluat ditampung dalam eppendorf dengan fraksi- fraksi tiap 1 ml. Setiap fraksi diuji dengan TLC. HASIL DAN PEMBAHASAN  HASIL PERCOBAAN  Ekstraksi pigmen Volume ekstrak pigmen = 6 ml  Spektrofotometri UV-Vis Panjang Gelombang (nm) Absorbansi 661,6 nm 644,8 nm 470 nm 0,280 0,113 0,262  Plat TLC Jarak yang ditempuh fasa gerak = 5 cm Jarak yang ditempuh pigmen (noda) = 1,5 cm Rf = 0,3  PEMBAHASAN Pada percobaan ini empat bagian percobaan, yakni ekstraksi pigmen, penentuan konsentrasi pigmen, pemisahan dan penentuan pigmen dengan TLC, dan pemisahan pigmen dengan kromatografi kolom. Jenis tumbuhan yang diekstraksi pada percobaan ini yakni daun bayam. Ekstraksi Pigmen Dalam proses ekstraksi pigmen digunakan daun bayam yang akan diekstraksi pigmennya. Daun bayam yang akan digunakan sebelumnya harus dicuci terlebih dahulu untuk menghilangkan pengotor yang dapat mempengaruhi proses pengamatan. Untuk mengekstrak pigmen dalam daun bayam hanya digunakan daunnya saja sementara tulang daunnya tidak digunakan karena pada pigmen tumbuhan umumnya terkandung pada daunnya. Daun bayam yang telah ditimbang kemudian ditambahkan aseton dan dilumatkan hingga halus. Penambahan aseton berfungsi untuk melarutkan pigmen yang terkandung dalam daun bayam, mengingat aseton merupakan pelarut non polar sehingga dapat dengan mudah melarutkan pigmen daun. Ekstrak yang telah diperoleh lalu disaring menggunakan corong gelas yang ujungnya diberi kapas dan diisi dengan Na2SO4 anhidrat untuk memisahkan hasil ekstrak pigmen dengan ampas daunnya. Adanya Na2SO4 anhidrat berfungsi untuk mengikat kandungan air yang terdapat dalam ekstrak pigmen karena sifat dari
• 4.
  kwr ‘16 Na₂SO₄ anhidratyang higroskopis, sehingga diharapkan ekstrak pigmen tidak mengandung air. Berdasarkan hasil percobaan diketahui dalam proses ekstraksi pigmen diperoleh ekstrak pigmen sebesar 6 ml. Ekstrak ini kemudian disebut sebagai ekstrak aseton. Penentuan Konsentrasi Pigmen Penentuan konsentrasi pigmen dapat diketahui dengan mengukur absorbansi sampel ekstrak aseton menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 470 nm, 661,6 nm dan 644,8 nm di mana pada panjang gelombang 600an nm ini merupakan daerah warna merah. Penggunaan panjang gelombang di daerah warna merah dikarenakan ekstrak pigmen yang diamati berwarna hijau. Warna ini merupakan warna yang diamati, namun warna yang diserap oleh spektrofotometri UV-Vis merupakan warna komplementernya. Warna hijau memiliki warna komplementer merah. Sehingga, dengan mengetahu absorbansi ekstrak pigmen pada panjang gelombang 661,6 nm maka dapat diketahui kandungan klorofil dalam ekstrak tersebut. Pada pengukuran ini digunakan larutan blanko berupa aseton. Larutan blanko ini bertujuan untuk mengetahui besarnya absorbansi terhadap larutan jika tanpa analit. Larutan blanko biasanya digunakan untuk tujuan kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis. Berdasarkan hasil percobaan dapat ditentukan konsentrasi pigmen klorofil a yakni 2,92 𝜇𝑔 𝑚𝑙, klorofil b yakni 1,10 𝜇𝑔 𝑚𝑙, klorofil total 4,02 𝜇𝑔 𝑚𝑙, dan karotenoid total 87,34 𝜇𝑔 𝑚𝑙. Pemisahan dan Penentuan Pigmen dengan TLC Penggunaan TLC pada percobaan ini yakni untuk mengidentifikasi kandungan suatu senyawa, di mana didasarkan pada pemisahan karena perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Fase diam yang digunakan pada percobaan ini yakni plat silika gel. Sedangkan fase gerak yang digunakan yakni larutan n-heksana/aseton (7/3). Penggunaan fase grak ini dikarenakan sifat kepolaran yang dimilikinya, di mana campuran antara n-heksana dan aseton membuatnya dapat mengelusi senyawa polar dan non polar. TLC dapat digunakan untuk memisahkan pigmen warna, karena silika gel dalam plat TLC yang digunakan sebagai fase diam dapat menyerap pigmen-pigmen warna dari campuran dalam daun bayam dengan gaya kapilaritas. Pigmen-pigmen warna akan berpindah tempat sepanjang kertas dengan kecepatan yang berbeda sesuai dengan tingkat kepolaran senyawa/pigmen dan pelarut yang digunakan. Awalnya plat TLC dibuat pembatas berupa garis dari bawah dan atas. Penandaan garis ini untuk menunjukkan posisi awal dan akhir dari pergerakan eluen. Pada plat lalu diteteskan sedikit sampel dan ditempatkan dalam gelas beker yang berisi larutan n-heksana/aseton (7/3). Gelas kemudian ditutup untuk meyakinkan
• 5.
  kwr ‘16 bawah kondisidalam gelas beker terjenuhkan oleh uap dari pelarut yang dapat mencegah penguapan pelarut. Ketika pelarut mulai membasahi plat, pelarut akan melarutkan senyawa- senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa dapat merambat naik karena pengaruh dari dorongan pelarut dan gaya kapilaritas. Senyawa akan cenderung bergerak pada plat kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. Kecepatan senyawa-senyawa bergerak ke atas bagian plat tergantung pada kelarutan senyawa tersebut dalam pelarut. Dalam metode ini berlaku prinsip “like dissolve like”, artinya polar menyukai yang polar dan tak polar menyukai tak polar. Dalam hal ini, komponen yang polar akan mengikat lebih kuat komponen yang relatif polar, sedangkan komponen yang tak polar akan mengikat lebih kuat komponen-komponen yang juga tak polar. Untuk mengetahui bentuk noda pada plat TLC tidak dapat diamati dengan mata telanjang. Namun, harus menggunakan bantuan sinar UV. Sinar ini dapat melihat noda hitam yang terbentuk pada plat, karena sinar UV memiliki panjang gelombang yang pendek dan dengan frekuensi yang tinggi, di mana pada kondisi tersebut sinar UV mempunyai energi kimia yang dapat memendarkan barium platinasianida, dan dapat menghitamkan plat foto. Jika telah diketahui bentuk nodanya, baru kemudian dapat ditentukan nilai Rf (retardation factor) dari masing-masing senyawa yang terpisah. Rf merupakan suatu ukuran pemisahan yang terjadi pada teknik TLC ini. Berdasarkan hasil percobaan diperoleh satu bercak noda dengan nilai Rf = 0,3. Ditinjau dari nilai Rf-nya maka nilai Rf mendekati nilai Rf yang dimiliki pigmen lutein. Sehingga, dapat dikatakan jika salah satu jenis pigmen yang terkandung dalam daun bayam yakni lutein. Pemisahan Pigmen dengan Kromatografi Kolom Pada percobaan ini ekstrak pigmen aseton yang telah diperoleh di awal ditambahkan dengan n-heksana dan akuades. Penambahan ini menyebabkan pigmen terdistribusi dalam dua fasa, yakni fasa organik dan fasa air. Pigmen akan lebih terdistribusi ke fasa organik karena kesamaan sifat kepolarannya (non polar). Saat larutan dikocok akan membentuk dua lapisan yang tidak saling bercampur karena adanya perbedaan berat jenis antara keduanya (berat jenis n-heksana lebih ringan daripada air). Dikarenakan yang akan dianalisis adalah pigmen, maka yang diambil yakni fasa organiknya (lapisan atas). Untuk menguapkan sisa pelarut maka digunakan rotari evaporator, di mana alat ini akan menguapkan sisa pelarut pada suhu tertentu dan dalam kondisi vakum. Proses elusi pada kromatografi kolom dilakukan dengan mengelusikan larutan n-heksana (sifatnya paling non polar) terlebih dahulu untuk mengondisikan kolom yang akan diisi ekstrak pigmen (non polar). Setelah ekstrak pigmen
• 6.
  kwr ‘16 dimasukkan kedalam kolom, kemudian diikuti mengelusikan n-heksana, n- heksana/aseton (70/30), dan aseton/metanol (80/20). Urutan elusi ini berdasarkan sifat kepolarannya, di mana n-heksana bersifat paling non polar, sedangkan metanol yang paling polar. Fase diam yang digunakan dalam percobaan ini yakni alumina, di mana saat ekstrak pigmen dimasukkan ke kolom akan teradsorb pada fasa diam (alumina). Saat setiap eluen mulai dimasukkan, maka senyawa dalam ekstrak pigmen tadi akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan sifat kepolarannya. Setiap senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung akan diperoleh beberapa fraksi. Jika menurut urutan eluen yang dimasukkan dalam kolom, maka diperkirakan fraksi awal yang keluar akan memiliki sifat kepolaran yang paling rendah, sedangkan fraksi akhir yang keluar memiliki sifat kepolaran yang paling tinggi. Pada percobaan kromatografi kolom ini kami mengalami kegagalan, di mana ekstrak pigmen tidak mau teradsorp dalam alumina (fasa diam). Hal ini karena adanya kesalahan dalam proses preparasi sampel, di mana selama preparasi sampel digunakan larutan teknis, sedangkan seharusnya digunakan larutan PA (pro analys). Larutan PA digunakan memiliki kemurnian sangat tinggi (>99,5%), sementara larutan teknis tidak memiliki kemurnian setinggi larutan PA sehingga biasanya memiliki kandungan air yang cukup tinggi. Sementara itu, diketahui bahwa fasa diam yang digunakan (alumina) merupakan fase diam yang tidak dapat bekerja jika dalam larutan tersebut mengandung air. Sehingga, saat ekstrak pigmen dielusikan maka larutan tidak dapat berinteraksi dengan fasa diam. KESIMPULAN ... ... ... DAFTAR PUSTAKA Day, R.A, 1980, Analisis Kimia Kuantitatif, PT. Gelora Aksara Pratama, Jakarta. Harvey, D., 2000, Modern Analytical Chemistry, The McGraw-Hill Companies, Inc., USA. Mulyani, S., 2006, Anatomi Tumbuhan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta. Nair, A. J., 2007, Principle of Biotechnology, Laxmi Publications, New Delhi. Pudjaatmaka, A. H., 2002, Kamus Kimia, Balai Pustaka, Jakarta. Stafsnes, M. H., et. al., 2010, Isolation and Characterization of Marine Pigmented Bacteria from Norwegian Coastal Waters and Screening for Carotenoidswith UVA-Blue Light Absorbing Properties, J. Microbiol, Vol 48, No 1, Hal 16-23. Watson, D., 2005, Analisis Farmasi, Edisi Kedua, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.