Modern taxonomy and classification of bacteria (RUS)
1 like494 views
Документ описывает методы идентификации бактерий в клинической микробиологической лаборатории, включая традиционные и молекулярно-генетические подходы. Основное внимание уделяется важности точной идентификации для выбора антибиотиков и эффективного лечения инфекций. Упоминаются современные технологии, такие как MALDI-TOF и геносистематика, которые значительно улучшили скорость и точность диагностики.
![ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ГЕНОВ
«ДОМАШНЕГО ХОЗЯЙСТВА» ДЛЯ ID БАКТЕРИЙ
Ген (Продукт)
Универсальная идентификация в пределах крупных таксонов:
23S рДНК (23S рРНК)
rpoB (B субъединица РНК-полимеразы)
groEL (шаперонин, обеспечивающий фолдинг белков;
hsp60/65 «60/65-kDa белок теплового шока»)
recA (один из основных белков, обеспечивающих
репарацию и поддержание структуры ДНК)
gyrA, gyrB (A и B субъединицы ДНК-гиразы)
Видовая идентификация внутри отдельных генетических групп:
все перечисленные выше гены
16S–23S рДНК (межгенная последовательность [спейсер])
tuf (Tu фактор элогации EF-Tu)
...](https://image.slidesharecdn.com/1memolsystematicsspecidrus-191209121054/85/Modern-taxonomy-and-classification-of-bacteria-RUS-29-320.jpg)
Modern taxonomy and classification of bacteria (RUS)
- 1. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ В КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ СОВРЕМЕННАЯ ТАКСОНОМИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ РОЛЬ ГЕНОСИСТЕМАТИКИ М.В. Эйдельштейн НИИ антимикробной химиотерапии (НИИАХ) ФГБОУ ВО СГМУ Минздрава России
- 2. ЧТО ОЖИДАЕТ ЛЕЧАЩИЙ ВРАЧ ОТ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ? ОБРАЗЕЦ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ Выделение возбудителя / возбудителей инфекционного процесса в чистой культуре и идентификация – оценка клинического значения выделенных микроорганизмов Определение чувствительности возбудителя инфекции к антибиотикам – выбор антибиотиков для тестирования – экспертная оценка фенотипа резистентности РЕЗУЛЬТАТ (ЧЕМ ЛЕЧИТЬ?) быстрый и правильный
- 3. ДВА РАСПРОСТРАНЕННЫХ ЗАБЛУЖДЕНИЯ 1960е-70е «Чтобы выбрать стратегию лечения, достаточно результатов «грубой» идентификации возбудителя, например, окраски по Граму» 1980е - … «Нам не нужно знать, как он (возбудитель) называется. Достаточно знать, к чему он чувствителен»
- 4. Микробиологу Оценка клинического значения Выбор АБ для тестирования Интерпретация результатов определения чувствительности ЗАЧЕМ НУЖНА ТОЧНАЯ ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ? Лечащему врачу Оценка клинического значения Выбор АБ препарата Выбор режима и длительности терапии Эпидемиологу Накопление и анализ информации - выявление вспышки / новых случаев - определение путей распространения инфекции Определение мер инфекционного контроля
- 5. 2 года назад – протезирование аортального клапана Последние 6 мес – периодические подъемы t до 37,5-38,0ºС После приема амокс./клав. (5-7 дней) периоды апирексии (1-2 мес) УЗИ сердца – нет признаков эндокардита При посеве крови в 2 случаях получен положительный результат Медленно растущая культура; на 3-5 сут инкубации в 5%CO2 и анаэробных условиях – слабый, «пылевидный» рост на чашках с шоколадным и кровяным агаром Ручная и автоматическая биохимическая идентификация (Vitek2, Phoenix) без результата КЛИНИЧЕСКИЙ СЛУЧАЙ Пациент «T», 39 лет Какой антибиотик? Продолжительность терапии? Контаминант или возбудитель?
- 6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ MALDI BIOTYPER Обе выделенные культуры – Aggregatibacter actinomycetemcomitans
- 7. РЕЗУЛЬТАТ Обычный компонент микрофлоры ротовой полости и верхних дыхательных путей Может вызывать локализованный периодонтит, гингивит Типичный представитель группы «HACEK» – бактериальный возбудитель эндокардита Нерегулярная окраска по Граму; палочки и кокки Проблемная биохимическая идентификация: каталаза(+), оксидаза(+) уреаза(-) Иногда возможна предположительная идентификация по форме колоний Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans Пациенту назначена терапия цефтриаксоном 2 г 1р/сут в течение 6 нед Нормальная t в течение 6 мес после завершения курса АБ терапии
- 8. ЗНАЧЕНИЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДЛЯ ПРАВИЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АБ Выбор АБ для определения чувствительности Грам(-) неферментирующие бактерии: Acinetobacter spp. (выбор доп. АБ для тестирования: сульбактам, ко-тримоксазол, АГ) Burkholderia cepacia complex (рутинное определение чувствительности?) Stenotrophomonas maltophilia (выбор АБ для тестирования: ко-тримоксазол) Интерпретация полученных результатов определения чувствительности: Staphylococcus aureus и CNS vs. оксациллин (различные пограничные значения МПК и Ø зон подавления роста)
- 9. Классические методы – основаны на изучении фенотипических свойств Физических – способность к росту в определенных условиях, морфология колоний, запах ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ: ПРОШЛОЕ И НАСТОЯЩЕЕ Микроскопических и тинкториальных – морфология клетки и способность воспринимать красители (окраска по Граму) Метаболических – способность ферментации, ассимиляции, оксидации, деградации и гидролиза различных субстратов 1/2
- 10. Классические методы – основаны на изучении фенотипических свойств Агглютинационных – (идентификация патогена, выделенного в чистой культуре, выявление патогена в клиническом материале) Результатов определения чувствительности к антибиотикам (Stenothrophomonas maltophilia – ко-тримоксазол, имипенем) ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ: ПРОШЛОЕ И НАСТОЯЩЕЕ 2/2
- 11. Идентификационные системы: ручные, механические, автоматизированные – основаны на изучении фенотипических свойств Набор тестов, подобранных для идентификации определенной группы бактерий (Грам(-), стафилококки и энтерококки, стрептококки и др.) до определенного уровня Идентификационная схема (чаще, компьютерная база данных), разработанная для каждой системы API-, Vitek, Phoenix, Sensititre, Microscan,.. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ: НАСТОЯЩЕЕ
- 12. Преимущества Высокая стандартизация и автоматизированный учет Возможность идентификации большего числа видов Низкая трудоемкость Часто – более высокая скорость получения результата Невысокие требования к уровню квалификации персонала Недостатки Высокая стоимость оборудования и материалов Несостоятельность для идентификации «проблемных», «редких» бактерий, изолятов с нетипичным биохимическим профилем Непригодность для референтной идентификации Непригодность для идентификации новых видов АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
- 13. БЫСТРО Можно ли получить все сразу? ID МИКРООРГАНИЗМОВ СЕГОДНЯ: ВЫБИРАЙТЕ СОЧЕТАНИЕ ЛЮБЫХ 2-X КАЧЕСТВ
- 14. СОВРЕМЕННАЯ РЕВОЛЮЦИЯ В БАКТЕРИОЛОГИИ: ID БАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ MALDI-TOF MS
- 15. ПРЕИМУЩЕСТВА ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОЙ БАКТЕРИОЛОГИИ Быстрая идентификации Стандартизация процесса Точность идентификации Возможность идентификации «проблемных», «редких» бактерий, а также изолятов с нетипичным биохимическим профилем Минимальная стоимость расходных материалов Возможность исследования большего количества колоний Отсутствие необходимости дополнительных тестов Быстрое определение клинического значения Быстрый выбор антибиотиков для тестирования
- 16. ГЕНОСИСТЕМАТИКА. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНO-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ (ID) КУЛЬТИВИРУЕМЫХ БАКТЕРИЙ
- 17. Зачем нужны молекулярно- генетические методы? (если микроорганизм может быть выделен в чистой культуре)
- 18. Геносистематика стала основой современной классификации микроорганизмов Реклассификация известных и описание новых видов бактерий на основе данных геносистематики (сотни новых видов, выделенных у человека*) Несостоятельность традиционных (биохимических) методов ID бактерий определенных групп – Streptococcus spp. / Enterococcus spp. – Acinetobacter spp. – Burkholderia cepacia complex – Klebsiella spp. / Enterobacter spp. / Citrobacter spp. / Serratia spp. – Mycobacterium spp., ... Геносистематика позволяет объяснить важные различия (в экологии, клинической значимости, антибиотико- резистентности,..) между видами, сходными морфологически и биохимически РОЛЬ ГЕНОСИСТЕМАТИКИ И НЕОБХОДИМОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ *Woo, et al., Clin Microbiol Infect 2008; 14: 908–934
- 19. КТО ИСПОЛЬЗУЕТ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ID БАКТЕРИЙ? Исследовательские и референтные лаборатории Клинические микробиологические лаборатории сейчас 10 лет назад через 5 лет...
- 20. «Broad-range» ПЦР и анализ эволюционно-консервативных генов (16S рРНК, 23S рРНК, rpoB, gyrA, gyrB, groEL, recA...) – секвенирование / пиросеквенирование – фрагментация и анализ спектра фрагментов – гибридизация на микрочипах – ESI-TOF MS,.. Геномная гибридизация (прошлое) Полногеномное секвенирование МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ВИДОВОЙ ID БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕНЫХ В ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЕ Масс-спектрометрия белков (MALDI-TOF MS) ИК-Фурье (FT-IR) и Рамановская спектроскопия клеток Спектральные методы изучения целых бактериальных клеток и их основных компонентов: Молекулярно-генетические методы:
- 21. Карл Воуз (Carl Woese) 1977 г.: секвенирование генов 16S рРНК впервые использовано для филогенетического анализа прокариот
- 22. АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ рРНК – ОСНОВА СОВРЕМЕННОЙ ФИЛОГЕНИИ И СИСТЕМАТИКИ ЖИВЫХ СУЩЕСТВ
- 23. International Bulletin of Bacteriological Nomenclature and Taxonomy International Journal of Systematic Bacteriology International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА БАКТЕРИЙ
- 24. List of Procaryotic Names with Standing in Nomenclature, LPSN (ранее: List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature) Список названий прокариот и их положение в номенклатуре http://www.bacterio.net/
- 25. National Center for Biotechnological Information, NCBI Национальный центр биотехнологической информации США Ресурс: Таксономия (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy)
- 26. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 16S рДНК-СЕКВЕНИРОВАНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ ID изолятов с нетипичными фенотипическими свойствами, дифференциация фенотипически неразличимых видов ID некультивируемых, труднокультивируемых и медленнорастущих бактерий ID бактерий без предварительного культивирования, непосредственно в клиническом материале ID новых видов бактерий
- 27. ON-LINE СЕРВИС RIPSEQ (PATHOGENOMIX) ДЛЯ ПРЯМОЙ ID БАКТЕРИЙ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 16S рДНК Полимикробные ассоциации (прямой анализ биоматериала) www.ripseq.com Чистые культуры NGS
- 28. Открытые базы данных (GenBank) могут содержать ошибки: - неправильно указана видовая принадлежность (например, вследствие реклассификации МО) - ошибки секвенирования (особенно в ранних источниках) Общие критерии дифференциации: - межвидовые различия: < 99% гомологии 16S рДНК; - межродовые различия: < 97% гомологии 16S рДНК применимы не для всех групп бактерий* Для некоторых групп микроорганизмов характерна слишком высокая консервативность 16S рРНК. Дифференциация отдельных близкородственных видов является затруднительной или невозможной - Mycobacterium (non-tuberculosis) - Burkholderia cepacia gr. - Staphylococcus (отдельные роды и виды) - Acinetobacter - Enterobacterales (отдельные роды и виды) АНАЛИЗ 16S рДНК: НЕДОСТАТКИ И ОГРАНИЧЕНИЯ *Drancourt, et al., J Clin Microbiol. 2000; 38(10):3623-30
- 29. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ГЕНОВ «ДОМАШНЕГО ХОЗЯЙСТВА» ДЛЯ ID БАКТЕРИЙ Ген (Продукт) Универсальная идентификация в пределах крупных таксонов: 23S рДНК (23S рРНК) rpoB (B субъединица РНК-полимеразы) groEL (шаперонин, обеспечивающий фолдинг белков; hsp60/65 «60/65-kDa белок теплового шока») recA (один из основных белков, обеспечивающих репарацию и поддержание структуры ДНК) gyrA, gyrB (A и B субъединицы ДНК-гиразы) Видовая идентификация внутри отдельных генетических групп: все перечисленные выше гены 16S–23S рДНК (межгенная последовательность [спейсер]) tuf (Tu фактор элогации EF-Tu) ...
- 30. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ (MALDI-TOF MS) БЕЛКОВ vs СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК MALDI-TOF MS Cеквенирование белков (16S и др. локусы) Стоимость оборудования Стоимость материалов Трудоемкость Требования к уровню квалификации персонала Использование в + ? клинических лабораториях Использование в + + референтных лабораториях Рутинная ID + – ID “проблемных” МО + + Референтная ID ± + ID новых видов ? + Характеристики и области применения
- 31. ЭТАПЫ АНАЛИЗА С ПОМОЩЬЮ ПЦР И СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПЦР очистка ПЦР-продуктов Реакция циклического секвенирования Очистка продуктов секвенирования Разделение продуктов секвенирования Анализ нуклеотидных последовательностей
- 32. Секвенирование следующего поколения (NGS) Roche JS Junior (454 Sequencing) ThermoFisher Scientific Ion S5 Illumina MiSeq Pacific Biosciences PacBio RS II (SMRT Sequencing) Oxford Nanopore Technologies MinION (Nanopore Sequencing)
- 33. Видовая ID Субвидовое типирование (rMLST, wgMLST, wgSNP) Вирулом Мобилом Резистом (приобретенные гены и мутации) БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ
- 34. http://www.genomicepidemiology.org/ $0,00 INTERPRETOME ? Идентификация Субвидовое типирование Вирулом Резистом Плазмиды Бактериофаги